一種檢測生物大分子相互作用的方法及裝置的製作方法
2024-04-03 04:53:05 1
專利名稱：一種檢測生物大分子相互作用的方法及裝置的製作方法
技術領域：
本發明屬生物晶片領域，具體地說，本發明涉及微流控生物晶片檢測生物大分子相互作用的方法，同時還涉及一種微流控的生物晶片的裝置。
背景技術：
生物晶片主要是指通過微加工和微電子技術在固體晶片表面構建微型生物化學分析系統，以實現對生命機體的組織、細胞、蛋白質、核酸、糖類以及其他生物組分進行準確、快速、大信息量的檢測。目前常見的生物晶片分為三大類即基因晶片、蛋白晶片和晶片實驗室(或稱微流控晶片)。生物晶片主要特點是高通量、微型化和自動化。生物晶片上高度集成的成千上萬密集排列的分子微陣列，能夠在很短時間內分析大量的生物分子，使人們能夠快速準確地獲取樣品中的生物信息，檢測效率是傳統檢測手段的成百上千倍。微流控生物晶片即晶片實驗室是生物晶片技術發展一個重要方向，它以分析化學為基礎，以微機電加工技術為依託，以微管道網絡為結構特徵，以生命科學為目前主要應用對象，是當前微型全分析系統發展的重點。它的目標是把整個化驗室的功能，包括採樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等集成在微晶片上，且可多次使用，因此較生物晶片有更廣泛的適用性及應用前景。現在已有由加熱器、微泵、微閥、微流量控制器、微電極、電子化學和電子發光探測器等組成的晶片實驗室問世，並出現了將生化反應、樣品製備、檢測和分析等部分集成的生物晶片。例如可以將樣品製備和PCR擴增反應同時在一塊小小的晶片上完成。再如GeneLogic公司設計製造的生物晶片可以從待檢樣品中分離出DNA或RNA，並對其進行螢光標記，然後當樣品流過固定於柵欄狀微通道內的寡核苷酸探針時便可捕獲與之互補的靶核酸序列。生物晶片是在多種固定化載體上刻蝕具有多種性能的生物反應器。此類生物晶片的突出優越性在於通過晶片通道中的微流控(microfluidic)操作，很容易在低於普通化學分析幾個數量級的體積(納升至微升)的水平上，實現微機控制的自動化定量操作，不僅分析速度大為提高，試樣與試劑消耗量也大為降低，而且由於這類微分析系統易於批量生產，因而生產成本顯著降低，這也為現代分析技術的大規模普及創造了條件。
細胞或組織的蛋白質不是雜亂無章的混合物，蛋白質間的相互作用和相互協調是細胞進行一切代謝活動的基礎。蛋白質間的相互作用及作用方式同樣也是蛋白質組研究所面臨的問題，從近期國際上蛋白質組學研究的發展動向可以看出，揭示蛋白質之間的相互作用關係，建立相互作用關係的網絡圖，已成為揭示蛋白質組複雜體系與蛋白質功能模式的先導，業已成為蛋白質組學領域的研究熱點。傳統的生物學手段是通過酵母雙雜交系統來分析一種細胞或特定組織的所有可能的蛋白質之間的相互作用，酵母雙雜交技術問世不到十年，已經在蛋白質間的相互作用研究、篩選新的蛋白質、研究蛋白質的功能等諸方面發揮重要作用。然而雙雜交技術也有其內在的不足之處，如假陰性現象是雙雜交分析過程中經常碰到的問題；此外一些對細胞致命的蛋白質也不適宜通過雙雜交系統來分析。雙雜交只是反映蛋白質間能發生作用的可能性，這種可能還必須經過其他實驗驗證，尤其要與生理功能研究相結合。生物晶片技術有望成為後基因組時代最重要的藥物研究和開發手段，但蛋白質晶片到2003年還只佔有不到20％的生物晶片市場。微流控晶片旨在集樣品準備、檢測及分析於一張晶片完成，預計將在藥物開發(包括藥物靶標鑑定、藥物毒理學預測、高通量藥物篩選及臨床藥物安全性)中得到廣泛的應用。