一株DSE真菌及藍莓組培苗快速菌根化的方法與流程

2024-03-26 14:18:05 2

本發明屬於微生物領域，具體地涉及一株dse真菌及藍莓組培苗快速菌根化的方法。

背景技術：

深色有隔內生真菌(darkseptateendophytes，dse)是一類廣泛存在於植物根內，且具有深色有隔菌絲的菌根真菌。已有的研究證實，dse與宿主互惠共生，賦予植物優良生長性狀，能提高宿主抗病蟲能力及在脅迫環境中的抗逆性。

藍莓(vacciniumspp.)又稱越橘，為杜鵑花科越橘屬植物，是具有較高經濟價值和廣闊開發前景的新興果樹樹種，栽培面積的擴大對藍莓苗的市場需求也日益增大。藍莓苗的繁育主要採用硬枝扦插和組織培養等方法。其中，組織培養方法繁殖速度快，適宜於優良品種的無病毒工廠化苗木繁育。目前，儘管許多藍莓品種的組培快繁體系已建立，但仍存在幼苗生根困難，葉片發黃，移栽成活率低等問題，成為制約藍莓苗規模化組培快繁的主要障礙。對藍莓苗進行有益促生菌的接種，快速實現其菌根化是克服藍莓組培苗生長緩慢，提高成活率的一個有效措施。

目前，已有學者對dse與植物在無菌條件下的共生培養體系開展研究。現行的方法多是採用改良的植物固體培養基，接入的dse菌種是菌塊或菌片的形式。但該方法在實施過程中往往出現dse菌片在植物培養基中生長緩慢，植物根系不能與dse充分接觸，從而造成共培養周期長、侵染效率低的情況。因此，上述方法不適於根系纖細不發達植物如藍莓與dse的共生培養。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題在於提供一株dse真菌及藍莓組培苗快速菌根化的方法，所述菌株為r16，其分類命名為tricladiumsplendens，已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏編號為：cgmccno.13885。該菌株菌落為灰白色，絨氈狀，邊緣光滑，菌落背面灰黃色。菌絲分叉，由主軸從不同平面發出2個側枝，頂部漸尖，菌絲內有隔，能產生孢子。

本發明為解決藍莓組培快繁中幼苗生根率低，生長緩慢，移栽成活率低等問題提供了有效途徑；穩定高效的dse菌與藍莓組培苗共生體系為研究dse與藍莓互作機理提供了理想實驗系統，也為建立dse與其它植物尤其是根系纖細植物的共生體系提供借鑑。

本發明是通過如下技術方案來實現的：

一株dse真菌，所述菌株為r16，其分類命名為tricladiumsplendens；該菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，其保藏編號為：cgmccno.13885。

本發明還提供一種所述菌株與藍莓組培苗快速菌根化的方法，所述方法的具體步驟如下:

1)藍莓苗的培養

選取生長狀態良好，株高4-5cm的藍莓組培苗進行快速繁殖，選取繁殖的高5-7cm生長狀態良好的藍莓組培苗進行生根培養；

2)dse接種劑的製備

取斜面保存的菌種r16接入含有50mlpda培養液的250ml三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震蕩培養10天，製備種子液；將種子液按10％(體積比)接入量接入到裝有新鮮pda培養液的三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震蕩培養10-15天，備用；所用pda培養液的成分及終濃度：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，ph5.6；高壓滅菌；

3)共培養基質的準備

先將乾苔蘚剪短，用清水洗淨，在蒸餾水中浸泡過夜，讓其充分吸水，ph為5.5，再分裝到組培瓶中，容器裝量體積比為15％-25％，121℃高壓滅菌1hr，備用；

4)dse真菌與藍莓共生體系的建立

將步驟1)製備的生長狀態良好的生根藍莓苗接入步驟3)製備的共培養基質中，再加入6-8ml步驟2)製備的dse接種劑，接種後，放至23-25℃，2000-3000lx的光強，光照時間8-16h/天條件下進行共培養；

5)共培養體系的檢測

共培養一周後，在共培養基質中有明顯的dse菌絲的生長；30天後取出藍莓苗，洗淨根部，然後將根系剪成4‐5cm長的根段將其放入提前配製好的faa固定液中固定；12小時後，將藍莓根段從faa固定液中取出，衝洗後脫色，隨機選取藍莓根段，在顯微鏡下鏡檢觀察深色有隔內生真菌的定殖情況，當部分根段看到深色有隔內生真菌的典型特徵結構--微菌核時，表明深色有隔內生真菌-植物共生體系建立。

