NK細胞體外擴增培養基組合和培養方法與流程
2024-03-27 21:28:05
本公開涉及生物
技術領域：
，具體地，涉及一種NK細胞體外擴增培養基組合和培養方法。
背景技術：
：自然殺傷細胞(naturalkillercell，NK)是機體重要的免疫細胞，主要分布於外周血中，能夠參與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節的生理過程。現有研究表明，NK細胞是人體內抗癌活性最強的細胞，可以釋放穿孔素在靶細胞表面形成穿孔，再通過顆粒酶進入靶細胞誘導靶細胞凋亡，同時可以分泌大量的細胞因子作用於靶細胞，還可以通過進一步激活其他種類免疫細胞攻擊靶細胞，並可以表達誘導細胞凋亡的蛋白和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，使靶細胞發生程序性凋亡。NK細胞免疫治療在臨床上已成為一種重要的治療手段。但是其在外周血中的數量僅佔淋巴細胞總量的5％左右，如何實現NK細胞體外擴增培養從而應用於治療是關鍵的技術問題。現有的NK細胞體外擴增手段主要包括在培養基中添加動物血清、細胞因子或與其它細胞共同培養來刺激NK細胞的生長。但是動物血清成分較複雜，易給細胞培養帶來不安全因素；細胞因子的添加不當容易引起NK細胞激活受體和抑制受體表達變化；同時，異體的細胞也往往存在醫學上的不安全性和倫理問題。因此，有必要開發一種高效、安全的NK細胞體外擴增方法從而為NK細胞的臨床治療應用提供有力的技術保障。技術實現要素：本公開的目的是提供一種NK細胞體外擴增培養基組合及體外擴增方法。為了實現上述目的，本公開提供一種NK細胞體外擴增培養基組合，包括基礎培養基、誘導培養基、增殖培養基和活化適應培養基；其中，所述基礎培養基的組成成分包括：RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、慶大黴素和BSA；所述誘導培養基的組成成分包括：RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、BSA、香菇多糖、靈芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培養基的組成成分包括：RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、BSA和細胞介素；所述活化適應培養基包括：RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、胰島素、轉鐵蛋白和穀氨醯胺。可選地，所述白細胞介素為IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的至少一種。可選地，所述白細胞介素為IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。可選地，所述基礎培養基包括以下含量的各組分：慶大黴素50-90IU/mL、BSA100-300μg/mL、RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：0.8-1.2。可選地，所述誘導培養基包括以下含量的各組分：BSA100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、靈芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：1-1.4。可選地，所述增殖培養基包括以下含量的各組分：BSA100-300μg/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、IL-185-15ng/mL和IL-215-15ng/mL，RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：1.2-1.6。可選地，所述活化適應培養基包括以下含量的各組分：胰島素1.5-3μg/mL、轉鐵蛋白2-3μg/mL、穀氨醯胺1-2mM，RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：2-4。本公開的第二個方面還提供了一種NK細胞體外擴增培養方法，包括使用本公開的第一個方面所述的NK細胞體外擴增培養基組合，所述方法包括：基礎培養：將分離的單個核細胞接種於基礎培養基中培養1-2天獲得基礎培養細胞；誘導培養：將所述基礎培養細胞接種於誘導培養基中培養2-4天獲得誘導培養細胞；增殖培養：將所述誘導培養細胞接種於增殖培養基中培養4-7天獲得增殖培養細胞；活化適應：將所述增殖培養細胞接種於活化適應培養基中培養0.5-1.5天。