一種用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統的製作方法
2024-04-01 04:59:05 1
專利名稱：一種用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統的製作方法
技術領域：
本發明屬微生物領域，具體涉及一種用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統 (pBTn)。
背景技術：
革蘭氏陽性菌特別是金黃色葡萄球菌是目前醫院感染最常見的病原體之一。 許多國家都設有專門機構，應對金葡菌的院內感染問題。研究報導，隨著fi-內醯 胺類抗生素的廣泛應用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)隨之增加，且引起 的感染和病死率有逐年增加的趨勢。金葡菌感染引起的疾病包括化膿性炎症，如 傷口化膿、骨、關節的感染，也可以引起內臟器官感染，如肺炎、膿胸、中耳炎、 心包炎、心內膜炎等；另外嚴重者可引起全身感染如敗血症、膿毒血症等。特別 是1999年-2000年，高致病力社區來源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的出現，所 致疾病已引起國際恐慌，其主要引起嚴重的敗血症以及致死性肺炎等，感染者死 亡率明顯增高。由於其高致病力和高致死率，國際上將其作為繼HIV之後第二 大危及人類生命的病原微生物，其毒力因子及致病機理更是目前國際各研究部門 研究熱點。
現有技術公開了若干有關從細菌基因組中篩選出需要的基因的方法。目前比 較可行的方法是，首先利用有效的轉座系統隨機插入到目的菌的基因組中，建立 轉座子突變文庫，然後採用一定的篩選方法篩選出生物形狀改變的克隆，進而明 確轉座子插入基因組的具體基因位置，進一步對基因功能進行研究。目前已公開 的用於構建轉座子突變文庫的轉座系統主要為Tn551或Tn917。但實踐表明， 該種轉座系統用於革蘭氏陽性菌，經誘導插入基因組並不是隨機插入，而往往是 插入到幾個特定的基因位點，因此，不具有隨機性插入到基因組的特點，致使用 該種轉座系統建立的轉座子突變文庫不具隨機性和實用性。其導致之後的以此突 變文庫為基礎進行的研究帶來相當的困難。此問題已成為構建有效的突變文庫的 瓶頸，因此，重新構建新的有效的轉座系統，對臨床實踐而言顯得尤為必要。研究人員分析上述Tn551或Tn917不能隨機插入到革蘭氏陽性菌基因組的主要原 因可能是其轉座酶的原因。
發明內容
本發明的目的是為解決現有技術存在的問題，提供一種可以高度隨機性，單 一性，穩定性地插入革蘭氏陽性菌基因組中的mariner based的轉座系統。具體
涉及一種用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統(pBTn)。
本發明構建了新的mariner based轉座系統pBTn,是用於革蘭氏陽性菌的高
效轉座系統，其特徵是包括溫度敏感性質粒，藥物耐藥基因和轉座酶，其中，溫
度敏感性質粒作為載體，溫度敏感性質粒中插入藥物耐藥基因，耐藥基因和轉座
酶之間插入特定的啟動子，使有效地控制轉座酶表達的時間，無明顯基因的插入熱點。
本發明的轉座系統的轉座酶來源於mariner真核轉座子。本發明的mariner based轉座系統具有良好的隨機性，單一性和穩定性地插入到革蘭氏陽性菌基因組 的特點，無明顯基因的插入熱點。所述的轉座子突變文庫具有顯著高的隨機性和 實用性，其使用效果明顯高於目前被廣泛使用的轉座系統Tn551或Tn917。本發明 為進一步研究革蘭氏陽性菌基因組中基因的功能奠定基礎。
