油菜莖基潰瘍病菌的pcr檢測方法及檢測用引物的製作方法

2024-04-04 02:14:05 1

專利名稱：：油菜莖基潰瘍病菌的pcr檢測方法及檢測用引物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及農業和植物檢疫
技術領域：
，具體涉及一種油菜莖基潰瘍病菌的檢測方法，尤其涉及一種油菜莖基潰瘍病菌的PCR檢測方法。此外，本發明還涉及檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物。
背景技術：
：油菜蓮基饋蕩病菌I^ptosphaeriamaculans(艮L.maculans)禾口油菜黑Jg病菌Leptosphaeriabiglobosa(即L.biglobosa)是世界範圍內引起油菜黑脛病的兩種病原菌。這兩種病菌的形態特徵相近，但引起油莖部感染和基部潰瘍的能力不同。油菜莖基潰瘍病菌L.maculans致病力強，引起莖基部發病。油菜黑脛病菌L.biglobosa致病力較弱，一般引起莖中上部為害，L.maculans是導致油菜黑脛病嚴重流行和油菜產量損失的主要原因。目前，我國僅有L.biglobosa分布，但是油菜的國際貿易和種子資源交流十分頻繁，我國每年都要從澳大利亞、烏克蘭、加拿大等油菜莖基潰瘍病發生國進境大量油菜籽，2009年我國進境油菜總量超過320萬噸。因此，進境油菜籽中油菜莖基潰瘍病菌的快速檢測已經成為口岸檢疫部門的新課題。目前油菜莖基潰瘍病菌檢測技術包括濾紙培養法和PCR方法，PCR以其快速、準確和靈敏的特點受到廣泛應用。Taylor(TaylorandBorgman,1993)等根據一段重複序列設計特異引物，建立了檢測強致病力菌株的PCR方法；Mahukuetal.(1995)從ITS序列設計引物來檢測強毒力的L.maculans；1995年，Mahuku等曾設計了ITS區的特異引物HV17S/HV26C檢測強毒力菌株(即油菜莖基潰瘍病菌)(Mahukuetal.1995)，序列分析發現下遊引物3』端與GenBank中部分油菜莖基潰瘍病菌菌株的序列不能完全匹配。2006年，Liu等根據ITS序列設計了檢測L.maculans的引物LmacF/LmacR(Liuetal.2006)，試驗中應用該引物檢測進境油菜籽樣品時，部分樣品的擴增容易出現假陽性的結果。此外，PCR反應的退火溫度也影響擴增的特異性。國內的油菜黑脛病是由L.biglobosa引起，主要分布於浙江、安徽、湖北、湖南、四川和內蒙古等油菜主產省區。我國尚未發生油菜莖基潰瘍病，其病原菌為檢疫性有害生物L.maculans.兩種病菌都以子囊殼和菌絲在病殘株中越夏和越冬，抗逆性強。主要通過空氣、病殘體和種子傳播，病殘體和帶菌種子是遠距離傳播的主要方式。目前，在全球變暖的大氣候下，油菜莖基潰瘍病還在歐洲、美洲、澳洲等地蔓延，給油菜產業帶來巨大的損失。中國是世界最大的油菜生產國家，種植面積達700多萬公頃，年產量1000萬噸以上。且國內的油菜種植品種對油菜莖基潰瘍病缺乏抗病性，油菜產區氣候與國外該病流行地區相似。如果油菜莖基潰瘍病菌傳入我國，將會給我國的油菜生產帶來毀滅性的打擊。2009年8月以來，上海口岸已經從澳大利亞、烏克蘭和加拿大等國進境的多批次油菜籽中截獲油菜莖基潰瘍病菌和油菜黑脛病菌。各地檢疫部門應加強防範意識，積極有效的開展進境油菜籽的檢疫。有關部門可採取預防措施進行監測和防控，此外，積極開展我國油菜和十字花科植物的抗性資源篩選，培育抗病品種，以應對生物安全隱患，保護我國油菜生產安全。
