新穎的益生菌菌株及其應用的製作方法

2024-02-29 17:12:15 2

專利名稱：新穎的益生菌菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種新穎的益生菌(BS139)，特別是關於一種具有可抵抗環境壓力的耐受性的枯草桿菌菌株。
背景技術：
在人體腸道內，具有種類約400種以上、總數約100兆的細菌(腸內菌)，其中 80-85%是正常菌群，15-20%是有害菌。因此，維持菌群生態平衡非常重要，其作用包括能幫助食物殘渣分解消化，還能製造維生素B群和K，益生菌產生乳酸和醋酸，能保持腸道微酸性，使有害菌無法生存。而現代人因物質豐富，飲食方面越來越精緻、講究，加上年紀增長，使腸內細菌產生極大變化，有益菌逐漸減少，有害菌大量增加，進而造成疲倦、焦慮、皮膚粗糙等現象，更甚者會影響養分正常吸收而產生疾病。所謂的益生菌O^robiotics)，有人譯為原生物素、生菌素、生菌劑或原生保健性菌種。根據聯合國世界衛生組織(WHO)對「益生菌」的定義，可定義為「適量的給予宿主，使其能產生健康效應的活菌」。亦可廣義地解釋為應用至人類或其它動物，藉由改善腸內微生物相平衡、有益於宿主的活菌。其作用包括可改善宿主腸內微生物的平衡，調整腸道菌落的組成，進而能幫助人類抵抗各種感染病原及抑制有害菌，並可改善泌尿生殖道菌群，預防感
^fe ο益生菌種類繁多，包括枯草桿菌(Bacillus subtilis)、嗜乳酸桿菌 (Lactobacillus acidophilus)、保力口利亞乳酸桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、雙岐雙叉桿菌(Bifidobacterium sp.)、龍根菌(Bifidobacterium Longum)、嗜熱性鏈球菌 (StreptococcusthermophiIus)等，市面上常見的益生菌包括有酵母菌及乳酸菌等，而利用乳酸菌製造出的產品眾多，其中以發酵乳、乳酸菌飲料、酸奶、優格、起司、胃腸藥、泡菜、糖果、餅乾等相關產品居多，整體而言，市售的產品多集中於發酵乳製品與錠劑膠囊型式的保健產品，是因其特性符合乳酸菌的生存環境，使乳酸菌可在乳製品存活一段期間，而一般乳酸菌在非乳製品如糖果、果凍內中則不易存活。此外，乳酸菌一般均強力代謝糖類，而且會產生乳酸，使產品具有酸味，產品口味因此被局限，因此目前市售產品通常添加許多食品添加物，如蔗糖、果糖等物質，有違養生健康的原則，為了使口感不被局限，市面上亦有藥劑型的產品，但此類的產品，卻難為兒童所接受。無論產品形式為何，乳酸菌要發揮功效必須為活菌，而人體的胃酸值介於pH值 2 3之間，許多乳酸菌菌種無法在此酸性環境下生存，因此能真正在人體中產生作用的乳酸菌菌種十分稀少；同時，腸內的膽鹽對乳酸菌也會產生破壞，可通過消化道抵達結腸的乳酸菌十分有限。再者，乳酸菌培養的條件須嚴格控管，須在特定溫度之下乳酸菌才能生長良好，且乳酸菌不耐高溫，成品無法利用高溫殺菌，使產品無法久放，易滋生雜菌。菌在不同環境壓力下會以內孢子型態存在，以增加對環境的耐受性。內孢子，又稱
