一種誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法
2024-04-02 08:43:05 1
專利名稱：一種誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，即 利用重組泛嗜性慢病毒介導外源基因整合到體外培養的櫛孔扇貝細胞中。
背景技術：
海洋雙殼類具較高的經濟價值，是我國海水養殖業的重要組成部分。建立海洋雙 殼類細胞的體外培養體系，將為其基礎生物學、病原體侵染機制、新品種開發研究以及功能 基因的分析等搭建平臺，並最終為扇貝細胞系的建立構建基礎。但在目前的研究中多涉及 添加促進細胞分裂的營養因子，其研究過程漫長、工作量大且進展緩慢。對比於其他組織，心臟組織由於心臟圍心膜的存在，在體外培養時較易克服微生 物的汙染，但是心臟細胞屬於終末分化細胞，退出了細胞分裂周期，導致體外培養時間有 限，所以採用傳統方法進行心臟細胞體外培養比較困難。工作量大且易發生汙染。因此急 需建立一種新的體外轉化方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，以克服現有技術的 不足。本發明特別使用重組泛嗜性慢病毒感染扇貝體外培養心臟細胞，使已經退出細胞 分裂周期的心臟細胞重獲分裂增殖能力，表明該方法用在具有一定分裂能力的扇貝其他組 織細胞中同樣可以獲得成功轉化的細胞，具有通用性。本發明的技術方案如下構建重組SV40LT以及報告基因GFP的慢病毒表達質粒， 並利用293FT細胞包裝出能夠表達目的基因的重組泛嗜性慢病毒；其特徵在於使用重組泛 嗜性慢病毒感染扇貝體外培養組織細胞，並用濃度為2 7微克/毫升的滅瘟素篩選得到 產生螢光或具有分裂能力的轉化細胞。扇貝體外培養心臟細胞的培養方法是首先將扇貝心臟組織樣品，尤其是櫛孔扇 貝心臟組織用煮沸的過濾海水清洗乾淨，在櫛孔扇貝心臟組織專用消毒液中浸泡20分鐘， 煮沸的過濾海水清洗後移至櫛孔扇貝心臟組織剪切液中，剪切至1立方毫米大小後均勻排 布於含1. 5毫升培養基的25毫升培養瓶中，再置於23°C的生化培養箱中培養16 24小時， 之後每天替換2毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基，至櫛孔扇貝心臟細胞遷出後即得到櫛孔扇 貝體外培養心臟細胞，每3天換液一次櫛孔扇貝心臟細胞培養基，以維持體外培養心臟細 胞正常生長。所述的櫛孔扇貝心臟細胞培養基配製方法首先在溶解了 13. 7克L15培養基粉末 的1升水溶液中添加NaCl 20. 2克、KCl 0. 54克、CaCl2O. 60克、MgSO4I克和MgCl23. 9克，成 為1100毫滲透摩爾的高滲透壓的基本培養基，即使L15培養基粉末水溶液獲得與煮沸的過 濾海水相近的滲透壓；用0. 22微米的微孔濾膜過濾除菌；然後再添加已經過濾除菌的5% 胎牛血清、6毫摩爾鈣離子、2毫摩爾L穀氨醯胺、50毫摩爾牛磺酸、100單位/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、50微克/毫升卡那黴素和1微克/毫升制黴菌素；最後調節PH值 至 7. 2 7. 4。所述的櫛孔扇貝心臟組織專用消毒液配方是含有500單位/毫升青黴素、500微克 /毫升鏈黴素、100單位/毫升慶大黴素和2微克/毫升制黴菌素的煮沸的過濾海水的水溶 液。所述的櫛孔扇貝心臟組織剪切液為煮沸的過濾海水或含5%胎牛血清的L15基本
培養基。所述的煮沸的過濾海水較已有的高壓滅菌過濾海水及其製備方法更加簡單、節省 時間，且能很好的達到除去過濾海水中微生物的目的。所述櫛孔扇貝的組織細胞的重組泛嗜性慢病毒感染方法是將含1000 3000個重 組泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的櫛孔扇貝心臟細胞培養基中，之後培養櫛孔扇貝心 髒細胞12 16小時，同時加入6微克/毫升聚凝胺。所述的滅瘟素篩選方法為，使用上述重組泛嗜性慢病毒感染扇貝體外培養組織細 胞3 5天後，在2毫升扇貝組織細胞培養基中添加4 14微克滅瘟素對轉化細胞進行培 養，每3 4天重新添加上述含有滅瘟素的培養基，培養7 10天呈現被篩選出的轉化細 胞。本發明利用重組泛嗜性慢病毒高效的將外源基因轉移到櫛孔扇貝體外培養心臟 細胞中，將外源基因穩定的整合到櫛孔扇貝心臟細胞基因組中，使該外源基因能夠持續的 表達，促進細胞增殖，為進一步構建櫛孔扇貝細胞系奠定基礎。
