誘導水稻生成植物抗毒素的誘導劑的篩選方法和以誘導劑為有效成分的水稻病害防除劑的製作方法
2024-03-01 19:45:15
專利名稱：誘導水稻生成植物抗毒素的誘導劑的篩選方法和以誘導劑為有效成分的水稻病害防除劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有誘導水稻生成植物抗毒素性質的誘導劑的篩選方法，以及將利用該篩選方法篩選出的誘導劑作為有效成分的水稻病害防除劑等。再詳細點說，本發明涉及能迅速而且正確地篩選誘導水稻生成植物抗毒素的誘導劑的方法，該篩選方法是先栽培試驗用的水稻，然後將試驗樣品施用於該水稻的適宜的部位，以水稻中生成的特定的植物抗毒素作為篩選的指標物質進行分析，通過分析，篩選出具有誘導水稻生成phytocassane和momilactone等植物抗毒素性質的物質的方法。由於這些植物抗毒素對於水稻病害，例如稻瘟病菌、稻紋枯病菌和稻胡麻斑病菌具有很強的抗菌性，所以具有誘導水稻生成植物抗毒素性質的誘導劑作為水稻病害防除劑的有效成分是很有用的。
另外，本發明還涉及到具有誘導水稻生成植物抗毒素作用的腦苷脂化合物PO8、PO9、R2以及腦苷脂衍生物，以及將一種或兩種以上該類物質用作水稻病害防除劑的使用方法，具體講，該方法是通過將腦苷脂化合物以及其衍生物施用到水稻的葉子上，誘導水稻生成phytocassane和momilactone等植物抗毒素的方法。由於這些植物抗毒素對於水稻病害，例如稻瘟病菌、稻紋枯病菌和稻胡麻斑病菌具有很強的抗菌性，所以該腦苷脂化合物以及其衍生物作為水稻病害防除劑的有效成分是很有用的。
一般來說，人們知道植物與病原菌一接觸，就表現出抗性反應(過敏反應)，在反應部位周圍組織產生對病原菌顯示出抗菌性的植物抗毒素。作為水稻的植物抗毒素，已知有momilactone A、B,oryzalexin A、B、C、D、E、F、S,sakuranetin,oryzalic acid A、B,oryzalide A、B。此外，還有本發明者等人發現的phytocassane A、B、C和D(特願平7-43520)。
誘導植物體產生植物抗毒素的物質稱為誘導劑(elicitor)(Keen,N.T.；《科學》Science 187:74-75(1975))，到目前為止，已經從植物病原菌中分離出了很多誘導劑。其中代表性的誘導劑有多糖類物質、蛋白類物質和脂類物質。多糖類物質有從大雄疫黴Phytophthora megasperma f.sp.glycinea分離出的hepta-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sharp,J.K.,B.Valentand,P.Albersheim；(美)《生物的化學雜誌》J.Biol.Chem.259:11321-11336(1984))，蛋白類物質有從Monilinia fructicola分離出的鏈核膽鹼Monicholine A(Cruickshank,I.A.M.和D.R.Perrin；《生命科學》LifeSci.7:449-458(1968))，脂類物質有從致病疫黴Phytophthora infestans分離出的eicosapentaenoic acid(Bostock,R.M.,J.Kuc和R.A,Laine；《科學》Science 212:67-69(1975))。
如上所述，誘導劑由於具有誘導植物體對病原菌產生顯示出抗菌性的植物抗毒素的作用，同時又由於具有與以往的農藥不同的作用，人們認為它可能成為安全性高的植物病害防除劑的有效成分，人們迫切希望發現有用的誘導劑，以及作為能發現有用誘導劑的方法，即能夠迅速而且簡便地探索具有誘導活性的物質的新的探索方法。