4芽孢(endospore)、內生孢子，是某些特殊種群的細菌，主要是芽孢桿菌屬Bacillus與梭菌屬Clostridium中細菌產生的特殊休眠體，有極強的抗逆性，對熱、鹼、酸、高滲、有機溶劑 (例如酒精)、家用清潔劑、以及輻射均有強耐受性。國際期刊JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Apr. 2006,p. 2692-2700證實Bacillus subtilis可於腸道中萌發，並且可由萌發態再次形成孢子。本案發明人針對已知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並本著鍥而不捨的精神，終構思出本案「新穎的益生菌菌株及其應用」，能夠克服先前技術的不足，提供一種具有可抵抗環境壓力的耐受性的枯草桿菌(Bacillus subtilis)菌株BS 139，包括耐酸、耐膽鹽以及耐高溫等特性，其保存於美國農業研究菌種保藏中心(Agriculture Agricultural Research krvice，NRRL)，保藏編號為NRRL NO. B-50347。並可進一步應用於食品產品及醫藥組成物的製備方面。以下為本案的簡要說明。

發明內容
近來民眾對於飲食健康非常看重，且生物技術逐漸提升，因此開始研究將益生菌與食品結合在一起，因為益生菌在人體內有助於抑制病源菌的孳生和吸收特殊的營養，因此在人體增加益生菌的菌數，有助於人體的健康。但是在經由飲食進入人體的菌，不管是益生菌還是病源菌，都必須通過胃酸和膽鹽的考驗，才能順利到達腸道，益生菌在食品加工的過程中，高溫也是一個考驗，因此如何使益生菌既可耐酸、耐膽鹽、耐高溫，又可長期存活於非乳製品中且不產酸，符合產品的製程、降低製作成本，將是一個非常重要的目標。本發明的菌株是由一豆腐乳製品中所分離取得的，豆腐乳為一種二次加工的豆製品，先將黃豆研磨成豆漿添加石膏，經過攪拌、固、壓製成硬豆腐，表面乾燥後，二次加工後才形成豆腐乳；二次加工的方法有兩種(一)使用黃豆曲或黃豆米曲黃豆、米等蒸煮於卻後制曲；豆腐鹽漬後混合黃豆曲熟成。(二)接種毛黴菌將表面乾燥的豆腐接種毛黴菌培養成黴豆腐，再浸鹽水、加調味料熟成。由於製作豆腐乳所使用的黴菌，必需選用馴化的人工培養菌種，本菌株是一天然菌株且微量存在於豆腐乳製品中，透過採樣、分離並分析其生物特性後，經實驗室鑑定為一新穎的枯草桿菌(Bacillussubtilis)分離株，且為一新穎的益生菌種，故給予該新穎之益生菌編號BS-139。因此，為實現本發明的目的，本發明一方面提供一種具有可抵抗環境壓力的耐受性的枯草桿菌(Bacillus subtilis)菌株，其微生物保藏號是NRRL NO. B-50347 ；分類命名是Bacillus subtilis ；保藏時間2010年2月1日；保藏地址華盛頓特區西南獨立大道 1400 號傑米湖惠滕大廈，20250(Jamie L. Whitten Building 1400Independence Ave. , S. W. Washington DC, 20250)；保藏單位美國農業研究菌種保藏中心(Agriculture Agricultural Research Service, NRRL)。本發明枯草桿菌菌株的形態學特徵將菌體以劃線分離方式，接種於 Luria-Bertin瓊脂平板培養基，經隔夜37°C有氧生長培養。革蘭氏染色為陽性菌G⑴，為好氧性菌，可產生內孢子，在生長對數期時之菌體呈4 μ mxl μ m杆狀，具有周鞭毛，高遊動性。於營養豐富的Luria-Bertini (LB)瓊脂平板培養基生長時，菌落形狀為圓形，淺乳白色，表面稍微突起，菌落周圍平滑本發明的另一目的是提供一種食品產品，包含所述枯草桿菌即益生菌BS139。本發明之又一目的即是提供一種醫藥組成物，包含所述枯草桿菌即益生菌BS139。