一種誘變乳酸產生菌生產l-丙氨酸的方法
2024-04-02 16:27:05
專利名稱：一種誘變乳酸產生菌生產l-丙氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種誘變乳酸產生菌生產L-丙氨酸的方法，屬於微生物技術領域。
背景技術：
L-丙氨酸是組成蛋白 質的胺基酸之一，雖為人體非必須胺基酸，卻是人體血液中含量最高的胺基酸，在醫藥、高分子材料、食品等領域具有廣泛的用途。在醫藥領域L-丙氨酸作為醫藥中間體，是生產維生素B6及L-氨基丙醇的主要原料；L-丙氨酸與糖代謝密切相關，在轉氨反應中是主要的氨基供體，具有重要的生理功能，在臨床上常添加到輸液中；另外，L-丙氨酸還是一種很好的利尿藥。在高分子材料領域近年來發現將L-丙氨酸添加到聚乳酸中可有效提高聚乳酸的性能。在食品領域L-丙氨酸具有獨特的改善風味的效果，與其他胺基酸配合使用能加強食品和飲料的風味；L-丙氨酸的添加可以明顯提高食品和飲料中蛋白質的利用率，還可以改善有機酸的酸味，越來越受到人們的歡迎和重視。目前，L-丙氨酸的主要工業化生產方法是酶法轉化，即通過富有L-天冬氨酸-P -脫羧酶活力的微生物細胞催化L-天冬氨酸而得到L-丙氨酸。酶法轉化工藝的特點是酶活力高，設備投資小，提取工藝簡單，但其主要原材料L-天冬氨酸價格較貴，造成其生產成本較高。Pascal Hols等報導了利用基因工程手段改造乳酸菌，以葡萄糖、蔗糖或乳糖等為原料發酵生產L-丙氨酸的方法(US 6 627 420 BI)，但是基因工程方法構建菌種的過程複雜，技術要求高，而且得到的基因工程菌株很難穩定遺傳和保藏。高理所等報導了利用紫外線和雷射等複合誘變的方法篩選L-丙氨酸的高產菌株(安徽工程科技學院學報，2008，23 (I): 19-24)，但是由於紫外線對各種微生物的誘變效應不同，加上微生物吸收射線劑量的大小很難把握，且突變後易發生光修復作用，所以紫外線誘變的效果不佳，正突變率較低,死亡率較高。離子注入生物體誘變育種是人工誘變方法的一種新方向，是集化學誘變、物理誘變為一體的綜合誘變方法。與傳統的誘變源如X射線、Y射線、紫外線以及各種化學誘變劑相比，離子注入法不僅有能量沉積，還有動量傳遞、質量沉積及電荷交換等效應。低能離子束對微生物的誘變是直接作用和間接作用的共同結果，其直接作用主要是注入離子的動量傳遞於細胞表面產生的濺射作用和沉積於細胞內部產生的刻蝕損傷，而間接作用主要是注入離子的能量沉積於細胞內部產生的自由基所導致的作用。它能夠引起染色體的畸變，導致DNA鏈鹼基的損傷、斷裂，從而使遺傳物質在基因水平或分子水平上發生改變或缺失，大幅提聞變異的頻率。
發明內容
針對上述現存的技術問題，本發明提供一種誘變乳酸產生菌生產L-丙氨酸的方法，以德氏乳桿菌保加利亞亞種delbrueckii subsp. bulgaricus為貨發菌種，採用低能離子注入法誘變處理細胞，並通過可逆抑制測定法篩選出生產L-丙氨酸的突變株，用該突變株以葡萄糖為底物、厭氧條件下發酵生產L-丙氨酸。
本發明為實現上述目的，通過以下技術方案實現本方法以乳酸產生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種delbrueckii subsp.■為出發菌種,活化出發菌一低能離子注入法誘變處理細胞一可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株一擴增培養種子液一厭氧發酵生產L-丙氨酸一發酵液淨化處理一製得成品，具體步驟如下。A、活化出發菌將出發菌德氏乳桿菌保加利亞亞種在斜面培養基上42°C培養至對數生長期，用0. 85 %的生理鹽水製成菌懸液，稀釋至ImL菌懸液含菌數約為107，鏡檢菌種健壯且無雜菌後，吸取0. ImL菌懸液均勻塗布於無菌空白培養皿上，無菌風吹乾製成菌膜。B、低能離子注入誘變法誘變處理細胞鏡檢無細胞重疊後，真空條件下對菌體細胞進行離子注入處理，注入離子為N離子，劑量為I. 5X 1014-5X IO16 ions/cm2,能量為15-20keV，脈衝注入，每次注入5s，間隔時間15_40s ;將經過離子注入處理後的菌膜用ImL 無菌生理鹽水進行洗脫，然後取0. ImL洗脫液塗布於固體平板上，置於37 °C培養箱中培養48h。 