在上述那樣的狀況下，本發明者等借鑑上述以前的技術，以開發探索誘導水稻生成植物抗毒素的有用的誘導劑的新的探索方法為目標，儘管一直在反覆深入研究，但使用水稻進行篩選具有誘導活性的物質的方法是非常難的，可以說到目前為止還沒有完全確立篩選的有效方法。而本發明人在為反覆進行開發篩選有效方法所進行的各種研究中，在新確立試驗水稻的種類，水稻的栽培方法，試驗樣品的施用方法，植物抗毒素的分析方法等基本技術方面獲得了成功，利用這些基本方法和技術使得篩選具有誘導劑活性的物質成為可能。
就是說，對於試驗使用的水稻，研究結果表明試驗水稻的品種和種類、栽培的溫度和溼度、試驗水稻的齡期、試驗樣品施用的部位等非常重要，很清楚，將這些條件設定為最適條件，就可以作為篩選方法使用。而關於分析的植物抗毒素，最好是以phytocassane和momilactone為例，確定誘導水稻中產生的植物抗毒素的提取方法和利用HPLC的分析方法。
利用上述方法試驗了各種物質，結果發現了數種具有誘導劑活性的化合物。
另外本發明人使用上述的篩選方法，以微生物產物為對象廣泛地篩選具有誘導活性的物質，結果發現在包括植物病原菌的絲狀菌中廣泛地存在著這樣的具有誘導活性的物質。
進一步通過溶劑提取、柱層析等手段對具有誘導活性的物質進行分離，得到3種活性物質，並進行了結構解析，結果表明這3種活性物質是下述結構式表示的腦苷脂化合物PO8、PO9和R2。同時研究結果證明這些物質作為水稻病害防除劑的有效成分是有效的，從而完成了本發明。PO8
PO9
R2
本發明人等對於作為具有誘導活性的物質發現的腦苷脂化合物PO8、PO9和R2的化學結構已有報導，PO8與腦苷脂A(Sitrin.R.D.等；《抗生素雜誌》J.Antibiot.41；469-480(1988)),PO9和PENII(Kawai.G.等；《農業生物化學》Agric.Biol.Chem.49:2137-2146(1985)),R2與腦苷脂B(Kawai.G.等；《脂質研究雜誌》J.Lipid.Res.,26:38-343(1985))具有同一結構。然而就報導的這些物質來說，與本發明有關的誘導活性方面的報導還沒有，同時本發明人首次闡明了該腦苷脂化合物對水稻具有防除病害作用。
本發明的課題在於提供誘導水稻生成植物抗毒素的誘導劑的篩選方法以及水稻病害防除劑。
本發明涉及具有誘導水稻生成植物抗毒素性質的誘導劑的篩選方法，具體講該篩選方法是以水稻的幼苗作為試驗植物，將試驗樣品施用於該水稻幼苗的適宜的部位，以水稻中生成的植物抗毒素作為篩選的指標物質進行誘導劑篩選的方法，同時本發明還涉及以具有誘導水稻生成植物抗毒素作用的特定化合物作為有效成分的水稻病害防除劑。
利用本發明，可以簡便而且高精度地進行誘導水稻生成抗毒素的誘導劑的篩選，同時可以提供無殘留毒性的低毒性、無公害的水稻病害防除劑。
如上所述，本發明涉及誘導水稻生成抗毒素的誘導劑的篩選方法，涉及到用水稻幼苗為試驗植物，利用HPLC分析水稻中生成的抗毒素(phytocassane和momilactone)的方法。同時還涉及利用本方法獲得的具有誘導活性的物質。
就是說，本發明的目的是提供誘導水稻生成抗毒素的誘導劑的篩選方法。
另外，本發明另一個目的是提供以水稻抗毒素phytocassane和momilactone A作為指標物質，能迅速而且簡便地探索具有誘導水稻生成抗毒素性質的誘導劑的篩選方法。
提供以具有誘導水稻生成抗毒素作用的特定的物質作為有效成分的水稻病害防除劑也是本發明的一個目的。
本發明為解決上述課題，涉及誘導水稻抗毒素生成的誘導劑的篩選方法，該誘導劑篩選方法的特徵是用水稻幼苗為試驗植物，然後將試驗樣品施用於該水稻幼苗的適宜的部位，以水稻中生成的特定的植物抗毒素作為指標物質進行誘導劑篩選的方法。
