用於同源重組的線性sumo載體的構建方法
2024-04-07 08:49:05
用於同源重組的線性sumo載體的構建方法
【專利摘要】本發明公開了用於同源重組的線性SUMO載體的構建方法,包括如下步驟:(1)合成DNA片段,其中含有限制性內切酶識別位點和SUMO標籤的核苷酸序列;(2)設計帶有限制性內切酶識別位點的引物,擴增DNA片段,雙酶切,回收;(3)PCR方法擴增pET表達載體,雙酶切,回收;(4)產物連接,得到載體前體;用限制性內切酶SfoI或MscI消化載體前體,得到用於同源重組的線性SUMO載體。本發明可以以商品化pET表達載體為基礎,基礎載體選擇面廣,方便靈活,重複性強,獲得的用於同源重組的線性SUMO載體使用方便,方法方便快捷,不會發生載體自連現象,是表達SUMO融合蛋白的有力工具。
【專利說明】用於同源重組的線性SUMO載體的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程【技術領域】,特別是涉及一種用於同源重組的線性SUM0載體 的構建方法。
【背景技術】
[0002] 基因重組技術是現代基因工程研究的一項基本技術,這種操作可把特定的基因整 合到載體上,並使之在受體細胞中增值表達。分離純化供體生物遺傳物質,用PCR擴增方法 在兩端加上特定限制酶識別位點,酶切處理後與適當載體連接,形成重組分子,然後轉入受 體細胞中增值表達。
[0003] 為了方便表達產物純化,一般在目的蛋白之前加上特定標籤,但有些蛋白的活性 受標籤影響較大,需要在純化後將標籤切除。SUM0蛋白酶以非常特異的方式切割重組蛋白 的SUM0標籤,因此含SUM0標籤的表達載體應用廣泛。但目前的使用方法均為在目的蛋白 基因兩端設計與載體相同的酶切位點,載體和目的基因分別雙酶切後純化回收,再將目的 序列和載體經T4DNA連接酶連接,轉入宿主細胞。操作繁瑣,成本較高。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是克服現有技術的不足,提供一種用於同源重組的SUM0載體的構 建方法。
[0005] 本發明的技術方案概述如下:
[0006] -種用於同源重組的線性SUM0載體的構建方法,包括如下步驟:
[0007] (1)合成SEQ ID NO. 1所示的第一合成片段,所述第一合成片段的第439-444的 6個核苷酸為限制性內切酶Sfol識別序列,第151-441的291個核苷酸為改進後的第一種 SUM0標籤的核苷酸序列;
[0008] (2)設計帶有限制性內切酶識別位點的引物,PCR方法擴增第一合成片段,使第一 合成片段兩端帶有限制性內切酶識別位點,雙酶切,回收;
[0009] (3)設計帶有與步驟⑵相同的限制性內切酶識別位點的引物,PCR方法擴增pET 表達載體,得到兩端帶有限制性內切酶識別位點的? promoter、T7 terminator外側的線 性PCR產物,雙酶切,回收;
[0010] (4)將步驟(2)和步驟(3)回收的產物連接,得到第一種載體前體;用限制性內切 酶Sfol消化第一種載體前體,得到用於同源重組的線性SUM0載體。
[0011] pET 表達載體優選:pET28a、pET28b 或 pET42a。
[0012] 另一種用於同源重組的線性SUMO載體的構建方法,包括如下步驟:
[0013] (1)合成SEQ ID N0. 2所示的第二合成片段,所述第二合成片段的第438-443的 6個核苷酸為限制性內切酶MscI識別序列,第151-440的290個核苷酸為改進後的第二種 SUM0標籤的核苷酸序列;
[0014] (2)設計帶有限制性內切酶識別位點的引物,PCR方法擴增第二合成片段,使第二 合成片段兩端帶有限制性內切酶識別位點,雙酶切,回收;
[0015] (3)設計帶有與步驟⑵相同的限制性內切酶識別位點的引物,PCR方法擴增pET 表達載體,得到兩端帶有限制性內切酶識別位點的? promoter、T7 terminator外側的線 性PCR產物,雙酶切,回收;
[0016] (4)將步驟(2)和步驟(3)回收的產物連接,得到第二種載體前體;用限制性內切 酶MscI消化第二種載體前體,得到用於同源重組的線性SUM0載體。
[0017] pET 表達載體優選:pET28a、pET28b 或 pET42a。
