無血清無蛋白細胞培養基的製作方法
2024-03-27 23:07:05 2
本發明涉及生物技術領域，具體來說是無血清無蛋白細胞培養基。
背景技術：
動物細胞已被廣泛用於重組蛋白藥物和疫苗的生產，培養基是動物細胞大規模培養的關鍵技術。用傳統的培養基培養細胞，需要在傳統培養基中加入5-10％的血清。血清價格昂貴，容易被病毒和支原體感染，每批次間的質量不穩定，血清中含有大量的蛋白質，給重組蛋白細胞產品的分離純化帶來很大的困難。為了克服以上難題，科學家們對血清中各成分在細胞培養中的作用的研究發現，血清中的胰島素，轉鐵蛋白和其他生長因子是促進細胞生長的主要成分，研發出用胰島素、轉鐵蛋白和其他生長因子替代血清的無血清培養基。由於這些生長因子主要是從血清中提取或者是用基因重組技術生產的，價格昂貴，每批次間的質量也不穩定，大大地限制了此類無血清培養基的大規模生產應用。無血清無蛋白培養基可以避免使用動物源的成分，降低生產成本，簡化下遊分離純化的步驟，避免外源傳染性海綿狀腦病，外源病毒和外源支原體的汙染，實現大規模的生產應用。目前我國也研發出一些無血清無蛋白培養基，但這些培養基只能支持低細胞密度的細胞生長，重組蛋白的表達也比較低，研發支持高細胞密度生長和高重組蛋白表達的無血清無蛋白培養基是目前培養基研究領域中的一項重要課題。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種支持細胞高細胞密度生長的無血清無蛋白成分界定的培養基；一種支持細胞高細胞密度生長和高重組蛋白表達的無血清無蛋白培養基。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案是：無血清無蛋白細胞培養基，包括胺基酸，維生素，無機鹽和微量元素，碳水化合物和其它化學物的成分，還包括聚胺或者其衍生物。
進一步的，所述胺基酸的成分及其在每升培養基中的含量如下：
進一步的，所述維生素的成分及其在每升培養基中的含量如下：
進一步的，所述無機鹽和微量元素的成分及其在每升培養基中的含量如下：
進一步的，所述碳水化合物和其它化學物的成分及其在每升培養基中的含量如下：
進一步的，所述微量元素中還含有以下3種鋅鹽中的任何一種或幾種：I.鹽酸鋅(ZnCl2)，II.硫酸鋅(ZnSO4-7H2O)，III.硝酸鋅[Zn(NO3)2-6H2O]，其在每升培養基中的含量分別如下:
ZnCl2 1–100μM
ZnSO4-7H2O 1–100μM
Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM
進一步的，所述微量元素中還含有以下3種螯合鐵中的任何一種或幾種：I.檸檬酸鐵銨(Ferric ammonium citrate or Ammonium iron(III)citrate)，II.檸檬酸鐵(Ferric citrate or iron(III)citrate)，III.乙二胺四乙酸鐵鈉鹽(Ethylenediaminetetraacetic acid Iron(III)sodium salt)，其在每升培養基中的含量分別如下：
檸檬酸鐵銨 1–500mg/L
檸檬酸鐵 1–500μM
乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 1–500μM
進一步的，所述聚胺或者其衍生物包括以下5種聚胺或者其衍生物中的一種或幾種：I.L-鳥氨酸(L-Ornithine)或者其衍生物，II.腐胺(Putrescine)或者其衍生物，III.亞精胺(Spermidine)或者其衍生物， IV.精胺(Spermine)或者其衍生物，V.屍胺(Cadaverine)或者其衍生物，其在每升培養基中的含量分別如下：
進一步的，所述無血清無蛋白細胞培養基中還含有另外2種聚胺或者其衍生物，胍基丁胺(Agmatine)或者其衍生物和L-瓜氨酸(L-Citrulline)或者其衍生物，其在每升培養基中的含量分別如下：
胍基丁胺或者其衍生物 1–1000μM
L-瓜氨酸或者其衍生物 1–1000μM
進一步的，所述無血清無蛋白細胞培養基中還含有水解物，所述水解物是酵母抽提物，或者酵母抽提物和大豆水解物的混合物，或者酵母抽提物和棉子水解物的混合物。
進一步的，所述酵母抽提物在每升培養基中的含量為1–8g，所述酵母抽提物和大豆水解物的混合物中酵母抽提物和大豆水解物在每升培養基中的含量各為1–8g，所述酵母抽提物和棉子水解物的混合物中酵母抽提物和棉子水解物在每升培養基中的含量各為1–8g。
