一種油菜菌核病的早期快速分子檢測方法

2024-04-06 22:32:05 1

專利名稱：：一種油菜菌核病的早期快速分子檢測方法
技術領域：
：本發明屬於植物病害的分子檢測檢測領域，具體涉及一種油菜菌核病的早期快速分子檢測方法。
背景技術：
：由核盤菌[&/"0""/。《;/^油'0'加(1^.)(^8317]引起的油菜菌核病，是我國油菜生產中的首要病害，在長江流域廣大油菜種植區尤其嚴重。一般年份油菜菌核病發病率為10°/。30%，嚴重時發病率會達到80%，造成油菜產量減少10%70%，含油量降低1%5%，給廣大農民造成高達數億元的經濟損失。近年來隨著油菜耕作制度的改變，如免耕法的應用，增加了菌核的越冬存活率；"雙低"油菜的大面積推廣，造成栽培品種的單一，對菌核病的抗性降低，油菜菌核病的發生呈逐年上升的趨勢，帶來的經濟損失也逐年加重。油菜各生育階段均可感染菌核病，但以花期最為敏感。油菜的花瓣防禦機制薄弱，極易被核盤菌的子囊孢子感染。春季氣候潮溼，病花瓣迅速腐爛，掉落在植株其他部位引起新的病斑，並迅速擴展形成菌核病的大爆發。這是核盤菌侵染油菜的主要方式。而化學農藥難以抵達油菜菌核病的主要侵害部位(如油菜的莖幹)，使得病害爆發後的治理效果不理想。但針對油菜菌核病發病的早期，我國目前仍缺乏快速靈敏準確的檢測和鑑定技術。傳統的微生物學檢測鑑定方法需要經過病原物分離、培養和生物學特徵分類，費時費力、工作量大，而且比田間病害發展提前不了多少時間，難應用於生產上預測預報。因此，研究油菜菌核病發病早期快速靈敏準確的檢測鑑定技術，並應用於菌核病的預測預報中，必將有利亍袖菜菌核病的田間綜合管理，促進我國油菜種植業的增產增收。
發明內容本發明的目的旨在提供一種油菜菌核病病發病早期的快速分子檢測方法，以實現對油菜菌核病發病早期的快速檢測，為油菜菌核病的田間綜合管理提供科學、準確的預測預報。本發明的技術方案包括下列步驟1.採集油菜花瓣先將1.5mlEppendorf管滅菌，將待測的隨機取樣于田間凋謝的油菜花瓣，按一片花瓣裝入一個Eppendorf管，將採集的花瓣樣本置於-80'C冰箱中冷凍；2.提取油菜花瓣總DNA:將裝有油菜花瓣的Eppendorf管從-8(TC冰箱中取出，迅速加入200jil抽提緩衝液，使之浸沒過花瓣；用家用微波爐的低火檔加熱所述的樣本，處理時間和順序依次為20s'20s'15s，以樣本不沸騰為宜；從所述微波爐中取出樣本後立即再加入200nl抽提緩衝液；80'C水浴5min，中間輕輕搖晃一次；分別加入200nl苯酚和200W氯仿'輕輕混勻；於l2，000rpm離心10min,取上清液，加入800nl-20。C預冷的無水乙醇，輕輕混勻，靜置沉澱20min;於12,000rpm離心10min,棄上清，取沉澱置於37。C下乾燥約10min;加入15nlddH20，3rC下靜置約5min'沉澱溶解'得到油菜花瓣總DNA;3.巢式PCR反應第一次PCR:以ITS4/1TS5為引物進行第一次PCR,擴增反應體系為PCRbuffer,10pmol引物ITS4，lOpmol引物ITS5，0.5UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，10^l步驟(2)製備的油菜花瓣總DNA，以ddH20補足25nl，將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增；PCR反應參數為95'C4min;94°C30s,50。C45s,72。C30s，30個循環；72。C延伸10min。第二次PCR:以XJJ21/XJJ222為引物的第二次PCR，擴增反應體系為PCRbuffer,10pmol引物XJJ21,10pmol引物XJJ222，0.5UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，1h1第—次PCR產物，以ddH20補足25pl;將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增，PCR反應參數為95°C4min;94°C30s，63°C30s，72°C30s，30個循環；72。