C、可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株挑選離子注入後的單菌落進行編號，並接種到對應編號的發酵培養基中，發酵液PH值在6. 5-7. 5，37 1厭氧發酵48h ;將發酵液過濾除去菌體，濾液經121°C蒸汽滅菌20min，加入I. 5%瓊脂，115°C蒸汽滅菌20min後，加入0. 01-0. 05%抑制劑，倒平板，並塗布指示菌，置於35-40°C培養箱中進行培養；選取指示菌生長的平板所對應的編號的突變菌株進行連續傳代培養，通過穩定性試驗，最終得到兩株編號為0108和Zofe. 1109的L-丙氨酸高產菌株。D、擴增培養種子液'Lds. 0108和Zofe. 1109分別依次通過斜面培養和種子罐培養，培養溫度37°C，斜面培養時間24h，種子罐培養時間18h。E、厭氧發酵生產L-丙氨酸將擴增後的種子液接種到發酵培養基中，底物葡萄糖濃度為6-12%，發酵溫度為35-40°C，培養基pH值為6. 5-7. 5，維持厭氧環境，待殘糖濃度小於0. 1%則發酵完成，發酵時間30-52h。F、發酵液淨化處理先採用陶瓷超濾膜或有機管式超濾膜過濾，然後通過納濾膜進一步過濾。G、製得成品納濾液經過真空濃縮蒸發，結晶析出L-丙氨酸，經離心，乾燥得成品。本發明的有益效果是乳酸產生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種作為出發菌種，在厭氧條件下具有較高的糖酵解能力，在實際應用過程中會節約大量的動力成本，且該菌種作為食品級菌種，其發酵產生的乳酸與丙氨酸是結構類似物，會大大提高正突變的效率。採用的低能離子注入誘變法具有突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩定等優點。所用的原材料葡萄糖屬於可再生純天然資源，來源廣泛，價格低廉，且厭氧發酵減少了動力消耗，降低了生產成本。提純過程中使用超濾膜過濾和納濾膜過濾去除雜質，保證了產品質量，適合大規模工業化生產。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。本發明以乳酸產生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種iLac tobaciIlus delbrueckiisubsp. bulgaricus)為出發菌種,經活化出發菌一低能離子注入法誘變處理細胞一可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株一擴增培養種子液一厭氧發酵生產L-丙氨酸一發酵液淨化處理一製得成品等步驟，可知實施過程主要分為兩個階段，首先是產L-丙氨酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變株的誘變，然後利用篩選出來的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變株Zofe. 0108和Zofe. 1109發酵生產L-丙氨酸。實施例1-1 :產L-丙氨酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變株的誘變。I、培養基組分。I. I斜面培養基的成分蛋白腖1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，瓊脂I. 5%，氫氧化鈉調pH至I. 0,121°C蒸汽滅菌20min。I. 2發酵培養基的成分葡萄糖6%，磷酸二氫鉀0. 2%，磷酸氫二鉀I. 2%，無水硫酸鎂0. 02%，氨水調pH至7. 0，115 °C蒸汽滅菌20min。 為避免對下步篩選L-丙氨酸產生菌造成幹擾，在發酵培養基配製過程中，無任何含丙氨酸的有機物摻入。2、操作步驟。2. I活化出發菌將出發菌德氏乳桿菌保加利亞亞種在斜面培養基上42°C培養18h左右，至對數生長期，用0. 