本發明的有益技術效果是：本發明無血清無蛋白細胞培養基中不含有蛋白質，所有成分都是來自無動物源的。本發明無血清無蛋白細胞培養基使用後活細胞密度，細胞成活率和重組蛋白的表達明顯效果優異，遠超其它細胞培養基。適用於用於重組蛋白和疫苗生產的細胞，尤其是CHO，NS0，Sp2/0，PerC.6，Cap，BHK，HEK293，Expi293，HT1080，Hela，MDCK，Vero細胞，可以很好的應用於重組蛋白和疫苗的生產，降低生產成本，減少汙染風險。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例。
圖1為本發明中重組蛋白在不同無血清無蛋白細胞培養基中的表達對比圖。
通過該附圖可見：重組蛋白在含有水解物的無血清無蛋白細胞培養基中的表達明顯高於在無血清無蛋白成分界定的細胞培養基中的表達，該附圖對應實施例中表9。
具體實施方式
下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
實施例1：
無血清無蛋白成分界定的細胞培養基，包括胺基酸、維生素、無機鹽和微量元素、碳水化合物和其他化學物、聚胺或者其衍生物，其具體成分含量構成為：
胺基酸的成分及其在每升培養基中的含量如下：
維生素的成分及其在每升培養基中的含量如下：
無機鹽和微量元素的成分及其在每升培養基中的含量如下：
其它微量元素及其在每升培養基中的含量如下：
ZnCl2 1–100μM
或者ZnSO4-7H2O 1–100μM
或者Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM
其它微量元素及其在每升培養基中的含量如下：
檸檬酸鐵銨 1–500mg
或者檸檬酸鐵 1–500μM
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 1–500μM
碳水化合物和其它化學物的成分及其在每升培養基中的含量如下：
聚胺或者其衍生物的成分及其在每升培養基中的含量如下：
實施例2：
無血清無蛋白成分界定的細胞培養基，包括胺基酸、維生素、無機鹽和微量元素、碳水化合物和其他化學物、聚胺或者其衍生物，其具體成分含量構成為：
胺基酸的成分及其含量：
維生素的成分及其含量：
無機鹽的成分及其含量：
微量元素的成分及其含量：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
其它微量元素的成分及其含量：
ZnCl2 68.15mg/L
或者ZnSO4-7H2O 143.78mg/L
或者Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L
其它微量元素的成分及其含量：
檸檬酸鐵銨 2g/L
或者檸檬酸鐵 489.88mg/L
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 734.1mg/L
碳水化合物和其它化學物的成分及其含量：
其它化學物的成分及其含量：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L
其它化學物的成分及其含量：
氯化膽鹼 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
聚胺或者其衍生物的成分及其含量：
L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L
本實施例無血清無蛋白成分界定的細胞培養基的製備方法：
步驟1：將無血清無蛋白成分界定的細胞培養基的成分按照不同的組分配製成不同的濃縮液：
10倍的胺基酸濃縮液：
200倍的維生素濃縮液：
1倍的無機鹽：
1000倍的微量元素濃縮液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍的其它微量元素濃縮液：
ZnCl2 68.15mg/L
或者ZnSO4-7H2O 143.78mg/L
或者Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L100倍的其它微量元素濃縮液：
檸檬酸鐵銨 2g/L
或者檸檬酸鐵 489.88mg/L
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 734.1mg/L
