利用長葉紫菜生產高吸光度藻紅素的用途及其方法
2024-03-03 00:36:15 2
專利名稱：利用長葉紫菜生產高吸光度藻紅素的用途及其方法
技術領域：
本發明是有關於用長葉紫菜(Porphyra dentata)生產具有高吸光度(OD)比值藻紅素的用途及其方法。利用長葉紫菜生活史中具有的有性生殖、無性生殖與營養繁殖三個世代交替及果孢子絲狀體階段不含各種膠類的特徵下，在控制的光線、溫度及營養條件下，延續其絲狀體階段，並進一步以其為材料，萃取高吸光度比值藻紅素。
背景技術：
不論就藻紅素、藻藍素或其它天然蛋白質色素而言，通常具有實用安全性，對熱、酸鹼度等亦具相當程度的穩定性，可應用於食品與化妝品上，同時亦可作為免疫學上抗體標誌用的螢光色素而應用於臨床診斷及細胞生化學研究上。
目前市場已開發並應用的有藻藍素(phycocyanin)與藻紅素(phycoerythrin)，其中，藻藍素生產的原料來源多為可予大量繁殖培養的藍綠藻，如螺旋藻(Spirulina)與銅鏽微囊藻(Microcystis)，且其培養與生產方法多享有專利。
而藻紅素則因原料的缺乏，或因原物料不利於色素生產，而存在產量少及價格昂貴的缺陷，對全球每年數萬磅食用紅色色素的需求，必須開發一種天然、安全、穩定又具特殊螢光釋出的紅色色素，預估大量生產後，將使價格下降，更會擴大其應用範圍與市場供給。
目前藻紅色素蛋白大部分是分離自紅藻的大型葉狀體，如紫菜(Porphyra)或仙菜藻(Ceramium)等，少部分則萃取自可大量控制培養的紫球藻(Porphyridium)。其主要問題在於1、目前雖有野生大量紅藻資源及栽培的紫菜作為藻紅素原料，但因多數紅藻含豐富膠質物(洋菜膠、鹿角菜膠、紅藻膠)，導致色素的萃出不易，尤其是乾燥後的藻類原料更是如此，再加上野生藻種的原料在品和產量上均有季節性差異，為人力所不易掌握。
2、目前紫球藻的培養於收集細胞時，亦有顯著的困難，因為單細胞藻體的收集一向是耗能而耗時的操作，影響生產成本甚大，而藻細胞於培養時所分泌的可溶性多醣類，除了阻礙細胞的收集外，亦影響到色素的抽取。
為了解決上述的問題，美國專利5,358,858提出了一種由頭髮菜(Bangiaatropurpurea)及狹葉紫菜(Porphyraangusta)絲狀體生產藻紅素的方法，利用頭髮菜及狹葉紫菜生活史中的絲狀孢子體階段不含各種膠類的特徵下，利用控制的光線、溫度及營養條件下，延續其絲狀體階段，並進一步以其為原料，萃取藻紅素，其步驟如下1、絲狀體的培養與繁殖，從野外採集成熟的頭髮菜或狹葉紫菜配子體，以滅菌海水及毛筆清洗藻體乾淨，稍陰乾後投入含改良過的SWM-III(如表一所示)培養皿中，培養皿內底部鋪有蓋玻片，待孢子釋放並附著於蓋玻片後，在室溫下、1000-4000lux的照度及每日10-16小時照光的培養箱中發芽成長，最後發育呈分歧多枝的絲狀孢子體。
表一SWM-III的組成NaNO38.5g/100ml 取2mlNa2HPO40.595g/100ml 取2mlNa2EDTA 0.5g/100ml 取2ml0.01625g/100ml 取2mlFeCl3(或FeCl3·7H2O)0.02885g/100ml 取2ml*1PI-metal 取2ml*2S-3Vitamins 取2mlSoil extract取50mlTris(10cc/l)取500mg
Livere xtract 取10mg海水pH＝7、5 1升(調pH時先以濃HCl調至pH≤7，再以適當濃度的NaOH調至pH7、5，如此可免於消毒時產生白色沉澱)其中*1PI-metal為H3BO312.368gMnCl21.385gZnCl20.109g蒸餾水 2升CoCl2·6H2O 4.479mgCuCl2·2H2O 0.034mg其中*2S-3Vitamins為ThiaminHCl 0.5gCapantothenate 0.1gNicotinicacid 0.1gP-aminobenzoicacid 10mgBiotin 1mg蒸餾水 2升Inositol 5gFolic acid 2mgThymine3mgB121mg(所有的Stock溶液均存於褐色瓶中，冷藏保存)2、絲狀體刮下後移至含培養液的三角瓶，在上述生長環境條件下培養，育成絲狀體的聚集團。