85%的生理鹽水製成菌懸液，稀釋至ImL菌懸液含菌數約為107，鏡檢菌種健壯且無雜菌後，吸取0. ImL菌懸液均勻塗布於直徑為9cm的無菌空白培養皿上，無菌風吹乾製成菌膜。2. 2低能離子注入法誘變處理細胞鏡檢無細胞重疊後，在真空條件下進行離子注入處理。注入的離子為N離子，離子能量15keV，注入劑量I. 5 X IO14 ions/cm2，注入時間5s，間隔時間15s。離子注入機由中國科學院等離子體物理研究所提供。將經過離子注入處理後的菌膜用ImL無菌生理鹽水進行洗脫，然後取0. ImL洗脫液塗布於固體平板上(成分同斜面培養基)，置於37 °C培養箱中培養48h。2. 3可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株挑選離子注入後長出的單菌落進行編號，用接種環將各個單菌落分別挑入到對應編號的發酵培養基中，37 °C厭氧發酵48h。發酵過程中pH值會下降，則流加濃度25%的氨水或者液氨,維持發酵液pH值在
6.5-7. 5。將發酵液過濾除去菌體，其濾液經121°C蒸汽滅菌20min。在滅菌後不含菌體的發酵液中添加I. 5%的瓊脂，115°C蒸汽滅菌20min後，將0. 01%的抑制劑L-氨基乙基磺酸過濾除菌後加入其中，倒平板。將作為指示菌的普通變形桿菌塗布於該平板上，置於37 V培養箱中培養48h。若指示菌在含有抑制劑的平板上生長，說明發酵液中含有L-丙氨酸，則對應編號的菌株即為產L-丙氨酸的突變株,挑取該編號的菌株在斜面培養基上培養18h後暫存於4°C冰箱。實施例1-2 :產L-丙氨酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變株的誘變。I、培養基組分斜面培養基和發酵培養基的成分同實施例I。2、操作步驟。2. I活化出發菌按實施例I的方法將出發菌株製成菌膜。2. 2低能離子注入法誘變處理細胞鏡檢無細胞重疊後，在真空條件下進行離子注入處理。注入離子為N離子，離子能量20keV，注入劑量6. 0 X IO15 ions/cm2,注入時間5s，、間隔時間30s。將經過離子注入處理後的菌膜用ImL無菌生理鹽水進行洗脫，然後取0. ImL洗脫液塗布於斜面培養基上，置於37°C培養箱中培養72h。2. 3可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株將長出的單菌落進行編號，用接種環將各個單菌落分別挑入到對應編號的發酵培養基中，37 1厭氧發酵48h。發酵過程中PH值下降，流加濃度25%的氨水，維持發酵液pH值在6. 5至7. 5。將發酵液過濾除去菌體，其濾液經121°C蒸汽滅菌20min。在滅菌後不含菌體的發酵液中添加I. 5%的瓊脂，115°C蒸汽滅菌20min後，將0. 03%的抑制劑L-氨基乙基磺酸過濾除菌後加入其中，倒平板。將作為指示菌的普通變形桿菌塗布於該平板上，置於37 °C培養箱中培養72h。
若指示菌在含有抑制劑的平板上生長，說明發酵液中含有L-丙氨酸，則對應編號的菌株即為產L-丙氨酸的突變株,挑取該編號的菌株在斜面培養基上培養18h後暫存於4°C冰箱。
實施例1-3 :產L-丙氨酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變株的誘變。I、培養基組分斜面培養基和發酵培養基的成分同實施例I。2、操作步驟。2. I活化出發菌按實施例I的方法將出發菌株製成菌膜。2. 2低能離子注入法誘變處理細胞鏡檢無細胞重疊後，在真空條件下進行離子注入處理，注入離子為N離子，離子能量20keV，注入劑量5. 0 X IO16 ions/cm2,注入時間5s，間隔時間40s。將經過離子注入處理後的菌膜用0.5 mL無菌生理鹽水進行洗脫，然後取
