蘆竹種苗的培育方法與流程

2024-03-27 20:12:05

本發明涉及植物的組織培養技術，具體涉及蘆竹種苗的培育方法。

背景技術：

蘆竹(Arundo donax)禾本科、蘆竹屬多年生植物，具發達根狀莖，稈粗大直立、堅韌，具多數節，常生分枝，可用於飼料、乙醇、造紙、發電和環境修復等多種行業。

現有蘆竹繁殖有播種、分株、扦插等方法，一般以分株方法為主；通常是早春時用快揪沿植物四周切成有4-5個芽一叢，然後移植；這種方法繁殖速度慢、種苗易帶毒，且勞動強度大、運輸不便，造林成本高，難以在短時間內解決種苗供應緊缺的問題，不利於蘆竹的產業化生產。相對於傳統的方法，利用組培技術對蘆竹進行繁殖，能夠短時間內獲得大量整齊一致的無病毒種苗，種苗生長優勢明顯，是蘆竹種苗產業化繁育的一種有效途徑。如公開號為CN103229720A的發明專利，公開了一種蘆竹愈傷組織再生植株的方法，包括如下步驟：(1)愈傷組織的誘導：將蘆竹組織接種於2，4-D1.0～5.0mg/l培養基中，接種後暗培養3d，然後於光周期為16小時光照8小時黑暗、光照強度為2000Lx條件下培養；(2)愈傷組織的繼代培養：將愈傷組織接種於含2，4-D5.0mg/l培養基中；(3)愈傷組織植株再生：培養基以MS培養基為基本培養基，添加IBA0.5mg/l和6-BA5.0mg/l；(4)壯芽培養；(5)生根培養：壯芽後植株接種於MS添加NAA0～0.5mg/L的培養基中生根；(6)移栽。該發明建立了一種利用蘆竹愈傷組織再生植株的方法，使用培養基配方較為簡單，但其培養時間較長，僅生根培養這一步驟就需要培養1個月左右才能達到90％的生根率。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種生根時間短且生根率高的蘆竹種苗的培育方法。

為解決上述技術問題，本發明採用以下技術方案：

蘆竹種苗的培育方法，包括初代培養步驟、繼代培養步驟和生根培養步驟，其中：

所述的生根培養步驟為：取繼代培養所得的叢生苗分株，轉入生根培養基中，光照培養，得到蘆竹生根苗；其中：

所述生根培養基的配方為：

1/2MS+NAA 0.1-0.3mg·L-1+蔗糖15-25g·L-1+活性炭0.5-3g·L-1，pH 5-5.8。

本發明通過採用特殊配方的生根培養基對採用現有常規方法獲得的繼代叢生苗進行生根培養，在培養時間≥7d時，即可達到90％以上的生根率(判定得到蘆竹生根苗的基準與現有技術中其它植株進行生根培養時得到生根苗的要求相同，具體可以是當叢生苗長出1-2cm的完整根系時即認定得到蘆竹生根苗)，而且每株長根3-5條，根長2-4cm。

上述培育方法的生根培養步驟中，進行光照培養的培養條件優選為：溫度為25±5℃，光照時間為10-15h/d，光照強度為40±5μmol·m-2·s-1；進一步優選為：溫度為25±3℃，光照時間為10-12h/d，光照強度為40μmol·m-2·s-1；所述生根培養基配方優選為：1/2MS+NAA 0.2-0.3mg·L-1+蔗糖15-25g·L-1+活性炭1-2g·L-1，pH 5-5.8；進一步優選為1/2MS+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖20g·L-1+活性炭1g·L-1，pH 5.8。

本發明所述方法中，用於進行生根培養的繼代叢生苗可以採用現有常規方法培育獲得，為了獲得更壯、鬚根多且生長良好的生根苗，優選按本發明提供的初代培養步驟和繼代培養步驟獲取繼代叢生苗；其中：所述的初代培養步驟為：