1倍的碳水化合物和其它化學物：
100倍的其它化學物濃縮液：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L
100倍的其它化學物濃縮液:
氯化膽鹼 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
100倍的聚胺或者其衍生物濃縮液：
L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L
步驟2：配製1倍的1L液體培養基：將以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去離子水的1L燒杯中並混勻，再加入去離子水定容至1L；
步驟3：調節PH值和滲透壓：用5N NaOH或者5N HCl調節pH至7.30，用NaCl調節滲透壓至295mOsm/L；
步驟4：用0.22μM的過濾膜除菌。
CHO細胞在本實施例不同配方的無血清無蛋白成分界定的細胞培養基中的批次懸浮培養及其實驗數據見表1和表2。培養條件和實驗方法：在125ml的振蕩培養瓶中分別加入30ml不同配方的無血清無蛋白成分界定的細胞培養 基，放入37℃含有5％二氧化碳的培養箱中，以每分鐘120轉搖床培養6天，每天取樣用Trypan blue血球計數法記錄活細胞密度(倍10E6cells/ml)和細胞存活率(％)。
表1
表2
實施例3：
無血清無蛋白成分界定的細胞培養基，包括胺基酸、維生素、無機鹽和微量元素、碳水化合物和其他化學物、聚胺或者其衍生物，其具體成分含量構成為：
胺基酸的成分及其含量：
維生素的成分及其含量：
無機鹽的成分及其含量：
微量元素的成分及其含量：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
其它微量元素的成分及其含量：
ZnCl2 68.15mg/L
其它微量元素的成分及其含量：
檸檬酸鐵銨 2g/L
或者檸檬酸鐵 489.88mg/L
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 734.1mg/L
碳水化合物和其它化學物的成分及其含量：
其它化學物的成分及其含量：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L
其它化學物的成分及其含量：
氯化膽鹼 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
聚胺或者其衍生物的成分及其含量：
本實施例無血清無蛋白成分界定的細胞培養基的製備方法：
步驟1：培養基配製：將無血清無蛋白成分界定的細胞培養基的成分按照不同的組分配製成不同的濃縮液。
10倍的胺基酸濃縮液：
200倍的維生素濃縮液：
1倍的無機鹽：
1000倍的微量元素濃縮液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍的其它微量元素濃縮液：
ZnCl2 68.15mg/L
100倍的其它微量元素濃縮液：
檸檬酸鐵銨 2g/L
或者 檸檬酸鐵 489.88mg/L
或者 乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 734.1mg/L
1倍的碳水化合物和其它化學物：
100倍的其它化學物濃縮液：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L
100倍的其它化學物濃縮液:
氯化膽鹼 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
100倍的聚胺或者其衍生物濃縮液：
步驟2：配製1倍的1L液體培養基：將以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去離子水的1L燒杯中並混勻，再加入去離子水定容至1L；
步驟3:調節PH值和滲透壓：用5N NaOH或者5N HCl調節pH至7.30，用NaCl調節滲透壓至295mOsm/L；
步驟4：用0.22μM的過濾膜除菌。
CHO細胞在本實施例不同配方的無血清無蛋白成分界定的細胞培養基中的批次懸浮培養及其實驗數據見表3和表4。培養條件和實驗方法：在125ml的振蕩培養瓶中分別加入30ml不同配方的無血清無蛋白成分界定的細胞培養基，放入37℃含有5％二氧化碳的培養箱中，以每分鐘120轉搖床培養6天，每天取樣用Trypan blue血球計數法記錄活細胞密度(倍10E6cells/ml)和細胞存活率(％)。