發明內容本發明要解決的技術問題在於提供一種油菜莖基潰瘍病菌的PCR檢測方法；為此，本發明還提供用於上述方法的檢測引物。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一方面，提供一種油菜莖基潰瘍病菌的PCR檢測方法，包括如下步驟(1)設計引物，該引物的序列為Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互補鏈；Lmb45'-aggcgagtcccaagtggaaca-3，(SEQIDNO.2)或其互補鏈；(2)收集菌絲並提取DNA；(3)採用步驟⑴設計的引物分別進行PCR檢測。步驟(2)中，所述收集菌絲並提取DNA具體為菌株用PDA培養基繁殖後收集菌絲，液氮研磨後取菌絲粉，用植物基因組提取試劑盒提取DNA。步驟(3)中，所述PCR檢測的反應體系為30μL，包括3μL10XPCRBuffer、3μLdNTP、3yLMgCl2、步驟(1)上下遊引物各0.5μL、1μL模板DNA、IUTaq聚合酶，加無菌水補至30μL。步驟(3)中，所述PCR檢測的反應程序為94°C預變性3min;然後以94°C30s,56°C30s,72°C40s擴增30個循環；最後72°C延伸5min。在本發明的另一方面，提供一種用於檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物，其序列為Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3『(SEQIDNO.1)或其互補鏈；Lmb45'-aggcgagtcccaagtggaaca-3『(SEQIDNO.2)或其互補鏈。目前，根據病菌的寄主專化性和地理來源的不同，L.maculans種下分為兩個亞種^ML,^LtSL.maculanssubsp·brassicae禾口L·maculanssubsp.lepidii，|1]"胃的寄i為培蕓薹屬Brassicaspp.。為了針對性檢測油菜等栽培蕓薹屬寄主上的L.maculanssubsp.brassicae，本發明根據Genbank中L.maculans的ITS序列，設計引物Lmb3/4特異性檢測油菜籽樣品中的有害生物L.maculanssubsp.brassicae，建立了L.maculans的PCR檢測方法。對供試的58個菌株進行檢測，試驗結果表明，引物Lmb3/4可特異性檢測L.maculans,且檢測的靈敏度很高。引物Lmb3/4能擴增供試的22個L.maculans菌株，得到276bp的預期條帶，供試的30個Lbiglobosa菌株以及6個相關種菌株沒有擴增產物。檢測靈敏度為4pg菌絲DNA，油菜籽樣品的檢測試驗表明這種PCR方法可用於進境油菜籽樣品中L.maculans的快速檢測。圖1是本發明實施例中PCR的檢測靈敏度結果示意圖；圖2是本發明實施例中油菜籽樣品的PCR檢測電泳圖。具體實施例方式以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，或按製造廠商建議的條件。1材料方法1.1供試菌株試驗用L.maculans和L.biglobosa部分菌株由本實驗室(上海出入境檢驗檢疫局)從加拿大、澳大利亞和烏克蘭等國進境油菜籽樣品中分離純化，部分菌株由深圳、江蘇和寧波出入境檢驗檢疫局技術中心提供，國內Lbiglobosa菌株由安徽農科院李強生老師提供，菌株編號和來源見表1。表1試驗菌株mmIi分離時間PCR反應IsolateCodeOriginYearPCRreactionL.maculanssubsp.8129-5澳大利亞Australia2009+brassicae8129-17澳大利亞Australia2009+8129-25澳大利亞Australia2009+6382-1澳大利亞Australia2009+6382-2澳大利亞Australia2009+6382-3澳大利亞Australia2009+8080-1烏克蘭Ukraine2009+333-13烏克蘭Ukraine2009+333-15烏克蘭Ukraine2009+420-3烏克蘭Ukraine2009+434-1烏克蘭Ukraine2009+434-2烏克蘭Ukraine2009+434-3烏克蘭Ukraine2009+895-1加拿大Canada2009+3-4加拿大Canada2009+3-9加拿大Canada2009+3-20加拿大Canada2009+15-2加拿大Canada2009十15-3加拿大Canada2009+15-5加拿大Canada2009