一種多孢木黴菌菌株HZ‑31及其在生物除草中的應用的製作方法

2024-03-01 11:05:15 4

本申請屬於微生物應用於農業植物保護領域，具體地說涉及一種多孢木黴菌菌株HZ-31及其在生物除草中的應用。

背景技術：

隨著社會文明的進步和公眾健康意識的提高，廣泛、長期、大量使用化學除草劑所帶來的負面影響亦日益顯現，倍受全球關注。一方面，大量化學除草劑的施用帶來了環境汙染，尤其是長殘效除草劑的應用引起了殘毒藥害、導致下茬作物的減產甚至人畜中毒。目前，全世界已經有100餘種化學除草劑在30多個國家被禁用或取消登記。另一方面，過度依賴和長期大量使用單一除草劑，導致了雜草抗藥性的產生和發展，使得藥效降低、用藥量增加、成本提高、也更加重了汙染，直接威脅到除草劑的繼續使用和農業生產安全。據最新統計，全球已發現244種(142種雙子葉，102種單子葉)雜草的447個生物型對22類作用位點的156種化學除草劑產生了抗藥性。因此，研製廣譜、高效、低毒新型綠色除草劑特別是發展生物除草顯得十分迫切。1992年世界環境與發展大會要求「在2000年前全世界生物農藥的產量佔農藥總產量的60％」。就生物除草而言，雖然目前遠未達到這一目標，但努力發展生物除草技術已逐漸成為全球的共識。

各國為了響應這一號召，制定了本國的發展戰略。美國、歐盟等許多國家，制訂了相應的法律法規，嚴格限制或停止使用一些化學農藥，同時大力發展生物農藥產業。我國在農業「十三·五」規劃中提出了「雙減(減化肥和農藥)」目標。除草劑在整個農藥市場中佔比超過50％，因此，要想順利實現這個目標，必須想辦法大幅降低化學除草劑的用量。而發展生物除草劑是替代和減少化學除草劑的使用並有效控制草害、保證農作物穩產高產、保障食品安全和公眾健康的重要基礎；是減少化學除草劑殘留、消除二次汙染、改善農業生態、實現環境安全和農業可持續發展的重要途徑；是現代有機農業生產的基本要求和重要保障。

近10年來，在國家各級政府部門和科研機構的高度重視下，尤其在「十一·五」、「十二·五」和國家「863」項目的資助下，我國已初步建立起了生物除草劑研究的技術體系，以馬唐-畫眉草彎孢黴C.eragrostidis、稗草-新月彎孢黴Culvularia lunata、稗草-禾長蠕孢菌H.gramineum和蟋蟀草平臍蠕孢菌株B.eleusines、加拿大一枝黃花Solidago canadensis-齊整小核菌S.rolfsii、空心蓮子草Alternantera phyloxeroides-假隔鏈格孢菌Nimbya alternantherae、紫莖澤蘭Ageratina adenophora-鏈格孢菌A.alternata研究已經取得了系列進展，特別是紫莖澤蘭致病型鏈格孢菌代謝產物——4-羥-3-乙醯基吡咯啉-2-酮類化合物作用機理和靶標以及模擬合成的研究具有原創性。目前，已經形成了一批具有自主智慧財產權的生物除草劑技術成果，申請國家發明專利30餘項，其中，國際專利2項；獲得中國國家發明授權11項，美國和日本國家發明專利各1項。已經有數項成果進入商業化發展階段，進行農藥註冊登記的田間藥效，並有望在近期獲得正式登記。總之，我國生物除草劑研究正在整體進入一個以追求自主創新為特點的快速發展新階段。

技術實現要素：

有鑑於此，本申請針對上述問題，提供了一種多孢木黴菌菌株HZ-31及其在生物除草中的應用。

為了解決上述技術問題，本申請公開了一種多孢木黴菌菌株，其分類命名為多孢木黴HZ-31(Trichoderma polysporum)，該菌株於2016年09月12日保藏於中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12867。該菌株在PDA平板上培養7d後，表面產生緻密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或墊狀的皰狀物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4個輪生，直角，分生孢子長橢圓形或球形，光滑，結合形態特徵和分子鑑定結果，判斷菌株HZ-31為多孢木黴(Trichoderma polysporum)。

本發明還公開了一種多孢木黴菌菌株HZ-31的可溼性粉劑。

進一步的，所述粉劑由下列重量百分比的原料組成：高嶺土10-15％、聚乙烯醇6％、糊精3％、拉開粉3％、膨潤土1％，餘量為固體發酵得到的多孢木黴真菌固體發酵物。依次將各組分加入混合機，邊加入邊攪拌，直至各組分完全混合均勻。