而本發明是將特徵如下的誘導劑篩選方法作為優選的實施方案，這些特徵是將試驗樣品滴施於水稻幼苗葉子的前端部分，然後用溶劑提取該植物體中生成的植物抗毒素，以水稻植物抗毒素phytocassane和momilactone A作為指標物質，利用高效液相色譜(HPLC)進行分析。
另外本發明也涉及到從利用上述篩選方法篩選的具有誘導水稻生成植物抗毒素作用的選自2-吡嗪羧酸、吡啶羧酸、2,6-吡啶二羧酸、2,3-吡啶二羧酸、吡咯-2-羧酸、氧嗪酸、腦苷脂化合物PO8、PO9、R2及其衍生物的一種或2種以上物質作為有效成分的水稻病害防除劑。
下面，就本發明進行更詳細的說明。
本發明人就誘導水稻產生植物抗毒素的物質的篩選方法，對試驗水稻的品種、栽培條件、植物抗毒素的分析條件等進行了詳細的研究。研究結果表明，試驗中使用的水稻品種，「秋田小町」Akitakomachi和「越光」Koshihikari等比較合適；培土為含有適宜的水稻生長所必需的氮、磷酸、鉀肥的顆粒狀培土，具體來說，使用HONENS 1號培土(全農)是合適的，作為試驗水稻的栽培條件，控制溫度、溼度和照度是重要的。具體來說，例如將出芽的種子植在缽中，在30-32℃的暗室中大約培育2～3天，等到芽伸出土壤表面上大約2～3cm時，移入人工氣象室內。人工氣象室的條件保持在溫度為18～20℃，溼度為80～85％，照度為2000～3000lux的條件下。當第2真葉長出期間，將照度調到3000～4000lux，溼度調到95～100％，白天溫度調到27～30℃，一直培育到第5真葉完全展開為止。不用說，這些栽培條件可以在與上述條件同等的範圍內進行適當地變更。另外，使用毛細移液管將試驗樣品滴施在第5真葉的前端部分的滴施方法是最理想的方法。
施用了樣品的水稻再栽培一周後，將施用了樣品的部分剪碎後，用乙酸乙酯、甲醇等溶劑進行提取，提取物用HPLC分析，例如，就phytocassane和momilactone的分析來說，從保留時間35分鐘左右的phytocassane A，保留時間43分鐘左右的phytocassane B，保留時間50分鐘左右的momilactone A的各個峰高可以求出誘導的植物抗毒素的量。對於其它的植物抗毒素也可以同樣進行分析。
上述篩選方法基本上是由如下一些步驟構成的。1試驗植物(水稻)(1)品種秋田小町Akitakomachi和越光Koshihikari(2)令期水稻幼苗，特別是真葉5齡(3)栽培栽培到第6真葉完全展開為止2試驗樣品的施用(1)施用部位葉身，特別是葉子的前端部分(2)施用方法用毛細移液管滴施(3)施用後的栽培期大約1周3提取和分析(1)樣品的製備將施用部位剪碎(2)提取用乙酸乙酯、甲醇等溶劑提取(3)分析用HPLC分析根據這一篩選方法，發現後面實施例2給出的化合物可以作為誘導水稻產生植物抗毒素的物質。
另外本發明人使用上述篩選方法，以檢索能誘導水稻產生植物抗毒素的物質作為目標，將樣品塗布於水稻葉身的葉面上之後進行適時栽培，測定水稻中產生的植物抗毒素的量，通過各種各樣的試驗，證實以稻瘟病和水稻稻紋枯病菌等植物病原菌為代表的絲狀菌體的有機溶劑提取物表現出高的誘導植物抗毒素的活性。誘導植物抗毒素產生的物質，例如PO8、PO9可以通過用乙酸乙酯、丙酮和乙醇等溶劑提取，經HPLC、薄層層析等手段進行精製，可以分離得到它們的單一成分。
作為培養本發明中使用的培養植物病原菌的液體培養液，只要是由現有使用的植物或微生物的提取物的絲狀菌培養中使用的培養基，無論哪一種都可以用，但優選的是例如PSY培養基等。這些培養基中使用了馬鈴薯等植物提取成分，或者是酵母提取物等。