C延伸10min;4.PCR擴增產物分析取4nl第二次PCR擴增產物，加入1^上樣緩衝液，混勻，在1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠中、5V/cm下電泳30min,用溴化乙錠(EB)染色15min後，在凝膠成相系統上成像；5.結果判定將瓊脂糖凝膠置於紫外光下，判定是否存在一條大小為292bp的目的條帶。其中步驟2所述的抽提緩衝液成分2%十六烷基三乙基溴化銨(w/v)，2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，1.4M氯化鈉，0.1M三羥甲基氨甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH8.0)，0.02M乙二胺四乙酸(EDTA);步驟3所述的T叫DNA聚合酶和步驟4所述的上樣緩衝液購自寶生物工程(大連)有限公司，即TAKARA公司，下同。步驟3所述的本發明設計的特異引物序列如下ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3';ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3';XJJ21:5，-GTTGCTTTGGCGTGCTGCTC-3''，XJJ222:5'-CTGACATGGACTCAATACCAATCTG-3';步驟4所述的電泳緩衝液(5XTBE)成分為Tris54g,硼酸27.5g,加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml,定溶至1000ml;工作濃度為0.5XTBE。本發明設計了一套核盤菌特異性引物，並成功建立了一種油菜菌核病發病早期的快速檢測方法。與其它檢測方法相比，本發明具有如下優點1.採用本發明，可以特異性檢測出核盤菌。本發明中設計的特異性引物不僅可以區分屬於親緣關係較遠的不同屬的常見植物葉部病原真菌，如交鏈孢屬的鏈格孢黴、鐮孢屬的未谷鐮孢菌和盾殼黴屬的核盤菌菌核寄生真菌盾殼黴，而且可以區分與核盤菌同屬於子囊菌亞門、盤菌綱、柔膜菌目的常見、重要植物葉部病原真菌葡萄孢屬的多個種的真菌，參見附圖l。而在"Apolymerasechainreaction(PCR)assayforthedetectionofinoculumof&/ero""/"sc/eroft'ora附"FreemanJ，WardE,CarderonC，EuropeanJournalofPlantPathology,2002,108:877-88一文中設計並被其它文章廣泛引用的核盤菌特異性引物"SSREV"和"SSFWD"事實上並不能區分核盤菌屬和葡萄孢屬，如附圖2(具體實驗步驟參考原文內容)。文獻所述的引物對應序列為ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'SSREV:5'-TGACATGGACTCAATACCAAGCTG-3'SSFWD:5'-GCTGCTCTTCGGGGCCTTGTATGC-3'2.採用本發明，可以檢測下限至lfg4tl的核盤菌DNA,其靈敏度高。而傳統的微生物學檢測方法則不能達到這個靈敏度。3.採用本發明方法檢測十分快速，7小時內即可得到準確的檢測結果，並可以適時跟蹤病害的發生發展情況，並進行及時的預測預報。而傳統的微生物學檢測則至少需要2天至l個星期以上。圖1:是本發明所設計特異性引物對核盤菌及其它真菌分離物總DNA的擴增結果泳道M:100bpDNAmarker,分子量標準從上至下依次為3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp(為Fermentas公司產品，目錄號SM0321)。泳道1-22分別為表1所述待檢測分離物SUN-F-M、SZ-14、SZ-254、SSSZ-25、SSXG-3、SSXG-25、EP-固Aa、Let-19、Ywd-A、2003-4-1、GariicBc-5、Peonybc-2、Canbc-2、Canbc-6、GarlicBc陽16、GarlicBc-8、GarlicBc-2、LilyBc-2、ZS-1、Chy-l、WH-3和XGGZ-1。泳道23:陰性對照。