進一步，所述的脫色方法為經過10％koh(g/ml)透明處理、質量比為10％h2o2漂白、質量比為1％hcl酸化、0.05％(g/ml)臺盼藍染色和體積比為50％甘油脫色。

本發明還提供一種包含所述菌株發酵菌液的藍莓生根製劑。

本發明與現有技術相比的有益效果：

本發明從藍莓根部篩選了一株dse菌株r16，所述菌株為一株tricladiumsplendens，已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏編號為：cgmccno.13885，建立了所述菌株與藍莓組培苗快速菌根化的方法。該體系採用滅菌苔蘚作為無菌條件下的共培養基質，dse接種劑採用液體培養方法。與現行的採用菌塊接種的方法相比，接種液體培養的菌株r16生長快，與藍莓根菌接觸充分，共培養時短，定植率高。dse菌株r16對藍莓組培苗生長有顯著的促進作用。與未接種對照相比，接種dse菌的藍莓苗生長有顯著優勢，葉片大而濃綠，根系發達，移栽成活率高。

附圖說明

圖1r16菌落形態特徵：a,菌落正面；b，菌落反面；

圖2r16菌絲形態特徵；

圖3r16在藍莓根內定植的菌絲和微菌核：a，箭頭所指為細胞內的r16菌絲；b，箭頭所指為細胞內的r16微菌核；

圖4r16對藍莓組培苗的促生效應：a未接種，b接種r16菌塊，c接種r16菌塊；

菌株為r16，其分類命名為tricladiumsplendens；該菌株保藏於2017年4月11日中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏編號為：cgmccno.13885。

具體實施方式

實施例1

藍莓根內生真菌的分離、純化，步驟如下：

1、用清水洗淨藍莓根段，然後將其轉移至超淨工作檯中進行如下操作：將根段浸泡在10％(質量比)雙氧水中8min，期間用無菌鑷子輕輕翻動幾次，以保證消毒徹底；無菌水漂洗2-3次後，將其轉入6％(質量比)次氯酸鈉，浸泡15分鐘，無菌水漂洗2次；濾紙吸乾根段表面殘留的液體。將消毒後的根段用無菌的剪刀剪成0.5cm長的根段，接入製備好的pda平板，於25℃恆溫培養箱中黑暗倒置培養。pda平板的配方：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，2％瓊脂，ph5.6。115℃滅菌20min，冷卻至60℃時，加入無菌的氨苄青黴素(50ug/ml)和硫酸鏈黴素(100ug/ml)。上述各成份濃度均為pda培養基中的終濃度。

2、當發現組織切口處有真菌長出來的時候，儘快用接種針將其挑入不加青黴素和鏈黴素的pda平板中，25℃恆溫培養箱中黑暗倒置進行純化培養，轉移3-5次後得到純菌落。

實施例2菌株r16的形態和分子生物學鑑定

1、挑取上述保存的純化菌種，接種到pda平板中，於25℃恆溫培養箱中培養活化1-2周。用直徑為0.5cm的無菌打孔器從菌落的最外層打取菌餅，接種到新的pda平板上，於25℃恆溫培養箱中培養1周，觀察菌落的形態。r16菌落為灰白色，絨氈狀，邊緣光滑，菌落背面為灰黃色(圖1)。

2、用接種針挑取少量純化後的單菌落菌絲，將其放入滴有一滴生理鹽水的載玻片上製成臨時裝片，並在顯微鏡下觀察內生真菌的菌絲結構。菌絲分叉，由主軸從不同平面發出2個側枝，頂部漸尖，菌絲內有隔，能產生孢子(圖2)。

3、對菌種進行分子生物學鑑定。採用全式金的plantgenomicdnakit試劑盒提取培養菌絲的基因組dna，擴增引物是its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。pcr反應體系(25μl)包括：2.5μl10×pcr緩衝液(含mg2+)，2μldntp(2.5mmeach)，1.5μlits1(10μm)，1.5μlits4(10μm)，0.2μltaq酶，2μl基因組dna，15.3μlddh2o，。擴增反應程序為：94℃預變性3min，循環1次；94℃變性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環；最後72℃延伸10min。pcr擴增產物寄至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。將獲得的rdna基因間內源轉錄間隔區序列，即its序列(internallytranscribedspacer)，與美國國立生物技術信息中心資料庫(ncbi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的序列進行blastn比對，與一株tricladiumsplendens(gq152146)相似度最高為98％。該菌種編號為r16，結合形態學鑑定為一株tricladiumsplendens，已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏號為cgmccno.13885。