作為PO8、PO9提取、分離的具體過程，例如可以用乙酸乙酯等溶劑提取稻瘟病菌體後，使用TSKgel ODS120A/IDS120T(東曹社制)等柱子通過HPLC分級，再經濃縮乾燥等精製過程等精製分離的方法可以作為理想的方法，但不限於給出的方法，將其它的同樣的精製的方法進行適當的組合進行分離和精製也是可能的，所以對於PO8、PO9提取、分離的精製過程並沒有特的限定。對於R2也可以通過同樣的精製手法例如從稻紋枯病菌中分離和精製。
本發明涉及的PO8、PO9和R2具有如下的性質。1)通過FAB-MS進行質譜分析，PO8的分子量為725,PO9為753，而R2為727。2)PO8、PO9和R2分別表現出
圖1～3給出的紅外吸收光譜圖。3)PO8、PO9和R2分別表現出圖4～6給出的1H-NMR光譜圖。4)PO8、PO9和R2分別表現出圖7～9給出的13C-NMR光譜圖。5)PO8、PO9和R2具有誘導水稻產生植物抗毒素的作用。作為誘導的植物抗毒素有phytocassane A、B、C、D,momilactoneA、B等。由於這些植物抗毒素對稻瘟病菌、稻紋枯病菌和稻胡麻斑病菌具有很強的抗菌性，可以認為受到這些物質誘導的水稻對病菌的感染表現出抗性。
本發明涉及的PO8、PO9和R2就象後面實施例給出的那樣具有誘導水稻產生植物抗毒素的性質，所以PO8、PO9和R2作為對稻瘟病菌、稻紋枯病和稻胡麻斑病等水稻病害的防除劑的有效成分是有用的。即，將該化合物作成適宜形態的製劑施用於水稻，可以防止水稻病害的發生。
本發明的水稻病害防除劑就象後面實施例給出的那樣，根據它們的使用目的，最好是將含有上述有效量的物質做成適宜形態的製劑，製劑的形態和製劑的手段並沒有特別的限定。作為將具有誘導水稻生成植物抗毒素作用的化合物施用於水稻的方法，就象後面實施例給出的那樣，例如，先將該化合物溶解於含有0.1％Tween 20的20mM磷酸緩衝液(pH7.0)中，然後將該溶液噴灑在水稻上，該方法雖然作為理想的方法例示於此，但不限於此，其它的方法也可以利用，將該化合物施用於水稻的製劑的形態，該製劑的施用方式和施用的方法等並沒有特別的限定。
附圖的簡單說明圖1表示本發明涉及的腦苷脂化合物PO8的紅外吸收光譜。
圖2表示本發明涉及的腦苷脂化合物PO9的紅外吸收光譜。
圖3表示本發明涉及的腦苷脂化合物R2的紅外吸收光譜。
圖4表示本發明涉及的腦苷脂化合物PO8的1H-NMR光譜圖。
圖5表示本發明涉及的腦苷脂化合物PO9的1H-NMR光譜圖。
圖6表示本發明涉及的腦苷脂化合物R2的1H-NMR光譜圖。
圖7表示本發明涉及的腦苷脂化合物PO8的13C-NMR光譜圖。
圖8表示本發明涉及的腦苷脂化合物PO9的13C-NMR光譜圖。
圖9表示本發明涉及的腦苷脂化合物R2的13C-NMR光譜圖。
以下根據實施例具體說明本發明，但本發明並不受以下實施例的任何限定。實施例1(1)作為試驗植物使用的水稻的栽培用鹽水挑選水稻種子(品種秋田小町Akitakomachi或越光Koshihikari)，去除不好的種子後，使種子發芽。長出芽的種子植入HONENS培土1號(全農)，直徑6cm的缽中植入8粒種子，於32℃的暗室中培育大約2～3天。芽大約長出土壤表面2～3cm時，移入人工氣象室內的玻璃箱中。人工氣象室保持溫度為18℃，溼度80％，照度3000lux的條件，水稻缽置於有一定遮光的場所。當第2真葉長出後階段，將照度調到3000lux，溼度調到100％，白天溫度調到27～30℃，一直培育到第5真葉完全展開為止。這樣栽培的水稻幼苗供以下試驗用。(2)樣品的施用和植物抗毒素的誘導樣品如表1給出的那樣，準備1～6個樣品。
使用毛細移液管將樣品溶液各20μl滴施於上述栽培的水稻幼苗的第5真葉的前端部分的10個點上。樣品按所設定的濃度溶解於含有0.1％Tween 20的20mM磷酸緩衝液(pH7.0)中，供植物抗毒素誘導試驗用。