可選地，所述接種的細胞密度為4.5×105個/mL-5.5×105個/mL。可選地，所述基礎培養階段、誘導培養階段、增殖培養階段和活化適應階段在免疫細胞體外擴增裝置中進行，所述裝置包括細胞培養袋1和承載所述細胞培養袋1的承載臺3，該裝置還包括容納於所述細胞培養袋1中的磁性浮球2以及在懸掛於所述細胞培養袋1上方並且能夠驅動所述磁性浮球2在所述細胞培養袋1中移動的磁性懸掛驅動器4，所述磁性懸掛驅動器4包括能夠吸引所述磁性浮球2的磁體片41和能夠懸掛且驅動所述磁體片41在所述細胞培養袋1上方移動的懸掛驅動架42；所述細胞培養袋(1)中充有細胞培養液，述細胞培養液中含有培養基以及待擴增的細胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養液液面上；所述磁體片(41)能夠在所述細胞培養袋(1)上方往復移動，從而通過磁力的作用，驅動所述磁性浮球(2)在漂浮狀態下在培養液液面往復移動，所述磁性浮球(2)在培養液液面以下的部分能夠攪拌培養液，從而在所述細胞培養袋(1)中模擬血液流動的體內環境。通過上述技術方案，本公開所提供的NK細胞體外擴增培養基能夠避免動物血清成分和異體細胞的添加，增加了細胞在臨床應用中的安全性。而且採用含有不同組分的培養基在細胞生產的特定階段進行有針對性的培養，可以更好的滿足NK細胞在不同階段的生長需求，更有效的擴增和活化NK細胞，培養獲得的NK細胞數量更多在臨床治療中也具有更高的活性。本公開的其他特徵和優點將在隨後的具體實施方式部分予以詳細說明，附圖說明附圖是用來提供對本公開的進一步理解，並且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用於解釋本公開，但並不構成對本公開的限制。在附圖中：圖1是本公開的免疫細胞體外擴增裝置中一種可選的實施方式的切向示意圖。圖2是本公開的免疫細胞體外擴增裝置中一種可選的實施方式的俯視示意圖。圖3是本公開的免疫細胞體外擴增裝置中一種可選的實施方式的部件示意圖。圖4是實施例和對比例NK細胞擴增倍數結果示意圖。圖5是實施例和對比例培養的NK細胞純度示意圖。圖6是實施例和對比例培養的NK細胞殺傷率結果示意圖。附圖標記說明1細胞培養袋2磁性浮球3承載臺4磁性懸掛驅動器11進氣口12出氣口13進液口14出液口15人工瓣膜片31恆溫託盤32底座41磁體片42懸掛驅動架43懸臂431限位孔432驅動孔4310限位杆4311支撐架4320絲杆4321電動機具體實施方式以下結合附圖對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用於說明和解釋本公開，並不用於限制本公開。本公開的第一個方面提供了一種NK細胞體外擴增培養基組合，包括基礎培養基、誘導培養基、增殖培養基和活化適應培養基；其中，所述基礎培養基的組成成分包括：RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、慶大黴素和BSA；所述誘導培養基的組成成分包括：RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、BSA、香菇多糖、靈芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培養基的組成成分包括：RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、BSA和白細胞介素；所述活化適應培養基包括：RPMI-1640培養基、GT-T551培養基、胰島素、轉鐵蛋白和穀氨醯胺。在本公開的具體實施過程中，根據細胞培養的不同階段依次先後使用所述基礎培養基、誘導培養基、增殖培養基和活化適應培養基。在本公開的一種優選的實施方式中，所述基礎培養基包括以下含量的各組分：慶大黴素50-90IU/mL，BSA100-300μg/mL，RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：0.8-1.2。所述基礎培養基的作用在於使得分離得到的單個核細胞能夠在培養的初始階段更快的適應體外培養環境，從而能夠以較好的細胞生理狀態進入後續的誘導和增殖過程，獲得適用於進一步誘導的基礎培養細胞。分離得到的單個核細胞可以在所述基礎培養基中預培養1-2天。