表3
表4
實施例4：
無血清無蛋白細胞培養基，成分包括胺基酸，維生素，無機鹽和微量元素，碳水化合物和其它化學物，聚胺或者其衍生物，水解物。其具體成分含量構成為：
胺基酸的成分及其在每升培養基中的含量如下：
維生素的成分及其在每升培養基中的含量如下：
無機鹽和微量元素的成分及其在每升培養基中的含量如下：
其它微量元素及其在每升培養基中的含量如下：
ZnCl2 1–100μM
或者ZnSO4-7H2O 1–100μM
或者Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM
其它微量元素及其在每升培養基中的含量如下：
檸檬酸鐵銨 1–500mg
或者檸檬酸鐵 1–500μM
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 1–500μM
碳水化合物和其它化學物的成分及其在每升培養基中的含量如下：
聚胺或者其衍生物的成分及其在每升培養基中的含量如下：
水解物的成分及其在每升培養基中的含量如下：
酵母抽提物 1–8g/L
或者 酵母抽提物1-8g/L和大豆水解物1-8g/L的混合物
或者 酵母抽提物1-8g/L和棉子水解物1-8g/L的混合物
實施例5：
無血清無蛋白細胞培養基，成分包括胺基酸，維生素，無機鹽和微量元素，碳水化合物和其它化學物，聚胺或者其衍生物，水解物。其具體成分含量構成為：
胺基酸的成分及其含量：
維生素的成分及其含量：
無機鹽的成分及其含量：
微量元素的成分及其含量：
其它微量元素的成分及其含量：
檸檬酸鐵銨 2g/L
或者檸檬酸鐵 489.88mg/L
或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 734.1mg/L
碳水化合物和其它化學物的成分及其含量：
聚胺或者其衍生物的成分及其含量：
L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L
水解物的成分及其含量：
酵母抽提物2g/L
或者 酵母抽提物2g/L和大豆水解物2g/L的混合物
或者 酵母提物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物
本實施例無血清無蛋白細胞培養基的製備方法：
步驟1：培養基配製：將無血清無蛋白細胞培養基的成分按照不同的組分配製成不同的濃縮液：
10倍的胺基酸濃縮液：
200倍的維生素濃縮液：
1倍的無機鹽：
1000倍的微量元素濃縮液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍的其它微量元素濃縮液：
ZnCl2 68.15mg/L
100倍的其它微量元素濃縮液：
檸檬酸鐵銨 2g/L
或者檸檬酸鐵 489.88mg/L
或者 乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 734.1mg/L
1倍的碳水化合物和其它化學物：
100倍的其它化學物濃縮液：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L
100倍的其它化學物濃縮液:
氯化膽鹼 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
100倍的聚胺或者其衍生物濃縮液：
L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L
1倍的水解物：
酵母物抽提物2g/L
或者酵母抽提物2g/L和大豆水解物2g/L的混合物
或者酵母抽提物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物
步驟2：配製1倍的1L液體培養基：將以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去離子水的1L燒杯中並混勻，再加入去離子水定容至1L；
步驟3：調節PH值和滲透壓：用5N NaOH或者5N HCl調節pH至7.30，用NaCl調節滲透壓至295mOsm/L；
步驟4：用0.22μM的過濾膜除菌。