+17-2加拿大Canada2009+17-3加拿大Canada2009+J-4a加拿大Canada2009+J-Ila加拿大Canada2009+L.biglobosasubsp.6382-53澳大利亞Australia2009一brassicae6382-54澳大利亞Australia2009-7873-1烏克蘭Ukraine2009-7873-2烏克蘭Ukraine2009-6555-1烏克蘭Ukraine2009-6555-2烏克蘭Ukraine2009一1602-1烏克蘭Ukraine2009-1602-2烏克蘭Ukraine2009-333-10烏克蘭Ukraine2009一333-14烏克蘭Ukraine2009-337-3烏克蘭Ukraine2009-337-4烏克蘭Ukraine2009—420-1烏克蘭Ukraine2009—431-1烏克蘭Ukraine2009一434-4烏克蘭Ukraine2009一726-2c日本Japan2009—Gs5-5d中國貴州Guizhou，China2008—Gj2-2d中國貴州Guizhou，China2008—Ah9-4d中國安徽Anhui,China2008—Ahl2-2d中國安徽Anhui,China2008—Ahl9-3d中國安徽Anhui,China2008—L.biglobosasubsp.3-2加拿大Canada2009一canadensis3-12加拿大Canada2009-17-1加拿大Canada2009-17-4加拿大Canada2009-15-4加拿大Canada2009-15-16加拿大Canada2009—895-3加拿大Canada2009-895-4加拿大Canada2009—9268-39"加拿大Canada2009—9268-46b加拿大Canada2009一L.biglobosasubsp.17-11加拿大Canada2009—australiensis337-2烏克蘭Ukraine2009一341-1烏克蘭Ukraine2009-Alternariasp.8129-84澳大利亞Australia2009—3-3加拿大Canada2009-A.alternaria333-3烏克蘭Ukraine2009—A.brassicae333-11烏克蘭Ukraine2009—333-18烏克蘭Ukraine2009-Phomasp.8129-92澳大利亞Australia2009一表1中，+表示positivereaction(陽性反應)；-表示negativereaction(陰性反應)；a江蘇出入境檢驗檢疫局吳翠萍提供；b深圳出入境檢驗檢疫局程穎慧提供；c寧波出入境檢驗檢疫局張建成提供；d安徽農科院李強生提供。1.2供試引物根據GenBank中L.maculans及其近緣種ITS序列差異，設計了L.maculans的特胃生弓LLmb3(5，-caccaattggatccccta-3『)/Lmb4(5『-aggcgagtcccaagtggaaca-3『),ψ增產物片段大小分別為276bp。引物委託上海生工生物技術服務有限公司合成。1.3菌絲收集及DNA提取供試菌株轉移至PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，每升培養基含有馬鈴薯200g，蔗糖20g和瓊脂17g)繁殖後收集菌絲，液氮研磨後取0.Ig菌絲粉，用植物基因組提取試劑盒(TIANGENBIOTECH公司，DP305-02)提取DNA。1.4引物特異性測試PCR試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司(Takara)。用引物Lmb3/4擴增供試的菌株DNA，PCR反應體系為30μL(Takara)，包括3μL10XPCRBuffer,3μLdNTP(各250μΜ)、3μMgCl2(25mM)、上下遊引物(5μΜ)各0.5yL、lyL模板DNA、1UTaq聚合酶，加無菌水補至30μL。PCR反應程序為94°C預變性3min；然後以94°C30s,56°C30s,72°C40s擴增30個循環；最後72°C延伸5min。