可選的，所述誘導培養基中還可以含有其他來自天然中藥物質的提取物，所述天然中藥提取物可以為已經證實對NK細胞的增殖有積極影響的中藥提取物種類，例如，所述中藥提取物包括但不限於人參多糖、人參皂苷、黃岑素、三七皂苷、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯、薑黃素、雲芝多糖、沙苑子總黃酮、蟲草多糖、黃芪多糖、枸杞多糖、三葉青提取物等。本公開對於添加的天然中藥提取物的量沒有特別的限制，只要能夠有效的提高細胞的增殖數量和活性即可。可選的，所述誘導培養基中還可以含有細胞培養中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、胺基酸、無機鹽、抗生素等。在本公開的一種優選的實施方式中，所述誘導培養基包括以下含量的各組分：BSA100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、靈芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：1-1.4。更為優選的，為了提高誘導培養效果，所述誘導培養基包括以下含量的各組分：BSA120-260μg/mL、香菇多糖60-70μg/mL、靈芝多糖60-70μg/mL、茶多酚25-35μg/mL、大蒜素25-35μg/mL、紫杉醇25-35μg/mL，RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：1-1.4。所述誘導培養基的作用在於通過合理配比利用具有誘導激活作用的物質，對NK細胞進行激活，促使其分泌細胞因子進而加快細胞的增殖。基礎培養後的細胞可以在所述誘導培養基中誘導培養2-4天獲得誘導培養細胞。可選的，所述增殖培養基中還可以含有細胞培養中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、胺基酸、無機鹽、抗生素等。可選的，所述增殖培養基還可以含有其它具有NK細胞刺激作用的細胞因子組分，例如腫瘤壞死因子、表皮生長因子、卵泡刺激因子等；所述白介素可以為IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的一種或多種。在本公開的一種特別優選的實施方式中，所述白細胞介素為IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。優選的，所述增殖培養基包括以下含量的各組分：BSA100-300μg/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、IL-185-15ng/mL和IL-215-15ng/mL，RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：1.2-1.6。所述增殖培養基的作用在於通過合理配比和利用能夠促進NK細胞增殖的物質實現細胞的大量體外增殖。誘導培養後的細胞可以在所述增殖培養基中增殖培養4-7天獲得增殖培養細胞。所述活化適應培養基還可以含有細胞培養中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、胺基酸、無機鹽、抗生素等。優選的，所述活化適應培養基包括以下含量的各組分：胰島素1.5-3μg/mL、轉鐵蛋白2-3μg/mL、穀氨醯胺1-2mM，RPMI-1640培養基與GT-T551培養基的體積比為1：2-4。所述活化適應培養基的作用在於為增殖培養後的NK細胞提供接近體內條件的營養環境，使得NK細胞在臨床應用時能夠更為有效的發揮生物學作用，增殖培養後的細胞可以在所述活化適應培養基中培養0.5-1.5天。本公開的第二個方面提供一種NK細胞體外擴增培養方法，包括使用本公開第一個方面所述的NK細胞體外擴增培養基組合，所述方法包括：基礎培養：將分離的單個核細胞接種於基礎培養基中培養1-2天獲得基礎培養細胞；誘導培養：將所述基礎培養細胞接種於誘導培養基中培養2-4天獲得誘導培養細胞；增殖培養：將所述誘導培養細胞接種於增殖培養基中培養4-7天獲得增殖培養細胞；活化適應：將所述增殖培養細胞接種於活化適應培養基中培養0.5-1.5天。在本公開的第二個方面中，每次進行細胞接種的細胞密度為4.5×105個/mL-5.5×105個/mL。細胞培養的條件包括在5％CO2，37℃的環境下進行。其中，在所述增殖培養階段，優選每兩天進行一次細胞傳代並更換一次新鮮的增殖培養基，傳代可以利用本領域常規的NK細胞傳代方法進行。