圖2:在"Apolymerasechainreaction(PCR)assayforthedetectionofinoculumof&/erof/"z'asc/eraft'oww"一文中設計的核盤菌特異性引物"SSREV"和"SSFWD"對核盤菌及其它真菌分離物總DNA的擴增結果泳道M:100bpDNAmarker(為Fermentas公司產品)，產品描述如上。泳道1-22分別為表1所述待檢測分離物SUN-F-M、SZ-14、SZ-254、SSSZ-25、SSXG-3、SSXG-25、EP-lPNAa、Let-19、Ywd-A、2003-4-1、GarlicBc-5、Peonybc-2、Canbc-2、Canbc-6、GarlicBc-16、GarlicBc-8、GarlicBc-2、LilyBc-2、ZS-l、Chy-l、WH-3和XGGZ-1。泳道23:陰性對照。圖3:本發明所設計引物對核盤菌總DNA檢測的靈敏度的擴增結果其中，圖3-1為核盤菌總基因組DNA濃度為10fg/pl時的擴增結果泳道M:100bpDNAmarker(為Fermentas公司產品)，產品描述如上。泳道1-9分別為9個重複。泳道10為陽性對照；泳道11為陰性對照。圖3-2為核盤菌總DNA濃度為1fg/nl時的擴增結果泳道M:100bpDNAmarker(為Fermentas公司產品)，產品描述如上。泳道l-9分別為9個重複。泳道10為陽性對照；泳道11為陰性對照。圖4:對油菜田中的凋落花瓣隨機抽樣檢測結果泳道M:100bpDNAmarker(為Fermentas公司產品)，產品描述如上。泳道1-10分別為10個隨機樣本。泳道11為陽性對照；泳道12為陰性對照。圖5:以ITS4/ITS5為引物對核盤菌屬菌株SUN-F-M進行PCR擴增得到的片段序列，方框內的鹼基為引物。圖6:以ITS4/ITS5為引物對葡萄孢屬菌株Canbc-2進行PCR擴增得到的全序列，方框內的鹼基為引物。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明，但不是對對本發明的限制。實施例1:檢測本發明設計的特異引物對核盤菌及其它真菌分離物的特異性試驗1.真菌分離物及真菌菌絲的培養參見表1列舉的核盤菌及其它真菌分離物及其採集地點。將真菌分離物接種於PDA培養基(配方及其製作方法用常規方法，即用去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g和少量蒸餾水煮製，補充蒸餾水至1000ml)上，20。C培養，活化2-3次。再用直徑為5mm的打孔器打出含菌絲的瓊脂塊，接種於鋪玻璃紙的PDA平板上，48h後刮取適量菌絲於-20'C凍存。表1待檢測分離物採集地點及分子檢測結果菌株編號分類名稱種名寄主採集地點檢測結果tableseeoriginaldocumentpage7SSSZ-25核盤齒油菜湖北隨州+SSXG-3核盤菌油菜湖北孝感+SSXG-25核盤菌油菜湖北孝感+EP-lPNAa核盤菌多種植物黑龍江佳木斯+Let-19雪腐核盤菌萵苣湖北神農架+Ywd-A三葉草核盤菌豌豆湖北武漢+2003-4-1小核盤菌萵苣湖北神農架GarlicBc-5灰葡萄孢大蒜湖北武漢—Peonybc-2灰葡萄孢牡丹湖北武漢—Canbc-2灰葡萄孢油菜湖北宜昌一Canbc-6灰葡萄孢油菜湖北孝感_GarlicBc-16盲種葡萄孢大蒜湖北竹山—GarlicBc-8蔥腐葡萄孢大蒜湖北鄂州—GarlicBc-2蔥鱗葡萄孢X跡湖北武漢—■LilyBc-2橢圓葡萄孢百合湖北武漢—ZS-1盾殼黴核盤菌湖北竹山一Chy-1盾殼黴核盤菌湖北長陽—WH-3鏈格孢黴三葉草湖北武漢—XGGZ-1禾穀鐮孢菌小麥湖北孝感—上述待檢分離物採用植物病理學常用方法採集和分離;"+"表示可以檢測到292bp的目的條帶，"一"表示不能檢測到292bp的目的條帶。2.提取真菌分離物總DNA參考Sambrook等(Sambrook,J.,Frisch,E.F.，Maniatis，T.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,seconded.1989.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY),具體步驟如下稱取0.2g於-20'C中冷凍的真菌菌絲在液氮中充分研磨成粉末，轉入1ml65'C預熱的抽提緩衝液(配方參見前述《