本發明的目的是為解決現有技術中存在的問題提供一種枯草桿菌(Bacillus subtilis)菌株即益生菌BS139，其保存於美國 Agricultural Research Service (NRRL)，保藏編號為NRRL N0.B-50347，本發明枯草桿菌菌株(即益生菌BS139)具有可抵抗環境壓力的耐受性，其實施型態包括菌液或菌粉型態。本發明益生菌BS 139的耐受性包括耐膽鹽、 溫度以及酸性環境等類似於人體胃腸道的條件。本發明培養具有孢子的益生菌BS139，並利用溶氧因子控制、培養基濃度控制技術來提升其產孢率，並強化孢子對高溫85°C 90°C的抗性，使益生菌BS139可耐酸、耐膽鹽， 且可耐高溫，符合產品的製程，降低製作成本，培養出不產酸的益生菌BS139，亦可長期存活於非乳製品中。 同時，也可將本發明益生菌BS139應用於製備食品產品，食品產品包括飲品、食品、動物食品、食品添加物中的一種或多種。飲品例如發酵乳、乳酸菌飲料、牛乳、乳飲料、豆奶、酸奶、酸乳、飲料、果汁、豆漿、 茶包、茶葉、咖啡粉、可可粉、奶粉、豆粉、麥粉、礦泉水、瓶裝水及雞精。食品例如豆花、奶酪、乾酪、冷凍優格、布丁、茶凍、仙草冰品、糖果、口含錠、西點、 蛋糕、麵包、餅乾、堅果、湯包、方便麵、麵條、面線、冬粉、餅乾、冰淇淋、軟糖、口香糖、穀類食品及烘焙原料。動物食品例如禽畜飼料、魚飼料、飼料、寵物飼料添加及寵物用品。食品添加物例如中藥包、調味包、調味品、辛香料、食品配料、辛香油、麻油、橄欖油、辣椒醬、酸辣醬、糖、鹽、醬油、食品添加劑、飲用水添加劑、冰品添加、食品配料、天然原料及健康原料。同時，本發明益生菌BS139也可應用於製備醫藥組成物，以益生菌BS139與氧化鎂 MgO的共同作用為例氧化鎂MgO在醫療方面可用於治療胃灼熱、胃酸和酸性消化不良，也可用作短效輕瀉劑(軟便劑)。本發明益生菌BS139孢子的抗逆性使其可輕易進入腸道，萌發後在腸道中改善腸道菌群，使排洩狀況恢復。其中所述的醫藥組成物可製成溶液、乳劑、 粉末、錠劑或膠囊等劑型。另外，本發明益生菌BS139也可應用於製備日常用品，日常用品包括保健用品、 清潔用品、美容用品、生活用品、農業用品。所述的保健用品為健康食品、保健食品、腸胃保護劑、生髮液及護髮劑。本發明益生菌BS139加入清潔用品可增強清潔用品的抗菌能力，其中所述的清潔用品為洗髮精、洗面奶、潤髮乳、沐浴乳、肥皂、香皂、洗衣粉、漱口水、牙膏、牙粉、陰部陰道衝洗液、尿布、衛生棉、棉墊、泡澡粉、泡澡包、泡腳粉、泡腳包及除屑劑。本發明益生菌BS139加入美容用品可形成保護膜，具有加強皮膚保溼、抗菌、代謝老化角質之功能，其中所述的美容用品為面霜、護手霜、潤膚霜、香水、面膜、精油及化妝品原料添加劑。所述的生活用品為鞋墊、芳香劑、軟膏、噴劑、噴霧劑痱子粉、環境用噴劑、馬桶除臭劑或水塔或飲水機內部添加。所述的農業用品為農業用微生物製劑、土壤活化劑、微生物肥料添加劑或微生物肥料發酵劑。本發明的枯草桿菌菌株具有如下優點經由本發明所採用的技術手段，可將本發明的益生菌BS139應用至食品產品的製作、加工或醫藥製備方面。利用本發明益生菌分離株具有對膽鹽、溫度及酸性環境耐受性的特性，可在食品加工的過程中可能遭遇的高溫下，仍然保持其活性。亦可在人體腸胃道中酸性、膽鹽等條件下，順利存活到達腸道。以改善宿主腸內微生物的平衡，調整腸道菌群的組成，進而能幫助人類抵抗各種感染病原及抑制有害菌等作用。