以蘆竹的帶腋芽莖段作為外植體，消毒後接種於初代培養基中，光照培養，直至在外植體上誘導形成嫩芽；其中：

所述初代培養基配方為：MS+6-BA 3-5mg·L-1+蔗糖25-35g·L-1+瓊脂3-4g·L-1，pH 5-5.8。

上述初代培養步驟中，對外植體的消毒處理與現有技術相同，具體的消毒處理可按下述方法進行：取外植體置於質量濃度為1-3％的洗潔精水溶液中浸泡10-20min，取出後用流水衝洗乾淨，再置於超淨工作檯上用體積濃度為70-75％的乙醇浸泡50-70s，取出後再置於質量濃度為0.1-0.2％的HgCl2中浸泡8-10min，取出，無菌水清洗3-5次。

上述初代培養步驟中，所述初代培養基配方優選為：MS+6-BA 3.5-4.5mg·L-1+蔗糖25-35g·L-1+瓊脂3.2-3.7g·L-1，pH 5-5.8；進一步優選為MS+6-BA 4mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH 5.8；在初代培養時光照培養的培養條件優選為：溫度為25±5℃，光照時間為10-15h/d，光照強度為20±5μmol·m-2·s-1；進一步優選為：溫度為25±3℃，光照時間為10-12h/d，光照強度為20μmol·m-2·s-1。

在上述限定的培養條件下，外植體在初代培養基中誘導得到嫩芽所需的時間約為30-40天。

本發明提供的繼代培養步驟為：將初代培養步驟所得嫩芽轉入繼代培養基中，光照培養，得到叢生苗；其中：

所述繼代培養基配方為：MS+6-BA 7-9mg·L-1+IBA 0.7-0.9mg·L-1+蔗糖25-35g·L-1+瓊脂3-4g·L-1，pH 5-5.8。

上述繼代培養步驟中，繼代培養基配方優選為：MS+6-BA 7.5-8.5mg·L-1+IBA 0.7-0.8mg·L-1+蔗糖25-35g·L-1+瓊脂3.2-3.7g·L-1，pH 5-5.8；進一步 優選為MS+6-BA 8mg·L-1+IBA 0.8mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH 5.8；在繼代培養時光照培養的培養條件優選為：溫度為25±5℃，光照時間為10-15h/d，光照強度為30±5μmol·m-2·s-1；進一步優選為：溫度為22±3℃，光照時間為10-12h/d，光照強度為30μmol·m-2·s-1。

在上述限定的培養條件下，嫩芽在繼代培養基中培養獲得叢生芽苗(約3-6cm)所需的時間約為20-25天。

與現有技術相比，本發明的特點在於：

1、本發明通過採用特殊配方的生根培養基對採用現有常規方法獲得的繼代叢生苗進行生根培養，在培養時間≥7d時，即可達到90％以上的生根率，而且每株長根3-5條，根長2-4cm。

2、進一步地，按本發明提供的初代培養步驟、繼代培養步驟和生根培養步驟可獲得大量整齊一致的無菌種苗，解決了傳統蘆竹種苗繁殖效率低、勞動強度大等問題，而且培育得到的蘆竹生根苗的時間短、生根率高，整個方法簡單易操作，可實現大批量生產，培育得到的蘆竹種苗無菌健壯，移栽後成活率高。

附圖說明

圖1為本發明實施例1培育得到的叢生苗的圖片；

圖2為本發明實施例1培育得到的生根苗的圖片。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳述,以更好地理解本發明的內容,但本發明並不限於以下實施例。

實施例1

1)以蘆竹帶腋芽莖段作為外植體，置於質量濃度為1％的洗潔精水溶液中浸泡10min，取出後在流動的自來水下衝洗乾淨，再置於超淨工作檯上用體積濃度為70％的乙醇浸泡60s，取出後再置於質量濃度為0.1％的HgCl2中浸泡10min，取出，用無菌水清洗5次；

2)將消毒後的外植體接種於初代培養基中，光照培養30天，在外植體上誘導形成嫩芽，所得嫩芽呈鮮綠色，生長良好；其中，所述的初代培養基配方為：MS+6-BA 3.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；光照培養條件為溫度為22±3℃，光照時間為12h/d，光照強度為20μmol·m-2·s-1；

