一種耐輻射麴黴及其在吸附銫137生物處理中的應用的製作方法
2024-02-29 02:30:15 1
一種耐輻射麴黴及其在吸附銫137生物處理中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種耐輻射麴黴及其在吸附銫137生物處理中的應用。通過某地區取樣，篩選、分離、篩選、生理生化鑑定獲得麴黴（Aspergillussp.）F77CGMCCNo.8382，利用該菌在吸附銫生物處理中的應用，對Pb2+、Zn2+，Ni+的耐受濃度最大，分別可達1000mg/L和500mg/L，500mg/L；對Co2+，Cr2+，Hg2+的耐受性次之，都可達200mg/L通過本法可以利用菌體的生長吸附銫離子，和放射性銫，也可以直接使用幹菌體吸附，最大吸附能力可達44.5mg/g幹菌體，應用該菌種吸附Cs137生物處理中的應用具有現實的價值和作用。
【專利說明】一種耐輻射麴黴及其在吸附銫137生物處理中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種微生物菌種應用於生物吸附放射性核素【技術領域】，具體的，本發 明涉及一種耐輻射麴黴及其在放射性核素吸附中應用的【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 城市化、工業化及人口增長造成全球性能源危機，可持續發展需求使得人類越來 越依賴於新能源。核能以其極低的二氧化碳排放和巨大的發展潛力而越來越受到眾多國家 的重視。核能高速發展的同時，也給全球環境造成巨大的壓力，使放射性汙染成為當前重大 的環境問題之一，特別是以車諾比和日本福島核電站為代表的核事故向環境釋放了大 量的放射性汙染物，造成當地及周邊環境嚴重的放射性汙染，對生態環境和人類健康造成 長期巨大的潛在威脅。
[0003] 作為生態系統的重要組成部分，微生物種群數量大、分布廣、比表面積大、繁殖快， 對環境變化的適應能力強，對放射性輻射表現出高度的耐受性。利用生物作用清除、修復和 治理放射性汙染具有選擇性強、處理時間短、成本低，不造成二次汙染和不破壞生態環境等 優點，近年來已成為放射性汙染治理的熱點研究技術之一。
[0004] 銫137(Cs137)是重要的裂變產物之一，也是核彈、核武器試驗和核反應堆內核裂 變的副產品之一，其半衰期較長，具有較高的遷移性，易通過生物鏈轉移造成輻射危害，它 會釋放伽瑪射線，在環境放射性汙染修復中備受關注。銫137的半衰期較長達30年，會在 環境或生態系統中存留、積累和遷移，造成嚴重的環境汙染和生態危害。如果透過進食或呼 吸，攝入了銫137,或受到沉降在地面上的銫137所照射，都會對身體有較持久的影響。
[0005] 在治理放射性環境汙染方面，傳統方法是工程法、化學法。工程法是物理性地收集 和隔離放射性物質的方法，化學法是採用特殊的化學品來固定和清除放射性汙染。上述方 法雖然已得到成功的應用，如日本的廣島和長崎兩個城市、馬紹爾群島共和國的比基尼環 礁核試驗場和澳大利亞的馬拉林加核試驗場的修復與重建，但其成本很高，難以用於大面 積輻射區的修復，因此，工程與化學的方法局限性很大。生物修復是利用特殊的生物富集和 固定放射性汙染物的方法，主要是微生物和植物，特別是微生物功能利用最受關注，因其 成本低，適合於大面積修復，因而生物修復放射性汙染成為當前研究的熱點。
[0006] 研究表明：微生物不僅可通過溶解和沉澱、生物吸附和吸收、氧化還原等作用來治 理環境中的放射性核素汙染，並且可以通過改變植物根際微環境，從而提高植物對重金 屬離子和放射性核素的吸收、揮發或固定的效率。相關的研究也取得了積極進展，如 分ite[1]等研究證明放射性核素鈾（U)在土壤中的遷移率受環境中微生物及環境因子的影 響，研究表明Fe(III)還原菌的增生有利於包括U在內的重金屬離 子由土壤向地下水遷移。C?和ft [3]等的研究表明，細菌菌群可促使可溶態U (VI)向穩定的U (IV)轉化，等研究顯示硫酸鹽還原菌可固定U，β9/7^--5·?〇/7θ[5] 等分離獲得可大量積累137CS、238+239+24°Pu等放射性核素的微生物菌株，Hu [6]等的研究表明 許多微生物都能吸附 U，如 aerwgiflosa CSZ/MpergiBiAs /應/闢 和 等研究發現施用AM菌根菌可促進行植物對137Cs、9°Sr 的積累，希瓦氏菌MR-1，可以有效將可溶性U6+、Cr6+和Tc7+還原為不溶性U 5+、 Cr3+ 和 Tc4+。
[0007] 利用微生物修復放射性環境汙染已經有成功的例子，CroW￡/e/8]在2001年利用土 著微生物對保加利亞南部含有放射性元素鈾、鐳和釷同重金屬銅、鎘和鉛汙染土壤，進行 原位修復，經過8個月的時間，汙染物的水平下降到人體安全範圍。