在尋找HIV藥物中，Jellis等用組合化學合成及DNA晶片技術篩選了654536種硫代磷酸八聚核苷酸，並從中確定了具有XXG4XX樣結構的抑制物，實驗表明，這種篩選物對HIV感染細胞有明顯阻斷作用。生物晶片技術使得藥物篩選，靶基因鑑別和新藥測試的速度大大提高，成本大大降低。晶片藥物篩選技術具有很大的潛在應用價值。美國已有多家生物晶片公司股票上市，而且其股價平均以每年75％的速率上漲。根據前線決策管理諮詢公司的最新報告，基因晶片市場包括用於臨床實驗和研究應用的晶片以及用於製造和分析晶片的相關設備在2000年達到了47億美元。
目前在中國專利網中，涉及生物晶片的專利共有178項，有115項是以各式各樣的新型生物晶片為內容的，在這當中與疾病治療相關的有33項，但這些生物晶片承擔的大多是檢測和診斷功能。我國專利CN95195417發明了一種對化學分析和合成進行微流體處理的裝置和方法，即一種用於分析和合成化學材料的微流控晶片系統。我國專利CN02132622發明了一種蛋白質分析用微流控晶片。美國專利US2003207467名稱為Protein chips for highthroughput screening of protein activity，涉及蛋白質晶片用於研究蛋白質功能。法國專利FR2827612名稱為New nucleic acid encoding G protein coupled receptor，useful for identifyingmodulators，potentially useful for treating e.g.Diabetes or Parkinson’s disease，涉及核酸編碼GPCR用於治療糖尿病和帕金森疾病。美國專利US20020094544將生物膜點陣結合在特殊基質表明，通過靶標複合物誘導激活與GPCR結合的標記G蛋白，來檢測靶標複合物與探針GPCR的結合。但是，與這些專利或論文的公開的生物晶片相比，本發明的微流控生物晶片能夠同時檢測幾種生物大分子相互作用，也可以利用其來檢測藥物對於某兩種生物大分子相互作用強弱的影響。本發明公開的微流控生物晶片具有樣品需求量少、使用方便高效等特點，並可能發展成為篩選藥物的有利工具。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測生物大分子相互作用的方法，該方法簡單易行且操作方便，能夠同時在線檢測幾種生物大分子相互作用，樣品需求量少、使用方便高效，並可成為篩選藥物的有利工具。
本發明的另一個目的在於提供一種檢測生物大分子相互作用的裝置，該裝置結構簡單、成本低廉，應用此生物晶片可準確地檢測到特異性的生物大分子。
為了實現上述任務，本發明採用以下技術方案本發明設計的微流控生物晶片能夠在儲液池內加入待研究的生物大分子樣品(如蛋白質、核酸及多糖等)，通過改變儲液池間的電壓驅動樣品溶液定向移動並實現在微混合器中的混合併相互作用，然後通過T字型通道上樣分離，由分離通道末端螢光信號的檢測實現對蛋白質相互作用定性乃至定量的研究。利用本發明提供的微流控晶片及相關研究方法來研究生物大分子相互作用，能在很短的時間內得到相關蛋白相互作用的大量信息，相對傳統的蛋白質相互作用研究模式更加方便、高效，同時也可作為酵母雙雜交系統研究蛋白質相互作用的有利驗證。
本發明微流控生物晶片是一種在有機玻璃上蝕刻有儲液池、槽道及微型混合器的晶片，其特點在於晶片由儲液池、槽道及微型混合器分別形成樣品混合作用流路、樣品分離與檢測流路及夾流流路三部分。
