防除連作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有機肥料的製作方法

2024-03-01 16:07:15

專利名稱：：防除連作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有機肥料的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種能防除連作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有機肥料，屬於農業集約化生產技術，專用於克服和消除連作番茄青枯病問題。二
背景技術：
：番茄青枯病是由茄科勞爾氏菌(及a/Wom'flw/fl"acean/w)引起的細菌性維管束土傳病害。1906年美國Simth學者首次發現並報導這一病害，至今全世界除南極洲外，其他國家和地區均有青枯病的存在。勞爾氏菌被分為五個生理小種和6個生化小種。各小種對番茄均有一定的致病能力，其中生理小種l對番茄的致病力最強。在我國，番茄青枯病主要發生在溫暖溼潤的南方，隨著氣候變暖和高效農業發展，青枯病逐漸向我國北方發展。青枯菌能通過土壤、流水(灌溉等)、種子等方式傳播，對環境有很強的適應能力。土壤中存在青枯菌後，初期由於病菌數量少，植株生長受到限制，矮小，果實小，農民往往認為是養分問題而加大氮肥投入，導致土壤中微生物群落進一步失衡，番茄連作3季以上，病原菌在根際成優勢菌，從而侵染番茄。在高溫高溼的條件下，病害發展迅速，發病嚴重的田塊發病率達100%，造成絕收。目前南方很多蔬菜基地不再適合種植番茄，對我國番茄市場的發展影響很大。目前沒有防治番茄青枯病的有效手段，利用根際微生物防治病害是綜合防治土傳病害的重要措施之一。生物防治技術滿足現代農業對環境保護，食品安全等的要求，是實現農業可持續農業發展的有效方法之一。另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規模化養殖後的畜禽糞便隨地棄置等不僅嚴重汙染了環境，也極大地浪費了能作為有機肥和生物有機肥產品的原料；大量的養分資源(C、N、P、K、S及微量元素)流失於土壤-植物系統之外，明顯地削弱了我國農業可持續發展的能力。如何將從土壤中因收穫作物而取走的營養元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機廢棄物製成商品有機肥料再施入土壤。如果將這些固體有機廢棄物經過高溫發酵合成髙品位的有機堆肥，再用於功能菌的載體，所製成的微生物有機肥料功能明確，將會有很好的應用前景。三、
發明內容1.技術問題本發明的目的在於提供一種能防治連作番茄青枯病的拮抗菌及其微生物有機肥料，克服或消除連作番茄作物青枯病效率達到80%以上，使大量的設施農業土壤和露地連作障礙土壤得到生物修復，確保集約化農業的順利發展。2.技術方案防除連作番茄青枯病的拮抗菌NJQL-18，該菌株屬於解澱粉芽孢桿菌(5""7/附w>Vo//^e/ac/eAW)，2009年7月9日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCN0.3177,主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G+,細胞形狀為短杆狀，形成芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶反應陽性、石蕊牛乳產酸腖化、V.P.反應陽性，甲基紅試驗陰性，發酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨糖、纖維二糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖產酸並產氣，不能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，澱粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。用拮抗菌NJQL-18所生產的防除連作番茄青枯病微生物有機肥料，該肥料中含有lxl0MVg以上的拮抗菌NJQL-18、全氮含量質量比為4~5%，全氮中質量比卯％以上為有機氮，總氮磷鉀養分為610%、有機質含量為3035%。所述的防除連作番茄青枯病微生物有機肥料，其生產方法包括1)選用拮抗菌NJQL-18，接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵條件為pH生長範圍自然，培養溫度範圍2530'C，攪拌速度為180300轉/分鐘，發酵中後期形成芽孢,發酵的拮抗菌液含菌或芽孢量^xi(T個/ml;所用PDA培養液配製方法為(以配製1L培養基為例)用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調至7,2-7.4，121'C滅菌20min。