本發明中，採用溫度敏感性質粒PBT2作為載體，所述的質粒成功轉入目的 菌中後，可以通過升高培養溫度而將該質粒去除；
本發明中，在溫度敏感性質粒pBT2中插入紅黴素的耐藥基因，該耐藥基因 兩端帶有重複序列；
本發明中，mariner based的轉座酶來源於pBADA7;
本發明中，在所述的紅黴素的耐藥基因以及所述的轉座酶之間插入來源於 PTX15的啟動子，該啟動子在葡萄糖存在下被遏制表達，只有在無葡萄糖或木糖 存在下才可活化，從而可以有效地控制轉座酶表達的時間。
本發明的用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統(PBTn)通過下述方法和步驟建
立
1) 用PCR方法從質粒pEC2擴增兩端帶有重複序列的紅黴素的耐藥基因並克隆 到溫度敏感性質粒pBT2上，重組質粒命名為pBT2IR;
2) 將木糖誘導性啟動子基因從pTX15酶切下來連接入pBT2IR，重組質粒命名為pBT2IRXY;
3)用PCR方法從質粒pBADA7擴增mariner based的轉座酶基因並克隆到質粒 pBT2IRXY上，該重組質粒命名為pBTn。
上述步驟l)中，用PCR方法從質粒pEC2 (Dr. Michael Otto實驗室)擴增兩 端帶有重複序列的紅黴素的耐藥基因(IRerm)， 擴增過程中使用的引物分別是序列1和序列2的
IRXba: 5、-TTTTTCTAGATAACAGGTTGGCTGATAAGTCCCCGGTCTGTCC GAGAGTGATTGGTCTTGCGTATGG-3、和IR Pst 5、-TTTTCTGCAGTAACAGG TTGGCTGATAAGTCCCCGGTCTCCCCGTAGGCGCTAGGGACCTCTTTAGC-3' (下劃線為酶切位點)，
IRerm的擴增模版為質粒pEC2 (含紅黴素的耐藥基因)；
擴增條件為95'C預變性5分鐘，95°C1分鐘，55'Cl分鐘，72°C1分鐘，共
35個循環，最後72'C延伸10分鐘。
將IRerm克隆到溫度敏感性質粒pBT2 (Dr. Michael O加實驗室)上-取100pl紅黴素耐藥基因PCR擴增產物用DNA純化試劑(Qiagen)，按說 明書進行純化，最後用40 pl ddH20進行洗脫。取該純化產物20 nl， 10xbuffer 4 Hi, Xbal (Roche) 2 pl， Pst I (Roche) 2 pi, ddH20 12ja1， 37。C 4h,對酶切產物 切膠回收純化。同樣對質粒pBT2用Xba I和Pst I酶切，對酶切產物切膠回收 純化。取pBT2酶切純化產物3 jil，紅黴素耐藥基因酶切純化產物8 pi, 10xbuffer 3pl， T4連接酶(Roche) 1^1， ddH20 15^1， 16°C連接過夜。取上述連接產物 轉化DH5a感受態細胞，塗布氨苄青黴素+紅黴素平板，37'C過夜培養後挑取陽 性克隆，提取質粒作初步鑑定，最後經測序確證，將重組質粒命名為pBT2IR。
上述步驟2)中，將木糖誘導性啟動子基因從pTX15(Dr. Michael O加實驗 室)酶切下來連接入pBT2IR:質粒pTX15用Xba I和BamH I酶切，電泳，將 長度約為1900bp片段切膠回收純化(木糖誘導性啟動子基因)。質粒pBT2IR同 樣用Xba I和BamH I酶切，對酶切產物切膠回收純化。取pBT2IR酶切純化產 物3pl，取從pTX15酶切下來的木糖誘導性啟動子基因純化產物8[il， 10xbuffer 3[U, T4連接酶lpl， ddH20 15nl，， 16'C連接過夜。取上述連接產物轉化DH5a感受態細胞，塗布氨苄青黴素+紅黴素平板，37'C過夜培養後挑取陽性克隆，提 取質粒作初步鑑定，最後經測序確證，將重組質粒命名為pBT2IRXY。