[0008] 利用微生物修復放射性的汙染環境必須考慮到以下兩個方面：第一，必須是強耐 輻射的微生物；第二，微生物修復環境時不能威脅到公共安全，也不能產生二次汙染。由 於大多數的細菌對放射性比較敏感，因此它們修復放射性汙染環境的能力會受到較大的限 制。因此，需要從自然環境中去分離具有輻射抗性的微生物，或者通過基因工程技術來改造 一些微生物使之獲得輻射抗性。目前尚無有關耐輻射麴黴及其在放射性核素吸附中應用的 報導。
【發明內容】
[0009] 針對目前國內外尚無關於耐輻射麴黴及其在放射性核素吸附中應用的相關報導， 特別是沒有耐輻射麴黴在銫生物處理中的應用相關報導。本發明目的旨在於提供一種 耐輻射麴黴及其在吸附Cs 137生物處理中的應用，特別是本發明提供一種利用耐輻射麴黴 5/7. )F77 CGMCC No. 8382在吸附銫生物處理中的應用。
[0010] 本發明採用的主要技術方案： 本發明從新疆巴音郭楞蒙古自治州地區汙染環境中取樣，以不同的培養溫度、pH值、培 養基為富集條件，篩選出一批生長良好的微生物菌株，從中優選出一株編號為F77的菌株， 經過微生物菌種的生理生化特性、菌落形態、菌種的分子水平等系列試驗驗證確定，該菌種 是一種耐福射麴黴(As/76?r^77A/5· 5/7. )F77,經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心（CGMCC)保藏，獲得保藏號為CGMCC No. 8382,利用該菌種在放射性銫生物處理中 應用，通過試驗證明該菌種耐福射麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382對於Ni+， Cr2+'、Zn2+、Co2+、Pb2+、Hg 2+六種離子均具有耐受特性，其中對Pb2+、Zn 2+,Ni+的耐受濃度最 大，分別可達1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L;對Co2+，Cr2+，Hg2+的耐受性次之，都可達 200 mg/L ;特別是在放射性核素銫吸附中應用獲得顯著明顯的技術效果，從而證明了該菌 種在吸附銫生物處理中具有良好的的應用前景。
[0011] 本發明具體提供一種利用麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382。本發明 所使用的麴黴5/7.)由新疆農業科學院微生物應用研究所從新疆巴音郭楞 蒙古自治州地區某地放射性汙染土壤中取樣分離，以不同的培養溫度、pH值、培養基為富 集條件，篩選出一批生長良好的微生物菌株，從中優選出一株編號為F77的菌株於申請日 前已保藏於布達佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC)保藏，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所，郵編：100101,保藏日期是2013年10月22日，保藏號是CGMCC No. 8382;該菌株培養 溫度28-30°C，最適培養溫度28°C左右；該菌種生長於PDA培養基表面為馬鈴薯200g、葡萄 糖20g、瓊脂15g、蒸餾水IL，pH自然，經28°C、48h培養，將菌種F77通過插片和水壓片的 鏡檢觀察，該菌株初生菌絲白色，呈疏鬆絨毛狀，分隔，菌落表面粽葉綠色。孢子梗和孢子 同色，孢子近圓形，成串著生在膨大的孢子梗頂端周圍，呈放射狀分布，無分生小梗。根據 以上形態特徵，初步鑑定該菌株為半知菌綱叢梗孢目叢梗孢科單梗麴黴屬的一個種。參照 《真菌鑑定手冊》進行鑑定，結合對F77菌株進行形態學，生理生化鑑定，命名為耐輻射麴黴 {.Aspergillus sp. )〇
[0012] 該菌株麴黴577. ) F77在PDA培養基，Wort培養基生長良好，經 Biolog FF鑑定板試驗證明F77可以利用吐溫80, N-乙醯基-β-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿 拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纖維二糖，D-木糖，蘋果酸，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸， a-D-葡萄糖，D-甘露醇，β-甲基-D-葡萄糖苷，6-0-D-吡喃葡萄糖醯，D-呋喃果糖，D-葡 萄醛酸，丙三醇，肝糖，麥芽三糖，奎尼酸，L-穀氨酸，腺苷-5 -磷酸鹽，a-D-葡萄糖-1-磷 本鹽，D-核糖，水楊苷，D-山梨醇，L-山梨糖，水蘇糖，K-海藻糖，松二糖，木糖醇，y-氨基丁 酸，溴代琥珀酸，反丁烯二酸，β_羥基丁酸，y_羥基丁酸，P-羥苯乙酸，a-酮戊二酸，D-蘋果 酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸醯胺，L-丙胺酸，L-丙胺醯氨 基乙酸，L-天冬醯胺，L-天冬氨酸，甘氨醯-L-穀氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，焦穀氨酸， L-絲氨酸，L-蘇胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。