CHO細胞在本實施例不同配方的無血清無蛋白細胞培養基中的批次懸浮培養及其實驗數據見表5和表6。培養條件和實驗方法：在125ml的振蕩培養 瓶中分別加入30ml不同配方的無血清無蛋白細胞培養基，放入37℃含有5％二氧化碳的培養箱中，以每分鐘120轉搖床培養6天，每天取樣用Trypan blue血球計數法記錄活細胞密度(倍10E6cells/ml)和細胞存活率(％)。
表5
表6
實施例6：
無血清無蛋白細胞培養基，成分包括胺基酸，維生素，無機鹽和微量元素，碳水化合物和其它化學物，聚胺或者其衍生物，水解物。其具體成分含量構成為：
胺基酸的成分及其含量：
維生素的成分及其含量：
無機鹽的成分及其含量：
微量元素的成分及其含量：
其它微量元素的成分及其含量：
檸檬酸鐵銨 2g/L
或者 檸檬酸鐵 489.88mg/L
或者 乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 734.1mg/L
碳水化合物和其它化學物的成分及其含量：
其它化學物的成分及其含量：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L
其它化學物的成分及其含量：
氯化膽鹼 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
聚胺或者其衍生物的成分及其含量：
水解物的成分及其含量：
酵母抽提物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物
本實施例無血清無蛋白細胞培養基的製備方法：
步驟1：培養基配製：將無血清無蛋白細胞培養基的成分按照不同的組分配製成不同的濃縮液：
10倍的胺基酸濃縮液：
200倍的維生素濃縮液：
1倍的無機鹽：
1000倍的微量元素濃縮液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍的其它微量元素濃縮液：
ZnCl2 68.15mg/L
100倍的其它微量元素濃縮液：
檸檬酸鐵銨 2g/L
或者檸檬酸鐵 489.88mg/L
或者 乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 734.1mg/L
1倍的碳水化合物和其它化學物：
100倍的其它化學物濃縮液：
次黃嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脫氧核苷 387.568mg/L
100倍的其它化學物濃縮液:
氯化膽鹼 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
100倍的聚胺或者其衍生物濃縮液：
1倍的水解物：
酵母抽提物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物
步驟2：配製1倍的1L液體培養基：將以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去離子水的1L燒杯中並混勻，再加入去離子水定容至1L；
步驟3：調節PH值和滲透壓：用5N NaOH或者5N HCl調節pH至7.30，用NaCl調節滲透壓至295mOsm/L；
步驟4：用0.22μM的過濾膜除菌。
CHO細胞在本實施例不同配方的無血清無蛋白細胞培養基中的批次懸浮培養及其實驗數據見表7和表8。培養條件和實驗方法：在125ml的振蕩培養瓶中分別加入30ml不同配方的無血清無蛋白細胞培養基，放入37℃含有5％二氧化碳的培養箱中，以每分鐘120轉搖床培養6天，每天取樣用Trypan blue血球計數法記錄活細胞密度(倍10E6cells/ml)和細胞存活率(％)。
表7
表8
重組蛋白CHO細胞在不同配方的無血清無蛋白細胞培養基中的批次懸浮培養表達實驗見表9和圖1。培養條件和實驗方法：在125ml的振蕩培養瓶中分別加入30ml不同配方的無血清無蛋白細胞培養基，放入37℃含有5％二氧化碳的培養箱中，以每分鐘120轉搖床培養6天，取樣做Western blot。
表9
如圖1所示重組蛋白在含有水解物的無血清無蛋白細胞培養基中的表達明顯高於在無血清無蛋白成分界定的細胞培養基中的表達。
不限上述實施例的本發明所述無血清無蛋白細胞培養基各成分具體作用以及原理表達如下：