圖IA 本發明益生菌BS139對數期生長時的光學顯微照相；圖IB 本發明益生菌BS139的菌落形態；圖2 本發明益生菌BS139的生長曲線；圖3A ;3B 本發明益生菌BS139的類源關係樹；圖4 本發明益生菌BS139對酸的耐受性測試結果；圖5 本發明益生菌BS139對溫度的耐受性測試結果；圖6 本發明益生菌BS139菌粉對膽鹽的耐受性測試；圖7 本發明益生菌BS139菌粉對溫度的耐受性測試；圖8 本發明益生菌BS139菌粉對酸的耐受性測試；圖9A 在果凍食品中本發明益生菌BS139對溫度的耐受性測試；圖9B 本發明益生菌BS139在果凍食品中的生長情況。
具體實施例方式下面結合具體實施例和附圖來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。形態學特徵參閱圖1A，顯示本發明益生菌BS139對數期生長時的光學顯微照片。將菌體懸浮於甘油中，懸滴於玻片上封片後，以倒立光學顯微鏡Leica DMI 3000，物鏡為100X/NA 1. 25 oilimmersion，配合 Photometries CooISNAP EZ CCD 數字擷取菌體影像。圖IB顯示本發明益生菌BS139的菌落形態。將菌體以劃線分離方式，接種於 Luria-Bertin瓊脂平板培養基，經隔夜37°C有氧生長培養。其形態學特徵包括革蘭氏染色為陽性菌G (+)，為好氧性菌，可產生內孢子，在生長對數期時，菌體呈4 μ mxl μ m杆狀(參見圖1A)，具有周鞭毛，高遊動性。於營養豐富的Luria-Bertini (LB)瓊脂平板培養基生長時，菌落形狀為圓形，淺乳白色，表面稍微突起，菌落周圍平滑(參閱圖1B)。培養性狀特徵圖2顯示本發明益生菌BS139的生長曲線。將本發明菌體接種於Luria-Bertin 液態培養基，經37°C有氧生長培養，記錄其菌液混濁度(Optical density at 600nm)。生理特性
另夕卜，本發明益生菌BS139具有下列酵素活性觸酶(catalase)、氧化酶(oxidase)、澱粉分解酶(α -amylase)、蛋白質分解酶(protease)、纖維酶分解酶 (cellulase)、納豆激酶(nattokinase)。鹼基序列分析利用本發明益生菌BS139抽取的染色體針對16S rDNA以及gyrase B基因(gyrB) 片段進行PCR定序，Bacillus subtilis BS139菌株的16SrDNA的核苷酸序列、gyrase B基因的核苷酸序列見序列表。結果顯示本發明枯草桿菌菌株屬於Bacillus subtilis—族， 與實驗室標準菌株B. subtilis strain 168 (ATCC :23857)相近但不同。利用序列比對工具 (BLAST)針對美國國家生物技術信息中心(NCBI)的資料庫進行分析比對，並繪製16S rDNA 以及gyraseB基因的類源關係樹(參閱圖3A 3B)，結果顯示可將本菌株歸類為一新穎的 Bacillus subtilis菌株，並命名為益生菌BS139。實施例1 益生菌BS139的發酵培養在發酵培養的之過程中，其重點步驟包括(一)益生菌篩選發酵時以碳源葡萄糖(Glucose)、氮源大豆蛋白與NaCl等生化試劑做菌種發酵，並於離心管與搖瓶處理； (二)好氧產孢子益生菌培養置入5L槽培養，後再置入100L槽培養，之後培養液靜置不供氧維持2日，增加微生物產孢率；(三)優勢生長篩選技術培養益生菌BS 139時，每小時取一次菌液，紀錄其生長效率，計算其生長效率最高的時間點，約於6小時可達對數生長中期(mid-log phase)。實施例2 益生菌BS139孢子耐溫、產率提升技術在提升孢子耐溫及產率方面，利用溶氧因子控制以大量曝氣來提高溶氧，以供應培養液內細菌的需氧量，若降低培養液的溶氧，環境變化將使得微生物產孢，可提高產孢率，並利用培養基濃度控制利用無菌水以體積比稀釋培養液濃度，利用濃度控制得到最高產孢速率的最適培養基濃度(以稀釋培養液為原濃度的50%與30% )，不同濃度下量測孢子產率。