打碎絲狀體的聚集團，移至更大生長的量瓶繼續發育成更多的聚集團，並因此漸次擴大培養的體積，在較大體積的照光培養槽中，應予打氣(每分鐘300毫升乾淨空氣)大量繁殖培養。通過100-400網目的網布過濾，濾除的培養液可回收再使用，對後續的培養並無妨礙。
3、藻體收穫後，因絲狀體結構可經真空或溫風迅速乾燥，再研磨成粉後，以水或磷酸鹽溶液予以充分攪拌萃取、離心，可得澄清的深紅藻蛋白溶液；藻色素的濃縮與純化，可通過20％硫酸銨溶液去除部分雜質蛋白沉澱，再於溶液中經60-65％硫酸銨溶液沉澱出色素蛋白，為OD565/OD280＝1.4-1.6的粗紅色色素，為食品級、化妝品可用的色素。
4、將沉澱的蛋白進一步通過膠濾層析純化(gelfiltration)，使用Sephadex G200樹酯分離，第一道程序可得OD比為3.3-3.7的藻紅素產品，再次重複即可得OD比為5.1-5.2的藻紅素，再經膠體電泳法(SDS)電泳所得的結果顯示純度約99％，可作為免疫檢驗用試劑。
上述的方法雖然可以避免傳統紫菜、仙菜藻萃取色素法需以加熱及分離膠值的複雜手續，或是紫球藻等單細胞植物萃取法，由於其體積小，導致收集的困難與其分泌的多醣類影響色素的抽取的問題，其主要缺陷在於但是頭髮菜及狹葉紫菜絲狀體直接形成的深紅藻蛋白溶液，其OD565/OD280隻有1.4-1.6，仍需進行藻色素的濃縮與純化，來獲取高OD值的藻紅素，造成製程複雜及成本較高。因此我們需要開發其它藻種的絲狀體，使其初次形成的深紅藻蛋白溶液就具有高OD值的藻紅素。
鑑於上述的背景技術中，傳統利用頭髮菜及狹葉紫菜絲狀體直接形成的深紅藻蛋白溶液，其吸光度比值偏低的問題。本發明人創造出本發明的技術方案。
發明內容
本發明的主要目的是提供一種利用長葉紫菜生產高吸光度藻紅素的用途及其方法，通過其單位重量含有藻紅素的高重量比值，達到降低單位成本的目的。
本發明的又一個目的是提供一種利用長葉紫菜生產高吸光度藻紅素的用途及其方法，通過其可萃取具有高吸光度比值藻紅素，達到減少藻紅素純化步驟的目的。
本發明的目的是這樣實現的利用長葉紫菜生產高吸光度藻紅素的用途，其生活史具有的有性生殖、無性生殖與營養繁殖三個世代交替，利用其孢子絲狀體生產高吸光度比值的藻紅素。
該孢子絲狀體為果孢子(carpospore)絲狀體。
該藻種為長葉紫菜(Porphyra dentata)，從其果孢子絲狀體中萃取的藻紅素，經高效能液相層析儀所得出的565nm的層析光譜圖。
該長葉紫菜果孢子絲狀體生產高吸光度比值的藻紅素，包含下列步驟以培養液培養長葉紫菜含成熟果孢子囊的配子體並得到果孢子；將該果孢子置於15-30℃下，500-6000lux的照度與明暗比為10∶14以上的環境下培養，使其長成為絲狀體；收集該絲狀體；加入酸鹼緩衝液，加以攪拌、離心，以得到深色色素蛋白溶液；及以鹽析法去除該深色的色素蛋白溶液中雜質，並沉澱出色素蛋白。
該培養液為SWM-III培養液。該SWM-III培養液為去有機物的SWM-III培養液。培養該果孢子絲狀體的方法為旋浮培養法。培養的環境為20℃，2000lux的照度與明暗比為12∶12。
收集該絲狀體的步驟更包含以網布收集法收集該絲狀體；乾燥該絲狀體；及研磨該絲狀體，使其成為粉末。網布收集法使用20-400網目網布。乾燥該絲狀體的方法為真空法。乾燥該絲狀體的條件為溫風法。離心的條件為轉速6000rpm、時間10min及溫度4℃。該酸鹼緩衝液為磷酸鉀溶液，以維持溶液pH值在5-10之間。鹽析法去除雜質為加入20％硫酸銨溶液。鹽析法沉澱色素蛋白為加入60-65％硫酸銨溶液。更包含以超過濾法(ultrafiltration)純化分離出藻紅素。更包含以膠濾層析法純化分離出藻紅素。膠濾層析法為使用SephadexG200的膠濾層析法。