本發明還公開了一種多孢木黴菌菌株HZ-31的可溼性粉劑製備方法，步驟包括：

(1)多孢木黴固體發酵物製備：將多孢木黴菌株HZ-31菌種以40％的量接種於固態基質上，室溫下培養8d，粉碎後獲得多孢木黴固體發酵物；

(2)各組分依次加入混合機，邊加入邊攪拌，直至各組分完全混合均勻。

進一步的，所述多孢木黴菌株HZ-31菌種的孢子量1×108個/mL。

本發明還公開了一種用於培養多孢木黴菌株HZ-31菌種的固態基質，所述固態基質由下列重量份數的原料組成：麥麩或麥稈糠96％、小麥粉2％和(NH4)2SO4 2％，所述基質的含水量為37％。

其培養方法為：該菌採用液體-固體聯合發酵的生產方式，即先以液體發酵培養菌絲體，後在固體基質上固定發酵培養，生產真菌侵染的基質。固體培養8d後獲得多孢木黴固體發酵物，以高嶺土作為載體，聚乙烯醇作為分散劑，膨潤土作為穩定劑，糊精作為保護劑，結合拉開粉作為潤溼劑，將HZ-31固體發酵物與篩選出的適宜載體、助劑按照15％的載體、6％的分散劑、1％穩定劑和3％的潤溼劑的比例混合，粉碎，再混合，製成可溼性粉劑。

生產流程：實驗室菌種→一級種子(培養基平板)→液體接種發酵→固體培養基接種→通風晾乾→粉碎→幹真菌侵染基質→載體助劑→可溼性粉劑→致病性及安全性測定。

本發明還提供一種多孢木黴菌菌株可溼性粉劑在控制野燕麥、酸模葉蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄雜草中的應用。

進一步的，所述可溼性粉劑使用劑量為20g/m2。

本發明的有益技術效果是：

1)本發明利用微生物資源防除雜草具有對作物影響小、環境負效應少、安全性高等優點，符合可持續農業的發展，已受到世界各國的高度重視。對微生物除草劑的評價，理論上主要依據兩條標準即有效性(藥效)和專一性(安全性)。雜草生防菌具備既對靶標雜草具有強致病性又對作物相對安全兩大特點。

2)本發明針對蠶豆、豌豆田的野燕麥、酸模葉蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄等常見雜草，製備一種多孢木黴菌可溼性粉劑，用於生物除草。本發明能有效安全地控制和防治部分農田常見雜草，成本低，無汙染，低殘留對環境友好。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本申請多孢木黴菌HZ-31可溼性粉劑對野燕麥、酸模葉蓼、密花香薷、薄朔草、藜、萹蓄葉片的離體致病效果；

圖2是本申請多孢木黴菌HZ-31可溼性粉劑對藜、野燕麥、密花香薷、萹蓄、薄朔草、酸模葉蓼植株的盆栽活體致病效果；

圖3是本申請多孢木黴菌HZ-31可溼性粉劑對藜、密花香薷等田間主要雜草的防控效果。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

實施例1

一種多孢木黴菌菌株，其分類命名為多孢木黴HZ-31(Trichoderma polysporum)，該菌株於2016年09月12日保藏於中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12867。該菌株在PDA平板上培養7d後，表面產生緻密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或墊狀的皰狀物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4個輪生，直角，分生孢子長橢圓形或球形，光滑，結合形態特徵和分子鑑定結果，判斷菌株HZ-31為多孢木黴(Trichoderma polysporum)。

實施例2可溼性粉劑的製備

一、菌株HZ-31最佳發酵條件的確定

以PDA培養基作為基礎培養基進行碳氮源單因素試驗，以產孢量和孢子懸浮液OD吸光值為指標確定菌株HZ-31最適碳、氮源；選用菜籽餅、麥稈糠、羊糞、麥麩、珍珠巖和蛭石作為基質，接種菌液後培養，確定產孢量高的底物固態發酵基質；以菜籽餅作為底物，混合營養物質加入三角瓶，每個處理加入無菌水20mL，接不同比例基質體積分數的孢子懸浮液，用血球計數板計數確定液體菌種的最適接菌量；通過單因素試驗篩選出培養基含水量和培養溫度，再結合培養時間這3個量作為因素，分別取5個水平，採用二次正交旋轉組合設計進行正交試驗，確定該菌的最優培養條件。

結果顯示碳氮源、發酵時間、接種量、培養時間等因素對菌株HZ-31的發酵生產均有明顯的影響。HZ-31最適碳源為小麥粉，最適氮源(NH4)2SO4，在PDA培養基上產孢量達到6.17×108mL-1時，最適碳源培養基上產孢量達到3.03×109個/mL，最適氮源培養基上產孢量達到7.53×108個/mL。小麥粉和(NH4)2SO4分別作為補充碳氮源，優化了固態培養基，促進了菌株的產孢量。產孢量高的底物固態發酵基質是麥麩或麥稈糠。研究中HZ-31最適宜的接種量為40％。正交試驗篩選出該菌株最適培養基質含水量均為37％，最適培養溫度為23℃，最佳培養時間為8d。對於菌株HZ-31的發酵生產工藝來說,明確各因素與菌株發酵生產之間的關係,為該菌的規模化生產和劑型研究提供理論依據。