在本發明中，樣品混合作用流路由4個獨立樣品儲液池和3個獨立微型層流混合器通過槽道連接而成，其中儲液池P1與縱向槽道T1連通接混合器M1，儲液池P2與橫向槽道T2連通接混合器M1，實現儲液池P1與儲液池P2中樣品的混合作用；儲液池P3與橫向槽道T3連通接混合器M2，在混合器M2中實現儲液池P1、P2和P3中樣品的混合作用；儲液池P4與橫向槽道T4連通接混合器M3，實現儲液池P1、P1、P3及P4中樣品的充分混合作用。混合器M3與縱向槽道T7接縱向槽道T8，縱向槽道T8再與橫向槽道T5連接。
本發明的夾流流路由儲液池P6、P8及連通槽道組成，儲液池P6與縱向槽道T6連通接橫向槽道T5，儲液池P8與縱向槽道T8連通接橫向槽道T5，槽道T6與T8等長實現樣品夾流。
本發明的樣品分離檢測流路由儲液池P5與儲液池P7及連接P5、P7的橫向槽道T5組成，實現樣品的橫向分離與檢測。
儲液池P1、P2中流出的樣品由縱向槽道連接混合後進入微型層流混合器M1，混合後的溶液再與儲液池P3中流出的樣品混合後進入微型層流混合器M2，混合後的溶液再次與儲池液P4中流出的樣品混合後進入微型層流混合器M3；樣品分離與檢測流路由儲液池P5和P7橫向連接而成，待檢測樣品與檢測試劑在夾流流路中的電流作用下經過樣品混合反應流路、樣品分離並收集檢測流路中信號；夾流流路由儲液池P6與P8縱向連接而成。
在本發明中，樣品分離與檢測流路由兩個獨立的儲液池通過橫向的槽道相連，其中儲液池P5與P7在樣品混合反應流路下遊，通過槽道末端的光電倍增管檢測待測樣品螢光信號的變化。
在本發明中，夾流流路由兩個獨立的儲液池通過縱向的槽道相連，並且槽道長度相等且對稱，其中儲液池P6與P8位於橫向槽道兩側，通過電極對微流控生物晶片兩端增加相等大小的電壓以實現夾流。
本發明公開的微流控晶片由蝕刻有儲液池、槽道及微型混合器的一塊聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，即有機玻璃)片與另一塊無蝕刻的完整聚甲基丙烯酸甲酯片鍵和而成，在兩塊片子之間形成封閉的連通電泳槽道。由儲液池加入的樣品在電壓的驅動下定向移動、混合併在層流微混合器中實現混合及相互作用，之後由T字型槽道上樣，改加分離電壓後，納升級樣品帶由電滲流驅動橫向移動，再由於樣品帶中個成分所帶電荷及分子量的差異而實現分離。
本發明微流控生物晶片檢測生物大分子相互作用的方法，該方法包括下列步驟1)儲液池P7中加入緩衝液並使之在毛細作用下充滿整個晶片縱向槽道(T1、T6、T7、T8)和橫向槽道(T2、T3、T4、T5)；2)用微量加樣器將待檢測生物大分子樣品加入儲液池P1、P2、P3及P4中；3)調節上樣電壓150～550V/cm，樣品以電滲流驅動的方式在電壓作用下定向移動並進樣；4)改變電壓為分離電壓(300V/cm)，在晶片分離通道末端聯結螢光檢測器，檢測樣品信號，可準確檢測到特異性的生物大分子。
在本發明中，待檢測樣品可以是蛋白質、核酸、多糖乃至藥物分子。
在本發明中，由高壓電源分出8路高壓鉑電極，8路高壓電極分別插入8個儲液池中，通過調節高壓電場實現晶片表面流體的定向移動與混合。
在本發明中，樣品相互作用之後，在分離通道末端分離，可以通過紫外、螢光或偶聯質譜的方法檢測並得到結果。
本發明以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，即有機玻璃)片作為基底製作微晶片。HF/HNO3為刻蝕混合劑實現所設計的流路。電滲流泵首先被用於樣品的輸送以及反應混合，反應後的溶液進入晶片上的電泳分離信道。通過分離通道末端連接螢光檢測器檢測螢光標記蛋白的信號變化。