上述步驟3 )中，用PCR方法從質粒pBADA7(來源於美國NIH)擴增mariner based的轉座酶基因(transposase， Tn):在擴增過程中使用的引物分別是序列3 禾口 4的TnBam 5、- CCATAAGATTAGCGGATCCTACCTAACGC -3、和TnKpn 5、國 CCTGCAGGTACCGGTCTAACAAAGAAAAACAC -3、(下劃線為酶切位點)。 mariner based的轉座酶基因的擴增模版為質粒pBADA7 (mariner based的轉座酶 基因)。擴增條件為95'C預變性5分鐘，95'C1分鐘，55'C1分鐘，72'C1分鐘， 共35個循環，最後72'C延伸10分鐘。
將mariner based的轉座酶基因克隆到質粒pBT2IRXY上mariner based的 轉座酶基因PCR擴增產物用DNA純化試劑進行純化。取該純化產物20 pl， 10xbuffer 4 pl， BamH I 2 pl， Kpn 12 pl， ddH20 12^1， 37°C 4h,對酶切產物切膠回 收純化。同樣對質粒pBT2IRXY用BamHI和Kpnl酶切，對酶切產物切膠回收 純化。取pBT2IRXY酶切純化產物3 pi, mariner based的轉座酶基因酶切純化 產物8 nl， lOxbuffer 3 pl， T4連接酶1 pl， ddH20 15pl, 16°C連接過夜。取上述 連接產物轉化DH5a感受態細胞，塗布氨苄青黴素+紅黴素平板，37'C過夜培養 後挑取陽性克隆，提取質粒作初步鑑定，最後經測序確證，將重組質粒命名為 pBTn (圖1)。
圖1是本發明構建的mariner based轉座系統pBTn示意圖， 其中顯示,在溫度敏感性質粒pBT2中插入兩端帶有重複序列的紅黴素的耐藥 基因，來源於mariner真核轉座子的轉座酶來源於pBADA7，在紅黴素的耐藥基 因以及轉座酶之間插入來源於pTX15的啟動子，這一啟動子在葡萄糖存在下被遏 制表達，只有在無葡萄糖，木糖存在下才可活化。
圖2是用Southern blot的方法分析轉座子單一性插入金黃色葡萄球菌的基 因組中的結果圖，
其中顯示，隨機挑取10個可以在紅黴素平板上生長而不能在氯黴素平板上 生長的陽性克隆，抽提基因組DNA，用EcoRI進行酶解消化後電泳，轉膜。以紅黴素抗性基因為探針進行Southern blot,以確定紅黴素抗性基因在基因組是否 為單一條帶。Southern blot結果顯示所有克隆基因組DNA中紅黴素抗性基因均 為單一性插入(100%)。
圖3為50個克隆紅黴素抗性基因插入金黃色葡萄球菌的基因組位點的示意 圖，圖中第圈l和圈2表示金黃色葡萄球菌可能的編碼序列，按基因的功能類別 不同用不同的顏色表示；第三圈表示金黃色葡萄球菌的rRNA， sRNA， tRNA; 第四圈為50個克隆紅黴素抗性基因插入金黃色葡萄球菌的基因組位點，其中紅 色數字為經測序確定為同一插入位點的克隆數，結果顯示隨機插入率為86% (43/50)，無明顯插入熱點。
具體實施方式
實施例l
1. 革蘭氏陽性菌電轉化感受態細胞的製備(以金黃色葡萄球菌為例)
(1) 取金黃色葡萄球菌儲存液1(^1接種50ml新鮮的TSB， 37'C，180rpm搖 菌過夜。
(2) 取1 ml培養過夜的菌液接種100ml新鮮的TSB， 37'C， 180rpm搖菌至 細菌OD值為0.4-0.5。
(3) 菌液室溫4000rpm離心20分鐘，棄上清，細菌用10%的甘油溶液洗5次
(4) 最後細胞懸浮於1 ml 10%的甘油溶液,按60[tl/管進行分裝後-8(TC保存.