3)將所得嫩芽轉入繼代培養基中，光照培養25天，得到高度為3-5cm的叢生苗(如圖1所示)，繁殖係數為2.7，所得叢生苗多、葉大，生長良好；其中：所述的繼代培養基配方為：MS+6-BA 7.5mg·L-1+IBA 0.8mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；繼代培養時光照培養條件為：溫度為22±3℃，光照時間為12h/d，光照強度為30μmol·m-2·s-1；

4)將所得叢生苗分株，轉入生根培養基中，光照培養10天，得到蘆竹生根苗(如圖2所示)，所得生根苗的主根壯、鬚根多，植株生長良好；經統計， 每株長根3-5條，根長2-4cm，生根率95％；其中：所述的生根培養基配方為：1/2MS+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖20g·L-1+活性炭1g·L-1，pH5.8；光照培養條件為溫度為22±3℃，光照時間為12h/d，光照強度為40μmol·m-2·s-1；

5)將所得生根苗按常規方法進行煉苗，即得到蘆竹種苗。

實施例2

重複實施例1，不同的是：

將步驟2)中的初代培養基配方修改為：MS+6-BA 4.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；經光照培養30天後所得嫩芽呈鮮綠色，較粗壯；

將步驟3)中的繼代培養基配方修改為：MS+6-BA 8.0mg·L-1+IBA 0.8mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；光照培養20天，繁殖係數為4.0，所得叢生苗多、葉大，生長良好，高3-6cm；

將步驟4)中的將生根培養基配方修改為：1/2MS+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖20g·L-1+活性炭1g·L-1，pH5.8；所得生根苗的主根壯、鬚根多，植株較粗壯；經統計，生根率為100％。

實施例3

重複實施例1，不同的是：

將步驟2)中的初代培養基配方修改為：MS+6-BA 4.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；經光照培養30天後所得嫩芽芽鮮綠色，生長良好；

將步驟3)中的繼代培養基配方修改為：MS+6-BA 8.5mg·L-1+IBA 0.8mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；光照培養25天，繁殖係數為2.7，所得叢生苗多、葉中等，生長良好，高3-6cm；

將步驟4)中的將生根培養基配方修改為：1/2MS+NAA 0.3mg·L-1+蔗糖20g·L-1+活性炭1g·L-1，pH5.8；所得生根苗的主根壯、鬚根多，植株生長良好；經統計，生根率為100％。

對比例1

重複實施例1，不同的是：

將步驟2)中的初代培養基配方修改為：MS+6-BA 2.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；經光照培養後所得嫩芽淡綠色、生長緩慢；

將步驟3)中的繼代培養基配方修改為：MS+6-BA 6.5mg·L-1+IBA 0.8mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；繁殖係數為2.0，所得叢生苗植株矮小生長緩慢；

將步驟4)中的將生根培養基配方修改為：1/2MS+NAA 0.08mg·L-1+蔗糖20g·L-1+活性炭1g·L-1，pH5.8；所得生根苗主根不明顯，鬚根較多；經統計，生根率為85％。

對比例2

重複實施例1，不同的是：

將步驟2)中的初代培養基配方修改為：MS+6-BA 5.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；經光照培養後主要朝愈傷組織方向發展，所得嫩芽呈現淡黃色，生長緩慢；

將步驟3)中的繼代培養基配方修改為：MS+6-BA 9.5mg·L-1+IBA 0.8mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂3.5g·L-1，pH5.8；繁殖係數為1.8，所得叢生苗多數較弱；

將步驟4)中的將生根培養基配方修改為：1/2MS+NAA 0.4mg·L-1+蔗糖20g·L-1+活性炭1g·L-1，pH5.8；所得生根苗的只有較少的鬚根且根部較細短；經統計，生根率為75％。

實施例4

1)以蘆竹的帶腋芽莖段作為外植體，置於質量濃度為3％的洗潔精水溶液中浸泡20min，取出後在流動的自來水下衝洗乾淨，再置於超淨工作檯上用體積濃度為75％的乙醇浸泡70s，取出後再置於質量濃度為0.2％的HgCl2中浸泡10min，取出，用無菌水清洗5次；