發明內容》中所示)，顛倒混勻；65'C溫育5min,中間輕輕混勻兩次；加入等體積氯仿/苯酚(v/v=l/l)混勻，12,000rpm離心15min;取上清，再加入等體積氯仿/苯酚(v/v=l/l)再抽提一次；取上清，加入兩倍體積的-20'C預冷的無水乙醇，於室溫下靜置沉澱30min;12,000rpm離心10min，棄上清，再用-20。C預冷的70%乙醇洗兩遍，置37'C溫箱乾燥後，用TE溶解，得到真菌的總DNA，-2(TC保存。3.巢式PCR反應將步驟2中得到的總DNA提取液用ddH2O稀釋10倍，用於第一次PCR反應。第一次PCR:以ITS4/ITS5為引物(引物序列參照本說明書《
發明內容》)的第一次擴增反應體系包括PCRbuffer、lOpmol引物ITS4、lOpmol引物ITS5、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、1pl上述的真菌總DNA稀釋液，以ddH20補足25pl。將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增。PCR反應參數設置為95'C4min;94°C30s、50°C45s、72°C30s，30個循環；72。C延伸10min。將第一次PCR產物用ddH2O稀釋10倍，用於第二次PCR。第二次PCR:以XJJ21/XJJ222為引物(引物序列參照本說明書《
發明內容》)的第二次擴增反應體系包括PCRbuffer、lOpmol引物XJJ21、lOpmol引物XJJ222、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、1W第一次PCR產物稀釋液，以ddH20補足25pl。將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增。PCR反應參數設置為95°C4min;94。C30s、63°C30s、72°C30s，30個循環；72。C延伸10min。4.PCR擴增產物分析取4pl第二次PCR擴增產物，加入lnl上樣緩衝液(TAKARA，大連)，混勻，在1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠中進行電泳，用0.5xTBE作為電泳緩衝液(配方參見前述《
發明內容》中所示)，5V/cm下電泳30min，用溴化乙錠(EB)染色15min後，凝膠成相系統上成像。結果如圖l。如果樣本為核盤菌，在紫外光下就會出現一條292bp的目的條帶；如果不是，則不能擴增到同樣分子量的目的條帶。實施例2:檢測本發明設計的特異引物對核盤菌的靈敏度試驗1.核盤菌菌株SUN-F-M菌絲的培養將核盤菌菌株SUN-F-M菌絲接種於PDA培養基(配方參見前述《
發明內容》中所示)上，20'C培養，活化2-3次。再用直徑為5mm的打孔器打出含菌絲的瓊脂塊，接種於鋪玻璃紙的PDA(配方如前所述)平板上，24h後刮取適量菌絲於-2(TC冷凍。2.提取核盤菌菌株SUN-F-M的總DNA參考Sambrook等(Sambrook，丄，Frisch,E.F"Maniatis，T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,seconded.1989.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)，具體步驟如下稱取0.2g-20'C冷凍的菌絲在液氮中充分研磨成粉末，轉入lml65'C預熱的抽提緩衝液(配方參見前述《
發明內容》中所示)，顛倒混勻；65。C溫育5min，中間輕輕混勻兩次；加入等體積氯仿/苯酚(v/v=l/l)混勻，12,000rpm離心15min;取上清，再加入等體積氯仿/苯酚(v/v=1/1)再抽提一次；取上清，加入兩倍體積的-20。C預冷的無水乙醇，於室溫下靜置沉澱30min;12,000rpm離心10min，棄上清，再用-20。C預冷的70%乙醇洗兩遍，置37。C溫箱乾燥後，用TE溶解，得到核盤菌SUN-F-M的總DNA,-2(TC保存。3.紫外分光光度計測量核盤菌菌株SUN-F-M總DNA的濃度(1)取10nl步驟2中所提取的核盤菌菌株SUN-F-M總DNA，用ddH20稀釋50倍；(2)用ddH20作為空白，在波長260nm、280nm、310nm處調節紫外分光光度計讀數為零；(3)加入DNA稀釋液於三處波長處讀OD值，並記錄；(4)計算DNA濃度，公式如下[dsDNA;h50x(OD26o—ODM。)x稀釋倍數(以上濃度單位為|ig/ml)4.核盤菌菌株SUN-F-M總DNA稀釋採用x10稀釋法，用ddH20將步驟3中己測濃度的核盤菌菌株SUN-F-M總DNA稀釋成1000fg^U、100fg/|ul、10fg/nl、lfg/nl、0.1fg/nl，重複三次。5.巢式PCR反應將步驟4中得到的DNA稀釋液用於第一次PCR反應。第一次PCR:以ITS4/ITS5為引物(引物序列參照本說明書《