0.ImL洗脫液塗布於斜面培養基上，置於37 °C培養箱中培養96h。2. 3可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株將長出的單菌落進行編號，用接種環將各個單菌落分別挑入到對應編號的發酵培養基中，37 1厭氧發酵48h。發酵過程中PH值下降，流加濃度25%的氨水，維持發酵液pH值在6. 5至7. 5。將發酵液過濾除去菌體，其濾液經121°C蒸汽滅菌20min。在滅菌後不含菌體的發酵液中添加I. 5%的瓊脂，115°C蒸汽滅菌20min後，將0. 05%的抑制劑L-氨基乙基磺酸過濾除菌後加入其中，倒平板。將作為指示菌的普通變形桿菌塗布於該平板上，置於37 °C培養箱中培養96h。若指示菌在含有抑制劑的平板上生長，說明發酵液中含有L-丙氨酸，則對應編號的菌株即為產L-丙氨酸的突變株,挑取該編號的菌株在斜面培養基上培養18h後暫存於4°C冰箱。重複實施例1-1至1-3，將得到的突變株進行連續傳代培養、發酵穩定性試驗，最終獲得2株產L-丙氨酸濃度較高、遺傳穩定性較好的的突變株，編號為Lds. 0108和Lds. 1109。實施例2-1 :利用突變株Zofe. 0108在100L發酵罐中發酵生產L-丙氨酸。I、培養基組分。I. I斜面培養基的成分蛋白腖1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，瓊脂I. 5%，氫氧化鈉調pH至I. 0,121°C蒸汽滅菌20min。I. 2種子培養基的成分蛋白腖0. 8%，酵母膏0. 5%，甘油0. 5%，磷酸二氫鉀0. 2%，磷酸氫二鉀I. 2%，無水硫酸鎂0. 02%，氫氧化鈉調pH至7. 0，121°C蒸汽滅菌20min。I. 3發酵培養基的成分葡萄糖6%，磷酸二氫鉀0. 2%，磷酸氫二鉀I. 2%，無水硫酸鎂0. 02%，氫氧化鈉調pH至7. 0，115 °C蒸汽滅菌20min。
2、操作步驟。2. I擴增培養種子液將突變株Zofe. 0108移種到斜面培養基上，在37°C下培養24h。將斜面上的菌株用無菌水製成菌懸液。按0.5%的接種量接入搖瓶種子培養基中，IOOOmL三角燒瓶裝液量300mL，培養溫度37°C，在轉速120rpm的搖床上培養18h。2. 2厭氧發酵生產L-丙氨酸將培養好的種子液按0. 5%的接種量接入100L發酵罐中，發酵溫度培35°C，轉速200rpm，罐壓0. 05Mpa,發酵過程中pH值下降，流加濃度25%的氨水，維持發酵液PH值在6. 5至7. 5。整個發酵過程不需要通入空氣，維持厭氧狀態。發酵30h，發酵液PH值不再降低，氨水消耗速度為零，測殘糖濃度小於0. 05%，停止發酵，高效液相檢測發酵液中L-丙氨酸濃度為5. 63%。2. 3發酵液淨化處理上述發酵液通過孔徑20納米管式有機膜膜超濾，除去菌體細胞等大分子物質，用20L純水透析洗滌過濾母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超濾清液中。超濾清液通過600分子量納濾膜過濾，脫去色素，進一步除去較大分子量雜質、 磷酸鹽、二價金屬離子等。納濾母液充分透析洗滌，得納濾液總共約185L。2. 4製得成品利用真空旋轉薄膜蒸發儀器對上述納濾液蒸餾濃縮結晶，濃縮液冷卻到20°C以下充分結晶，抽濾得母液20L，乾燥晶體，得L-丙氨酸3980. 6g，經檢驗產品含量達到99. 2%，比旋光度14. 7，質量符合GB 25543-2010。實施例2-2 :利用突變株Zofe. 1109在10立方米發酵罐中發酵生產L-丙氨酸。I、培養基組分。I. I斜面培養基的成分蛋白腖1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，瓊脂I. 5%，氫氧化鈉調pH至I. 0,121°C蒸汽滅菌20min。I. 2種子培養基的成分蛋白腖0. 8%，酵母膏0. 5%，甘油0. 5%，磷酸二氫鉀0. 2%，磷酸氫二鉀I. 2%，無水硫酸鎂0. 02%，氫氧化鈉調pH至7. 0，121°C蒸汽滅菌20min。I. 3發酵培養基的成分葡萄糖9%，磷酸二氫鉀0. 2%，磷酸氫二鉀I. 2%，無水硫酸鎂0. 02%，氫氧化鈉調pH至7. 0，115 °C蒸汽滅菌20min。2、操作步驟。2. I擴增培養種子液將突變株Zofe. 1109分別移種到斜面培養基上，在37°C下培養24h。將斜面上的菌株用無菌水製成菌懸液。按0.5%的接種量接入搖瓶種子培養基中，IOOOmL三角燒瓶裝液量300mL，37°C，在轉速120rpm的搖床上培養18h。2. 