2)將拮抗菌分別與腐熟後的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物進行固體發酵，每噸固體有機物料中加入拮抗菌液50L，發酵溫度為30-50'C，使拮抗菌含量達到lxlS個/g以上，獲得拮抗菌NJQL-18固體菌劑；所用腐熟的豬糞堆肥發芽指數為98%以上，有機質含量》35%，有機氮含量為l.2-2%,含水量25-30%。3)再將豬糞堆肥NJQL-18固體菌劑與30-50。/。的菜粕微生物酶解混合物的NJQL-18固體菌劑按照50-70%:30-50%(體積比)的比例充分混合，後熟2-3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過60'。的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為防除連作番茄青枯病微生物有機肥料。所述微生物有機肥料可專用於防除連作番茄青枯病。3.有益效果4本發明一種能克服或消除連作番茄青枯病的微生物有機肥料及其生產方法，利用豬糞堆肥和菜粕的微生物酶解混合物，再與拮抗菌液混合後製成微生物有機肥料，其產品與目前市場上的產品相比具有如下優點1)肥料產品中含有抑制番茄青枯病原細菌生長的專一性高效菌株(NJQL-18菌)，其抑制效果非常顯著，肥料中該高效菌株的含量達到lxlS個/g以上，施入土壤後能形成優勢群，並在土壤中存活下來。2)肥料產品中含有豐富的可溶性有機碳和有機氮，能給功能菌提供十分優越的生長環境，極大地提高了外來功能菌在土壤中的定殖和發揮功能的能力。3)本發明產品有機磷和有機氮含量特別高，均達到4%。本產品原料之一為豬糞堆肥，總磷含量很高，而且生物有效性特別高，在做成生物有機肥產品中無需添加任何含磷化肥，使用本產品後能使作物順利度過苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤後生物有效性較差；本產品中有機氮能達到4%以上(大部分為胺基酸和小分子多肽)，確保了氮素持續穩定的供應，使番茄的生長和抗逆能力大大增強。4)試驗結果表明，在連作番茄的土壤上施用本產品後，能顯著降低番茄青枯病的發病率，生物防治率達80%以上，連續三年施用本肥料的土壤，連作青枯病的生物防治率更高。四圖l拮抗菌NJQL-18液體菌劑對番茄青枯病的防治效果圖2NJQL-18有機肥對番茄青枯病防治效果CKns指育苗時不用NJQL-18有機肥，CKts指移栽後不施用NJQL-18有機肥；BIOns指育苗時用NJQL-18有機肥，BIOts指移栽時穴施NJQL-l8有機肥五具體實施例方式1.菌株的分離和鑑定採集已經發生連作障礙並出現番茄青枯病病症的植株和周圍土壤，採用SMSA青枯病選擇性培養基獲得病原菌株並驗證其致病性。採集連作番茄青枯病發病的田塊健康番茄植株根際土壤，分別利用NA改良培養基、PDA改良培養基和LB改良培養基利用對峙法、牛津杯法以病原菌為指示菌進行拮抗試驗，分離和初篩拮抗菌株。通過盆栽試驗復篩高效拮抗菌株，最終獲得高效拮抗菌株NJQL-18，並進行鑑定，菌種凍幹一20'C保存。菌株NJQL-18屬於解澱粉芽孢桿菌(5ad//zaw_y/o//^e/"c/e";y)，主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G+，細胞形狀為短杆狀，形成芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶反應陽性、石蕊牛乳產酸腖化、V.P.反應陽性，甲基紅試驗陰性，發酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨糖、纖維二糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖產酸並產氣，不能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，澱粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。2.菌劑生產1)將拮抗菌NJQL-18接種至ljPDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為pH生長範圍自然，培養溫度範圍2530'C，攪拌速度為180~300轉/分鐘，發酵中後期形成芽孢，發酵的拮抗菌液含菌或芽孢量2lxl(^個/ml;所用PDA培養液配製方法為(以配製1L培養基為例)用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min，接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調至7.2-7.4,121'C滅菌20min。2)將拮抗菌分別與腐熟後的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物進行固體發酵，每噸固體有機物料中加入拮抗菌液50L，發酵溫度為30-50'C,使拮抗菌含量達到lxlS個/g以上，獲得拮抗菌NJQL-18固體菌劑；所用腐熟的豬糞堆肥發芽指數為98%以上，有機質含量》35%,有機氮含量為1.2-2%,含水量25-30%。