測序結果：

ggaaggatcattacagtgttccctgcccttcggggtaggacgccacccttgattattttatgagtgttgctttggcgggcctcgcggcctggccgcgccccggcttcggcgggggagcgcccgccagaggattctacaaacctgactattagtgtcgtctgagtactatataatagttaaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccgtggtattccgcggggcatgcctgttcgagcgtcattataaccaatccagctcgctgggtcttgggcaccgccgccaggcgggcctcaaaataagtggcggtacggccggactctgagcgtagtaaatcttctcgctacagggtcccgggcggcactggccagcaacccccaaatctttcacaggttgacctcggatcaggtagggataccc。

實施例3藍莓組培苗的培養，步驟如下：

(1)藍莓芽分化

選取生長狀態良好，株高4-5cm的藍莓組培苗進行快速繁殖。在超淨工作檯中用無菌的剪刀將組培瓶中的藍莓植株從基部剪斷，剪成2-3cm的莖段，然後用無菌的鑷子將其接到含有分化培養基的組培瓶中，每瓶中接入3-4個莖段，均勻分散放置。所用的培養基是以wpm培養基為基本培養基，在每升wpm培養基中均添加蔗糖20g、瓊脂5-10g，添加植物激素玉米素1.0-3.0mg，培養基ph5.0-5.5，培養容器裝量10-30％，121℃高壓滅菌20min。培養條件設置為23-25℃，2000-3000lx的光強，光照時間8-16h/天，培養時間40-60天。

(2)藍莓生根培養

在超淨工作檯中，選取高6cm生長狀態良好的藍莓組培苗進行生根培養。用無菌的剪刀從藍莓組培苗的基部剪斷，然後用無菌的鑷子將剪斷的植株插入帶有濾紙球的生根培養基中，植株插的深度以植株底部剛浸入培養基為宜，每瓶液體培養基中接入6-10株藍莓苗。所用培養基為1/2wpm培養基為基本培養基，然後加入蔗糖20g，吲哚丁酸1-2.5mg，定容到1升，調培養基的ph為5.0-5.5，培養容器裝量10-30％。將配好的液體培養基倒入裝有濾紙球的組培瓶中，121℃高壓滅菌20min。濾紙球以鋪滿組培瓶的底部以固定藍莓幼苗。培養條件設置為23-25℃，2000-3000lx的光強，光照時間8-16h/天，培養時間40-60天。

實施例4不同接種方法的效果比較

1、dse接種劑的製備

製備2兩種r16接種劑：第一種是現行多採用的菌塊的形式：取斜面保存的菌種，接入pda平板，25-28℃倒置培養14天，備用。第二種是本發明採用的液體培養的形式：取斜面保存的菌種r16接入含有50mlpda培養液的250ml三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震蕩培養10天，製備種子液。將種子液按10％接入量接入到裝有100ml新鮮pda培養液的500ml三角瓶中，25-28℃，180-200r/min震蕩培養10-15天，備用。所用pda液體培養基的組成：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，ph5.6，分裝到500ml三角瓶中，每瓶分裝100ml，並放入10-20個直徑為3-5mm的玻璃球，121℃高壓滅菌20min。

共培養基質的準備

2、共培養基質的製備

先將乾苔蘚剪短，用清水洗淨，在蒸餾水中浸泡過夜，讓其充分吸水，ph5.5，再分裝到組培瓶中，容器裝量為15％-25％，121℃高壓滅菌1hr，備用。

3、dse真菌與藍莓共生體系的建立

選擇生長狀態良好的生根藍莓苗用無菌的鑷子接入上述製備共培養基質中。設置三個實例組：一個不接菌對照組和兩個接菌實例組。兩個接菌實例組分別採用兩種方法：一是利用上述製備的r16培養平板，使用打孔器打取直徑5mm的r16菌塊，每棵藍莓苗周圍均勻放置3塊。二是採用本發明優化的方法：用移液槍加入6-8ml上述製備的r16培養液。吸取前，需要將dse接種劑晃動混勻。移液槍頭前端需剪掉2-3mm，並滅菌後才能使用。每組各20瓶藍莓苗，均放至23-25℃，2000-3000lx的光強，光照時間8-16h/天條件下進行共培養。