菌株HZ-31可溼性粉劑的製備

(一)載體和助劑的篩選

將高嶺土、硅藻土、磷酸鉀、拉開粉、幾丁質、殼聚糖和羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、膨潤土、輕質碳酸鈣、聚乙烯醇等載體和助劑，分別按2％的比例加入菌株HZ-31對應的最適培養基。分別以200uL的菌液(稀釋106個/mL)塗平板，4-6d之後觀察菌落生長狀況，確定其對菌株孢子萌發的影響。將8mm的菌餅置於不同載體或助劑的培養基中，觀察不同載體助劑對菌株生長狀況的影響。

菌落數量及直徑測量結果如下：

表1 HZ-31在不同載體上菌落數量及直徑記錄

由表1看出，載體高嶺土處理後，菌落萌發數量多且菌落生長較快，選作HZ-31的載體。聚乙烯醇作為分散劑，膨潤土作為穩定劑，糊精作為保護劑，結合拉開粉作為潤溼劑。

(二)菌株HZ-31可溼性粉劑製備

採用液體-固體聯合發酵的生產方式，即先以液體發酵培養菌絲體，後在固體基質上固定發酵培養，生產真菌侵染的基質。固體培養8d後獲得多孢木黴固體發酵物，以高嶺土作為載體，聚乙烯醇作為分散劑，膨潤土作為穩定劑，糊精作為保護劑，結合拉開粉作為潤溼劑，將HZ-31固體發酵物與篩選出的適宜載體、助劑按照15％的載體、6％的分散劑、1％穩定劑和3％的潤溼劑的比例混合，粉碎，再混合，製成可溼性粉劑。

實施例3菌株HZ-31可溼性粉劑對雜草的致病性的影響

採集新鮮的雜草葉片，置於墊有無菌濾紙的培養皿中，配置HZ-31可溼性粉劑，接種量為100uL/葉，以只接種清水的葉片為對照，每處理重複三次。置於25℃光照培養箱中保溼培養，觀察葉片發病情況。

將田間生長4～5葉期，葉色正常的野燕麥、酸模葉蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄移栽於花盆(Φ＝15cm)中，於實驗室內培養；將HZ-31可溼性粉劑溶解後噴霧接種到移栽的健康雜草植株上。以接種清水的植株作為空白對照，設3次重複。接種後的雜草植株置於室溫，7d後調查雜草發病程度，稱鮮重，計算發病率、鮮重效，所有數據採用DPS統計軟體進行差異顯著性分析。同時將HZ-31可溼性粉劑溶解後噴霧接種到農田4-6葉期雜草植株上，觀察其控制效果。

如圖1-3所示，噴施菌株HZ-31可溼性粉劑後，6種雜草均表現出受害症狀，不同程度的出現萎蔫，褪綠變黃，甚至枯萎症狀。結合發病率、鮮重效綜合分析(見表2)，HZ-31可溼性粉劑對野燕麥、酸模葉蓼、密花香薷、萹蓄致病效果突出，HZ-31可作為防除野燕麥、酸模葉蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄等農田雜草的生物除草劑，進行進一步研究。

表2 菌株HZ-31可溼性粉劑對不同雜草致病力

注:同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

實施例4菌株HZ-1對作物的安全性的影響

將青海省5種主栽作物：春小麥(青春587)、春油菜(青雜5號)、蠶豆(青海9號)、豌豆(草原224)、青稞(北青8號)分別種植於Φ＝15cm花盆中，室內培養備用。HZ-31可溼性粉劑按上述方法接種於到3～4葉期的作物植株上，設3次重複，接種7d後觀察供試作物的發病情況，記載發病程度。

HZ-31菌株可溼性粉劑接種後對豌豆(草原224)、蠶豆(青海9號)均無致病性，作物長勢和株高與對照植株相比均未受影響，表現為沒有反應(NS)；春小麥(青春587)、青稞(北青8號)有輕微的致病性，接種後3d，5％葉片出現萎蔫，後期症狀不擴展，表現為輕微反應(LS)；對春油菜(青雜5號)嚴重感病(SS)。

本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這裡使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現有技術的上下文中的意義一致的意義，並且除非像這裡一樣定義，不會用理想化或過於正式的含義來解釋。

最後所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發明的技術方案，儘管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和範圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。