發明內容》)的第一次擴增反應體系包括PCRbuffer、lOpmol引物ITS4、lOpmol引物ITS5、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、10nl上述的核盤菌菌株SUN-F-M總DNA稀釋液，以ddH20補足25pl，每個處理設三個重複。將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增。PCR反應參數設置為95°C4min;94°C30s、50°C45s、72°C30s,30個循環；72。C延伸10min。第二次PCR:以XJJ21/XJJ222為引物(引物序列參照本說明書《
發明內容》)的第二次擴增反應體系包括PCRbuffer、lOpmol引物XJJ21、10pmol引物XJJ222、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、1|il第一次PCR產物，以ddH20補足25nl。將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增。PCR反應參數設置為95°C4min;94°C30s、63°C30s、72°C30s，30個循環；72。C延伸10min。6.二次PCR擴增產物分析取4nl二次PCR擴增產物，加入lnl上樣緩衝液(TAKARA，大連)，混勻，在1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠中進行電泳，用0.5xTBE作為電泳緩衝液(配方參見前述《
發明內容》中所示)，5V/cm下電泳30min，用溴化乙錠(EB)染色15min後，凝膠成相系統上成像。結果如圖3-l、3-2。如果核盤菌總DNA樣本量充分，在紫外光下就會出現一條292bp的目的條帶；如果核盤菌總DNA樣本量不充分，則不能擴增到同樣分子量的目的條帶。統計結果如表2，所設計的引物對核盤菌的檢測靈敏度可以達到1fg"l。表2本發明設計的特異引物對核盤菌的靈敏度檢測tableseeoriginaldocumentpage10"+"表示可以檢測到292bp的目的條帶，"一"表示不能檢測到292bp的目的條帶。實施例3:對大田中的油菜菌核病發病早期實施快速分子檢測的具體步驟1.採集油菜花瓣先將1.5mlEppendorf管滅菌。在待檢測的位於中國湖北省武漢市華中農業大學油菜田中劃分為4x4=16個小區，每個小區採用5點取樣法，樣本總量為80個。從油菜葉片上收集凋落的花瓣，一片花瓣裝入一個Eppendorf管中。-8(TC冰箱中凍存。2.提取油菜花瓣總DNA(1)將裝有花瓣的Eppendorf管從-80'C冰箱中取出，迅速加入200抽提緩衝液(配方參見前述《
發明內容》中所示)，使之浸沒過花瓣；(2)用家用微波爐的低檔火加熱，處理時間和順序依次為20s，20s，15s，以不沸騰為宜，從微波爐中取出後立即再加入200^il抽提緩衝液(配方參見前述《
發明內容》中所示)；(3)8(TC水浴5min,中間輕輕搖晃一次；(4)分別加入200nl苯酚和200^U氯仿，輕輕混勻；(5)12,000rpm離心10min，取上清液，加入800-20。C預冷的無水乙醇，輕輕混勻，靜置沉澱20min;(6)12,000rpm離心10min，棄上清，沉澱置丁'37。C下乾燥約10min;(7)加入15nlddH20，37。C下靜置約5min,沉澱溶解，得到油菜花瓣總DNA。3.巢式PCR反應第一次PCR:以ITS4/ITS5為引物(引物序列參照本說明書《