4、共培養體系的檢測

共培養30天時，從上述3個實例組各取10瓶藍莓苗檢測r16在藍莓根部的定植情況，剩餘10瓶藍莓苗繼續培養，用於分析r16對藍莓苗的接種效應。用清水洗淨根部，然後用剪刀將根系剪成4‐5cm長的根段將其放入提前配製好的faa固定液中固定。時間後，將藍莓根段從faa固定液中取出，用蒸餾水衝洗3次。經過10％koh(g/ml)透明、質量比為10％h2o2漂白、質量比為1％hcl酸化、0.05％(g/ml)臺盼藍染色和體積比為50％甘油脫色後，隨機選取藍莓根段，在顯微鏡下鏡檢觀察深色有隔內生真菌的定殖情況，當部分根段看到深色有隔內生真菌的典型特徵結構--微菌核時，表明深色有隔內生真菌-植物共生體系建立。結果顯示，接種r16培養液的藍莓苗根中，r16菌絲定殖率達到21.1％，微菌核的定殖率為6.8％(圖3)；而接種r16菌塊的藍莓根中，僅觀察到r16菌絲定植，定植率為7.9％；未接菌對照組的藍莓根樣中沒有觀察到相應的菌絲和微菌核。同時，從上述兩個接菌實例組的藍莓根樣中，只分離得到與接種劑形態特徵相同的dse菌株r16，進一步表明r16在藍莓根內成功定植。以上結果說明，對於根系纖細不發達的藍莓苗來說，採用液體培養的接種劑可有效提高dse真菌定植率，實現快速菌根化。

5、dse菌對藍莓組培苗的促生效應

共培養90天後，觀察接種r16對藍莓苗生長的影響。與未接種對照相比，接種r16的藍莓苗生長均表現出優勢，根系發達，葉片大而濃綠。接種r16培養液實驗組的藍莓苗優勢更為顯著(圖4)。

實施例5適宜共培養基質的篩選

選擇苔蘚、草炭土和蛭石三種常用栽培基質按不同體積比例混合作為待用共培養基質。設定三個實例組：苔蘚：草炭土：蛭石1：1：1；苔蘚：草炭土1：1；純苔蘚。先將乾苔蘚(ph5.5)剪短，用清水洗淨，在蒸餾水中浸泡過夜，讓其充分吸水，按不同體積比例與草炭土或蛭石混合，分裝到培養瓶中，容器裝量為15％-25％。，121℃高壓滅菌2hr，備用。按實施例4中的步驟3接入藍莓生根苗和菌株r16液體接種劑。每組各10瓶藍莓苗，均放至23-25℃，2000-3000lx的光強，光照時間8-16h/天條件下進行共培養。共培養50天時，檢測上述三個實例組中r16在藍莓根部的定植情況。檢測方法同實施例4的步驟4。表1示在不同共培養基質中r16對藍莓根部定植率的比較。在苔蘚、草炭土、蛭石三種等體積混合的基質中，r16的定植率最低，而在純苔蘚中，r16定植率最高。並且，以純苔蘚作為共培養基質，操作更簡單，因此本發明確定純苔蘚為最佳共培養基質。

表1不同共培養基質對r16在藍莓根內定植率的影響

本發明提供了一株dse真菌r16及利用所述菌株快速、高效實現藍莓組培苗菌根化的方法，因此該菌株的菌液可以製成藍莓促生長製劑，在藍莓苗工廠化組培快繁中推廣應用，具有廣闊的應用前景和市場空間。

sequencelisting

魯東大學

一株dse真菌及藍莓組培苗快速菌根化的方法

無

1

patentinversion3.3

1

512

dna

tricladiumsplendens

1

ggaaggatcattacagtgttccctgcccttcggggtaggacgccacccttgattatttta60

tgagtgttgctttggcgggcctcgcggcctggccgcgccccggcttcggcgggggagcgc120

ccgccagaggattctacaaacctgactattagtgtcgtctgagtactatataatagttaa180

aaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgat240

aagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccc300

gtggtattccgcggggcatgcctgttcgagcgtcattataaccaatccagctcgctgggt360

cttgggcaccgccgccaggcgggcctcaaaataagtggcggtacggccggactctgagcg420

tagtaaatcttctcgctacagggtcccgggcggcactggccagcaacccccaaatctttc480

acaggttgacctcggatcaggtagggataccc512