在本公開的一種可選的實施方式中，所述分離的單個核細胞可以是通過如下方式得到的：採用人淋巴細胞分離液，利用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，可選的，所述淋巴細胞分離液的密度為1.080。在本公開的一種可選的實施方式中，包括將所述PBMC細胞進行磁珠分選，從而得到NK細胞。本公開對於磁珠分選的方法沒有特別的限制，可以通過本領域常規的NK細胞磁珠分選方式進行。在本公開的一種優選的實施方式中，所述基礎培養階段、誘導培養階段、增殖培養階段和活化適應階段在免疫細胞體外擴增裝置中進行，該裝置包括細胞培養袋1和承載所述細胞培養袋1的承載臺3，其中，該裝置還包括容納於所述細胞培養袋1中的磁性浮球2以及在懸掛於所述細胞培養袋1上方並且能夠驅動所述磁性浮球2在所述細胞培養袋1中移動的磁性懸掛驅動器4，所述磁性懸掛驅動器4包括能夠吸引所述磁性浮球2的磁體片41和能夠懸掛且驅動所述磁體片41在所述細胞培養袋1上方移動的懸掛驅動架42；所述細胞培養袋1中充有細胞培養液，述細胞培養液中含有培養基以及待擴增的細胞；所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養液液面上；所述磁體片41能夠在所述細胞培養袋1上方往復移動，從而通過磁力的作用，驅動所述磁性浮球2在漂浮狀態下在培養液液面往復移動，所述磁性浮球2在培養液液面以下的部分能夠攪拌培養液，從而在所述細胞培養袋1中模擬血液流動的體內環境。其中，在使用狀態下，所述細胞培養袋1中充有細胞培養液，所述細胞培養液中含有培養基以及待擴增的細胞，其中，所述培養基為本公開所述的基礎培養基、誘導培養基、增殖培養基或活化適應培養基。所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養液液面上。所述磁體片41能夠在所述細胞培養袋1上方往復移動，從而通過磁力的作用，驅動所述磁性浮球2在漂浮狀態下在培養液液面往復移動，所述磁性浮球2在培養液液面以下的部分能夠發揮柔和地攪拌培養液的作用，從而在所述細胞培養袋1中模擬血液流動的體內環境，由此促進待擴增的細胞的生長和增殖。所述磁體片41可以為永磁體或電磁體。所述磁體片41的形狀可以設置為弧形，以維持所述磁性浮球2的穩定。可選地，所述懸掛驅動架42包括固定連接在所述磁體片41上的懸臂43；所述懸臂43上開設有至少一個限位孔431和至少一個設置有內螺紋的驅動孔432；所述懸掛驅動架42還包括至少二個支撐架4311以及限位連接在所述支撐架4311上的限位杆4310和絲杆4320；所述限位杆4310可滑動地穿過所述限位孔431；所述絲杆4320上設置有與所述驅動孔432的內螺紋匹配的外螺紋並螺旋穿過所述驅動孔432，且所述絲杆4320能夠通過繞軸線轉動驅動所述懸臂43沿所述限位杆4310滑動。其中，所述懸掛驅動架42可以不限於上述結構，只要能驅動所述磁體片41移動即可。所述懸臂43和所述支撐架4311的高度可以設置為能夠按需要調節的結構。所述磁體片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以進行合理地調節，只要能維持所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養液液面上且所述磁性浮球2在磁力作用下能夠移動即可。所述磁體片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以通過所使用的磁性材料的性能和數量的合理改變而得到合理調節。所述磁體片41的數量可以為一個或多個，所述磁性浮球2的數量也可以為一個或多個。可選地，該裝置還包括能夠驅動所述絲杆4320進行軸向轉動的電動機4321。所述電動機4321的轉速可以通過控制器進行合理地控制，避免磁性浮球2的移動速度過快或過慢。可選地，在該裝置的使用狀態下，所述磁性浮球2能夠不與所述細胞培養袋1的壁接觸。也就是說，所述磁體片41與所述磁性浮球2之間的磁力應當小於所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2脫離培養液液面。同時，所述磁體片41與所述磁性浮球2之間的磁力與所述磁性浮球2的合力應當大於所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2沉底。可選地，在該裝置的使用狀態下，以所述磁性浮球2的體積計，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位於所述細胞培養袋1中的細胞培養液液面以上且剩餘部分位於液面以下。