聚甲基丙烯酸甲酯為聚酯類高分子材料，實驗表明，經0.1M NaOH浸泡過夜的聚甲基丙烯酸甲酯表面在兩端加有高壓的鹼性緩衝液條件下電離出大量羥基，使得晶片那表面與緩衝液中形成雙電層，從而產生一定的電滲流推動樣品在晶片槽道中的流動。先在緩衝液儲液池中加入電泳緩衝液(如pH 8.1的硼砂緩衝液)並使其充滿槽道，然後依次在對應儲液池中加入蛋白樣品，分別調節8個儲液池中電極電壓，使得液流由樣品儲液池向樣品廢液池移動，在溶液流動的過程中經過微型混合器實現多個樣品的充分混合作用。最後切換個電極電壓為分離電壓，使得充分混合併進樣的樣品在分離通道實現有效分離。在分離通道末端，可連接紫外或螢光信號檢測器，通過檢測樣品紫外或標記螢光的信號變化定性判斷生物大分子相互作用強弱及藥物對某幾種生物大分子相互作用的影響。
本發明的目的在於實現一種利用微流控晶片研究生物大分子相互作用的有效方法，因此本發明設計了多儲液池分布混合的流路設計。根據實際研究的需要，可以選擇其中兩個樣品儲液池加入待測樣品，研究兩種生物大分子的相互作用，也可以研究幾種生物大分子分布混合且相互作用後的存在形式。為了防止大分子物質在流動過程中的阻塞，本發明在液流匯合處均設計90度的彎角結構以利於液流順利實現定向移動，此外鋸齒形微槽道混合器能有效實現層流式的樣品混合以利於樣品之間充分作用。當樣品處於混合反應流路時，樣品儲液池均加有高壓，樣品廢液池則接地，樣品在電滲流的驅動下由儲液池向廢液池方向移動，在槽道中實現相互混合併作用。當樣品流過T字型通道時，橫向截留的100μm左右液柱即為進樣樣品。此時切換緩衝液池P5接高壓，緩衝液池P7接地，樣品實現橫向的電泳分離。同時在緩衝液池P6與P8加一定強度的高壓實現夾流。在分離槽道末端偶聯螢光信號檢測器，檢測已標記的待測蛋白樣品信號及相互作用後的樣品信號，以此定性的判斷生物大分子相互作用的強弱。
與以前的專利及論文公開的生物晶片相比，本發明能夠同時檢測幾種生物大分子相互作用，也可利用其來檢測藥物對於某兩種生物大分子相互作用強弱的影響，具有樣品需求量小、使用方便快捷等優點，可能發展成為藥物篩選的有利工具。本發明公開了一種微流控晶片，該晶片成本低廉、操作方便，利用本發明提供的微流控晶片及其檢測生物大分子相互作用的方法，能在很短的時間內得到相關蛋白相互作用的大量信息，相對傳統的蛋白質相互作用研究模式更加方便、高效，同時也可作為酵母雙雜交系統研究蛋白質相互作用的有利驗證。本發明旨在提供一種實現樣品在線混合、反應並檢測幾種不同生物樣品之間相互作用強弱的有效方法，該方法的實現對於蛋白質組學研究蛋白質相互作用有極大意義。此外，利用本發明也可定性的研究藥物對於某兩種生物大分子相互作用強弱的影響，並以此作為藥物篩選的重要指標。
圖1為微流控生物晶片結構示意圖；圖2、圖3均為圖1的配合示意圖；圖4為利用微流控晶片單獨進樣螢光標記G蛋白時，在分離槽道末端檢測的螢光信號譜峰圖。其中兩個峰分別為螢光標記G蛋白和過量螢光標記物的峰；圖5為利用微流控晶片同時進樣螢光標記G蛋白和D2型多巴胺偶聯受體，充分混合作用後，橫向分離並在槽道末端檢測的螢光信號譜峰圖。三個峰分別為螢光標記G蛋白、過量螢光標記物及兩種蛋白相互作用形成的複合物的峰；圖1所示為微流控生物晶片實際構造圖，其特徵為蝕刻有8個儲液池並由相互連通的槽道組成，各儲液池加樣方式依實施例中說明。