下面結合較佳實施例和附圖詳細說明。
圖1是利用高效能液相層析儀(HPLC)得出的藻紅素UV吸收及螢光發散層析光譜圖；圖2是頭髮菜生活史的示意圖；圖3是狹葉紫菜生活史的示意圖；圖4是海面生活史的示意圖；圖5-圖7是傳統的頭髮菜萃取出的純質藻紅素經高效能液相層析儀所得出的280nm、565nm、615nm的層析光譜圖。
圖8-圖10是傳統的狹葉紫菜萃取出的純質藻紅素經高效能液相層析儀所得出的280nm、565nm、615nm的層析光譜圖。
圖11-圖13是本發明的長葉紫菜萃取出的純質藻紅素經高效能液相層析儀所得出的280nm、565nm、615nm的層析光譜圖。
具體實施例方式
下面的較佳實施例僅為說明本發明，還可以廣泛地在其它藻種的實施例施行，且本發明的範圍不受下面較佳實施例的限定。
眾所周知，藻膽蛋白是來自藻類體內的一種水溶性螢光蛋白色素。因其具有特殊的螢光性質，目前主要被廣泛的運用於流動細胞儀的螢光試劑上。各種藻膽蛋白中，藻紅素是其中的一種，亦是天然物中螢光強度最高的一種，因此有許多螢光檢測方法採用此類色素。
圖1為藻紅素利用高效能液相層析儀(HPLC)得出的UV吸收及螢光發散層析光譜圖，其層析條件如下所述HPLC columnHYDROCELL DEAE NP10Column size50*4.6mmBuffer A10mMK-PBS pH6.0Buffer B10mMk-PBS，0.5M NaCl pH6.0
Gradient0％ Buffer B→12min→50％Buffer BDetection565nmFlow rate1ml/min而高效能液相層析儀主要由高精密度高壓泵體、分離管、偵測儀和記錄器所組成。
參閱圖2所示，觀察頭髮菜生活史，有性生殖為產生造果器6(即雌性配偶體5)與精子囊2(即雄性配偶體1)釋放的精子3受精4之後，在果孢子囊7會發育成果孢子8，裡面的果孢子8成熟後，即會散出，變成絲狀孢子體9，在側腰狀色素體b作用下，成長為胞子體10和殼胞子囊11，其放出殼胞子12在單胞子形成部位15進一步成長為幼體13、單列藻體14，在星狀色素體a作用下，形成單胞子16，單胞子16進一步形成直立體(配偶體)18、多列藻體17成長為雄性配偶體1。
無性生殖則是由單孢子16直接發育成萌發成幼體13、單列藻體14及小型藻體，等到一定時候又可產生單孢子16，單孢子16又萌發成單列藻體14及小型藻體，如此循環一直到適當的環境條件下，單列藻體14及小型藻體所產生的單孢子16就可萌發成大型藻體17。同時，單列藻體14及小型藻體也能轉變成大型藻體17，再進入有性生殖世代。
參閱圖3所示，觀察狹葉紫菜生活史中，由於其與圖2的頭髮菜生活史大體相同，故不詳述。我們可以得知上述兩種藻類的生活史一般是有性生殖及無性生殖兩個世代交替，傳統技術就是利用絲狀孢子體階段不含各種膠類的特徵，在控制的光線、溫度及營養條件下，延續其絲狀體階段，並進一步以其為原料，萃取藻紅素。
參閱圖4所示，觀察海面(Nemalion)生活史，由於其與圖2的頭髮菜生活史大體相同，故不詳述。藻類的生活史除了是以有性生殖及無性生殖兩個世代交替外，另外部分藻類還多出一個營養繁殖世代，即產生四分孢子的孢子體(即四分孢子體)，其過程為造果器受精後形成果孢子體(carposporephyte)、果孢子(carpospore)、四分孢子體(tetrasporophyte)、四分孢子囊(tetrasporangium)、最後是四分孢子(tetraspore)，其中果孢子與四分孢子都會萌發成絲狀體，但此兩種絲狀體的特性不同。