具體實施例方式本發明首先將重組SV40LT以及報告基因GFP的慢病毒表達質粒，與商品化的包 裝載體一同轉染到293FT細胞中即產生重組泛嗜性慢病毒，收集含有重組泛嗜性慢病毒的 293FT細胞培養液並低溫保存。然後將櫛孔扇貝心臟組織樣品用煮沸的過濾海水清洗3次，去除表面的微生物； 配製櫛孔扇貝心臟組織專用消毒液，配方是含有500單位/毫升的青黴素、500微克/毫升 鏈黴素、100單位/毫升慶大黴素和2微克/毫升制黴菌素的煮沸的過濾海水的水溶液；使 用上述櫛孔扇貝心臟組織專用消毒液浸泡心臟組織20分鐘，煮沸的過濾海水清洗3次後移 至0. 5毫升櫛孔扇貝心臟組織剪切液中，將心臟剪切至1立方毫米大小後均勻排布於含1. 5 毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基的25毫升培養瓶中，再置於23°C的生化培養箱中培養16 24小時，之後每天替換2毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基，1天 4天後心臟組織塊周圍遷出 大量細胞，即得到櫛孔扇貝體外培養心臟細胞，隨後每3天替換櫛孔扇貝心臟細胞培養基2 毫升，以維持體外培養心臟細胞正常生長。誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，將含1000 3000個重組泛嗜性慢病毒的病 毒液加入1毫升的櫛孔扇貝心臟細胞培養基中，同時加入6微克/毫升聚凝胺，之後培養櫛 孔扇貝心臟細胞12 16小時即完成扇貝組織細胞體外轉化(即重組泛嗜性慢病毒成功感 染扇貝組織細胞，使重組SV40LT或報告基因GFP能夠表達)。滅瘟素篩選轉化細胞的方法使用上述重組泛嗜性慢病毒感染扇貝體外培養組織 細胞3 5天後，在2毫升扇貝組織細胞培養基中添加4 14微克滅瘟素對轉化細胞進行
4培養，每3 4天重新添加上述含有滅瘟素的培養基，培養7 10天呈現被篩選出的轉化 細胞。實施例1本發明首先根據已發表的SV40LT基因序列設計正、反向引物，擴增出2. Ikb的 SV40LT基因，在TOPO酶的作用下將SV40LT基因連接到慢病毒表達質粒中，獲得重組慢 病毒表達質粒；採用促轉染試劑Lipofectamine 2000將重組慢病毒表達質粒pLenti6/ V5-D-T0P0/LT轉染包裝細胞株293FT細胞，轉染24h後，鏡下觀察，細胞與轉染前相比，狀態 較差，形狀變圓，將轉染72h時收集含有重組泛嗜性慢病毒的293FT細胞培養液，並-80°C保 存。將櫛孔扇貝心臟組織樣品用煮沸的過濾海水清洗3次，去除表面的微生物；櫛孔 扇貝心臟組織專用消毒液是含有500單位/毫升的青黴素、500微克/毫升鏈黴素、100單 位/毫升的慶大黴素和2微克/毫升的制黴菌素的煮沸的過濾海水的水溶液；配製櫛孔扇 貝心臟細胞培養基首先在溶解了 L15培養基粉末的水溶液中添加NaCl 20. 2克/升、KCl 0. 54克/升、CaCl2O. 60克/升、MgSO4I克/升和MgCl23. 9克/升；用0. 22微米的微孔濾 膜過濾除菌；然後再添加5%胎牛血清、6毫摩爾鈣離子、2毫摩爾L穀氨醯胺、50毫摩爾牛 磺酸、100單位/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、50微克/毫升卡那黴素和1微克/毫 升制黴菌素；最後調節PH值至7. 2。使用上述櫛孔扇貝心臟組織專用消毒液浸泡心臟組織 20分鐘，煮沸的過濾海水清洗3次後移至0. 5毫升櫛孔扇貝心臟組織剪切液中，將心臟剪切 至1立方毫米大小後均勻排布於含1. 5毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基的25毫升培養瓶中， 再置於23°C的生化培養箱中培養16小時，之後每天替換2毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基， 2天後心臟組織塊遷出約4000個細胞，得到櫛孔扇貝體外培養心臟細胞。將含約1000個重組泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的櫛孔扇貝心臟細胞培養 基中，之後培養櫛孔扇貝心臟細胞12小時，同時加入6微克/毫升聚凝胺。病毒感染3天 後，在2毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基中添加4微克滅瘟素對轉化細胞進行篩選，每3天重 新添加上述含有滅瘟素的培養基。篩選10天後，部分細胞脫落死亡，仍然貼壁的細胞出現 分裂現象。實施例2根據已發表的GFP基因序列設計正、反向引物，擴增出700bp的GFP基因。在TOPO 酶的作用下將GFP基因連接到慢病毒表達質粒中，獲得重組慢病毒表達質粒；採用促轉染 試劑Lipofectamine 2000將重組慢病毒表達質粒pLenti6/V5-D_T0P0/GFP轉染包裝細胞 株293FT細胞，轉染24h後，鏡下觀察，細胞與轉染前相比，狀態較差，形狀變圓，轉染48h後 收集含有重組泛嗜性慢病毒的293FT細胞培養液並-80°C保存。將櫛孔扇貝心臟組織用煮沸的過濾海水清洗3次，去除表面的微生物；櫛孔扇貝 心臟組織專用消毒液是含有500單位/毫升的青黴素、500微克/毫升鏈黴素、100單位/毫 升的慶大黴素和2微克/毫升的制黴菌素的煮沸的過濾海水的水溶液；配製櫛孔扇貝心臟 細胞培養基首先在溶解了 L15培養基粉末的溶液中添加NaCl 20. 2克/升、KCl 0. 54克 /升、CaCl2O. 60克/升、MgSO4I克/升和MgCl23. 9克/升；用0. 22微米的微孔濾膜過濾除 菌；然後再添加5%胎牛血清、6毫摩爾鈣離子、2毫摩爾L穀氨醯胺、50毫摩爾牛磺酸、100 單位/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、50微克/毫升卡那黴素和1微克/毫升制黴菌素；最後調節PH值至7. 4。使用上述櫛孔扇貝心臟組織專用消毒液浸泡心臟組織20分鐘， 煮沸的過濾海水清洗3次後移至0. 5毫升櫛孔扇貝心臟組織剪切液中，將心臟剪切至1立 方毫米大小後均勻排布於含1. 5毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基的25毫升培養瓶中，再置於 23°C的生化培養箱中培養24小時，之後每天替換2毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基；4天後 心臟組織塊遷出約8000個細胞，得到櫛孔扇貝體外培養心臟細胞。
將含約3000個重組泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的櫛孔扇貝心臟細胞培養 基中，之後培養櫛孔扇貝心臟細胞16小時，同時加入6微克/毫升聚凝胺。病毒感染5天 後，在2毫升櫛孔扇貝心臟細胞培養基中添加14微克滅瘟素對轉化細胞進行培養，每4天 重新添加上述含有滅瘟素的培養基。培養7天後，部分細胞脫落死亡，仍然貼壁的細胞在熒 光顯微鏡下可觀察到GFP基因表達產物發出綠色螢光信號。
權利要求
一種誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，包括構建重組SV40LT以及報告基因GFP的慢病毒表達質粒，並利用293FT細胞包裝出能夠表達目的基因的重組泛嗜性慢病毒，其特徵在於使用重組泛嗜性慢病毒感染扇貝體外培養組織細胞，並用濃度為2～7微克/毫升的滅瘟素篩選得到產生螢光或具有分裂能力的扇貝體外培養組織轉化細胞。
2.如權利要求1所述的誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，其特徵是所述的扇貝體外 培養的組織細胞是櫛孔扇貝體外培養心臟細胞。