整個晶片的流路設計，包括電滲流進樣及電泳分離的流路示意圖如圖2及圖3所示。在圖2的進樣方式中，到待檢測樣品所在的儲液池(P1、P2、P3和P4)均接高壓，而樣品的廢液池(P6)接地，樣品以電滲流移動的方式按圖2中箭頭的方向移動，實現樣品的充分混合和相互作用並進樣。切換分離電壓至如圖3所示，緩衝液所在的儲液池(P7)接高壓，廢液池(P5)為接地。這時其它的儲液池均切斷了電源，在進樣區帶中的反應試劑和產物沿著分離信道電泳分離後經過檢測窗口，最後進入廢液池(P5)。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，2002，分子克隆實驗指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照製造廠商所建議的條件。
實施例11.1晶片構造及加樣方式本發明所公開的新型微流控生物晶片其特點在於晶片由儲液池、槽道及微型混合器分別形成樣品混合反應流路、樣品分離與檢測流路及夾流流路三部分在本發明中，樣品混合作用流路由4個獨立樣品儲液池P1、P2、P3和P4和3個獨立微型層流混合器M1、M2和M3通過槽道連接而成，其中儲液池P1由縱向槽道T1連通接入混合器M1，儲液池P2由橫向槽道T2連通接入混合器M1，實現儲液池P1與P2中樣品的混合作用；儲液池P3由橫向槽道T3連通接入混合器M2，在M2中實現P1、P2和P3中樣品的混合作用；儲液池P4由橫向槽道T4連通接入混合器M3，實現P1、P1、P3及P4中樣品的充分混合作用。混合器M3由縱向槽道T7接入縱向槽道T8，縱向槽道T8再與橫向槽道T5連通實現樣品的進樣。
本發明的夾流流路由儲液池P6、P8及連通槽道組成，儲液池P6與縱向槽道T6連通接橫向槽道T5，儲液池P8與縱向槽道T8連通接入橫向槽道T5，縱向槽道T6與T8等長實現樣品夾流。
本發明的樣品分離檢測流路由儲液池P5與儲液池P7及連接儲液池P5、P7的橫向槽道T5組成，實現樣品的橫向分離與檢測。
在本發明中，儲液池P1、P2中流出的樣品由縱向槽道連接混合後進入微型層流混合器M1，混合後的溶液再與儲液池P3中流出的樣品混合後進入微型層流混合器M2，混合後的溶液再次與儲池液P4中流出的樣品混合後進入微型層流混合器M3；樣品分離與檢測流路由儲液池P5和P7橫向連接而成，待檢測樣品與檢測試劑在夾流流路中的電流作用下經過樣品混合反應流路、樣品分離並收集檢測流路中信號；夾流流路由儲液池P6與P8縱向連接而成。
該晶片由蝕刻在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)晶片表面的8個獨立加樣儲液池(如圖1所示P1～P8)及相互連通的槽道組成，儲液池通過高壓電極外加不同電壓以形成電壓差實現槽道內部樣品的移動、分離及檢測。其中儲液池加P7、P8加入50～150μl樣品緩衝液(不需很準確，只要求充滿槽道)；儲液池P1、P2、P3、P4加入10μl生物大分子樣品溶液；儲液池P6為上樣樣品廢液池；儲液池P5為樣品廢液池。
1.2試劑的配製1)晶片體系緩衝液——PBS緩衝液8.0g氯化鈉(NaCl)、0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，加雙蒸水溶解並定容至1000ml，用0.45μm膜過濾以除去雜質，防止堵塞槽道。
2)蛋白質樣品及藥物溶液的配製蛋白質樣品均溶於1)所述之PBS緩衝液，其濃度不大於μM級即可。
實施例2利用該晶片分離檢測D2型多巴胺偶聯受體與G蛋白相互作用1)用微量加樣器在圖1所示的儲液池P7中用微量加樣器加入25μl的20mM PBS緩衝液(pH 8.0)，抽氣使緩衝液充滿整個晶片槽道；2)用微量加樣器在圖1所示的儲液池P1中加入10μl濃度為0.1mg/ml的螢光標記的G蛋白；3)如下表所示在各儲液池插入電極並加上上樣電壓，實現樣品進樣
4)此時如下表所示在各儲液池插入電極並加上分離電壓