胺基酸：胺基酸是構成蛋白質的主要成分，同時通過胺基酸的代謝為細胞的生長提供能源。細胞培養基中的胺基酸主要包括21種，其中9種必須胺基酸：L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-纈氨酸和12種非必須胺基酸：L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬醯胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-胱氨酸，L-穀氨酸，L-穀氨醯胺，L-甘氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-酪氨酸。由於穀氨醯胺在培養基中的不穩 定性，常用相同摩爾濃度的L-丙氨醯-L-穀氨醯胺取代穀氨醯胺。CHO細胞是脯氨酸缺陷型細胞，CHO細胞的生長需要脯氨酸。由於傳統細胞培養基中的胺基酸濃度過低，傳統細胞培養基只能支持低細胞密度的貼壁培養，要支持高細胞密度的懸浮培養，必須大幅提高培養基中的胺基酸濃度，同時保證各胺基酸濃度的平衡，避免因某種胺基酸的耗盡限制細胞的生長和重組蛋白的表達。
維生素：維生素是細胞生長和代謝中許多重要酶的輔基和輔酶，細胞培養基中的維生素主要是B族維生素包括：泛酸鈣，煙醯胺，鹽酸吡哆醇，鹽酸硫胺，維生素B12，生物素，葉酸，核黃素等。
無機鹽：無機鹽對維持細胞膜的滲透壓，對營養物質通過細胞膜起著重要的調節作用。培養基中的無機鹽主要包括：Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Cl-，HPO42-，HCO3-等，其中磷是構成DNA和RNA的重要元素，HCO3-起到培養基PH的調節作用。
微量元素：微量元素是細胞生長和代謝中許多重要酶的輔基，培養基中的微量元素主要包括：Fe，Zn，Cu，Mn，Se等。
鋅鹽和螯合鐵：血清中的胰島素和轉鐵蛋白是促進細胞生長的主要生長因子，鋅離子(Zn2+)具有調節葡萄糖代謝的功能，可以替代胰島素。螯合鐵：檸檬酸鐵銨或者檸檬酸鐵或者乙二胺四乙酸鐵鈉鹽能有效地把鐵離子傳遞給細胞，可以替代轉鐵蛋白。
碳水化合物：碳水化合物主要是為細胞的生長提供能源，為胺基酸，DNA的合成提供前體物質，細胞培養基中的碳水化合物主要是葡萄糖。
其它化學物：培養基中還含有一些其它化學物，次黃嘌呤，胸腺嘧啶脫氧核苷是DNA補救合成途徑中的主要前體物，氯化膽鹼、肌醇和氯化乙醇胺是構成細胞膜磷脂的重要成分，丙酮酸鈉和檸檬酸鈉能快速進入細胞的代謝並且對培養基起到穩定的作用，在培養基中加入葡聚糖硫酸鈉可以減少細胞在高細胞密度懸浮培養中的細胞聚團。在培養基中加入表面活性劑Kolliphor p188可以降低細胞在懸浮培養過程中所產生的剪切力對細胞的損傷。由於葡聚糖硫酸鈉和表面活性劑Kolliphor p188會降低細胞的附著能力，對於培養貼壁和附著生長的細胞，應除去無血清無蛋白細胞培養基中的葡聚糖硫酸鈉和表面活性劑Kolliphor p188。
聚胺(Polyamine)：聚胺對促進細胞的生長起著重要的作用。
水解物：通常重組蛋白在無血清無蛋白成分界定的細胞培養基中的表達都比較低，酵母抽提物，大豆水解物和棉子水解物已被廣泛用於提高重組蛋白的表達，在成分界定的無血清無蛋白細胞培養基中加入水解物可以提高重組蛋白的表達。
本發明中的水解物均為市場上買得到的無動物源水解物，酵母抽提物是在市場上買得到的無動物源酵母抽提物，例如BD Biosciences的Yeast extract UF 210929等，大豆水解物是在市場上買得到的酶分解的無動物源大豆水解物，例如Kerry BioScience or Sheffield BioScience的酶分解的大豆水解物HyPep1502等，棉子水解物是在市場上買得到的酶分解的無動物源棉子水解物，例如Kerry BioScience or Sheffield BioScience的酶分解的棉子水解物HyPep7504等。
本發明的培養基中不含有蛋白質，所有成分都是來自無動物源的，本發明無血清無蛋白細胞培養基使用後活細胞密度，細胞成活率和重組蛋白的表達明顯效果優異，遠超其它細胞培養基。適用於用於重組蛋白和疫苗生產的細胞，尤其是CHO，NS0，Sp2/0，PerC.6，Cap，BHK，HEK293，Expi293，HT1080，Hela，MDCK，Vero細胞，可以很好的應用於重組蛋白和疫苗的生產，降低生產成本，減少汙染風險。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。