藉由不同測試發現以上技術可提升益生菌的產孢率、孢子耐溫及產率，強化孢子對高溫85°C 90°C的抗性及提高其產孢率。實施例3 益生菌BS139對酸的耐受性測試樣本的前製備首先將少許菌粉泡在培養液中，活化四小時後塗在培養基上放在37°C培養器 (incubator)中進行隔夜培養(overnight)，並且用腸出血性大腸桿菌(EHEC)做同樣方式製備。完成樣本製備後，依照下列步驟進行1.用牙籤挑取平盤上的菌落少許加入離心管裝的6ml培養液中，放在37°C培養器中(incubator)旋轉培養16小時。2.將培養的菌液分裝到無菌圓底培養管，分別是1-0、1-1、1-2、1_3以及l_ls、 l-2s、l-3s 共 7 管，每管 0. 8ml。3.將上述7管以7000rpm、anin離心，倒掉上清液，再迅速以7000rpm、IOsec離心， 再倒掉上清液只留下沉澱(pellets)。4.將 l-ls、l-2s、l-3s 分別加入 0. 8ml 的 PBS(pH 2. 0)，其餘 4 管加入 0. 8ml 的 PBS (pH 7. 3)，震動(vortex)打散 pellets。
5.將1-0取出20 μ 1做序列稀釋(利用PBS ρΗ7· 3稀釋)，取IO6UO7稀釋菌液 0. Iml利用培養基進行塗盤隔夜計數，其餘6管都放入37°C培養器中培養(150rpm)，每一小時取配對的2管序列稀釋，取0. Iml的適當稀釋倍數以培養基進行塗盤隔夜計數，即第1小時取1-1及I-IS稀釋塗盤，以此類推接下來兩小時進行的實驗。6.以上述方式進行三重複實驗，並紀錄計數所得的數據。7.取腸道出血性大腸桿菌(EHEC)菌液採用同上述方式進行測試，所測得的數據當作實驗的對照組。8.此實驗需進行pH2. 0、pH3. 0、pH4. 0、pH7. 3共4種酸性耐受性測試，因此須以 PH3. 0、pH4. 0的PBS分別重複上述的實驗。結果請參閱圖4，顯示BS139對酸之耐受性測試結果。根據實驗的觀察結果發現， BS139在pH 4. 0環境下最多可存活2小時。實施例4 益生菌BS139對溫度的耐受性測試本實施例中，首先進行如實施例3的樣本前製備及以下步驟1.用牙籤挑取平盤上的菌落少許加入離心管裝的6ml培養液中，放在37°C培養器中(incubator)旋轉培養16小時。2.將培養之菌液分裝到無菌圓底培養管，分別標記1-0、1-1、1_2共3管，每管 0. 8ml。3.將上述3管以7000rpm、anin離心，倒掉上清液迅速離心7000rpm、IOsec再倒掉上清液只留下沉澱(pellets)。4.將上述3管加入0. 8ml的PBS (pH 7. 3)，震動打散pellets。5.將1-0管中取出20 μ 1做序列稀釋(利用PBS ρΗ7. 3稀釋)，取0. Iml的106、
IO7稀釋菌液進行培養基塗盤隔夜計數。6.將配對的2管(1-1、1_2)放入100°C幹浴器中培養，每隔15分鐘取1管菌液進行序列稀釋，並取0. Iml適當稀釋倍數的菌液進行培養基塗盤隔夜計書，亦即第15分鐘取 1-1，第30分鐘取1-2稀釋塗盤。7.以上述方式做三重複實驗，並紀錄計數所得的數據。8.取EHEC菌液採用同上述方式進行測試，所測得之數據當作實驗的對照組。9.此實驗需進行的溫度測試有50°C、75°C、80°C、10(rC，並且測試抗溫時間有10 分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時。