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠IXTAE緩衝液中電泳，EB染色後用凝膠成像系統分析。1.5引物靈敏度測試將編號為8129-5的L.maculan菌株的DNA測定核酸濃度後分別系列稀釋10、102、IO3UO4倍，用引物Lmb3/4進行PCR擴增，測試PCR的檢測靈敏度。1.6進境油菜籽樣品的檢測從烏克蘭進境油菜籽樣品(樣品編號333)中挑取變色、畸形或皺縮種子，分別以50,10,5粒和1粒為一個樣品，各準備30份樣品。樣品液氮研磨後提取DNA，每份樣品DNA取IyL進行PCR檢測。2結果與分析2.1引物特異性測試供試58個菌株DNA用引物Lmb3/4進行PCR擴增，引物Lmb3/4可以擴增22株供試的L.maculans菌株DNA，得到276bp的預期擴增產物，供試的其他菌株DNA和空白對照沒有擴增條帶(表1)。試驗結果表明，引物Lmb3/4可特異性檢測L.maculans.2.2引物靈敏度測試引物Lmb3/4擴增不同系列稀釋度編號為8129-5的L.maculan菌株的菌絲DNA，4ng、400pg和40pg的DNA可以擴增得到預期條帶，4pg的DNA未出現預期條帶(圖1)；圖1中，M.是MarkersDL2000(Takara)100，250，500，750，1000，2000bp；14表示編號為8129-5的L.maculan菌株的4ng，400pg,40pg,4pgDNA；試驗結果表明，引物Lmb3/4的檢測靈敏度為4pg菌絲DNA。2.3油菜籽樣品的PCR擴增進境油菜籽樣品中的疑似染病種子分別以10、5、1粒為一個試驗樣品，提取DNA後進行PCR檢測。如表2所示，檢測結果表明，PCR方法對1粒、5粒和10粒油菜籽樣品的陽性檢出率分別為10%、23.3%和40%。油菜籽樣品的PCR檢測電泳結果如圖2所示，圖2中，M表示MarkersDL2000(Takara)100，250，500，750，1000，2000bp；13表示PCR對10粒，5粒，1粒的檢測；4表示L.maculans的DNA；5表示L.biglobosa的DNA；6表示無DNA模板。表2油菜籽樣品的PCR檢測tableseeoriginaldocumentpage83討論根據病菌的寄主專化性和地理來源的不同，目前認為油菜黑脛病菌L.biglobosa種下包括六個亞種(Mendes-Pereiraetal.2003；Voigtetal.2005；Vincenotetal.2008)，^L.biglobosasubsp.brassicae,寄i為I屬Brassicaspp.；L.biglobosasubsp.thlaspii,寄主為薪寞(遏藍菜)Thlaspiarvense；L.biglobosasubsp.erysimii,寄主為H芥屬Erysimumsp.；L.biglobosasubsp.canadensis；L.biglobosasubsp.australiensis禾口L.biglobosasubsp.occiaustralensis。油菜苯基饋蕩病菌L.maculans禾中下包括兩個亞禾中，包括L.maculanssubsp.brassicae,寄主為栽培蕓薹屬Brassicaspp.；L.maculanssubsp.Iepidii,寄主為獨行菜屬Lepidiumspp.(Mendes-Pereiraetal.2003；Voigtetal.2005；Vincenotetal.2008).o試驗中從澳大利亞、烏克蘭和加拿大等進境油菜籽樣品中分離的100餘個油菜莖基潰瘍病菌分離物經測序和序列分析，所有分離物均與L.maculanssubsp.brassicae的序列高度相似，相似性為99.8%。同時分離的100餘個油菜黑脛病菌分離物形包含了L.biglobosasubsp.brassicae>L.biglobosasubsp.canadensis禾口L·biglobosasubsp.australiensis等三個亞種。