一種兩核苷酸實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法
2024-04-05 20:49:05 1
一種兩核苷酸實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法
【專利摘要】本發明提供了一種微量微生物鑑定的方法。通過兩核苷酸同時加入到測序反應中，得到一系列峰譜信息圖。在峰譜圖中，不同模板所需的測序反應次數不同，且在不同的測序方式下得到的測序反應峰譜信號強度不同。通過這一原理可實現微生物菌群的鑑定。該方法有效提高了微生物鑑定的靈敏度、縮短了操作時間，為微生物的分離和鑑定提供了一種可靠的選擇。
【專利說明】—種兩核苷酸實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，是一種實現微生物種群鑑定的方法，具體涉及一種兩核苷酸實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法及其應用。
【背景技術】
[0002]微生物的鑑定在疾病預防和治療方面有廣泛的應用。快速、準確地檢測微生物在疾病傳染和抗菌治療中有重要的作用，尤其是少量致病微生物的檢測。例如，近年來肺結核疾病治療中抗藥株給治療帶來很大的困難，需要對菌株進行有效的鑑定，以便採取個體化用藥的針對性治療。常用的手段是將微生物系統分類發育標記分子(Phylogeneticmarkers)可變區進行PCR擴增分析。目前，基於系統分類發育標記分子的微生物鑑定方法普遍用於微生物的分離和鑑定。這些系統分類發育標記分子有16s rRNA、18s rRNA、rnpB、ropB、gyrB基因等。這些系統分類發育標記分子普遍存在於微生物中，既含有高度保守的序列區域，又有中度保守和高度變化的序列區域，因而它們適用於進化距離不同的各類生物親緣關係的研究。基於PCR擴增系統分類發育標記分子序列來鑑定微生物種群的方法主要有 Sanger 測序，焦憐酸測序，Real-TimePCR、PCR-DGGE (Denaturing Gradient GelElectrophoresis)>PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)等。其中，最準確的方法為Sanger測序、焦磷酸測序，即是將PCR產物的序列的鹼基信息完全測定，然後與菌株的特徵序列的鹼基信息進行比對來確定，這些將特徵序列的鹼基信息完全確認的測序方法被認為是金標準。然而，Sanger測序受特定設備的限制，需要到指定的場所進行測定，使得時間上受限。相對而言，焦磷酸測序需要的儀器價格便宜，簡易的焦測序儀甚至可以方便攜帶於現場進行分析。傳統的焦磷酸測序方法通過每次加入一種核苷酸進行實時合成測序。每次測序反應都能得到鹼基的具體信息。通過測序得到系統分類發育標記分子的序列，然後與資料庫中的菌株序列比對，鑑定具體的菌株。但是，對於傳統的焦測序平臺用於這些特定PCR產物的序列分析而言，在DNA模板量少，以及老舊的傳統焦測序儀器上，要準確獲取長度約為50bp的序列信息不僅費時，而且往往很難。所以，需要提出一種有效分離和鑑定微量微生物種群的方法。
[0003]本實驗室提出一種基於兩核苷酸實時合成測序的方法(ZL201210128597.9)，該方法通過同時加入未標記的兩種dNPTs實時測序，得到一組編碼。該方法中兩核苷酸測序方式可以有三種方式:AG/CT，AC/GT，AT/CG。採用該方法對PCR產物進行測序，要麼將PCR產物分為兩份，要麼對PCR產物焦測序之後再進行變性。前者，對PCR產物樣本的需求量大，不利於微量模板的檢測和鑑定。後者，產物變性會相應的增加測序步驟和測序時間，降低測序效率。但是 ，通過兩核苷酸同時加入到測序反應中，相同模板濃度的情況下，測序得到的峰譜信號比傳統焦測序的峰譜信號強，即峰高更高。這一特點有利於檢測微量樣本。另外，通過兩核苷酸同時加入到測序反應中，模板所需的測序反應次數會相應的減少，且不同模板在不同的測序方式下得到的峰譜信息不同，以及每次反應得到的峰譜信號強度也不同。所以，可以通過比較模板測序反應次數以及每次反應得到的峰譜信號強度來鑑定微生物。所以，我們提出一種基於兩核苷酸實時合成測序圖譜鑑定微生物的方法。