本發明就是利用具有營養繁殖世代的長葉紫菜，其果孢子絲狀體階段不含各種膠類的特徵，在控制的光線、溫度及營養條件下，延續其絲狀體階段，並進一步以其為原料，萃取出具有高OD值藻紅素，其步驟如下1、絲狀體的培養與繁殖，將成熟的長葉紫菜含成熟果孢子囊的配子體，以滅菌海水及毛筆清洗藻體乾淨，稍陰乾後投入不含有機物的SWM-III培養液的培養器中，培養器內底部鋪有玻璃片，待果孢子(carpospore)釋放並附著於玻璃片後，在溫度15-30℃下，500-6000lux的照度，明暗比為10∶14以上及每日10小時以上照光的培養器中發芽成長，最後發育呈分歧多枝的絲狀體。
2、絲狀體刮下後移至含培養液的大型培養槽，在上述生長環境條件下培養，可育成絲狀體的疏鬆小聚集團，並因此漸次擴大培養的體積，在較大體積的照光培養槽中，應予打氣使該小聚集團懸浮於培養液中(稱為旋浮培養)大量繁殖培養。通過20-400網目的網布過濾，濾除的培養液可回收再使用，對後續的培養並無妨礙。
3、藻體收穫後，因絲狀體結構可經真空或溫風迅速乾燥，再經自動磨粉機研磨成粉後，取2.4公克重的粉末，加入70毫升、10mM的磷酸鉀溶液或其它酸鹼緩衝液予以充分攪拌，以維持溶液pH值在5-10之間予以充分攪拌、再以6000rpm、10min及4℃的狀態下離心，可得澄清的深紅藻蛋白溶液。藻色素的濃縮與純化，可通過20％硫酸銨溶液去除部分雜質蛋白沉澱，再於溶液中經60-65％硫酸銨溶液沉澱出色素蛋白，其為OD565/OD280＝2.66的粗紅色色素，為食品級、化妝品可用的色素。
上述澄清的深紅藻蛋白溶液也可以用直接收穫的溼藻體磨碎加磷酸鉀溶液後再離心取得，而藻色素的濃縮與純化可通過超過濾法(ultrafiltration)來進行。
4、將沉澱的蛋白進一步通過膠濾層析純化(gelfiltration)，使用120公分長的Sephadex G200樹酯分離，第一道程序可得OD比為4.5以上的藻紅素產品，再次重複即可得OD比為5.3以上藻紅素，再經膠體電泳法(SDS)電泳所得的結果顯示純度約99％，可作為免疫檢驗用試劑。
參閱圖5-圖7所示，為傳統從頭髮菜萃取出的純質藻紅素經高效能液相層析儀(HPLC)所得出的280nm、565nm、615nm的層析光譜圖，參閱圖8-圖10所示，為傳統從狹葉紫菜萃取出的純質藻紅素經高效能液相層析儀所得出的280nm、565nm、615nm的層析光譜圖。實際上，從不同的藻種中所萃取出的藻紅素，其經高效能液相層析儀所得出層析光譜圖亦有所差異，就像人類的手指指紋一般。因此，我們可以通過此一特性來分辨出藻紅素是由何種藻種所生產。
參閱圖11-圖13所示，是本發明從長葉紫菜取出的純質藻紅素經高效能液相層析儀所得出的280nm、565nm、615nm的層析光譜圖。
表二為傳統的頭髮菜、狹葉紫菜與本發明的長葉紫菜萃取藻紅素的比較表。
第一列為單位藻類重量(克)含藻紅素重量(毫克)的比值，代表在相同的藻類重量下可以產出的藻紅素，我們可以清楚得知本發明的長葉紫菜，其含藻紅素的比值為最高。
第二、三列為從藻種中萃取出藻紅素的吸光度比值(OD565/OD280)及(OD615/OD565)，前者表示藻紅素和其它蛋白質純度的比例，後者表示藻藍素和藻紅素的純度比，(OD565/OD280)比值越高表示藻紅素純度越高，其附加價值越高，越具有食品或化妝品色素利用價值，也越有利後端製成純化，因可應用於醫療的免疫檢驗用試劑上；而因為藻藍素會吸收藻紅素所發出的螢光，造成作為在食品或化妝品色素用途時螢光顏色不佳，因此(OD615/OD565)越低表示藻藍素含量越少，在螢光顏色效果上更佳。同樣地，我們可以明顯看出本發明的長葉紫菜，其萃取出藻紅素具有最高的吸光度比值。因此，利用本發明的長葉紫菜絲狀體來萃取藻紅素，其較傳統頭髮菜和狹葉紫菜的絲狀體，具有高藻紅素含量與高吸光度比值的優點。
表二 各藻種藻粉色素成份分析
其中RPE一種藻紅蛋白，具有親水性並在水與形成穩定性水溶液，其最大UV吸收波長及螢光發散波長各為566nm及575nm。
Ba傳統頭髮菜(Bangia atropurpurea)Pa傳統狹葉紫菜(Porphyra angusta)Pd本發明的長葉紫菜(Porphyra dentata)本發明是通過舉出一個較佳實施例來描述，但是本發明並不限定於所舉出的實施例，顯而易見地，其它未脫離本發明所揭示的精神下，所完成的等效改變或修飾，均應包含在本發明的保護範圍之內。
