篩選RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質的方法

2024-04-03 05:22:05

專利名稱：篩選RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質的方法
篩選RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質的方法
技術領域：
本發明涉及用於篩選RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質的系統。本發明還涉及利用其的篩選方法。
背景技術：
阿爾茨海默病(AD)是老年痴呆最常見的形式。現在僅在美國就有估計 四百五十萬人患有阿爾茨海默病。它是世界範圍內65歲以上人中10%以上被診斷患有的 神經退行性疾病。阿爾茨海默病(AD)是呈現為散發性且家族性疾病的異類實體。遺傳性 誘因導致家族性阿爾茨海默病(FAD)。散發性AD(SAD)的原因目前未知。遺傳性阿爾茨海 默病是阿爾茨海默病的不常見形式，僅佔所有阿爾茨海默病患者的5-10%。其餘的病例全 部是散發性形式。研究表明阿爾茨海默病的病理學特徵與大腦中澱粉狀蛋白斑和神經原纖維纏結 有關。澱粉狀蛋白斑起因於澱粉狀蛋白β肽(Αβ)的沉積，並且神經原纖維纏結是由於被 稱為tau的微管相關蛋白的過度磷酸化——使其以不溶性形式聚集——而形成的病態蛋白 聚集體。Αβ是澱粉狀-β前體蛋白(APP)依序分裂後形成的，並且在正常大腦中被保持在 恆定水平。然而，在AD患者中發現了過量的Αβ累積，形成了斑點。這些斑點誘導神經元 損失，引起認知和記憶的病損。存在一種維持大腦中澱粉狀蛋白β肽水平的體內穩態的控制系統。系統功能的 平衡功能受到RAGE (晚期糖基化終產物受體；Zlokovic TRENDS inNeuroscience. 28. 2005， D. Stern&Zlokovic et al. Nat. Med. vol 9，2003)、LRP-1 (低密度脂蛋白受體相關蛋白-1 ; Zlokovic et al. Neuron,vol 43. 333-344,2004, D. Stern&Zlokovic et al. Nat. Med. ,vol 9,2003)的調節(圖1)。RAGE涉及通過與澱粉狀蛋白β肽的直接相互作用澱粉狀蛋白β 肽從周圍脈管向中樞神經系統的流入，而LRP-I涉及澱粉狀蛋白β肽從中樞神經系統向周 圍脈管的流出。RAGE——其在澱粉狀蛋白β肽向大腦的傳輸中起重要作用——被報導在患有阿 爾茨海默病的患者中具有升高的水平(E. Stopa et al. (2006)ActaNeuropathol.)。通過 RAGE活性的過量澱粉狀蛋白β肽的流入加速了澱粉狀蛋白β肽在大腦中的沉積，引起澱 粉狀蛋白斑的形成。此外，除了澱粉狀蛋白β肽向大腦的流入外，RAGE還涉及通過與澱 粉狀蛋白β肽的相互作用的各種發信號過程。特別地，RAGE與澱粉狀蛋白β肽的相互 作用被報導引起反應性氧種類(ROS)的產生以及炎症，從而誘導細胞凋亡(Zlokovic et al. (2004)Neuron, vol 43. 333-344)(圖2)。因此，RAGE和澱粉狀蛋白β肽之間相互作用 的抑制被期待阻礙澱粉狀蛋白β肽的累積及其向下遊發信號，因此對阿爾茨海默病的進 展發揮著非常大的預防性作用。最初研究RAGE是由於其在糖尿病中的重要作用。因為澱粉狀蛋白β肽——AD 的主要原因——是RAGE的配體這個公開內容，所以對RAGE的研究已經轉向與AD的相互關係。到目前為止，已經從下列兩個方向努力抑制RAGE與澱粉狀蛋白β肽之間的相互作用 使用化合物，和使用可溶性RAGE (sRAGE)——RAGE的異構體，其通過可選的剪接產生。關於 化合物，最先進的分子是Transtech的TTP488，其已經在患有阿爾茨海默病的患者中進行 第2階段的實驗研究並且目前處於糖尿病性腎病的第2階段研究。該化合物是口服可生物 利用的小分子，其被報導降低了澱粉狀蛋白β肽負載。對於與澱粉狀蛋白β肽的相互作 用來說與跨膜RAGE (全長RAGE)相競爭，可溶性RAGE (sRAGE)被假定抵消了澱粉狀蛋白β 肽向CNS的流入或者全長RAGE的發信號。已經進行了深入研究以檢驗sRAGE作為澱粉狀 蛋白β肽鰲合劑的應用。如上所解釋，對抑制RAGE與澱粉狀蛋白β肽之間相互作用的物質的大部分研究已經轉向對候選物的篩選。相反，可以檢驗藥物候選物有效性並且被允許應用於臨床階段 的體外篩選系統進展很少。事實上，甚至RAGE拮抗劑的領先研究小組進行實驗僅僅達到這 樣的程度新藥物候選物的發信號過程僅僅通過RT-PCR或蛋白質印跡法進行研究。目前還 沒有報導使得預測候選物如何在體內起作用成為可能的任何系統。為了產生本發明，對用於預測候選物作用方式的系統深入且徹底的研究導致這樣 的發現基於RAGE表達細胞系的模擬BBB系統能夠模擬體內BBB並且被用作篩選RAGE-澱 粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質的有效體外系統。