發明內容》)的第一次擴增反應體系包括PCRbuffer、10pmol引物ITS4、10pmol引物1TS5、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、10nl上述油菜花瓣總DNA，以ddH20補足25^d。將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增。PCR反應參數設置為95°C4min;94。C30s、50°C45s、72°C30s，30個循環；72。C延伸10min。第二次PCR:以XJJ21/XJJ222為引物(引物序列參照本說明書《
發明內容》)的第二次擴增反應體系包括PCRbuffer、lOpmol引物XU21、lOpmol引物XJJ222、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、lHl第一次PCR產物，以ddH20補足25pl。將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增。PCR反應參數設置為95°C4min;94°C30s、63°C30s、72°C30s，30個循環；72。C延伸10min。4.二次PCR擴增產物分析取4nl二次PCR擴增產物，加入l(il加樣緩衝液(TAKALA，大連)，混勻，在1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠中進行電泳，用0.5xTBE作為電泳緩衝液(配方參見前述《
發明內容》中所示)，5V/cm下電泳30min，用溴化乙錠(EB)染色15min後，凝膠成相系統上成像。如圖4。如果油菜花瓣樣本上攜帶核盤菌，在紫外光下就會出現一條292bp的目的條帶；如果沒有，則不能擴增到同樣分子量的目的條帶。統計得出，80個樣本中PCR陽性出現28次，即陽性出現次數/總樣本數=35.0%。本實施例總計只需要7個小時。具體的安排為在步驟2第(5)、(6)步實驗間隙可以配製步驟3的第一次PCR反應體系；在步驟3的第一次PCR反應實驗間隙可以配製第二次PCR反應的反應體系;在第二次PCR反應實驗間隙可以製做步驟4中的瓊脂糖凝膠。這樣可以充分節省時間。本實施例總計需要時間=lh20min(提取總DNA)+2h30min(第一次PCR)+2h(第二次PCR)+lh(電泳+成像)=7hours序列表aio>華中農業大學<120〉一種油菜菌核病的早期快速分子檢測方法〈130〉<141〉2008-12-20〈160〉2Patentlnversion3.1〈210〉1<211〉564咖A<213〉核盤菌(^SWerc^'/7Yasc7er。fj'ariffl)gene<222〉(1)..(564)〈221〉primer_bind<222〉(545).,(564)<223〉primer一bind<222〉(1)..(22)<223〉<400〉1gtcgt肌caaggtttccgtetggtg肌cctgcgg卿gertc60tcatgcccgactcccacccttgtgtattattax:tttgttgctttggcgag120ctgctcttcggggccttgtatgctcgccag3gaac3tcaaaactctttttattaatgtcg180tctgagtacttaaaactttc肌caacggatctcttggttctggcstcgat240gcg犯atgcgtg犯ttgcagaattcagtga300ctttgaacgcacattgcgccccttggtattccggggggcatgcctgttcgagcgtceittt360c肌ccctc朋gctcagc"ggtattgsgtccatgtcagtaatggcaggctct朋^tcag420formulaseeoriginaldocumentpage14權利要求1、一種油菜菌核病的早期快速分子檢測方法，其特徵在於下列步驟(1)採集油菜花瓣先將1.5mlEppendorf管滅菌，將待測的隨機取樣于田間凋謝的油菜花瓣，按一片花瓣裝入一個Eppendorf管，將採集的花瓣樣本置於-80℃冰箱中冷凍；(2)提取油菜花瓣總DNA將裝有油菜花瓣的Eppendorf管從-80℃冰箱中取出，迅速加入200μl抽提緩衝液，使之浸沒過花瓣；用家用微波爐的低火檔加熱所述的樣本，處理時間和順序依次為20s，20s，15s，以樣本不沸騰為宜；