施用了樣品的水稻在溼度為80％、照度為2000lux、夜間溫度為18℃、白天溫度為23℃的人工氣象室中栽培3天。然後將白天的溼度設定為100％後再栽培4天。(3)植物抗毒素的提取和分析採取8枚施用了樣品的水稻葉子，剪碎後，加入10ml乙酸乙酯-0.1NNa2CO3混合液(1∶1)，進行過夜的振蕩提取。提取物經離心分離(5000rpm、4℃/20分鐘)，取上清液(乙酸乙酯相)濃縮乾燥。乾燥的提取物溶解於0.4ml的乙醇中，然後再加入0.6ml的0.02N HCl進行混合。將混合液離心，得到的上清液100μl供HPLC分析用。HPLC的條件如下。柱子TSK-gel ODS 120T(4.6mm×300mm)溶劑∶乙腈-水(45∶55)(體積比)流速1.2ml/min溫度50℃檢測器UV 280nm(phytocassane)/215nm(momilactone)(4)結果按照上述方法廣泛地進行化合物的篩選，篩選結果確認下面的1～6個樣品有誘導植物抗毒素生成的作用。1)2-吡嗪羧酸(2-Pyrazinecarboxylic acid)2)吡啶羧酸(Picolinic acid)3)2,6-吡啶二羧酸(2,6-Pyridinedicarboxylic acid)4)2,3-吡啶二羧酸(2,3-Pyridinedicarboxylic acid)5)吡咯-2-羧酸(Pyrrole-2-carboxylic acid)6)氧嗪酸(Oxonic acid，鉀鹽)1．2-Pyrazinecarboxylic acid
2．Picolinic acid
3．2,6-Pyridinedicarboxylic acid
4．2,3-Pyridinedicarboxylic acid
5．Pyrrole-2-carboxylic acid
6．Oxonic acid，鉀鹽
實施例2表1誘導產生的植物抗毒素量
如表1所示的那樣，很清楚，樣品1～6具有誘導水稻植物抗毒素生成的作用，作為水稻病害防除劑的有效成分是有用的。實施例3PO8、PO9的製備(1)稻瘟病菌的培養將剝了皮的馬鈴薯200g切碎，加入1L蒸餾水，於121℃進行60分鐘的高壓滅菌處理。高壓滅菌處理後，用紗布將固形物過濾除去，製備成1L的濾液。然後向濾液中加入2％的蔗糖和0.5％的酵母提取液，製備成PSY培養基。按照每瓶裝200ml將培養基分裝到500ml的三角燒瓶中。於121℃下進行40分鐘的滅菌，然後向冷卻的培養基中接種稻瘟病菌(race 031株)。於26℃下進行7天的振蕩培養(150rpm)。(2)PO8、PO9的提取、精製培養結束後，用紗布過濾培養物，收集稻瘟病菌菌體。然後加入菌體重量5倍量左右的蒸餾水，將pH調到10.5，加入與水等體積的乙酸乙酯，進行攪拌、提取。分離乙酸乙酯相，在減壓條件下，蒸餾除去乙酸乙酯，得到油狀的殘渣。將殘渣溶解於85％的乙醇中，製備的樣品液注入TSKgel ODS 120A HPLC柱(21.5mm×375mm，東曹社制)，用91％的乙醇(10ml/min)洗脫。PO8在保留時間25分鐘前後，PO9在保留時間30分鐘前後被洗脫出來。分別收集各自的級分，用同一根柱子再進行一次層析。PO8用81％乙醇(10ml/min)於保留時間60分鐘前後，PO9用86％乙醇(10ml/min)在保留時間40分鐘前後被洗脫出來。收集各個級分使用TSK gel ODS 120T柱(21.5mm×375mm，東曹社制)，進行HPLC，用95％的乙腈(10ml/min)進行分級，PO8在保留時間43分鐘前後，PO9在保留時間60分鐘前後被洗脫出來。分別收集各個級分，蒸餾掉溶劑，得到PO8、PO9的純品。實施例4R2的製備將稻紋枯病菌於稻瘟病菌同樣的條件下培養並使用乙酸乙酯進行粗提取，回收的級分供HPLC分析試驗用。