2)將消毒後的外植體接種於初代培養基中，光照培養30天，在外植體上誘導嫩芽，所得嫩芽芽淡綠色，生長良好；其中，所述的初代培養基配方為：MS+6-BA 5.0mg·L-1+蔗糖35g·L-1+瓊脂4.0g·L-1，pH5.8；光照培養條件為溫度為25±5℃，光照時間為15h/d，光照強度為25μmol·m-2·s-1；

3)將所得嫩芽轉入繼代培養基中，光照培養23天，得到高度為3-6cm的叢生苗，繁殖係數為2.8，所得叢生苗較多、葉大，生長良好；其中：所述的繼代培養基配方為：MS+6-BA 9.0mg·L-1+IBA 0.7mg·L-1+蔗糖35g·L-1+瓊脂4.0g·L-1，pH5.8；繼代培養時的光照培養條件為：溫度為25±5℃，光照時間為15h/d，光照強度為35μmol·m-2·s-1；

4)將所得叢生苗分株，轉入生根培養基中，光照培養8天，得到蘆竹生根苗，所得生根苗的主根壯、鬚根多，植株生長良好；經統計，生根率為91.3％；其中：所述的生根培養基配方為：1/2MS+NAA 0.3mg·L-1+蔗糖25g·L-1+活性炭3g·L-1，pH5.8；光照培養條件為溫度為25±5℃，光照時間為15h/d，光照強度為35μmol·m-2·s-1；

5)將所得生根苗按常規方法進行煉苗，即得到蘆竹種苗。

實施例5

1)以蘆竹的帶腋芽莖段作為外植體，置於質量濃度為1％的洗潔精水溶液中浸泡10min，取出後在流動的自來水下衝洗乾淨，再置於超淨工作檯上用體積濃度為70％的乙醇浸泡50s，取出後再置於質量濃度為0.1％的HgCl2中浸泡8min，取出，用無菌水清洗3次；

2)將消毒後的外植體接種於初代培養基中，光照培養30天，在外植體上誘導嫩芽，所得嫩芽芽淡綠色，生長良好；其中，所述的初代培養基配方為：MS+6-BA 3.0mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂3.0g·L-1，pH5.0；光照培養條件為溫度為25±5℃，光照時間為10h/d，光照強度為15μmol·m-2·s-1；

3)將所得嫩芽轉入繼代培養基中，光照培養25天，得到高度為4-6cm的叢生苗，繁殖係數為3.0，所得叢生苗較多、葉相對較小，生長良好；其中：所述的繼代培養基配方為：MS+6-BA 7.0mg·L-1+IBA 0.9mg·L-1+蔗糖25g·L-1+瓊脂3.0g·L-1，pH5.0；光照培養條件為溫度為25±5℃，光照時間為10h/d，光照強度為35μmol·m-2·s-1；

4)將所得叢生苗分株，轉入生根培養基中，光照培養7天，得到蘆竹生根苗，所得生根苗的主根壯、鬚根多，植株生長良好；經統計，生根率為90.7％；其中：所述的生根培養基配方為：1/2MS+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖15g·L-1+活性炭0.5g·L-1，pH5.0；光照培養條件為溫度為25±5℃，光照時間為10h/d，光照強度為25μmol·m-2·s-1；

5)將所得生根苗按常規方法進行煉苗，即得到蘆竹種苗。

田間實驗：

2015年3月，按本發明實施例2的方法進行培育，將得到的蘆竹種苗直接移栽於實驗田中，之後按常規管理方式進行管理，移栽成活率≥98％(移植蘆竹種苗成活株數/蘆竹種苗的總移植株數×100％)。於2015年11月收成，期間一直按現有常規管理方式進行管理，經統計，畝產量約為5600kg。

2015年3月，按現有傳統方法(具體是將將根莖埋入土中，4月中旬竹筍破土，下旬進入出苗盛期，8月底至9月下旬生長健壯的莖稈陸續抽出淡紫色的花穗，11月份氣候轉冷後，葉片完全凋枯，可以收割。)進行蘆竹的栽培，期間按現有常規管理方式進行管理，整個栽培過程中沒有發生病害。經統計，畝產量約為3600kg。