2厭氧發酵生產L-丙氨酸將培養好的搖瓶種子液按0. 5%的接種量接入500L種子罐中，培養37°C，轉速200rpm，罐壓0. 05Mpa，厭氧培養18h。上述種子罐種子液，移種至有效容積為10立方米的發酵罐，發酵溫度37°C，轉速IOOrpm，罐壓0. 05Mpa發酵過程pH值下降，流加液氨，維持發酵液PH值在6. 5至7. 5。整個發酵過程不需要通入空氣，維持厭氧狀態。發酵40h，發酵液PH值不再降低，液氨消耗速度為零，測殘糖濃度小於0. 04%,停止發酵，高效液相檢測發酵液中L-丙氨酸濃度為7. 52%。2. 3發酵液淨化處理上述發酵液通過孔徑50納米陶瓷膜超濾，除去菌體細胞等大分子物質，純水透析洗滌過濾母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超濾清液中。超濾清液通過800分子量納濾膜過濾，脫去色素，進一步除去較大分子量雜質、磷酸鹽、二價金屬離子等。納濾母液充分透析洗滌，得納濾液總共約14. 5立方。2. 4製得成品利用單效真空蒸發器對上述納濾液蒸餾濃縮結晶，濃縮液冷卻到20°C以下充分結晶，抽濾離心母液3. 2立方米。乾燥晶體，得L-丙氨酸506kg，經檢驗產品含量達到99. 5%，比旋光度14. 5，質量符合GB 25543-2010。實施例2-3 :利用突變株Zofe. 0108在100立方米發酵罐中發酵生產L-丙氨酸。I、培養基組分。I. I斜面培養基的成分蛋白腖1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，瓊脂I. 5%，氫氧化鈉調pH至I. 0,121°C蒸汽滅菌20min。I. 2種子培養基的成分蛋白腖0. 8%，酵母膏0. 5%，甘油0. 5%，磷酸二氫鉀0. 2%，磷酸氫二鉀I. 2%，無水硫酸鎂0. 02%，氫氧化鈉調pH至7. 0，121°C蒸汽滅菌20min。
I. 3發酵培養基的成分葡萄糖12%，磷酸二氫鉀0. 2%，磷酸氫二鉀I. 2%，無水硫酸鎂0. 02%,氫氧化鈉調pH至7. 0，115 °C蒸汽滅菌20min。2、操作步驟。2. I擴增培養種子液將突變株Zofe. 0108分別移種到斜面培養基上，在37°C下培養24h。將斜面上的菌株用無菌水製成菌懸液。按0.5%的接種量接入搖瓶種子培養基中，IOOOmL三角燒瓶裝液量300mL，37°C，在轉速120rpm的搖床上培養18h。2. 2厭氧發酵生產L-丙氨酸將培養好的搖瓶種子液按0. 5%的接種量接入500L種子罐中，培養37°C，轉速200rpm，罐壓0. 05Mpa，厭氧培養18h。將培養好的種子液移種至種至5000L種子罐中繼續擴增培養，培養37°C，轉速lOOrpm，罐壓0. 05Mpa,厭氧培養ISh0上述擴增培養的種子液，移種至有效容積為100立方米的發酵罐，發酵溫度40°C，轉速56rpm,罐壓0. 05Mpa,發酵過程pH值下降，流加液氨，維持發酵液pH值在6. 5至7. 5。整個發酵過程不需要通入空氣，維持厭氧狀態。發酵52h，發酵液PH值不再降低，液氨消耗速度為零，測殘糖濃度小於0. 05%，停止發酵，高效液相檢測發酵液中L-丙氨酸濃度為10. 68%。2. 3發酵液淨化處理上述發酵液通過孔徑50納米陶瓷膜超濾，除去菌體細胞等大分子物質，純水透析洗滌過濾母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超濾清液中。超濾清液通過1000分子量納濾膜過濾，脫去色素，進一步除去較大分子量雜質、磷酸鹽、二價金屬離子等。納濾母液充分透析洗滌，得納濾液總共約124. 5立方。2. 4製得成品利用三效真空蒸發器對上述納濾液蒸餾濃縮結晶，濃縮液冷卻到200C以下充分結晶，抽濾離心母液12. 2立方米。乾燥晶體，得L-丙氨酸7476kg，經檢驗產品含量達到99. 5%，比旋光度14. 5，質量符合GB 25543-2010。
權利要求