通過HPLC一次精製，使用TSKgel ODS 120A柱(21.5mm×375mm，東曹社制)，R2用91％乙醇(10ml/min)在保留時間26分鐘前後被洗脫出來。作為二次精製，用86％乙醇(10ml/min)再進行層析，R2在保留時間50分鐘前後被洗脫出來。再使用TSK gel ODS 120T柱(21.5mm×375mm，東曹社制)，以乙腈和乙醇分別含有46.5％的混合液作為洗脫液，用10ml/min的流速進行分級，R2在保留時間53分鐘前後被洗脫出來，完全被精製。實施例5利用PO8、PO9和R2進行植物抗毒素的誘導(1)植物抗毒素的產生將實施例1中得到的PO8、PO9和R2溶解於含有0.1％的Tween20的20mM磷酸緩衝液(pH6.5)中，製備100ppm的樣品溶液。將各種濃度的樣品溶液和不含樣品的溶劑施用於用缽栽培的水稻(品種秋田小町Akitakomachi)上，然後測定誘導植物抗毒素產生的活性。這種情況下，施用的部位為完全展開的第5真葉的前端部分，在隔開適當的距離的10個點上用毛細移液管滴施20μl(每一葉)的各個樣品溶液。(2)植物抗毒素的提取將用樣品溶液處理的水稻在人工氣象室中培養7天後，取8片處理葉，剪碎後，加入10ml的乙酸乙酯-0.1N碳酸鈉混合液(1∶1,pH10)，振蕩過夜。取乙酸乙酯相，濃縮乾燥，再溶解於4ml的乙醇中。(3)利用HPLC進行分析在上述溶液中加入0.02N Hcl 0.6ml混合後，進行離心分離處理。從得到的上清液中取100μl供HPLC分析。
HPLC的條件如下。柱子TSK-gel ODS 120T(4.6mm×300mm東曹社制)溶劑∶乙腈-水(45∶55)(體積比)流速1.2ml/min溫度50℃檢測器UV 280nm(phytocassane)/215nm(momilactone)下面的表2中給出了誘導產生的植物抗毒素的量。就象表2的結果所表明的那樣，本發明涉及的PO8、PO9和R2表現出具有誘導水稻高濃度產生植物抗毒素(phytocassaneA、B,momilactoneA、B)的活性。表2誘導產生的植物抗毒素量
實施例6稻瘟病防除試驗(1)方法每一缽中種入8粒水稻種子(品種秋田小町Akitakomachi)，然後在人工氣象室中培育，在本葉3、4令苗階段，進行樣品的噴霧處理。每一區5缽，將PO8溶解於含有0.1％的Tween20的20mM磷酸緩衝液(pH7.0)中(50μg/ml)，每一缽噴施2ml該溶液。在對照組噴施有0.1％的Tween20的20mM磷酸緩衝液(pH7.0)和水。處理後，於室溫下放置2小時，使葉面乾燥，再於人工氣象室中培育。向藥液處理3天後的苗的表面噴施稻瘟病菌(race 007株，親和性株)的分生孢子懸濁液。然後移入人工氣象室繼續培育，5天後通過測定各區的第4葉上發生的罹病性病斑，判定防除效果。(2)結果結果在只噴施水的區的罹病性病斑數每葉檢測出21.8個，而在噴施不含樣品的磷酸緩衝液的區，每葉檢測出19.3個。與對照相比，在噴施PO8區，每葉的病斑數是2.7個，確認PO8具有明顯的抑制發病的效果。噴施了PO9和R2也同樣可以看出大致同樣的防除效果。實施例7稻胡麻斑病菌防除試驗劑(1)方法在於稻瘟病防除試驗同樣的條件(被檢測植物的栽培、樣品的施用方法以及病原菌感染法)下，考查PO9對稻褐斑病菌的防除效果。不過為判定防除效果的病斑數的測定要在噴施稻褐斑病菌分生孢子懸濁液2天後進行。(2)結果結果在只噴施水的的對照區的病斑數每葉51.3個，而在以25μg/ml濃度噴施了PO9的區中每葉的病斑數是13.4個，在以50μg/ml濃度噴施了PO9的區中每葉的病斑數是10.8個，確認PO9具有明顯的抑制發病的效果。