從所述微波爐中取出樣本後立即再加入200μl抽提緩衝液；80℃水浴5min，中間輕輕搖晃一次；分別加入200μl苯酚和200μ1氯仿，輕輕混勻；於12,000rpm離心10min，取上清液，加入800μl-20℃預冷的無水乙醇，輕輕混勻，靜置沉澱20min；於12,000rpm離心10min，棄上清，取沉澱置於37℃下乾燥約10min；加入15μlddH2O，37℃下靜置約5min，沉澱溶解，得到油菜花瓣總DNA；(3)巢式PCR反應第一次PCR以ITS4/ITS5為引物進行第一次PCR，擴增反應體系為PCRbuffer，10pmol引物ITS4，10pmol引物TTS5，0.5UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，10μl步驟(2)製備的油菜花瓣總DNA，以ddH2O補足25μl，將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增；PCR反應參數為95℃4min；94℃30s，50℃45s，72℃30s，30個循環；72℃延伸10min。第二次PCR以XJJ21/XJJ222為引物的第二次PCR，擴增反應體系為PCRbuffer，10pmol引物XJJ21，10pmol引物XJJ222，0.5UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，1μl第一次PCR產物，以ddH20補足25μl；將所述試劑加入後混勻，置於PCR儀內進行擴增，PCR反應參數為95℃4min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，30個循環；72℃延伸10min；(4)PCR擴增產物分析取4μl第二次PCR擴增產物，加入1μl上樣緩衝液(購自TAKARA公司)，混勻，在1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠中、5V/cm下電泳30min，用溴化乙錠(EB)染色15min後，在凝膠成相系統上成像；(5)結果判定將瓊脂糖凝膠置於紫外光下，判定是否存在一條大小為292bp的目的條帶；其中步驟(2)所述的抽提緩衝液配方為2％十六烷基三乙基溴化銨(w/v)，2％聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，1.4M氯化鈉，0.1M三羥甲基氨甲烷-鹽酸(pH8.0)，0.02M乙二胺四乙酸；步驟(3)所述的本發明設計的特異引物序列如下ITS45』-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3』；TTS5.5』-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3』；XJJ215』-GTTGCTTTGGCGTGCTGCTC-3』；XJJ2225』-CTGACATGGACTCAATACCAATCTG-3』；步驟(4)所述的電泳緩衝液(5×TBE)配方為Tris54g，硼酸27.5g，加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml；工作濃度為0.5×TBE。全文摘要本發明屬於植物病害分子檢測領域，涉及油菜菌核病早期快速分子檢測方法。特徵包括採集凋謝的油菜花瓣，提取油菜花瓣總DNA，巢式PCR，PCR擴增產物分析，瓊脂糖凝膠電泳和結果判定。如樣本中存在核盤菌，在紫外光下瓊脂糖凝膠中就會出現一條292bp的目的條帶；不是則否。本發明的引物不僅可區分親緣關係較遠的不同屬的常見植物葉部病原真菌，如交鏈孢屬的鏈格孢黴、鐮孢屬的禾穀鐮孢菌和盾殼黴屬的核盤菌菌核寄生真菌盾殼黴，且可區分與核盤菌同屬於子囊菌亞門、盤菌綱、柔膜菌目的常見重要植物葉部病原真菌葡萄孢屬的多個種的真菌；其靈敏度高，可檢測下限至1fg/μl的核盤菌DNA；本發明快速，7小時內即可得到準確的檢測結果，傳統微生物學方法至少需2天或1周以上。文檔編號C12Q1/04GK101434997SQ200810236958公開日2009年5月20日申請日期2008年12月23日優先權日2008年12月23日發明者付豔蘋,姜道宏,黎覃,謝甲濤申請人:華中農業大學