其中菜粕的微生物分解混合物製備方法為(公知公用，見發明專利ZL200610086126.0，一種農用胺基酸的生物製取方法及其肥料產品)，菌株37-l發酵液加入到菜粕原料中，調節含水量55-65。/。和pH6.0-7.5，進行開放式固體發酵，待發酵溫度上升至50'C時立即開始翻堆，以後每天翻堆，使堆溫始終維持在35-5(TC共5天，固體發酵開始後，堆物的pH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調節含水量和pH,使它們分別維持在55-65%和6.0-7.0，發酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物pH調整為5.0左右，再進行低溫乾燥或自然涼幹，即為菜粕的微生物分解混合物(含胺基酸的混合材料)。3)再將豬糞堆肥的NJQL-18固體菌劑與菜粕微生物酶解混合物的NJQL-18固體菌劑按照50-70%:30-50%的比例充分混合，後熟2-3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過60'C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30W以下，包裝出廠即為防除連作番茄青枯病微生物有機肥料。該肥料產品中含有lxl0MVg以上的拮抗菌NJQL-18、全氮含量質量比為45%,全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分為6~10%、有機質含量為3035%。可專用於防除連作番茄青枯病。3.溫室防效試驗考察NJQL-18液體菌劑或微生物有機肥(功能菌為NJQL-18)防治番茄青枯病的能力。1)NJQL-18液體菌劑的防治效果供試土壤為青枯病發病土壤，採自南京麒麟鎮後村番茄青枯病發病田塊。番茄品種為合作903,為青枯病感病品種。種子表面消毒後，播種到裝有400g健康土壤的小缽子裡(500ml)進行育苗，30天後進行試驗。在處理營養缽中加入20mlNJQL-18菌懸液(109cfii/ml)，而對照營養缽中加入20ml無菌水，三天後移栽到5公斤的盆缽中。移栽後14天開始記錄發病情況，移栽21天後，對照植株的感病指數達83.3%,NJQL-18處理植株的感病指數為30。/。，防病率達64.0%,表明NJQL-18表現出較很好的防治效果。而且經NJQL-18液體菌劑處理後，番茄地上部乾重增加了82.4%,表現出明顯的促生作用(圖l、表l)。2)微生物有機肥的防治效果供試土壤為青枯病發病土壤，採自南京麒麟鎮後村番茄青枯病發病田塊。供試品種為合作903，為青枯病感病品種。實驗設置3個處理1)CKns+CKts;2)BIOns+CKts;3)BIOns+BIOts。CKns指育苗時不用NJQL-18有機肥，CKts指移栽後不施用NJQL-18有機肥；BIOns指育苗時用NJQL-18有機肥，BIOts指移栽時穴施NJQL-18有機肥。番茄種子表面消毒後，播種到裝有400g健康土壤(拌入2%的NJQL-18有機肥或不拌入，所有處理均為等養分，氮磷鉀用化肥補齊。)的小缽子裡(500ml)，育苗50天(春季)後將番茄移栽到含有青枯病發病土壤的周轉箱，每箱12株，每處理2重複。移栽時處理3)的每株番茄根部施用5gNJQL-18有機肥。移栽後47天的防治效果見圖2。結果表明育苗時施用NJQL-18有機肥的防病率達82.7y。，育苗和移栽都施用NJQL-18有機肥的防病率高達89.6。/。(表O。施用微生物有機肥還顯著促進番茄生長，地上部鮮重增加124.4%。試驗結果說明，單純使用液體菌劑在發病嚴重的土壤中防病率為64.0%，將生防菌製成微生物有機肥後可顯著提高防病效果，達到89.6%。_表lNJQL-18溫室防治番茄青枯病效果_處理移栽後天數(天)感病指數(％)防病率(％)幹(鮮)重增加(％)液體菌劑CKNJQL-18CK+CK21214783.330.096.464.082.4(幹)微生物有機肥BIO+CK4716.782.7%92.5(鮮)BIO+BIO4710.089.6%124.4(鮮)注:番茄青枯病發病等級分5級:0級表示植株正常；1級表示植株葉片萎蔫比例￡25%:2級表示26%^植株葉片萎蔫比例^50%:3級表示51%植株葉片萎蔫比例^75%;4級表示76°/<^植株葉片萎蔫比例<(對照感病指數-處理感病指數)/對照感病指數4.田間試驗為驗證本發明的微生物有機肥在田間的防治效果，在南京麒麟鎮後村番茄青枯病發病大棚進行了田間試驗。番茄品種為合作903。實驗處理如下1)對照(CK)，育苗時不施用有機肥；2)普通有機肥(OF)(不含功能微生物)，即育苗時施用2%普通有機肥；3)NJQL-18有機肥(BIO)，即育苗時施用2WNJQL-18有機肥。所有處理均為等養分，氮磷鉀用化肥補齊。移栽後108天後(收穫後期)的結果見(表2)。用NJQL-18有機肥育苗後番茄青枯病的生物防治率達到86.8%，番茄增產30%。表2大田發病率、防病率和產:tableseeoriginaldocumentpage8本發明專利從改善土壤微生物區系這一關鍵問題著手，研製出一種能顯著降低連作番茄青枯病發生的微生物有機肥料產品，防治率達80%以上。