[0004]本發明的目的是提供一種微量微生物鑑定的方法。通過兩核苷酸同時加入到測序反應中，得到一系列峰譜信息圖。在峰譜圖中，不同模板所需的測序反應次數不同，且在不同的測序方式下得到的測序反應峰譜信號強度不同。通過這一原理可實現微生物菌群的鑑定。該方法能有效提高微生物鑑定的靈敏度、縮短操作時間、為微生物的分離和鑑定提供一種可靠的選擇。
【發明內容】
[0005]技術問題:本發明的目的是提供一種兩核苷酸實時合成測序圖譜實現微生物種群鑑定的方法。本發明為微生物種群的分類和鑑定提供了一種可行的檢測方法，有助於簡化微生物種群的鑑定。
[0006]技術方案:一種兩核苷酸循環實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法，通過對微生物特定可變區的待測核酸序列進行兩核苷酸循環的測序反應，由測序反應所得到的測序圖譜確定微生物具體的菌株；所述的兩核苷酸為dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP中的兩種不同的核苷酸，所述兩核苷酸循環測序反應指根據微生物不同菌株的特定可變區的待測核酸序列具有特定的測序 圖譜，從(dATPaS+dCTP )/ (dGTP+dTTP )、(dATPaS+dGTP )/ (dCTP+dTTP )、(dATPaS+dTTP ) / (dCTP+dGTP )三組中任意選擇其中一組進行的兩核苷酸循環測序反應，其中，dATPa S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate)是 dATP 的替代物，因為 DNA 聚合酶對dATP a S的催化效率比對dATP的催化效率高。所述的測序反應得到的測序圖譜包括參與合成反應的核苷酸種類(峰的類型)，以及合成核苷酸的數目(峰的高度或者信號強度)。
[0007]進一步地，所述的微生物特定可變區的待測核酸序列先通過PCR擴增後再進行兩核苷酸循環實時合成測序。所述測序圖譜的特徵包括峰的類型、峰的高度，以及峰的排列形式構成的全部信息。
[0008]進一步地，dNTPs合成實時釋放相同的檢測分子，其檢測分子是化學發光檢測的焦磷酸鹽，電化學檢測的氫離子或者光學檢測的螢光信號。
[0009]進一步地，微生物特定可變區在兩核苷酸組合測序方式(AG/CT，AT/CG和AC/GT)下，得到三組不同的測序峰譜信息。根據不同微生物種群的可變區需要進行不同次數的兩核苷酸合成反應，以及不是每次測序反應都能得到相同的測序信號強度，我們即可鑑定出該序列所屬的菌株。
[0010]如果兩種菌株在一種測序方式下(AG/CT，AT/CG和AC/GT中的任意一種)得到的峰譜信息圖完全相同，則可以選擇其他兩種中任意一種測序方式進行鑑定；如果兩種菌株的特定可變區在AG/CT，AT/CG和AC/GT的測序方式下，得到的菌株都相同(這種情況下可變區完全相同，傳統測序的方法也無法鑑定)，可以選擇其他可變區進行測序。
[0011]有益效果:
[0012]本發明應用兩核苷酸同時加入到測序反應中，測定微生物菌群的特定可變區，根據不同微生物菌群特定的可變區需要不同數目的測序次數，以及不同微生物菌群特定的可變區得到不同測序峰譜信息的原理，不同種、不同屬的微生物都能準確地鑑定出來。
[0013]1.本發明通過結合菌株測序所需的反應次數以及每次測序所得的信號強度來進一步鑑定微生物。[0014]2.本發明直接採用商品化、非標記的天然核苷酸進行合成測序，在提高測序長度的同時還降低了測序成本。
[0015]3.本發明的最大優點是按照微生物種群測序所得到的峰譜信息鑑定微生物種群。
[0016]4.本發明與傳統測序方法分離鑑定微生物種群相比，不僅減少反應次數，而且對少量樣本具有較高的靈敏性，可以用於微量樣本的種群鑑定。