3.如權利要求1所述的誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，其特徵是所述的重組泛嗜 性慢病毒感染扇貝體外培養組織細胞的感染方法是將含1000 3000個重組泛嗜性慢病 毒的病毒液加入1毫升的扇貝組織細胞培養基中，同時加入6微克/毫升聚凝胺，培養扇貝 組織細胞12 16小時即完成誘導扇貝組織細胞體外轉化。
4.如權利要求1所述的誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，其特徵是所述的滅瘟素篩 選方法使用上述重組泛嗜性慢病毒感染扇貝體外培養組織細胞3 5天後，在2毫升扇貝 組織細胞培養基中添加4 14微克滅瘟素對轉化細胞進行培養，每3 4天重新添加上述 含有滅瘟素的培養基，培養7 10天呈現被篩選出的轉化細胞。
5.如權利要求2所述的誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，其特徵是所述的櫛孔扇貝 體外培養心臟細胞的培養方法是首先將櫛孔扇貝心臟組織樣品用煮沸的過濾海水清洗幹 淨，在櫛孔扇貝心臟組織專用消毒液中浸泡20分鐘，煮沸的過濾海水清洗後移至櫛孔扇貝 心臟組織剪切液中，剪切至1立方毫米大小後均勻排布於含1. 5毫升培養基的25毫升培養 瓶中，再置於23°C的生化培養箱中培養16 24小時，之後每天替換2毫升櫛孔扇貝心臟細 胞培養基，至櫛孔扇貝心臟細胞遷出後即得到櫛孔扇貝體外培養心臟細胞，每3天更換櫛 孔扇貝心臟細胞培養基一次，以維持體外培養心臟細胞正常生長。
6.根據權利要求5所述的誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，其特徵是所述的櫛孔扇 貝心臟細胞培養基配製方法首先在溶解了 13. 7克L15培養基粉末的1升水溶液中添加 NaCl 20. 2 克、KCl 0. 54 克、CaCl2O. 60 克、MgSO4I 克和 MgCl23. 9 克，用 0. 22 微米的微孔濾 膜過濾除菌；使用前再添加已過濾除菌的5%胎牛血清、6毫摩爾鈣離子、2毫摩爾L穀氨醯 胺、50毫摩爾牛磺酸、100單位/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、50微克/毫升卡那黴 素和1微克/毫升制黴菌素；最後調節PH值至7. 2 7. 4即製成。
7.根據權利要求5所述的誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，其特徵是所述的櫛孔扇 貝心臟組織專用消毒液是含有500單位/毫升青黴素、500微克/毫升鏈黴素、100單位/ 毫升慶大黴素和2微克/毫升制黴菌素的煮沸的過濾海水的水溶液。
8.根據權利要求5所述的誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法，其特徵是所述的櫛孔扇 貝心臟組織剪切液為煮沸的過濾海水或含5%胎牛血清的L15基本培養基。
全文摘要
本發明涉及一種誘導扇貝組織細胞體外轉化的方法。包括構建重組SV40LT以及報告基因GFP的慢病毒表達質粒，並利用293FT細胞包裝出能夠表達目的基因的重組泛嗜性慢病毒；其特徵在於使用重組泛嗜性慢病毒感染扇貝體外培養組織細胞，尤其是櫛孔扇貝體外培養心臟細胞，並用滅瘟素篩選得到產生螢光或具有分裂能力的轉化細胞。本發明利用重組泛嗜性慢病毒高效的將外源基因轉移到櫛孔扇貝體外培養心臟細胞中，將外源基因穩定的整合到櫛孔扇貝心臟細胞基因組中，使該外源基因能夠持續的表達，促進細胞增殖分裂，為進一步構建櫛孔扇貝細胞系奠定基礎。
文檔編號C12N15/867GK101935676SQ20101025818
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者孫大鵬, 張志峰, 晏萌, 林娜, 王 華, 邵明瑜 申請人:中國海洋大學