[0018] 本發明的優點:本發明可以以商品化pET系列表達載體為基礎,基礎載體選擇面 廣,方便靈活,重複性強,可按照實驗室現有載體情況選擇限制性內切酶Sfol或限制性內 切酶MscI進行酶切。以pET28a載體為例,該載體上沒有限制性內切酶MscI識別序列,因 此不用進行突變,將合成片段與PET表達載體PCR擴增產物連接獲得質粒,用限制性內切酶 MscI酶切質粒即可獲得用於同源重組的線性SUM0載體。
[0019] 若所選載體中含有相應的限制性內切酶識別序列,首先將合成片段與pET表達載 體PCR擴增產物連接獲得質粒,再進行點突變,將多餘限制性內切酶識別序列去除之後,用 限制性內切酶Sfol或限制性內切酶MscI酶切質粒即可獲得用於同源重組的線性SUM0載 體。
[0020] 以本發明的構建方法獲得的用於同源重組的線性SUM0載體使用方便,和帶有多 克隆位點的SUM0環狀載體相比省去了現有雙酶切載體和目的蛋白核酸序列,然後回收酶 切產物,再進行載體和目的片段的體外連接等步驟,本發明只需將載體及目的片段以線性 的形式轉入載體進行同源重組連接,方法方便快捷,不會發生載體自連現象,是表達SUM0 融合蛋白的有力工具。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例2同源重組菌落PCR檢測。其中,第1道為200bp ladder第2至8 道為菌落PCR結果。
[0022] 圖2為實施例4同源重組菌落PCR檢測。其中,第1道為200bp ladder第2至8 道為菌落PCR結果。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0024] 下述的實施例不以任何形式限制本發明,凡採用等同替換或等效變換的方式所獲 得的技術方案,均落在本發明的保護範圍。
[0025] 為方便起見選擇帶有適合於後期目的蛋白表達標記基因的載體,載體中如果帶有 T7promoter、T7 terminator基因則在其兩端設計引物,PCR產物為除去T7 promoter、T7 terminator之外的全部序列,並在引物5'端設計限制性內切酶識別位點,如Hind III內切 酶識別位點AAGCTT和EcoRI內切酶識別位點GAATTC,PCR後回收純化線性載體前體。
[0026] 下面各實施例中的合成片段和引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0027] 實施例1
[0028] -種用於同源重組的線性SUM0載體的構建方法,包括如下步驟:
[0029] (1)合成SEQ ID NO. 1所述的第一合成片段;第一合成片段的第439-444的6個 核苷酸為限制性內切酶Sfol識別序列,第151-441的291個核苷酸為改進後的第一種SUM0 標籤的核苷酸序列;
[0030] (2)設計第一人工合成序列引物,第二上遊引物為: CCAAGCTTCGATCCCGCGAAATT(SEQ ID N0. 5 所示)帶有 Hind III 內切酶識別位點 AAGCTT,第 二下遊引物為:
[0031] CGGAATTCCAAAAAACCCCTCAAGA(SEQ ID N0. 6 所示)帶有 EcoRI 內切酶識別位點 GAATTC,用Phiision?超保真PCR Master Mix擴增目的片段。反應體系如下:
[0032] 第…人丨:介成)V段(SEQ丨DN0.丨)丨OOpg/μΙ ΙμΙ ΙΟμΜ第:丨遊引物 ΙμΙ !?)μΜ第:下遊引物 ΙμΙ 2x Phusion Master Mix 25μΙ 水 22μ1 總體枳 50μ1 反應程印:98 Γ 30s 981: 10s 70r 15s 72 Γ 30s 30個循'環 72'.C 5min
[0033] 用上海生工SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒,回收PCR產物。
[0034] (3)選擇商品化載體pET28a,設計引物,第一上遊引物為:
[0035] CCAAGCTTCGATCCTCTACGCC(SEQ ID N0. 3 所示),帶有 Hind III 內切酶識別位點 AAGCTT ;第一下遊引物:CGGAATTCCTGAAAGGAGGAACTAT(SEQ ID N0. 4 所示)。帶有 EcoRI 內 切酶識別位點GAATTC,用Phusion?超保真PCR Master Mix擴增目的片段,Phusion?超保 真 PCR Master Mix 購自 NEW ENGLAND BioLabs,反應體系如下:
[0036] pET28a lOOpg/μΙ ΙμΙ 10μΜ第--上遊引物 ΙμΙ 10μΜ第--下遊引物 1神 2x Phusion Master Mix 25μΙ 水 22μ1 總體枳 50μ1 反應程序:98 °C 30s 98 °C 10s 65 °C 15s
[0037] 72 ? 3min 30個循環 1TC 5mm
[0038] 用上海生工SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒,回收PCR產物(兩端帶有限制性 內切酶識別位點的T7 promoter、T7 terminator外側的線性PCR產物)。
[0039] (4)用限制性內切酶Hind III和EcoR I分別對步驟(2)、(3)的PCR產物進行酶 切,反應體系如下:
[0040] NEBuffcr(10x) 5μΙ HindM(10U4il) Ιμ? EcoR I (lOU/μ!) ΙμΙ 步驟(2)產物(步驟(3)產物) 10μΙ 水 33μΙ 總體積 50μ1
[0041] 反應條件為37°C 3小時。用上海生工SanPr印柱式PCR產物純化試劑盒,回收酶 切產物。
[0042] (5)用T4 DNA連接酶將酶切產物連接,T4 DNA連接酶購自NEW ENGLAND BioLabs, 反應體系如下:
[0043] 10x T4 DNA ligase Buffer 2μ1 瞻切後的步 (2)產物 5μ1 _切後的步_ (3)產物 2μ1 Τ4 DNA ligase ΙμΙ 水 10μ! 總體積 20μΙ
[0044] 反應條件為16°C 16小時,得到連接產物(第一種載體前體)。
[0045] (6)將連接產物轉化大腸桿菌DH5a菌株感受態細胞,先在液體LB培養基中 37°C,300rpm培養1小時後,在50ng/ml kan抗性LB固體平板培養基上進行篩選,獲得陽性 轉化子。並將陽性轉化子接種於含有50ng/ml kan的液體LB培養基中,在37°C搖床中振蕩 培養過夜。利用生工生物工程(上海)有限公司所生產的"SanPrep柱式質粒DNA小量抽 提試劑盒"按照其操作說明提取質粒DNA。
[0046] (7)序列中除了第一種SUM0標籤核苷酸序列末端的限制性內切酶Sfol識別序 列外,還有4個限制性內切酶Sfol識別序列GGCGCC,依次設計引物將這4個GGCGCC改為 GGAGCC,用高保真DNA聚合酶擴增,回收擴增產物,平末端連接。引物序列如下:
[0047] 第三上遊引物:TCCCAATACGCAAACCGCC(SEQ ID N0. 7)
[0048] 第三下遊引物:GCCAGGGTGGTTTTTCTTTTC(SEQ ID Ν0· 8)
[0049] PCR反應體系及程序參照步驟(3)(用第三上、下遊引物替換第一上、下遊引物), 純化回收PCR產物,用T4 PNK酶進行磷酸化修飾,T4 PNK購自NEW ENGLAND BioLabs,再 用T4 DNA連接酶連接,連接反應參照步驟(5),將連接產物轉化大腸桿菌DH5a菌株感受 態細胞,先在液體LB培養基中37°C,300rpm培養1小時後,在50ng/ml kan抗性LB固體平 板培養基上進行篩選,獲得陽性轉化子。並將陽性轉化子接種於含有50ng/ml kan的液體 LB培養基中,在37°C搖床中振蕩培養過夜。利用生工生物工程(上海)有限公司所生產的 "SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒"按照其操作說明提取質粒DNA。
[0050] T4 PNK磷酸化修飾反應條件如下:
[0051] T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer 10x 5μ1 PCR 產物 10μ1 ΑΤΡΙΟηιΜ 5μ! T4 Polynucleotide Kinase Ιμ? 水 29μ1 總體積 50μ1
[0052] 反應條件為37°C,30min,產物可直接用於連接。
[0053] (8)繼續修改內切酶Sfol識別序列GGCGCC,引物如下:
[0054] 第四上遊引物:TCCATCTCCTTGCATGCACCA(SEQ ID N0. 9)
[0055] 第四下遊引物:GCCCAACAGTCCCCCGG(SEQ ID Ν0· 10)
[0056] 第五上遊引物:TCCTATATCGCCGACATCACCG(SEQ ID Ν0· 11)