因此比照上述方式，依測定目標調整幹浴器的溫度及放置時間，然後進行測試並紀錄數據。結果參閱圖5，顯示BS139對溫度的耐受性測試結果。根據實驗的觀察結果發現， BS139培養液於50°C作用30分鐘時則約還有20%存活率。實施例5 益生菌BS139菌粉對膽鹽的耐受性測試樣本的前製備將要測試的菌粉用離心管(印pendorf tubes)先分裝20管菌粉，以作為實驗用的樣本，每管菌粉重約0. lg，置於-20°C冰箱中。1.從-20°C冰箱中取1管0. Ig菌粉，將此菌粉加入IOml的培養液(含3%膽鹽，bile salt)中充分震動混勻。2.分裝入4管無菌圓底培養管，每管Iml分別標示為1_0、1_1、1_2、1_3。3.將1-0培養管取出20 μ 1進行序列稀釋(利用PBS ρΗ7. 3稀釋)，取0. Iml的IO5UO6稀釋菌液進行培養基塗盤隔夜計數，其餘3管(1-1、1-2、1-；3)放入37°C培養器中旋轉培養(150rpm)，每隔1小時取1管進行序列稀釋，取0. Iml的適當稀釋菌液進行培養基塗盤隔夜計數，亦即第1小時取1-1稀釋塗盤，以此類推接下來兩小時進行的實驗。4.以上述方式進行三重複實驗，並紀錄計數所得的數據。5.完成3%膽鹽抗性測試之後，改換成含有0. 3%膽鹽的培養液按上述方式進行抗性測試，並且紀錄所得數據以做比較。結果參閱圖6，顯示BS139菌粉對膽鹽的耐受性測試。實驗結果顯示BS 139在含有3%和0. 3%之膽鹽的環境下作用3小時，還有將近20%的存活率。實施例6 益生菌BS139菌粉對溫度的耐受性測試本實施例中，首先進行如實施例5的樣本前製備及以下步驟1.從_20°C冰箱中取 1管0. Ig菌粉，將此菌粉加入IOml的培養液中充分震動混勻。2.分裝入3管無菌圓底培養管，每管Iml分別標示為1-0、1_1、1_2。3.將1-0試管取出20 μ 1進行序列稀釋(利用PBS ρΗ7. 3稀釋)，取0. Iml的105、 IO6稀釋菌液進行培養基塗盤隔夜計數，其餘2管(1-1、1-幻放100°C幹浴器中培養，分別在第10分鐘及第30分鐘分別取1-1及1-2試管進行序列稀釋，取0. Iml的適當稀釋菌液進行培養基塗盤隔夜計數。4.以上述方式進行3重複實驗，並紀錄計數所得的數據。5.此實驗測試的溫度有50°C、75°C、80°C、10(rC共4種，因此還必須更改幹浴槽的
溫度重複上述實驗，以測得各溫度的存活數據。結果參閱圖7，顯示BS139菌粉對溫度的耐受性測試。實驗結果顯示BS 139菌粉在100°C的溫度下幾乎沒菌存活，在75°C、80°C的溫度作用30分鐘內有80%以上存活率。實施例7 益生菌BS139菌粉對酸的耐受性測試本實施例中，首先進行如實施例5的樣本前製備及下列步驟1.從_20°C冰箱中取 1管0. Ig菌粉，將此菌粉加入IOml的PBS (pH4. 0)中充分震動混勻。2.分裝入4管無菌圓底培養管，每管Iml分別標示為1-0、1-1、1-2、1-3。3.將1-0培養管取出20 μ 1進行序列稀釋(利用PBS ρΗ7. 3稀釋)，取0. Iml的 IO5UO6稀釋菌液進行培養基塗盤隔夜計數，其餘3管(1-1、1-2、1-；3)放入37°C培養器中旋轉培養(150rpm)，每隔1小時取1管進行序列稀釋，取0. Iml的適當稀釋菌液進行培養基塗盤隔夜計數。4.以上述方式進行3重複實驗，並紀錄計數所得的數據。5.此實驗要測試的pH有2.0、3.0、4.0、7. 3共4種，因此還必須更改PBS的pH值