這樣可以使得所述磁性浮球2便於移動，且具有較好的驅動液流的攪拌效果。可選地，所述磁性浮球2的外殼為具有生物相容性的外殼，且所述磁性浮球2中設置有用於提供浮力的空腔。其中，生物相容性的外殼可以使用細胞培養領域的常規生物相容性材料製成，例如使用聚乳酸塑料、納米羥基磷灰石材料和聚醚醚酮材料製成。用於提供浮力的空腔可以為一個或多個，空腔中可以填充輕質材料，例如泡沫塑料。所述磁性浮球2中所使用的磁性材料可以為永磁體和/或軟磁體。可選地，所述細胞培養袋1上開設有可封閉的進氣口11、出氣口12、進液口13和出液口14中的至少一者。其中，所述進氣口11可以用於通入新鮮的培養用氣體(例如體積百分比分別為95％的空氣與5％的二氧化碳的混合氣體)。所述出氣口12可以實現培養用氣體的循環。通入新鮮的培養用氣體可以帶有高於大氣壓的壓力，所述出氣口12可以連接有限壓閥。進液口13可以用於向所述細胞培養袋1充入含有培養基以及待擴增的細胞的培養液。所述出液口14可以用於排出舊的培養基或者排出培養擴增後的培養液。可選地，所述出氣口12和/或所述出液口14上設置有能夠阻止細胞通過的篩網。例如所述出液口14上可以設置有濾布，在開啟所述出液口14時，可以將廢舊培養基過濾排出而將細胞過濾留存在所述細胞培養袋1以內。也可以從所述出液口14反向通入新鮮培養基而將濾布上的細胞反向衝洗至細胞培養袋1以內，繼續進行培養擴增。可選地，所述細胞培養袋1的內部還設置有模擬血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述人工瓣膜片15可以適當地模擬生理狀態下的血管瓣膜，也可以適當地增加攪拌液流效果。可選地，所述承載臺3包括能夠維持細胞培養恆溫的恆溫託盤31和支撐所述恆溫託盤31的底座32。所述恆溫託盤31可以在15-40℃的溫度內選擇一個溫度區間保持恆溫，從而使得細胞培養擴增能夠脫離複雜的培養設備而獨立運行。本公開提供的用於細胞體外擴增的裝置所提供的擴增條件優於不進行攪拌的培養擴增條件，也優於其他非懸浮式底部磁性攪拌的培養擴增條件，能夠取得更好的擴增效果。所述免疫細胞體外擴增裝置能夠在體外模擬NK細胞的體內增殖環境，實現模擬血管流動狀態的蠕動式非接觸攪拌，使得免疫細胞在培養過程中降低團聚並充分吸收本公開所述的培養基中的養分並接受信號分子的刺激，提高擴增的細胞收率以及細胞活性。以下結合實施例具體說明本公開的技術方案。實施例1按照表1中給出的培養基成分配製基礎培養基、誘導培養基、增殖培養基和活化適應培養基備用。健康志願者晨起空腹於肘靜脈抽取25mL外周血，加肝素抗凝；利用淋巴細胞分離液進行密度梯度離心，收集單個核細胞層，用PBS離心洗滌後計數A，用基礎培養基對分離的單個核細胞進行重懸，調整細胞密度至5×105個/mL，在本公開所述的免疫細胞體外擴增裝置中進行細胞培養，首先在5％CO2，37℃的環境下進行基礎培養1.5天獲得基礎培養細胞。將細胞離心收集起來，調整細胞密度至5×105個/mL，在5％CO2，37℃的環境下進行誘導培養3天獲得誘導培養細胞。將細胞離心收集起來，調整細胞密度至5×105個/mL，在5％CO2，37℃的環境下進行增殖培養6天(每兩天傳代換液一次)獲得增殖培養細胞。將細胞離心收集起來，調整細胞密度至5×105個/mL，在5％CO2，37℃的環境下，進行活化適應培養1天後收集活化後細胞並計數B，計算細胞的擴增倍數用B除以A獲得的數值即為細胞的擴增倍數。將所述活化後細胞用PBS洗滌兩次，然後調整細胞密度後用流式細胞儀檢測NK細胞佔總細胞的百分數，為細胞純度結果。結果如表5和圖4-5所示。以對數生長期的A549細胞作為靶細胞，以所述活化後細胞作為效應細胞，按照1：1、10：1、20:1的效靶比將效應細胞和靶細胞混合，同時設效應細胞孔、靶細胞孔，每組均設3個平行孔，每孔終體積為200μl，37℃、5％，CO2培養箱中孵育，12h後每孔加入20μlCCK-8溶液，繼續孵育4h，用酶標儀檢測450nm時的OD值，計算NK細胞的殺傷率。結果如表6和圖6所示。本實施例中進行細胞培養的裝置為免疫細胞體外擴增裝置，所述裝置包括細胞培養袋1和承載所述細胞培養袋1的承載臺3，該裝置還包括容納於所述細胞培養袋1中的磁性浮球2以及在懸掛於所述細胞培養袋1上方並且能夠驅動所述磁性浮球2在所述細胞培養袋1中移動的磁性懸掛驅動器4，所述磁性懸掛驅動器4包括能夠吸引所述磁性浮球2的磁體片41和能夠懸掛且驅動所述磁體片41在所述細胞培養袋1上方移動的懸掛驅動架42。