就象上述實施例所給出的那樣，可知通過使用本發明所涉及的PO8、PO9或R2作為有效成分做成水稻病害防除劑是有用的。實施例8製劑1液體製劑將本發明的具有誘導活性的物質與其它成分按以下配比通過常規方法製備液體製劑。
PO8 0.25％Tween20(和光純藥社制) 5％20mM磷酸鉀緩衝液(pH7.0) 94.75％使用的時候，將上述液劑稀釋50～200倍後施用。製劑2可溼性粉劑將本發明的具有誘導活性的物質與其它成分按以下配比通過常規方法製備可溼性粉劑。
PO9 5％SORUPOLU 807010％(陰離子表面活性劑東邦化學工業社制)NEW CALUGEN WG-2 5％(陰離子表面活性劑竹本油脂社制)羧甲基纖維素 3％中性無水硫酸鈉 16％粘土61％使用的時候，將上述製劑稀釋500～4000倍後施用。製劑例3粉劑將本發明的具有誘導活性的物質與其它成分按以下配合比例通過常規方法製備粉劑。
R2 3％白炭黑 1％磷酸二異丙酯2％滑石 94％製劑例4流體製劑將本發明的具有誘導活性的物質與其它成分按以下配比通過常規方法製備流體製劑。
PO85％聚乙二醇 10％(夾)氧雜蒽樹膠 0.4％NEW CALUGEN FS-1(非離子型表面活性劑竹本油脂社制)10％NEW CALUGEN FS-4 10％(陰離子型表面活性劑竹本油脂社制)聚矽氧烷 0.2％水 68.4％使用的時候，將上述製劑稀釋500～4000倍後施用。
本發明涉及誘導水稻生成植物抗毒素的物質的篩選方法，以及將具有誘導水稻生成植物抗毒素作用的特定物質作為有效成分的水稻病害防除劑等。使用本發明可以得到如下的效果。1)可以簡便而且高精度地篩選誘導水稻生成植物抗毒素的誘導劑。2)提供用作為了篩選誘導水稻生成植物抗毒素的誘導劑的指標物質的phytocassane和momilactone A的使用方法及其分析方法。3)提供以具有誘導水稻生成植物抗毒素作用的特定物質作為有效成分的水稻病害防除劑。4)由於植物抗毒素對於稻瘟病菌、稻紋枯病菌和稻胡麻斑病菌等病菌具有很強的抗菌性，所以利用本發明的篩選方法選擇出來的物質作為稻瘟病菌、稻紋枯病菌和稻胡麻斑病菌等水稻病害防除劑的有效成分是很有用的。
權利要求
1.一種誘導水稻生成植物抗毒素性質的誘導劑的篩選方法，其特徵在於，作為試驗植物使用的是水稻的幼苗，然後將試驗樣品施用於該水稻幼苗的適宜的部位，以水稻中生成的特定植物抗毒素作為篩選的指標物質進行誘導劑的篩選。
2.權利要求1記載的誘導劑篩選方法，其特徵是將試驗樣品滴施於水稻幼苗葉身的前端部分，然後用溶劑提取該植物體中生成的植物抗毒素，以水稻植物抗毒素phytocassane和momilactone A作為指標物質進行高壓液相色譜(HPLC)分析。
3.一種水稻病害防除劑，其有效成分是由選自通過權利要求1記載的誘導劑篩選方法篩選出來的具有誘導水稻生成植物抗毒素作用的2-吡嗪羧酸、吡啶羧酸、2,6-吡啶二羧酸、2,3-吡啶二羧酸、吡咯-2-羧酸、氧嗪酸、腦苷脂化合物PO8、PO9、R2及其衍生物中的一種或2種以上物質組成的。
全文摘要
本發明課題提供了誘導水稻生成植物抗毒素的誘導劑的篩選方法以及水稻病害防除劑。具有誘導水稻生成植物抗毒素性質的誘導劑的篩選方法,使用水稻的幼苗作為試驗植物,然後將試驗樣品施用於該水稻幼苗的適宜的部位,以水稻中生成的植物抗毒素作為篩選的指標物質進行誘導劑篩選。本發明還涉及以具有誘導水稻生成植物抗毒素作用的特定化合物作為有效成分的水稻病害防除劑。
文檔編號G01N33/50GK1221315SQ9719539
公開日1999年6月30日 申請日期1997年4月21日 優先權日1997年4月21日
發明者古賀仁一郎, 山內豐藏, 梅村賢司, 巖田道顯 申請人:株式會社植物防禦系統研究所