重複上述實驗方式，以測得數據。結果參閱圖8，顯示BS139菌粉對酸的耐受性測試。根據實驗結果發現菌粉的 BS139對於酸的耐受性明顯的比營養態菌液較好，直到pH3. 0培養3小時的後存活率才逐漸減少。根據以上實驗結果，BS139菌粉在酸、膽鹽或溫度的耐受性明顯優於BS139培養菌液，其原因在於BS139菌粉中的內孢子相當多，遠高於BS139培養菌液中孢子的含量，而內孢子是BS139在惡劣環境下存活的方式，它可以提升BS139對外面壓力的耐受性。實施例8 益生菌BS139在果凍食品中對溫度的耐受性測試
10
樣本的前製備將盒裝的含有益生菌BS139的果凍先分裝到2支離心管(50ml)中，關緊後用 parafilm封住開口，存放在4°C冰箱中。1.從4°C冰箱中取一管果凍出來，用滅菌過的湯匙取約2ml的果凍各裝入15ml的離心管中，分別加入Iml的PBS(pH 7. 3)，再加入玻璃珠震蕩打碎果凍。2.用移液器(pipet)從中取2管各2ml置入離心管中，分別標示1_0、1_1。3.以PBS (pH 7. 3)對1_0試管進行序列稀釋，取0. Iml的103、IO4稀釋菌液進行
培養基塗盤隔夜計數，所得數值即表示存活數。4.將1-1試管90°C加熱10分鐘之後同樣稀釋塗盤隔夜計數，所得數值即表示存活孢子數。5.按上述方法進行三重複實驗，並紀錄計數所得數據。6.果凍儲存於4°C冰箱不同時間後，以上述相同實驗方式計數存活菌數以及孢子數。結果參閱圖9A，顯示在果凍中BS139對溫度的耐受性測試。根據實驗的結果顯示， 果凍中的BS139在置於90°C中10分鐘後還有近70%以上的存活率。接著參閱圖9B，其顯示BS139在果凍中的生長情況。此實驗數據是取上述實驗中 1-0三重複實驗計數所得的菌落平均數，並將其換算成Iml中所含的菌落數。根據結果可以發現果凍中的BS139的菌數隨著時間增加而逐漸減少。通過本實施例，可以了解益生菌BS139可通過各種加工的過程，製造形成不同的食品或是附加食品，另外，本發明益生菌BS 139亦可應用於製備日常用品，例如健康食品、保健食品、腸胃保護劑、保健用品、生髮液及護髮劑。實施例9 食品加工益生菌BS139摻菌製備技術基於BS139的特性，非常適於製作益菌果凍，其步驟包括(一)高溫滲菌製作於熱融的果凍膠體混合物，於80°C高溫中加入孢子菌粉攪拌，而後再降溫至75°C中進行巴斯德滅菌，其後注入容器後再降溫至10°C中冷凝成型；(二)成型低溫處理技術將降溫後的成品置於10°C處理30分鐘，此時可促使產品中活化的營養態細菌繼續形成耐溫耐酸孢子。 並於儲存時間內保持活性穩定，可達到一周內活菌數大於切川8^!!/^^!^ ；低溫4°C儲存三周後，活菌數大於3xl08CfU/100ml。本實施例所製成的益菌果凍，其可食用測試系由陽明大學創新育成中心進駐廠商的臺美檢驗科技公司進行食品微生物測試以及一般食品的安定性試驗。由以上之實施例可知，本發明所提供的益生菌BS139具產業上的利用價值，故本發明符合專利的要件。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種枯草桿菌(Bacillus subtilis)菌株，其微生物保藏號是NRRL NO. B-50347, 該菌株具有可抵抗環境壓力的耐受性。
2.如權利要求1所述的枯草桿菌菌株，其中所述的枯草桿菌菌株的實施型態為菌液。
3.如權利要求1所述的枯草桿菌菌株，其中所述的枯草桿菌菌株的實施型態為菌粉。
4.如權利要求1所述的枯草桿菌菌株，其中所述的枯草桿菌菌株具有的耐受性為膽鹽耐受性。