[0017]5.本發明操作簡單。它可以在任何基於合成測序的測序平臺進行，操作簡單、易行。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是本發明兩核苷酸實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的流程圖。選定待測菌群的可變區(a)作為測序靶點。例如，選擇rnpB (RNase P RNA)基因作為測序靶點。測序靶點的選擇要具備以下兩個條件:(I)普遍存在於微生物中；(2 )既含有高度保守的序列區域，又有中度保守和高度變化的序列區域。理論上根據各菌群的部分可變區核苷酸序列進行兩核苷酸實時合成測序圖譜預測，得到各可變區焦測序後的峰譜信息圖。該峰譜信息圖包括參與反應的鹼基種類、個數以及測序峰高(即信號強度)。
[0019]提取菌群的DNA模板，在聚合酶作用下PCR擴增部分可變區。PCR產物的5』端固定在載體上，測序引物與固定的PCR產物雜交進行焦磷酸測序。測序方式從(((^1?0 5+(?^?)/ (dCTP+dTTP )、(dATP a S+dCTP ) / (dGTP+dTTP )、(dATP a S+dTTP ) / (dCTP+dGTP ))三種中任選一種。這裡以(dATP a S+dGTP) / (dCTP+dTTP)的測序方式為例。首先，按照dATP a S/dGTP=l的比例將兩核苷酸加入，在聚合酶作用下反應進行焦磷酸測序。其次，再按照dCTP/dTTP=l的比例將兩核苷酸加入，在聚合酶作用下反應進行焦磷酸測序。不斷循環加入(dATP a S+dGTP)/ (dCTP+dTTP)`進行焦磷酸測序，直到得到一組含有鹼基種類、信號強度測序圖譜為止(b)。測序時通過對核苷酸合成後產生的特定分子濃度(如焦磷酸鹽，氫離子或者光學檢測的螢光分子等)通過轉化為光、電等信號進行實時檢測，得到該次測序反應測定的包含鹼基種類、個數以及峰高信息的測序峰譜圖。
[0020]根據測序圖譜信息，比較待測菌群的測序反應數目。首先，如果圖譜中測序反應總次數相同(C)，則比較每次測序得到的信號強度。依次從第1次測序反應的信號強度開始比較。如果第I~n次反應所得的信號強度相同，則比較第n+1次測序反應的信號強度，直到信號強度不同為止。然後，再與預測的峰譜信息作比較，由此可以依次確定不同菌株。如果測序反應總次數不同(d)，則直接與預測得到的菌株測序峰譜信息比較，從第1次測序得到的峰譜信息開始比較，直到可以確定具體的菌株(e)。
[0021]如果某兩種菌株在特定測序方式下(AG/CT，AT/CG和AC/GT中的任意一種)得到的峰譜信息完全相同，則可以選擇其他兩種中的任意一種測序方式進行鑑定；如果某兩種菌株的特定可變區在AG/CT、AT/CG和AC/GT三種測序方式下得到的菌株峰譜信息都相同(這種情況下可變區完全相同，傳統測序方法也無法鑑定)，可以選擇其他可變區進行測序。
[0022]圖2是模擬兩核苷酸實時合成測序得出的13種分支桿菌(M.paratuberculosis、M.tuberculosis、M.gastr1、M.kansasi1、M.marinur、M.gordonae、M.malmoense、M.leprae、M.1ntracellular、M.xenop1、M.celatum、M.fortuitum、M.smegmatis)部分 rnpB 基因焦測序所得的峰譜信息預測圖。該圖模擬了循環加入(dATPa S+dTTP)以及(dGTP+dCTP)的混合物進行兩種核苷酸實時合成焦測序得到的測序圖譜。圖譜中，橫坐標表示每次測序反應所加入的兩種核苷酸的種類為(dATPa S+dTTP)和(dGTP+dCTP)。AT代表加入dATP a S和dTTP的混合物進行測序。同理，GT代表加入dGTP和dTTP的混合物進行測序；縱坐標表示每次測序反應得到的峰譜信號強度(即峰的高度或者合成的鹼基數目)。