[0013] 本發明通過總DNA的提取、ITS1基因的PCR擴增和測序，根據測序結果，用Blast 搜索軟體從GenBank、EMBL等資料庫中調出相似性較高的相關菌株的ITS1基因序列，用 CLUSTAL X進行多序列比對，並採用Saitou和Nei的鄰接法用MEGA 5. 0軟體進行系統進化樹的構建和同源性比較。經測定，耐福射麴黴577. )F77 CGMCC No. 8382 的 ITS1 基因序列為 600bp。
[0014] 通過上述結果及ITS1基因同源分析、系統發育分析結果，將純化的菌株耐輻射曲 黴Usper價7ΛΛ5沙.）F77 CGMCC No. 8382進行系統進化樹的構建及多樣性分析，菌種編 號為F77與/Yaras PT18同源性最高，但兩者還存在明顯的差異，顯 示不同屬性的菌種，本發明將菌種編號為F77菌株鑑定為麴黴5/7.)。
[0015] 同時，本發明具體提供一種利用耐福射麴黴5/7. ) F77 CGMCC No. 8382進行放射性銫生物處理中應用技術方案：分別在含有10mg/L的穩定銫離子的PDA培 養基中加入lml (6772. 95貝克）放射性銫母液，和2ml (13545. 9貝克）放射性銫母液，接 種F77,培養至最適的生長時間，收集樣品。分別通過ICP-MS和液閃測定菌株在生長過程中 對穩定性銫和放射性銫的吸附。通過試驗表明，菌種F77對於放射性銫存在下，對穩定的銫 的吸附率明顯下降，只有19. 3%，而在一倍放射性銫和兩倍放射性銫存在下，對穩定性銫吸 附率差異不大，對於放射性銫的吸附率差異也不大，都達40%以上。
[0016] 本發明所用的菌株麴黴沙.）F77 CGMCC No. 8382對其中對Pb2+、 Zn 2+，Ni+的耐受濃度最大，分別可達 1000 mg/L 和 500 mg/L，500 mg/L;對 Co2+ Cr2+，Hg2+ 的耐受性次之，都可達200 mg/L ;在放射性核素銫吸附中應用獲得顯著明顯的技術效果，從 而證明了該菌種在吸附銫生物處理中具有良好的的應用前景。
[0017] 本發明進而提供耐福射麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382的分離和培 養方法。
[0018] 1.分離培養基採用：PDA培養基。
[0019] 2.分離和篩選條件：採取梯度稀釋法，稱取10g 土壤樣品於90mL無菌生理鹽水 中，30 ° C活化30min後進行梯度稀釋，選取10' 10' ΚΓ4稀釋液分別塗布於分離培養基澱 粉PDA培養基平板，每個處理3個重複，置30° C培養。待長出菌落後挑取形狀、大小、顏色 等不同的菌落分別劃線接種於相應的平板，直至無雜菌落。
[0020] 經培養篩選確定的耐輻射麴黴取）F77 CGMCC No. 8382在PDA 培養基上菌株菌絲疏鬆絨毛狀，分隔，菌落表面粽葉綠色。可以利用吐溫80, N-乙醯 基-β-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纖維二糖，D-木糖，蘋果 酸，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸，a-D-葡萄糖，D-甘露醇，β-甲基-D-葡萄糖苷，6-0-D-吡 喃葡萄糖醯，D-呋喃果糖，D-葡萄醛酸，丙三醇，肝糖，麥芽三糖，奎尼酸，L-穀氨酸，腺 昔 _5'一憐酸鹽，a_D_匍萄糖-1-憐本鹽，D-核糖，水楊昔D-山梨醇，L-山梨糖，水蘇糖， K-海藻糖，松二糖，木糖醇，y_氨基丁酸，溴代琥珀酸，反丁烯二酸，β_羥基丁酸，y_羥基丁 酸，P-羥苯乙酸a-酮戊二酸，D-蘋果酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯， L-丙胺酸醯胺，L-丙胺酸，L-丙胺醯氨基乙酸，L-天冬醯胺，L-天冬氨酸，甘氨醯-L-穀氨 酸，L-苯基柄氨酸脯氨酸，焦穀氨酸，L-絲氨酸，L-蘇胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。