所述懸掛驅動架42包括固定連接在所述磁體片41上的懸臂43；所述懸臂43上開設有一個限位孔431和一個設置有內螺紋的驅動孔432；所述懸掛驅動架42還包括二個支撐架4311以及限位連接在所述支撐架4311上的限位杆4310和絲杆4320；所述限位杆4310可滑動地穿過所述限位孔431；所述絲杆4320上設置有與所述驅動孔432的內螺紋匹配的外螺紋並螺旋穿過所述驅動孔432，且所述絲杆4320能夠通過繞軸線轉動驅動所述懸臂43沿所述限位杆4310滑動。電動機4321驅動所述絲杆4320進行軸向轉動。所述細胞培養袋1上開設有可封閉的進氣口11、出氣口12、進液口13和出液口14。所述出氣口12和所述出液口14上設置有能夠阻止細胞通過的篩網。所述細胞培養袋1的內部還設置有模擬血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述承載臺3包括能夠維持細胞培養恆溫的恆溫託盤31和支撐所述恆溫託盤31的底座32。在細胞培養過程中，所述磁性浮球2不與所述細胞培養袋1的壁接觸，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位於所述細胞培養袋1中的細胞培養液液面以上且剩餘部分位於液面以下。所述磁性浮球2的外殼為具有生物相容性的外殼，且所述磁性浮球2中設置有用於提供浮力的空腔。所述免疫細胞體外擴增裝置的切向示意圖如圖1所示、俯視示意圖如圖2所示，懸掛驅動架部件示意圖如圖3所示。表1實施例2用實施例1的方法進行NK細胞體外培養，區別僅在於，所使用的各培養基的組成成分如表2所示。檢測細胞的擴增倍數、純度結果如表5和圖4、5所示，NK細胞的殺傷率結果如表6和圖6所示。表2實施例3用實施例1的方法進行NK細胞體外培養，區別僅在於，所使用的各培養基的組成成分如表3所示。檢測細胞的擴增倍數、純度結果如表5和圖4、5所示，NK細胞的殺傷率結果如表6和圖6所示。表3實施例4用實施例1的方法進行NK細胞體外培養，區別僅在於，增殖培養基中不添加IL-18。檢測細胞的擴增倍數、純度結果如表5和圖4、5所示，NK細胞的殺傷率結果如表6和圖6所示。實施例5用實施例1的方法進行NK細胞體外培養，區別僅在於，培養不使用本公開所述的免疫細胞體外擴增裝置，改為在常規T25細胞培養瓶中進行培養。檢測細胞的擴增倍數、純度結果如表5和圖4、5所示，NK細胞的殺傷率結果如表6和圖6所示。對比例1按照表4中給出的培養基成分配製培養基。健康志願者晨起空腹於肘靜脈抽取25mL外周血，加肝素抗凝；利用淋巴細胞分離液進行密度梯度離心，收集單個核細胞層，用PBS離心洗滌後計數，用培養基對分離的單個核細胞進行重懸，調整細胞密度至5×105個/mL，在本公開所述的免疫細胞體外擴增裝置中進行細胞培養，在5％CO2，37℃的環境下培養12天，每兩天傳代換液一次，培養結束後檢測細胞的擴增倍數、純度和殺傷率。檢測細胞的擴增倍數、純度結果如表5和圖4、5所示，NK細胞的殺傷率結果如表6和圖6所示。表4對比例2用實施例1的方法進行NK細胞體外培養，區別僅在於，不進行活化適應培養。檢測細胞的擴增倍數、純度和殺傷率。檢測細胞的擴增倍數、純度結果如表5和圖4、5所示，NK細胞的殺傷率結果如表6和圖6所示。對比例3用實施例1的方法進行NK細胞體外培養，區別僅在於，培養基組合中不添加GT-T551培養基，僅使用RPMI-1640培養基。檢測細胞的擴增倍數、純度和殺傷率。檢測細胞的擴增倍數、純度結果如表5和圖4、5所示，NK細胞的殺傷率結果如表6和圖6所示。表5組別擴增倍數(倍)純度(％)實施例118693.62實施例217292.27實施例317791.85實施例416290.43實施例516690.86對比例19376.21對比例212878.36對比例313683.47表6通過以上實施例可以看出，利用本公開所提供的NK細胞體外培養基組合和培養方法進行NK細胞體外培養，擴增倍數可以高達186倍，純度可以達到93.62％，效靶比20:1時殺傷率可以達到93％。並且，優選在本公開所述的免疫細胞體外擴增裝置中進行細胞培養時，能獲得更高的NK細胞擴增倍數、純度和殺傷率。並且，優選在增殖培養基中添加IL-18的情況下，能獲得更高的NK細胞擴增倍數、純度和殺傷率。並且，優選培養基組合中含有GT-T551培養基時能獲得更高的NK細胞擴增倍數、純度和殺傷率。以上詳細描述了本公開的優選實施方式，但是，本公開並不限於上述實施方式中的具體細節，在本公開的技術構思範圍內，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本公開的保護範圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內容。當前第1頁1 2 3