本肥料產品的作用機制在於本肥料產品中的有效碳和有效氮源給產品中的功能菌的培育提供了很好的條件，使之迅速建立外源有益功能菌微生物的生態及其食物鏈；另一方面，本肥料產品中含有較高含量的有機氮和有機磷，這些營養物質對連作障礙土壤中作物的生長十分有利，大大提高了作物的立苗率和抗逆能力。權利要求1、一種防除連作番茄青枯病的拮抗菌，該菌株NJQL-18屬於解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，2009年7月9日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNO.3177，主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G+，細胞形狀為短杆狀，形成芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶反應陽性、石蕊牛乳產酸腖化、V.P.反應陽性，甲基紅試驗陰性，發酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨糖、纖維二糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖產酸並產氣，不能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，澱粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。2、用權利要求1所述拮抗菌NJQL-18所生產的防除連作番茄青枯病微生物有機肥料。3、根據權利要求2所述的防除連作番茄青枯病微生物有機肥料，其特徵在於該肥料中含有lxl8個/g以上的拮抗菌NJQL-18、全氮含量質量比為45%，全氮中質量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養分為610%、有機質含量為3035%。4、權利要求2或3所述防除連作番茄青枯病微生物有機肥料的生產方法，包括1)將拮抗0NJQL-18接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，其發酵條件為pH生長範圍自然，培養溫度範圍2530'C，攪拌速度為180300轉/分鐘，發酵中後期形成芽孢，發酵的拮抗菌液含菌或芽孢量^lxl(^個/ml;2)將拮抗菌分別與豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物進行固體發酵，每噸固體有機物料中加入拮抗菌液50L,發酵溫度為30-50'C,使抬抗菌含量達到lxl0MVg以上，獲得拮抗菌NJQL-18固體菌劑；3)再將豬糞堆肥的NJQL-18固體菌劑與菜粕微生物酶解混合物的NJQL-18固體菌劑按照體積比50-70%:30-50%的比例充分混合，後熟2-3天，後熟過程中翻堆2次，最後在溫度不超過60'C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30。/。以下，包裝出廠即為防除連作番茄青枯病微生物有機肥料。5、根據權利要求4所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟(1)所用PDA培養液配製方法為，以配製1L培養基為例用200g土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後煮30min,接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調至7,2-7.4，121'C滅菌20min。6、根據權利要求4或5所述微生物有機肥料的生產方法，其中步驟(2)所用腐熟的豬糞堆肥發芽指數為98%以上，有機質質量比含量》35%，有機氮質量比含量為1.2-2%,含水量質量比25-30%。7、權利要求2或3所述微生物有機肥料的應用。全文摘要本發明涉及防除連作番茄青枯病的拮抗菌及其生產的微生物有機肥料，屬於農業集約化生產技術。本發明分離到了對番茄青枯病病原細菌有顯著拮抗作用的拮抗菌NJQL-18，該拮抗菌與有機物料再進行固體發酵製成微生物有機肥料，肥料中含有1×108個/g以上的NJQL-18、全氮含量為4～5％(90％以上為有機氮)，總氮磷鉀養分為6～10％、有機質含量為30～35％。試驗表明，這種微生物有機肥料施入土壤後能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優勢群，在發病嚴重的番茄青枯病土壤中生防效率達80％以上。在還沒有形成連作障礙的土壤上長期施用本微生物有機肥料能在很大程度上防止連作番茄青枯病的發生。文檔編號C12N1/20GK101659933SQ200910183360公開日2010年3月3日申請日期2009年9月18日優先權日2009年9月18日發明者徐陽春,楊興明,標沈,沈其榮,中韋申請人:南京農業大學被以下專利引用(3),