綜上所述，本發明的實施例能達到所預期的功效，又其所揭露的具體構造，不僅未曾見諸於同類產品中，亦未曾公開於申請前，具有新穎性、創造性和實用性。
權利要求
1.一種利用長葉紫菜生產高吸光度藻紅素的用途，其特徵是用長葉紫菜的生活史具有有性生殖、無性生殖及營養繁殖三個世代交替，利用其孢子絲狀體生產高吸光度藻紅素。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵是該孢子絲狀體為果孢子絲狀體。
3.根據權利要求1所述的用途，其特徵是該長葉紫菜從其果孢子絲狀體中萃取的藻紅素，經高效能液相層析儀所得出的565nm的層析光譜圖。
4.一種利用長葉紫菜生產高吸光度藻紅素的方法，其特徵是它包含下列步驟(1)以培養液培養長葉紫菜含成熟果孢子囊的配子體，並得到果孢子；(2)將該果孢子置於溫度15-30℃下，光照為500-6000lux的照度與明暗比為10∶14以上的環境下培養，使其長成為絲狀體；(3)收集該絲狀體；(4)加入酸鹼緩衝液，加以攪拌和離心，得到深色的色素蛋白溶液；(5)以鹽析法去除該深色的色素蛋白溶液中雜質，並沉澱出色素蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵是該培養液為SWM-III培養液。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵是該SWM-III培養液為去除有機物的SWM-III培養液。
7.根據權利要求4所述的方法，其特徵是該培養該果孢子絲狀體的方法為旋浮培養法。
8.根據權利要求4所述的方法，其特徵是該(1)的培養環境為20℃，2000lux的照度與明暗比為12∶12。
9.根據權利要求4所述的方法，其特徵是收集該絲狀體更依次包含如下的步驟以網布收集法收集該絲狀體、乾燥該絲狀體及研磨該絲狀體，使其成為粉末。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵是該網布收集法使用20-400網目的網布。
11.根據權利要求9所述的方法，其特徵是乾燥該絲狀體的方法為真空法。
12.根據權利要求9所述的方法，其特徵是乾燥該絲狀體的條件為溫風法。
13.據權利要求4所述的方法，其特徵是該離心的條件為轉速6000rpm、時間10min及溫度4℃。
14.根據權利要求4所述的方法，其特徵是該酸鹼緩衝液為磷酸鉀溶液，以維持溶液pH值在5-10之間。
15.根據權利要求4所述的方法，其特徵是該鹽析法去除雜質為加入20％硫酸銨溶液。
16.根據權利要求4所述的方法，其特徵是該鹽析法沉澱色素蛋白為加入60-65％硫酸銨溶液。
17.根據權利要求4所述的方法，其特徵是它還包含以超過濾法純化分離出藻紅素。
18.根據權利要求4所述的方法，其特徵是它還包含以膠濾層析法純化分離出藻紅素。
19.據權利要求18所述的方法，其特徵是該膠濾層析法為使用SephadexG200的膠濾層析法。
全文摘要
一種利用長葉紫菜生產高吸光度藻紅素的用途及其方法。利用長葉紫菜生活史中具有的有性生殖、無性生殖與營養繁殖三個世代交替及果孢子絲狀體階段不含各種膠類的特徵下，在控制的光線、溫度及營養條件下，延續其絲狀體階段，並進一步以其為材料，萃取高吸光度比值藻紅素。通過其單位重量含有藻紅素的高重量比值，達到降低單位成本及減少藻紅素純化步驟的功效。
文檔編號A01H1/04GK1520718SQ03102040
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月27日 優先權日2003年1月27日
發明者江永棉, 周宏農, 鄭俊明, 呂志翼 申請人:人宇生物科技股份有限公司, 呂志翼