一種微藻快速生長突變體篩選方法及應用與流程
2024-03-01 14:55:15
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種具有高生長速率的微藻突變體藻株的篩選方法和應用。特別涉及一種通過結合群體dna遺傳圖譜技術aflp和流式細胞技術篩選微藻快速生長突變體的方法。該方法篩選迅速，結果可靠。
背景技術：
微藻屬於古老的低等植物，廣泛分布於湖泊、海洋等水域，具有高效吸收太陽能，固定二氧化碳進行快速增殖的能力(光合作用)。同時微藻細胞可以生產多種高價值的營養物質及化工原料，如類胡蘿蔔素、蛋白質、多糖、油脂等。隨著經濟的快速發展，能源短缺問題亟待解決。在經歷了兩代生物質能源的開發後(乙醇、纖維素乙醇)，微藻以其增殖快、油脂佔細胞乾重大、不與人爭糧不與糧爭地、可操作性強等優點漸漸發展成為第三代生物質能源的主力。
目前生產中所用藻種多是從自然界直接分離所得的野生種，其後代性狀單一且容易產生藻種退化。所以有必要人為地對現有藻種進行育種改良。目前主要的育種手段有：從自然界篩選的天然藻種、經物理化學誘變得到的突變體、基因工程手段得到的轉基因藻種。每個方法都有自身的優缺點：天然藻種篩選工作量大且存在藻種退化的現象，物理化學誘變專一性不強，轉基因表達不穩定。
中國專利201410844238.2涉及螢光顯微篩檢生長快和油脂含量高的微藻單細胞。該方法利用顯微鏡圖像處理軟體通過拍攝的顯微鏡圖像對藻細胞的顏色進行定量化數據分析，篩選出生長速率快的優勢微藻單細胞。但該方法忽視了藻細胞大小及每個藻細胞葉綠素含量的個體差異。比如，若一個藻細胞較大，其每個細胞葉綠素含量較高，所得螢光顯微的圖片顏色較深，但可能其細胞數量並不高，故而顏色較深不能說明該藻株具有生長較快的優勢。
中國專利申請201310691127.8涉及一種微藻藻株人工選育方法。該方法利用常壓室溫等離子體對野生藻株進行誘變，利用酶標儀或者具有孔板掃描功能的分光光度計對孔板培養的微藻od值進行測定，獲得藻細胞生長情況。但該方法不能準確得出優勢藻種具體的細胞濃度及增長比例，並且突變體株的穩定性有待驗證。
中國專利申請201510127466.2涉及一種快速生長微藻藻株高通量篩選系統和方法。該方法是利用微流控系統，將微藻細胞洗滌並分散到凝膠至適當濃度，注入到微流控晶片中，形成單分散單細胞液滴，對包裹在油相中的微球進行去油、過濾、再分散，於恆溫培養箱進行培養；通過倒置顯微鏡成像判別是否存在活細胞及細胞生長速度的快慢，通過隨機間隔取樣採集凝膠放大圖片，並對有細胞生長的凝膠微球進行計數，進而監測微藻在單細胞水平的生長狀況。但該方法涉及複雜的微流控系統的建立並且要解決如何防止汙染的問題。
中國專利申請201310164886.9涉及提高微藻生長速率和油脂產率的方法。該申請中利用適應進化來進行實驗，即不通過基因工程手段而活化潛在途徑、強化特定代謝表型或提高環境適應能力。培養微生物到達一定的指標(細胞密度、生長速率或底物消耗等)後進行傳代培養，不斷重複這個過程直至代謝表型不再變化。但該方法只是盲目的傳代20-200個培養循環，導致傳代次數過多，培養周期過長。
由於已有方法中的不足，本領域中仍然需要更加高效、可靠的微藻突變體特別是快速生長突變體的篩選方法。
發明簡述
在本發明中，將物理化學誘變、天然藻種篩選的方法與群體dna遺傳圖譜技術結合，通過分析代間遺傳背景差異，避免了常規藻種篩選中不斷傳代的盲目性，同時可以解決物理化學誘變突變株的不穩定遺傳的問題。
本發明的一具體實例中，對化學誘變劑甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate，ems)誘變處理後的雨生紅球藻nies-144藻株傳代培養，傳代期間利用群體dna遺傳圖譜分析技術——擴增片段長度多態性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，aflp)監測不同代間遺傳背景的變化趨勢，用來確定傳代培養次數，進而利用流式細胞技術快速篩選出生長優勢突變體藻株。
附圖說明
圖1為用10對高多態性引物擴增所得的f0-f14代的aflp遺傳圖譜。
圖2示出f0-f14代遺傳背景的變化趨勢。
圖3篩選出的3株血球藻nies-144的快速生長突變體與野生型生長曲線對比。
發明詳述
在第一方面，本發明提供了一種篩選微藻細胞突變體的方法，包括以下步驟：
a)對微藻細胞群體進行誘變，或提供包含微藻細胞突變體的微藻細胞群體；