[0021] 通過實施本發明具體的技術方案，實現本
【發明內容】
達到以下有益效果： 本發明提供的耐輻射麴黴Usper價7ΛΛ5沙.）F77 CGMCC No. 8382及其在銫離子吸附 中的應用，Ni+，Cr2+，、Zn2+、Co2+、Pb2+、Hg 2+六種離子均具有耐受特性，其中對Pb2+、Zn 2+，Ni+ 的耐受濃度最大，分別可達1000 mg/L和500 mg/L，500 mg/L;對Co2+，Cr2+，Hg2+的耐受性 次之，都可達200 mg/L通過本法可以利用菌體的生長吸附銫離子，和放射性銫，也可以直接 使用幹菌體吸附，最大吸附能力可達44. 5mg/g幹菌體。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1所示為麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382的菌落形態水壓片圖。
[0023] 圖2所示為麴黴5/7. ) F77 CGMCC No. 8382系統發育樹狀圖。
[0024] 圖 3 麴黴 5/7. ) F77 CGMCC No. 8382 對酸度的耐受性圖。
[0025] 圖4麴黴（Aspergillus sp. )F77 CGMCC No. 8382吸附時間對銫吸附行為的影響 圖。
[0026] 圖5麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382銫初始濃度對吸附效果的影響 圖。
[0027] 圖6麴黴（Aspergillus sp. ) F77 CGMCC No. 8382吸附等溫式擬合曲線圖。
[0028] 圖7鉀對麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382生長和吸附銫的影響圖。
[0029] 圖 8 麴黴 5/7. ) F77 CGMCC No. 8382pH 對吸附效果的影響圖。
[0030] 圖9不同菌體量對麴黴5/7. ) F77 CGMCC No. 8382吸附銫離子的 影響圖。
[0031] 圖10吸附時間對於對麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382吸附銫離子 的影響圖。
[0032] 圖11溫度對麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382菌體對銫離子吸附的 影響圖。
[0033] 圖12麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382對穩定銫和放射性銫的吸附 率圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合具體實施例進一步闡明本發明，當然，這些實施例僅用於說明本發明，而 不用於限制本發明要求保護的範圍。
[0035] 本發明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設備： 培養基選用：PDA培養基表面為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、蒸餾水IL，pH自然。
[0036] 主要儀器與試劑：MSSPX-250型生化培養箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-1F B型單人雙面淨化工作檯，E360K離心機，恆溫搖床HWY-KKLPCR儀Eppendorf No:5345,電 泳儀 Bio-Rad Mode 200/2.0,凝膠成像儀 United-Bio, GK-330C plus，PCR 預混液（TaKaRa Biotechnology),其餘試劑均為分析純。超聲波破碎儀為美國Sonics，VC 130。Xseries II 型電感耦合等離子體質譜（ICP-MS)，美國THERMO公司；Seven Easy Plus S20P型精密pH 計，上海梅特勒-託利多儀器有限公司；DHG-9240A型電熱恆溫鼓風乾燥箱，上海一恆科學 儀器有限公司；THZ-82氣浴恆溫振蕩箱，江蘇金壇誠輝儀器廠；GMSX-280壓力蒸汽滅菌器， 北京永光明醫療儀器有限公司。試劑均為分析純，水為超純水，18.2 ΜΩ ?cm。
[0037] 本發明中選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，但不限制本發明的實 施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用於本發明以下實施方式的實施。