試驗所設計的L.maculans特異性引物是針對性檢測亞種L.maculanssubsp.brassicae,該亞種主要分布在歐洲、加拿大、澳大利亞和紐西蘭等地，寄主植物包括甘藍型油菜Brassicanapus、甘藍B.oleracea、芥菜B.juncea，和甜菜Betavulgaris(Mendes-Pereiraetal.2003)。試驗中病原菌的分離是從PCR初檢陽性的油菜籽樣品中挑取變色、畸形或皺縮等異常種子表面消毒後進行培養，分離到病菌的可能性高於隨機取樣，挑取種子樣品和隨機樣品的PCR檢測結果也證實了這種可能性；另一方面，種子樣品在表面消毒的過程中，附著在種子表面的病菌菌絲等被有效殺滅失活，因此，挑取樣品中分離到病菌的概率並不能真實代表原始樣品中種子攜帶病菌的概率。從分離病菌的結果看，澳大利亞進境油菜籽樣品分離成功率為2.0-2.6%；烏克蘭進境油菜籽樣品分離成功率為0-2.6%；加拿大進境油菜籽樣品分離成功率為0-0.3%。總體上，加拿大進境油菜籽樣品中種子攜帶油菜莖基潰瘍病菌的概率小於澳大利亞和烏克蘭樣品。由於試驗樣品經過初步篩選，樣品中油菜籽的實際帶菌率應該低於此值。每個試驗樣品的帶菌量不同，且處於比較低的水平，1粒油菜籽種子即使帶菌，含量也非常有限，常規PCR不易檢測出來，試驗中檢測了30份1粒種子的樣品，僅能檢測出6個陽性，且擴增條帶弱。權利要求一種油菜莖基潰瘍病菌的PCR檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)設計引物，該引物的序列為Lmb35』-caccaattggatccccta-3』(SEQIDNO.1)或其互補鏈；Lmb45』-aggcgagtcccaagtggaaca-3』(SEQIDNO.2)或其互補鏈；(2)收集菌絲並提取DNA；(3)採用步驟(1)設計的引物進行PCR檢測。2.如權利要求1所述的油菜莖基潰瘍病菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述收集菌絲並提取DNA具體為菌株用PDA培養基繁殖後收集菌絲，液氮研磨後取菌絲粉，用植物基因組提取試劑盒提取DNA。3.如權利要求1所述的油菜莖基潰瘍病菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟(3)中，所述PCR檢測的反應體系為30μL，包括3μL10XPCRBuffer、3yLdNTP,3yLMgCl2、步驟(1)上下遊引物各0.5μL、1μL模板DNA、IUTaq聚合酶，加無菌水補至30μL。4.如權利要求1或3所述的油菜莖基潰瘍病菌的PCR檢測方法，其特徵在於，步驟(3)中，所述PCR檢測的反應程序為94°C預變性3min；然後以94°C30s,56°C30s,72°C40s擴增30個循環；最後72°C延伸5min。5.一種用於檢測油菜莖基潰瘍病菌的引物，其特徵在於，其序列為Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互補鏈；Lmb4:5，-aggcgagtcccaagtggaaca-3，(SEQIDNO.2)或其互補鏈。全文摘要本發明公開了一種油菜莖基潰瘍病菌的PCR檢測方法及檢測用引物，根據油菜莖基潰瘍病菌L.maculans與其近似種ITS序列的差異，設計了檢測L.maculans的特異性引物Lmb3(5』-caccaattggatccccta-3』)/Lmb4(5』-aggcgagtcccaagtggaaca-3』)，建立了L.maculans的PCR檢測方法。該方法的檢測靈敏度為4pg菌絲DNA，油菜籽樣品的檢測試驗表明這種PCR方法可用於進境油菜籽樣品中油菜莖基潰瘍病菌L.maculans的快速檢測。文檔編號C12N15/11GK101805793SQ201010142440公開日2010年8月18日申請日期2010年4月8日優先權日2010年4月8日發明者周國梁,尚琳琳,易建平申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局