b)對經誘變的微藻細胞群體或所述包含微藻細胞突變體的微藻細胞群體進行傳代；
c)通過群體dna遺傳圖譜技術分析每代的微藻細胞群體的遺傳背景；
d)根據群體遺傳背景的變化確定最佳傳代；和
e)對處於最佳傳代的微藻細胞群體進行篩選，獲得期望的微藻細胞突變體。
在一些實施方案中，所述誘變是隨機誘變，例如化學誘變或輻射誘變，優選甲基磺酸乙酯(ems)誘變。本領域已知的其他誘變方法也可用於本發明的方法中，只要其能夠在微藻細胞群體中產生期望的突變。在一些實施方案中，所述微藻細胞突變體是天然突變體。
在一些實施方案中，所述群體dna遺傳圖譜技術包括但不限於限制性酶切片段長度多態性(rflp)、隨機引物擴增多態性dna(rapd)、擴增片段長度多態性(aflp)、短串聯重複序列dna遺傳多態性分析(str)和單核苷酸多態性分析(snp)。在一優選實施方式中，所述群體dna遺傳圖譜技術是擴增片段長度多態性(aflp)。如何執行群體dna遺傳圖譜技術屬於本領域上技術人員的能力範圍。
可以通過本發明的方法篩選突變體的微藻可以是各種微藻，包括但不限於小球藻(chlorella)、眼蟲藻(euglenagracilis)、柵藻(scenedesmus)、扁藻(tetraselmisgracilis)、菱形藻(nitzschia)、富油新綠藻(neochlorisoleoabundans)、微擬球藻(nannochloropsis)、杜氏藻(dunaliella)和血球藻(haematococcuspluvialis)。在一具體實施方式中，所述微藻是血球藻。
在一些實施方案中，所要篩選的微藻突變體是快速生長突變體。在相同培養條件下，目標微藻細胞突變體相對於相應的野生型微藻細胞具有增加的生長速率。生長速率例如可以通過細胞數目或生物質計算。例如，所述微藻細胞突變體的生長速率相對於相應的野生型微藻細胞增加大約50％-500％，例如增加大約50％、大約100％、大約150％、大約200％、大約250％、大約300％、大約350％、大約400％、大約450％或大約500％。
在一些實施方案中，其中步驟d)中將群體遺傳背景經歷劇烈變化後，其群體遺傳背景與前一代相比無明顯變化或變化較少的一代確定為最佳傳代。例如，在使用alfp分析群體遺傳背景的實施方案中，可以通過比較相鄰兩代之間dna擴增條帶的差異來顯示遺傳背景的變化程度。通常而言，在傳代開始時，野生型微藻細胞佔優勢，因此群體遺傳背景變化較小。隨著傳代進行，突變體微藻細胞(例如快速生長突變體微藻細胞)比例逐漸增加，這將伴隨著群體遺傳背景的劇烈變化。在傳代後期，突變體微藻細胞已經佔據主導地位，群體遺傳背景因而也趨於穩定。此時，由於突變體細胞在群體中已經佔多數，可以停止傳代，開展後續的篩選，將更容易獲得期望的突變體，例如快速生長突變體。此外，由於經過上述傳代，微藻的遺傳背景已經趨於穩定，因此獲得的期望的微藻突變體將很可能是能夠穩定遺傳的突變體。根據本文上述教導，本領域技術人員可以容易地確定最佳的傳代數目。通過本發明的方法，可以更加高效、可靠地獲得穩定遺傳的微藻突變體特別是快速生長突變體。
在本發明的方法的一些實施方案中，其中步驟e)中通過流式細胞術進行所述篩選。使用流式細胞術可以對突變體微藻細胞進行快速、精確、高通量篩選。
在第二方面，本發明還提供了通過本發明的方法獲得的微藻細胞突變體。
所述微藻可以是各種微藻，包括但不限於小球藻(chlorella)、眼蟲藻(euglenagracilis)、柵藻(scenedesmus)、扁藻(tetraselmisgracilis)、菱形藻(nitzschia)、富油新綠藻(neochlorisoleoabundans)、微擬球藻(nannochloropsis)、杜氏藻(dunaliella)和血球藻(haematococcuspluvialis)。在一具體實施方式中，所述微藻是血球藻。
在一些實施方案中，所述微藻突變體是快速生長突變體。在相同培養條件下，所述微藻細胞突變體相對於相應的野生型微藻細胞具有增加的生長速率。例如，所述微藻細胞突變體的生長速率相對於相應的野生型微藻細胞增加大約50％-500％，例如增加大約50％、大約100％、大約150％、大約200％、大約250％、大約300％、大約350％、大約400％、大約450％或大約500％。在一些實施方案中，所述微藻突變體能夠穩定遺傳。
實施例
現參照下列意在舉例說明本發明(而非限定本發明)的實施例來描述本發明。