1.一種誘變乳酸產生菌生產L-丙氨酸的方法，其特徵在於，以乳酸產生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種delbrueckii subsp.■為出發菌種,活化出發菌—低能離子注入法誘變處理細胞一可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株一擴增培養種子液一厭氧發酵生產L-丙氨酸一發酵液淨化處理一製得成品，包括如下具體步驟 A、活化出發菌將出發菌德氏乳桿菌保加利亞亞種在斜面培養基上42°C培養至對數生長期，用0. 85%的生理鹽水製成菌懸液，稀釋至ImL菌懸液含菌數約為107，鏡檢菌種健壯且無雜菌後，吸取0. ImL菌懸液均勻塗布於無菌空白培養皿上，無菌風吹乾製成菌膜； B、低能離子注入誘變法誘變處理細胞鏡檢無細胞重疊後，真空條件下對菌體細胞進行離子注入處理，注入離子為N離子，劑量為I. 5 X 1014-5 X IO16 ions/cm2,能量為15_20keV，脈衝注入，每次注入5s，間隔時間15-40S ;將經過離子注入處理後的菌膜用ImL無菌生理鹽水進行洗脫，然後取0. ImL洗脫液塗布於固體平板上，置於37 °C培養箱中培養； C、可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株挑選離子注入後的單菌落進行編號， 並接種到對應編號的發酵培養基中，發酵液PH值在6. 5-7. 5，37 1厭氧發酵48h ;將發酵液過濾除去菌體，濾液經121°C蒸汽滅菌20min，加入I. 5%瓊脂，115°C蒸汽滅菌20min後，力口A 0. 01-0. 05%抑制劑，倒平板，並塗布指示菌，置於35-40°C培養箱中進行培養；選取指示菌生長的平板所對應的編號的突變菌株進行連續傳代培養，通過穩定性試驗，最終得到兩株編號為0108和Zofe. 1109的L-丙氨酸高產菌株； D、擴增培養種子液'Lds.0108和Zofe. 1109分別通過斜面培養和種子罐培養，培養溫度37°C，斜面培養時間24h，種子罐培養時間18h ； E、厭氧發酵生產L-丙氨酸將擴增後的種子液接種到發酵培養基中，底物葡萄糖濃度為6-12%，發酵溫度為35-40°C，培養基pH值為6. 5-7. 5，維持厭氧環境，待殘糖濃度小於0. 1%則發酵完成，發酵時間30-52h ； F、發酵液淨化處理先採用陶瓷超濾膜或有機管式超濾膜過濾，然後通過納濾膜進一步過濾； G、製得成品納濾液經過真空濃縮蒸發，結晶析出L-丙氨酸，經離心，乾燥得成品。
2.根據權利要求I所述的一種誘變乳酸產生菌生產L-丙氨酸的方法，其特徵在於，所述的可逆抑制測定法以L-氨基乙基磺酸為抑制劑，以普通變形桿菌Proteus vulgaris為指示菌。
3.根據權利要求I所述的一種誘變乳酸產生菌生產L-丙氨酸的方法，其特徵在於，所述的厭氧發酵過程中流加氨水或者液氨。
4.根據權利要求I所述的一種誘變乳酸產生菌生產L-丙氨酸的方法，其特徵在於，所述的陶瓷超濾膜或有機管式超濾膜採用20-50納米孔徑以下的。
5.根據權利要求I所述的一種誘變乳酸產生菌生產L-丙氨酸的方法，其特徵在於，所述的納濾膜採用600-1000分子量孔徑以下的。
全文摘要
本發明公開了一種誘變乳酸產生菌生產L-丙氨酸的方法，屬於微生物技術領域，以德氏乳桿菌保加利亞亞種Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus為出發菌種，經過活化出發菌→低能離子注入法誘變處理細胞→可逆抑制測定法篩選生產L-丙氨酸的突變株→擴增培養種子液→厭氧發酵生產L-丙氨酸→發酵液淨化處理→製得成品。有益效果是採用的低能離子注入誘變法突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩定；原材料葡萄糖屬於可再生純天然資源，來源廣泛，價格低廉，且厭氧發酵減少了動力消耗，降低了生產成本；提純過程中使用超濾膜過濾和納濾膜過濾去除雜質，保證了產品質量，適合大規模工業化生產。
文檔編號C12R1/225GK102719502SQ20121014273
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者劉煥書, 孟凡會, 徐龍, 朱傳厚, 苗位雲, 郭志遠, 韓秀麗, 黃建坡 申請人:淮北新旗胺基酸有限公司