2. 將新構建的mariner based轉座系統(pBTn)轉入革蘭氏陽性菌(以金黃色葡萄 球菌為例)
(1) 60^1電轉化感受態細胞室溫復甦5分鐘
(2) 60nl電轉化感受態細胞中加入pBTn DNA 10嗎，輕輕混勻後室溫放置30分鐘
(3) 將混合液轉入0.2ml的電轉杯，2KV， 25pF，電轉。
(4) 電轉後立即加入900W新鮮的TSB， 30°C， 180rpm搖菌3h.
(5) 塗布氯黴素+紅黴素平板，30'C過夜培養20h後挑取陽性克隆
3. 轉座子突變文庫的建立(1) 選取上述單個克隆接種100ml新鮮的TSB (無葡萄糖，含氯黴素與紅黴 素)，30°C， 180rpm搖菌過夜。
(2) 取上述過夜菌液20ml接種500 ml新鮮的TSB (無葡萄糖，含木糖,氯黴 素與紅黴素)，30°C， 180rpm搖菌過夜.
(3) 取上述過夜菌液20 ml接種500 ml新鮮的TSB (無葡萄糖，含紅黴素)， 43°C， 180rpm搖菌過夜.
(4) 重複步驟(3)至少2次.
(5) 取上述過夜菌液20ml接種500ml新鮮的TSB(無葡萄糖)，43°C， 180rpm 搖菌過夜.
(6) 取上述菌液lml，進行一系列的稀釋後各取100^1塗布紅黴素平板，37'C培 養過夜.
(7) 選取在紅黴素平板生長，氯黴素平板上不生長的克隆為轉座子插入的陽性 克隆進行保存，以備分析.
4.轉座子插入基因組位點的確定
用於鑑定轉座子插入基因組位點所用的引物如表l所示。 第一輪PCR反應所用的引物為引物arbl或arb2 (40 pmol/反應)和erm引 物(erm-5.3或erm-5.2， erm-3.3，或erm-3.2; 20pmol/反應)。總反應體系為30nl， 模版DNAlnl。 PCR反應條件:95"C預變性5分鐘，3(TC30s， 72'C1分鐘，共6個 循環，然後94'C30s， 45。C30s， 72'C1分鐘，共30個循環，最後72'C延伸10分鐘。 第二輪PCR反應所用的引物為引物arb3(40 pmol/反應)和erm引物(erm-5.2， erm-5.1， erm-3.2，或erm-3.1; 20pmol/反應)。總反應體系為30nl，模版為第一輪 PCR產物3nl。 PCR反應條件94°C30 s， 45°C30 s， 72'C1分鐘，共30個循環，最 後72'C延伸10分鐘。
第二輪PCR產物經過DNA純化後可以直接進行序列測定，測序引物為erm-5.3 或erm-3.3。測序結果通過比對，明確紅黴素抗性基因插入基因位點(圖3)。表l
引物名稱及(序列序號)5、3'序列
erm-5.1 erm-5.2 erm-5,3 erm-3.1 erm-3.2 erm-3.3
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
STAPHarbl (11) STAPHarb2 (12) arb3 (13)
GCTTCTAAGTCTTATTTCCATAAC
AGATAATGCACTATCAACACACTC
TCTACATTACGCATTTGGAATAC
TAGGTATACTACTGACAGCTTC
ATTCTATGAGTCGCTTTTGTA
TACTTATGAGCAAGTATTGTCTA GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNGATAT GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNGATCA GGCCACGCGTCGACTAGTCA復旦大學附屬華山醫院
—種用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統
11
13
Patentln version 3.1
1
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DNA
革蘭氏陽性菌
1
飾ctaga taacaggttg gctgataagt ccccggtctg tccgagagtg attggtcttg 60 cgtatgg 67
2
67
DNA
革蘭氏陽性菌
2
ttttctgcag taacaggttg gctgataagt ccccggtctc cccgtaggcg ctagggacct 60 ctttagc 67
3 29 DNA 革蘭氏陽性菌 3
ccataagatt agcggatcct acctaacgc 29
4