5)在分離槽道末端連接螢光檢測及光電轉換裝置，檢測樣品信號；6)用0.1M NaOH溶液充分衝洗晶片槽道，然後用氮氣吹乾，之後用微量加樣器在圖1所示的儲液池P7中用微量加樣器加入25μl的20mM PBS緩衝液(pH 8.0)，抽氣使緩衝液充滿整個晶片槽道；7)用微量加樣器在圖1所示的儲液池P1中加入10μl濃度為0.1mg/ml的螢光標記G蛋白；8)用微量加樣器在圖1所示的儲液池P2中加入10μl濃度為0.25mg/ml的D2型多巴胺偶聯受體及濃度為1mM的鹽酸多巴胺混合物，充分混合併使其充滿儲液池；9)如下表所示在各儲液池插入電極並加上上樣電壓，實現樣品進樣，當樣品流經各個微型混合器時，各樣品經過結構式混合器充分混合併相互作用，然後流入下遊槽道；
10)當樣品之間充分混合互作並進樣完畢之後，部分樣品流入樣品廢液池(如圖1所示號儲液池P6)，而在晶片十字交叉處滯留待分離的樣品帶；11)此時如下表所示在各儲液池插入電極並加上分離電壓
12)在分離槽道末端連接螢光檢測及光電轉換裝置，檢測樣品信號；利用該微流控生物晶片單獨檢測螢光標記G蛋白時，其譜圖為G蛋白螢光峰信號與過量FITC螢光標記物的峰信號(如圖4)；當D2型多巴胺偶聯受體與G蛋白相互作用後進樣分離，可見除上述兩個峰之外的相互作用複合物峰的形成(如圖5)，由此判斷D2多巴胺偶聯受體與G蛋白有較強的相互作用。
權利要求
1.一種檢測生物大分子相互作用的方法，它包括下列步驟A、儲液池(P7)中加入緩衝液並使之在毛細作用下充滿整個晶片縱向槽道(T1、T6、T7、T8)和橫向槽道(T2、T3、T4、T5)；B、用微量加樣器將待檢測生物大分子樣品加入儲液池(P1、P2、P3、P4)中；C、調節上樣電壓150～550v/cm，樣品以電滲流驅動的方式在電壓作用下定向移動並進樣；D、改變電壓為分離電壓300V/cm，在晶片分離通道末端聯結螢光檢測器，檢測樣品信號。
2.一種實現權利要求1所述的檢測生物大分子相互作用的裝置，包括儲液池(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8)；混合器(M1、M2、M3)；儲液池(P1)與縱向槽道(T1)連接通混合器(M1)，儲液池(P2)與橫向槽道(T2)連通接混合器(M1)，儲液池(P3)與橫向槽道(T3)連通接混合器(M2)，儲液池(P4)與橫向槽道(T4)連通接混合器(M3)，混合器(M3)與縱向槽道(T7)接縱向槽道(T8)，縱向槽道(T8)與橫向槽道(T5)連接；儲液池(P6)與縱向槽道(T6)連通接橫向槽道(T5)，儲液池(P8)與縱向槽道(T8)連通接橫向槽道(T5)；儲液池(P5)與儲液池(P7)連通接儲液池(P5、P7)的橫向槽道(T5)。
全文摘要
本發明公開了一種檢測生物大分子相互作用的方法及裝置，其步驟是首先將儲液池P7中加入緩衝液並使之在毛細作用下充滿整個晶片槽道；其次是用微量加樣器將待檢測生物大分子樣品加入儲液池中；第三是調節上樣電壓150～550v/cm，樣品以電滲流驅動的方式定向移動並進樣；第四是改變電壓為分離電壓，在晶片分離通道末端聯結螢光檢測器，檢測樣品信號。實現該方法的裝置由儲液池、連通槽道和混合器組合而成。本發明方法簡單易行，操作方便，結構簡單、成本低廉，可準確檢測到特異性的生物大分子相互作用。
文檔編號G01N21/76GK1696667SQ20051001882
公開日2005年11月16日 申請日期2005年5月31日 優先權日2005年5月31日
發明者梁毅, 周拯, 項瑾, 廖俊明, 周兵瑞, 杜芬, 陳杰 申請人:武漢大學