[0023]圖3為M.paratuberculosis以及M.celaturn菌株的兩核苷酸實時焦測序所獲得的峰譜信息圖。該圖為循環加入(dATPa S+dCTPs)以及(dGTP+dTTP)兩核苷酸的混合物進行實時焦磷酸測序。該圖中，橫坐標為循環加入的測序方式為:AC/GT。其中，A代表加入dATP a S和dCTP的混合物進行測序。同理，T代表加入dGTP和dTTP的混合物進行測序。縱坐標表示測序反應的信號強度。峰譜上方的標註表示峰的信號強度和加入反應的兩核苷酸種類，如AC2表示加入dATP a S和dCTP的混合物進行焦測序，且測序得到的信號強度是2 ；GT1表示加入dGTP和dTTP的混合物進行焦磷酸測序，且測序得到的信號強度是I。
[0024]其中， 及反應所需的酶購自凱傑生物技術(上海)有限公司(QIAGENChina(Shanghai)C0.，Ltd),實驗中所用的菌株來東南大學中大醫院結核病患者的臨床分離株。
【具體實施方式】
[0025]實施例一:兩核苷酸實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法
[0026]1.13種分支桿菌(Mycobacteriumsp.) rnpB基因峰譜預測
[0027]以 13 種分支桿菌(M.paratuberculosis、M.tuberculosis、M.gastr1、M.kansasi1、M.marinur、M.gordonae、M.malmoense、M.leprae、M.1ntracellular、M.xenop1、M.celatum、M.fortuitum、M.smegmatis)為例，闡述兩核苷酸實時測序峰譜鑑定微生物種群的方法。該例中選取rnpB基因作為測序靶點。這13種分支桿菌的部分rnpB基因可變區的序列如表1所示。首先，根據菌株的基因序列預測這13種分支桿菌屬的部分rnpB基因可變區在兩核苷酸實時合成測序的情況下得到的峰譜信息。
[0028]表1各菌株部分可變區序列
[0029]
【權利要求】
1.一種兩核苷酸循環實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法，其特徵在於，通過對微生物特定可變區的待測核苷酸序列進行兩核苷酸循環的測序反應，由測序反應所得到的測序圖譜確定微生物具體的菌株；所述的兩核苷酸為dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP中的兩種不同的核苷酸，所述兩核苷酸循環測序反應指從(dATPaS+dCTP) / (dGTP+dTTP)、(dATPaS+dGTP) / (dCTP+dTTP)、(dATPaS+dTTP) / (dCTP+dGTP)三組中選擇其中一組進行兩核苷酸循環測序反應，所述的測序反應得到的測序圖譜包括參與合成反應的核苷酸種類(峰的類型)，以及合成核苷酸的數目(峰的高度或者信號強度)。
2.根據權利要求1所述的一種兩核苷酸循環實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法，其特徵在於，所述的微生物特定可變區的待測核酸序列先通過PCR擴增後再進行兩核苷酸循環實時合成測序。
3.根據權利要求1所述的一種兩核苷酸循環實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法，其特徵在於，所述測序圖譜的特徵包括峰的類型、峰的高度，以及峰的排列形式構成的全部信息。
4. 根據權利要求1所述的一種兩核苷酸循環實時合成測序圖譜鑑定微生物種群的方法，其特徵在於，dNTPs合成實時釋放相同的檢測分子，其檢測分子是化學發光檢測的焦磷酸鹽，電化學檢測的氫離子或者光學檢測的螢光信號。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740824SQ201410009116
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】肖鵬峰, 浦丹 申請人:東南大學