32
DNA
革蘭氏陽性菌
4
cctgcaggta ccggtctaac aaagaaaaac ac 32
5
24
DNA
革蘭氏陽性菌
5
gcttctaagt cttatttcca taac 24
6
24
DNA
革蘭氏陽性菌
6
agataatgca ctatcaacac actc 24
7 23 DNA革蘭氏陽性菌 7
totacattac gcatttggaa tac 23
8
22
DNA
革蘭氏陽性菌
8
taggtatact actgacagct tc 22
9
21
DNA
革蘭氏陽性菌
9
attetatgag tcgcttttgt a 21
10
23
DNA
革蘭氏陽性菌
10
tacttatgag caagtattgt cta 23
11
25
DNA 細菌 11
ggccacgcgt cgactagtca gatat 25
12
25
DNA
革蘭氏陽性菌
12
ggccacgcgt cgactagtca gatca 25
13
20
DNA
革蘭氏陽性菌
13
ggccacgcgt cgactagtca 20
權利要求
1、一種用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統，其特徵是包括溫度敏感性質粒，藥物耐藥基因和轉座酶，其中，溫度敏感性質粒作為載體，溫度敏感性質粒中插入藥物耐藥基因，耐藥基因和轉座酶之間插入特定的啟動子，使有效地控制轉座酶表達的時間，無明顯基因的插入熱點，命名為pBTn。
2、 按權利要求1所述的用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統，其特徵是所述的 作為載體的溫度敏感性質粒為pBT2，其轉入目的菌中後，通過升高培養溫度被 去除。
3、 按權利要求1所述的用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統，其特徵是所述的 藥物耐藥基因是兩端帶有重複序列的紅黴素的耐藥基因。
4、 按權利要求1所述的用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統，其特徵是所述的 轉座酶來源於mariner真核轉座子。
5、 按權利要求1所述的用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統，其特徵是所述的 轉座酶來源於pBADA7。
6、 按權利要求1所述的用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統，其特徵是所述的 耐藥基因和轉座酶之間插入的啟動子為來源於pTX15的啟動子。
7、 按權利要求1或5所述的用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統，其特徵是所 述的啟動子在葡萄糖存在下被遏制表達，在無葡萄糖，木糖存在下活化。
8、 權利要求1的用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統的製備方法，其特徵是通 過下述方法製備，1) 用PCR方法從質粒pEC2擴增兩端帶有重複序列的紅黴素的耐藥基因並 克隆到溫度敏感性質粒pBT2上，重組質粒命名為pBT2IR;2) 將木糖誘導性啟動子基因從pTX15酶切下來連接入pBT2IR,重組質粒 命名為pBT2IRXY;3) 用PCR方法從質粒pBADA7擴增mariner based的轉座酶基因並克隆到 質粒pBT2IRXY上，重組質粒命名為pBTn。
全文摘要
本發明屬微生物領域，涉及一種用於革蘭氏陽性菌的高效轉座系統pBTn，採用溫度敏感性質粒pBT2作為載體，其成功轉入目的菌中後，通過升高培養溫度而被去除；溫度敏感性質粒中插入兩端帶有重複序列的紅黴素的耐藥基因，在紅黴素的耐藥基因和來源於mariner真核轉座子的轉座酶間插入來源於pTX15的啟動子，該啟動子在葡萄糖存在下被遏制表達，在無葡萄糖，木糖存在可活化，能有效地控制轉座酶表達的時間。本發明建立的轉座子突變文庫無明顯插入熱點，具有高度隨機性和單一性插入到革蘭氏陽性菌基因組的特點。實用性明顯高於目前被廣泛使用於原核生物的轉座系統Tn551或Tn917。
文檔編號C12R1/445GK101597617SQ20091005403
公開日2009年12月9日 申請日期2009年6月26日 優先權日2009年6月26日
發明者元 呂, 敏 李, 蔣曉飛 申請人:復旦大學附屬華山醫院