5.如權利要求1所述的枯草桿菌菌株，其中所述的枯草桿菌菌株具有的耐受性為溫度耐受性。
6.如權利要求1所述的枯草桿菌菌株，其中所述的枯草桿菌菌株具有的耐受性為酸耐受性。
7.一種食品產品，包含可食性材料和如權利要求1所述的枯草桿菌菌株。
8.如權利要求7所述的食品產品，其中所述的食品產品是飲品、食品、動物食品、食品添加物中的一種或多種。
9.如權利要求8所述的食品產品，其中所述的飲品是發酵乳、乳酸菌飲料、牛乳、乳飲料、豆奶、酸奶、酸乳、飲料、果汁、豆漿、茶包、茶葉、咖啡粉、可可粉、奶粉、豆粉、麥粉、礦泉水、瓶裝水、雞精中的一種或多種。
10.如權利要求8所述的食品產品，其中所述的食品是豆花、奶酪、乾酪、冷凍優格、布丁、茶凍、仙草冰品、糖果、口含錠、西點、蛋糕、麵包、餅乾、堅果、湯包、方便麵、麵條、面線、 冬粉、餅乾、冰淇淋、軟糖、口香糖、穀類食品、烘焙原料中的一種或多種。
11.如權利要求8所述的食品產品，其中所述的動物食品是禽畜飼料、魚飼料、飼料、寵物飼料添加劑、寵物用品中的一種或多種。
12.如權利要求8所述的食品產品，其中所述的食品添加物是中藥包、調味包、調味品、 辛香料、食品配料、辛香油、麻油、橄欖油、辣椒醬、酸辣醬、糖、鹽、醬油、食品添加劑、飲用水添加劑、冰品添加、食品配料、天然原料、健康原料中的一種或多種。
13.—種醫藥組成物，包含如權利要求1所述的枯草桿菌菌株。
14.如權利要求13所述的醫藥組成物，其中所述的醫藥組成物的劑型為溶液、乳劑、粉末、錠劑或膠囊。
15.一種日常用品，包含如權利要求1所述的枯草桿菌菌株。
16.如權利要求15所述的日常用品，其中所述的日常用品是保健用品、清潔用品、美容用品、生活用品、農業用品中的一種或多種。
17.如權利要求16所述的日常用品，其中所述的保健用品是健康食品、保健食品、腸胃保護劑、生髮液、護髮劑中的一種或多種。
18.如權利要求16所述的日常用品，其中所述是清潔用品是洗髮精、洗面奶、潤髮乳、 沐浴乳、肥皂、香皂、洗衣粉、漱口水、牙膏、牙粉、陰部陰道衝洗液、尿布、衛生棉、棉墊、泡澡粉、泡澡包、泡腳粉、泡腳包、除屑劑中的一種或多種。
19.如權利要求16所述的日常用品，其中所述的美容用品是面霜、護手霜、潤膚霜、香水、面膜、精油、化妝品原料添加劑中的一種或多種。
20.如權利要求16所述的日常用品，其中所述的生活用品是鞋墊、芳香劑、軟膏、噴劑、 噴霧劑、痱子粉、環境用噴劑、馬桶除臭劑或水塔、飲水機內部添加劑中的一種或多種。
21.如權利要求16所述的日常用品，其中所述的農業用品是農業用微生物製劑、土壤活化劑、微生物肥料添加劑、微生物肥料發酵劑中的一種或多種。
全文摘要
益生菌與食品的結合有助於抑制人體病源菌的孳生和吸收特殊的營養。然而，這些益生菌在食品加工的過程中要在高溫下生存，並且進入人體後必須通過胃酸和膽鹽的考驗，才能順利到達腸道。因此，本發明提供一種具有可抵抗環境壓力的耐受性的枯草桿菌(Bacillus subtilis)菌株BS139，包括耐酸、耐膽鹽以及耐高溫等特性，其保存於美國農業研究菌種保藏中心(Agricultural ResearchService，NRRL)，保藏編號為NRRL NO.B-50347。並可進一步應用於食品產品、醫藥組成物及日常用品的製備方面。
文檔編號C12R1/125GK102191189SQ201010122650
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月3日 優先權日2010年3月3日
發明者林秀霞, 遊政穎 申請人:林秀霞