實施例1、血球藻的活化及預培養：
從固體平板上挑取血球藻nies-144單克隆藻株接種於含10mlbasal液體培養基的50ml三角瓶中，15μmol·m-2·s-1、20℃下靜置培養10d，轉接入含100mlbasal培養基的250ml三角瓶裡同等條件下培養4d。1500g，5min離心收集藻細胞。
實施例2、ems化學誘變藻細胞：
1、1500g，5min離心收集對數期血球藻細胞，用4％ems(甲基磺酸乙酯)處理1h；1500g，5min離心去除誘變劑。
2、50ml硫代硫酸鈉na2s2o3重懸細胞以終止誘變反應。
3、離心去除硫代硫酸鈉，用basal培養基清洗藻細胞兩次，最後重懸於basal培養基中並避光24h。
4、將誘變後的藻細胞接種於250ml三角瓶，記為f0代，15μmol·m-2·s-1、20℃下靜置培養，待f0代恢復活力並長出新鮮藻細胞後依次傳代接種，分別記為f1、f2、f3.....。
實施例3、通過計算推測合適的傳代次數
假設初始接種量為n個細胞，其中包含一個快速生長突變體。
野生型增長到對數期可增長10倍，假設快速生長突變體到對數期可增長20倍，則可以通過計算當該快速生長突變體比例增至50％時所需的傳代次數。
各代生長到對數期時快速生長突變體所佔比例(fn)如下所示
當fn＝50％時，若初始接種量n＝4x104，則可推導出傳代次數n＝13.7。然而，由於誘變後獲得的突變體增長效率具有不確定性，以及初始接種量可能存在差異，實際中需要的傳代次數和理論計算會存在較大差異。因此仍然需要適於實踐的確定最佳傳代次數的方法。
實施例4、aflp檢測血球藻遺傳背景變化
1、收集經誘變後每一代的藻細胞並用試劑盒(qiagenplantminikit)提取血球藻總dna。
2、限制性內切酶ecori和msei37℃5min消化dna。隨後80℃處理5min使酶失活。注意酶切反應的各成分需在室溫按照以下順序依次添加。
表1.利用限制性內切酶消化基因組dna的反應組成
3、酶切後的dna片段與接頭於25℃反應10min。連接體系如下表2：
表2.酶切片段與接頭連接反應的條件
4、預擴增及選擇性擴增：
兩輪pcr均採用20μl體系。預擴增反應體系如下表3所示：
表3.預擴增pcr反應體系
預擴增反應程序：
選擇性擴增反應體系如下表4所示：
表4.選擇性擴增反應體系
選擇性擴增反應程序：
5、pcr產物加變性緩衝液，90℃5min變性後置於冰上，配製20ml7％的聚丙烯醯胺膠，電泳緩衝液為1xtbe，所用儀器為li-cor4300。
上述實驗過程中用到的接頭及兩輪pcr引物信息如下：
e-l、e-s、m-l、m-s為ecori和msei接頭引物，e-a，m-c為預擴增引物，其餘為螢光標記的選擇性擴增引物，選擇性擴增引物兩兩配對可形成64對引物。
表5.接頭引物與擴增引物
aflp結果如圖1所示。圖1顯示10對高多態性引物(1-2、1-7、2-3、2-7、3-2、4-3、4-4、5-4、8-3、8-4)所擴增得到的條帶有所差異。通過這些差異，可以顯示出不同代之間的變化。起初突變體混合液遺傳背景複雜，所以11代之前的dna遺傳背景變化較大並沒有穩定下來，11代之後隨著傳代次數的增加，生長優勢株突變體逐漸佔據較高比例，所以11代之後的遺傳圖譜條帶變化不大，逐漸趨於穩定。
圖2為f0-f14代遺傳背景的變化趨勢，更加直觀的顯示不同代之間遺傳背景的差異。可以得出接種至第14代時，優勢突變株已經佔據較高比例，與公式推導得出的最佳傳代次數相一致。此時aflp遺傳圖譜也顯示其dna背景趨於穩定，可以進行後續突變株的快速篩選。
實施例5、突變體篩選
aflp帶型逐漸穩定之後，將血球藻突變體按照2500/5000/10000個細胞塗布於basal固體平板上，約1個月後長出單克隆，挑取出單克隆藻株接種到24孔板，長至對數期時用流式細胞儀檢測各藻株的細胞數，按照相同的接種量接種於12孔板並在第二天、第四天用流式細胞儀檢測細胞濃度，即可代表各藻株的生長速度。從中挑選出生長速度較快的突變體。
挑選出的7個生長突變體用血球計數板計數的方法進行復篩，進一步驗證挑選出的生長突變體的可重複性。
圖3示出了用上述方法篩選出的3株生長速度最快的突變株與野生型對比，這3株突變體相對野生型都有明顯的生長優勢，最後生物質相比野生型增長了47％。由此，說明以aflp技術為監測基礎結合流式細胞技術的微藻快速生長突變體篩選方法是可行的。該方法所篩選到的突變體可以穩定遺傳。