[0057] 第五下遊引物:GCCAGCAACCGCACCTGTG(SEQ ID NO. 12)
[0058] 第六上遊引物:TCCACAGGTGCGGTTGCTG(SEQ ID NO. 13)
[0059] 第六下遊引物:GCCGGTGATGCCGGCC(SEQ ID NO. 14)
[0060] 用上述引物依次替換步驟(7)中的引物,其它同步驟(7)。
[0061] (9)經過步驟(7)和步驟⑶的突變過程,只剩下第一種SUM0標籤核苷酸序列末 端的限制性內切酶Sfol識別序列GGCGCC,用Sfol酶切質粒DNA即得到第一種用於同源重 組的線性SUM0載體。
[0062] Sfol反Μ體系如卜: NEBuiTer(lOx) 5μΙ Slol I μ丨 步驟(8)產物 10μΙ 水 3φ1 總缽積 50μ1
[0063] 反應條件為37°C 3小時。用上海生工SanPr印柱式PCR產物純化試劑盒,回收酶 切產物即得到第一種用於同源重組的線性SUM0載體。
[0064] pET表達載體選用pET28b時,設計相應的引物,採作本實施例的方法,可以製備得 到相應的用於同源重組的線性SUM0載體。
[0065] pET表達載體選用pET42a時,設計相應的引物,採作本實施例的方法,可以製備得 到相應的用於同源重組的線性SUMO載體。
[0066] 實施例2
[0067] 以綠色螢光蛋白GFP為例,以同源重組的方式構建SUM0-GFP融合蛋白。
[0068] (1)設計引物擴增GFP基因,並在兩端帶有線性SUM0載體的同源區域,第七上遊引 物為:AGATTGGTGGCATGGTGAGCAAG(SEQ ID N0. 15 所示),第七下遊引物為:AGATCCGGCTGCTA TTACTTGTACAGCT(SEQ ID N0. 16 所示)
[0069] PCR反應體系如下:
[0070]
【權利要求】
1. 一種用於同源重組的線性SUMO載體的構建方法,其特徵是包括如下步驟: (1) 合成SEQ ID NO. 1所示的第一合成片段,所述第一合成片段的第439-444的6個 核苷酸為限制性內切酶Sfol識別序列,第151-441的291個核苷酸為改進後的第一種SUMO 標籤的核苷酸序列; (2) 設計帶有限制性內切酶識別位點的引物,PCR方法擴增第一合成片段,使第一合成 片段兩端帶有限制性內切酶識別位點,雙酶切,回收; (3) 設計帶有與步驟(2)相同的限制性內切酶識別位點的引物,PCR方法擴增pET表 達載體,得到兩端帶有限制性內切酶識別位點的? promoter、T7 terminator外側的線性 PCR產物,雙酶切,回收; (4) 將步驟(2)和步驟(3)回收的產物連接,得到第一種載體前體;用限制性內切酶 Sfol消化第一種載體前體,得到用於同源重組的線性SUMO載體。
2. 根據權利要求1所述的一種用於同源重組的線性SUMO載體的構建方法,其特徵是所 述 pET 表達載體為 pET28a、pET28b 或 pET42a。
3. -種用於同源重組的線性SUMO載體的構建方法,其特徵是包括如下步驟: (1) 合成SEQ ID NO. 2所示的第二合成片段,所述第二合成片段的第438-443的6個 核苷酸為限制性內切酶MscI識別序列,第151-440的290個核苷酸為改進後的第二種SUMO 標籤的核苷酸序列; (2) 設計帶有限制性內切酶識別位點的引物,PCR方法擴增第二合成片段,使第二合成 片段兩端帶有限制性內切酶識別位點,雙酶切,回收; (3) 設計帶有與步驟(2)相同的限制性內切酶識別位點的引物,PCR方法擴增pET表 達載體,得到兩端帶有限制性內切酶識別位點的? promoter、T7 terminator外側的線性 PCR產物,雙酶切,回收; (4) 將步驟(2)和步驟(3)回收的產物連接,得到第二種載體前體;用限制性內切酶 MscI消化第二種載體前體,得到用於同源重組的線性SUMO載體。
4. 根據權利要求3所述的一種用於同源重組的線性SUMO載體的構建方法,其特徵是所 述 pET 表達載體為 pET28a、pET28b 或 pET42a。
【文檔編號】C12N15/66GK104140976SQ201410389646
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月8日 優先權日:2014年8月8日
【發明者】田方, 張濤, 徐彬 申請人:天津謙泰生物技術有限公司