[0038] 實施例一：麴黴 取）F77CGMCC No. 8382 的分離、培養 1.分離：本發明所使用的耐福射麴黴5/7. )F77由新疆農業科學院微生 物應用研究所從新疆巴音郭楞蒙古自治州地區某地放射性汙染土壤中取樣分離，利用傳統 的平板培養法分離出土層中的微生物，平板劃線法純化菌株，以不同的培養溫度、pH值、培 養基為富集條件，篩選出一批生長良好的微生物菌株，從中優選出一株編號為F77的菌株。
[0039] 分離步驟：依據梯度稀釋法，稱取10g 土壤樣品於90mL無菌生理鹽水中，30° C於 恆溫振蕩箱活化30min後進行梯度稀釋，選取1(Γ2、10' ΚΓ4稀釋液分別塗布於PDA培養基 的平板，每個處理3個重複，置30° C培養。待長出菌落後挑取形狀、大小、顏色等不同的菌 落分別劃線接種於新的分離培養基PDA培養基，直至無雜菌落。將純化後的菌株一部分採 用凍幹安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存於4° C直接用於後續研究。
[0040] 2.培養條件：將純化的菌株接種到馬鈴薯固體培養基斜面上，於30°C培養6天，放 入4 °C冰箱中保存備用。
[0041] 具體的：該菌株培養溫度28-30°C，最適培養溫度30°C左右；該菌種生長於PDA培 養基表面為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、蒸餾水IL，pH自然，經30°C、48h培養。
[0042] 本發明所使用的耐福射麴黴(Aspergi/AAs· 57?. ) F77菌株已保藏於布達佩斯條約 微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)保藏，地 址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏日期 為2013年10月22日，菌種保藏號為CGMCC No. 8382,該菌株培養溫度28-30°C，最適培養 溫度30°C左右；該菌種生長於PDA培養基表面為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、蒸餾水 IL，pH自然，經30°C、48h培養。菌種F77通過插片和水壓片的鏡檢觀察，該菌株初生菌絲 白色，疏鬆絨毛狀。孢子堆粽葉綠色，孢子近圓形，成串著生在膨大的孢子梗頂端四周，成放 射狀分布，無分生小梗。參見附圖1。根據以上形態特徵，初步鑑定該菌株為半知菌綱叢梗 孢目叢梗孢科單梗麴黴屬的一個種。參照《真菌鑑定手冊》進行鑑定，結合對F77菌株進行 形態學，生理生化鑑定，命名為麴黴5/7.)。
[0043] 該菌株麴黴5/7. ) F77在PDA培養基，Wort培養基生長良好，經 Biolog FF鑑定板試驗證明F77可以利用吐溫80, N-乙醯基-β-D-葡萄糖胺，核糖醇，L-阿 拉伯糖，D-阿拉伯醇，熊果苷，D-纖維二糖，D-木糖，蘋果酸，糊精，赤藻糖醇，D-葡萄糖酸， a-D-葡萄糖，D-甘露醇，β-甲基-D-葡萄糖苷，6-0-D-吡喃葡萄糖醯，D-呋喃果糖，D-葡萄 醛酸，丙三醇，肝糖，麥芽三糖，奎尼酸，L-穀氨酸，腺苷-5 ζ -磷酸鹽，a-D-葡萄糖-1-磷 本鹽，D-核糖，水楊苷，D-山梨醇，L-山梨糖，水蘇糖，K-海藻糖，松二糖，木糖醇，y-氨基丁 酸，溴代琥珀酸，反丁烯二酸，β_羥基丁酸，y_羥基丁酸，P-羥苯乙酸，a-酮戊二酸，D-蘋 果酸，D-葡萄糖二酸，癸二酸，琥珀酸，琥珀酸甲基酯，L-丙胺酸醯胺，L-丙胺酸，L-丙胺 醯氨基乙酸，L-天冬醯胺，L-天冬氨酸，甘氨醯-L-穀氨酸，L-苯基柄氨酸，脯氨酸，焦谷 氨酸，L-絲氨酸，L-蘇胺酸，2-氨基乙醇，腐苷，腺苷。結果見表1。
[0044] 表1 :溫度、pH等因素對菌株F77生長的影響_
【權利要求】
1. 一種麴黴5/7. )F77,其特徵在於，所述的麴黴dpergiBiAs 5/7. )F77 保藏編號為CGMCCNo. 8382。
2. 如權利要求1所述的麴黴(As/76?r^77A/5· 5/7. )F77在在放射性核素吸附中應用。
3. -種利用耐輻射麴黴5/7. )F77 CGMCC No. 8382在吸附銫生物處理 中的應用。
【文檔編號】C12R1/66GK104087519SQ201410334312
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】王瑋, 王衛憲, 張志東, 謝玉清, 張麗娟, 徐輝, 顧美英, 朱靜, 唐琦勇, 宋素琴, 王耀琴, 楚敏 申請人:新疆農業科學院微生物應用研究所