發明內容技術問題因此目的是提供用於體外篩選抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的物質的系統。本發明的另一目的是提供篩選抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的物質的方法。有利的效果根據本發明的篩選系統被用於定量分析候選物的對RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互 作用的抑制活性以及通過細胞旁路途徑的通過速度，因此發現阿爾茨海默病的藥物。此外， 該系統可被用於檢驗與RAGE信號級聯放大相關的蛋白，因此提供對於理解阿爾茨海默病 病因學有用的信息。

圖1是圖解澱粉狀蛋白β肽通過RAGE (晚期糖基化終產物受體)和LRP (低密度 脂蛋白受體相關蛋白)在大腦和血液之間交換的示意圖(Neuron，43，605-608，2004，部分 進行了修改)。圖2是圖解通過RAGE-澱粉狀蛋白β肽複合物發起的下遊信號級聯放大的示意 圖(Stroke,35(suppll)，2628-2631，2004)。圖3是篩選抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的候選物的系統的示意圖，其顯 示了基於Transwell板的體外篩選系統的結構(a)，隨著細胞間緊密連接形成的TEER的變 化(b)，通過RT-PCR表達緊密連結蛋白(c)，以及由於用甘露醇打斷緊密連接形成而導致標 準物(FD40)通過速度的增加。
圖4是顯示通過該篩選系統鑑別的抑制RAGE與澱粉狀蛋白β肽之間相互作用物 質的圖，其中候選物24比其它候選物6、25和32通過速度慢60%。圖5是導入CHO的pNFkB-螢光素酶載體的示意性基因圖譜，其通過在pLuc-MCS 載體的MCS (多克隆位點)中靠近NFkB的位置插入增強子DNA而製備(Stratagene，Cat. no.219087)。圖6是這樣的圖，顯示了通過使用下遊信號級聯放大篩選的抑制RAGE與澱粉狀蛋 白β肽之間相互作用的候選物。在對照物，與NFkB結合的螢光素酶的表達水平在用澱粉 狀蛋白β肽處理後由於響應於RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用NFkB的激活而增加。相 反，候選物24顯示螢光素酶的表達水平降低，證實其對RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的 抑制活性。圖7是潮黴素選擇性載體(pcDNA3. Ι/Hygro⑴載體)的示意性基因圖譜 (Invitrogen, Cat no.V870-20)。最佳實施方式根據其一方面，本發明提供用於體外篩選抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的 物質的系統。更詳細地，該系統是包含表達人RAGE的細胞系的模擬血腦屏障(BBB)系統。在本發明的優選實施方式中，bEND. 3細胞系——其被報導適合於形成血腦屏障
(BBB) (M. Gumbleton et al. Brain research, vol 990. 95-112，2003)-被用於該系統的
構建。得自小鼠腦內皮瘤的bEND. 3細胞系是多瘤病毒中型T抗原轉化的腦內皮細胞。首先， bEND. 3細胞在Transwell板的上插入物中以合適的密度進行培養(Corning，Cat. No. 3495) 以形成細胞間的緊密連接，如圖3A所示。倘若類似於BBB的條件，該細胞間緊密連接可充 當用於篩選抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的物質的系統的主要成分。bEND. 3細胞 之間緊密連接的形成可通過各種試驗進行鑑別。例如，TEER(跨內皮電阻)可被最有效地 用於檢驗內皮細胞間緊密連接的形成。TEER隨著細胞間緊密連接的形成而增加。因此，與 初始TEER值的比較確定緊密連接的形成。另一方面，Z0-1、緊蛋白和密蛋白——被稱為緊 密連接蛋白——隨著緊密連接形成，表達水平增加。基於其mRNA水平——其可通過反轉錄 PCR(RT PCR)進行分析，可以測定緊密連接的形成。在更簡單的方法中，甘露醇——其已知 幹擾緊密連接的形成——被施加到細胞培養層，然後將標準物穿過細胞間空間的通過速度 與沒有施加甘露醇的陰性對照進行比較。在本發明的優選實例中，bEND. 3細胞間緊密連接的形成通過所有的上述三種方法 進行檢測。因此，對於四天的培養TEER被觀察到增加(圖3B)，並且緊密連接蛋白ZOl和緊 蛋白被發現表達水平增加，如RT-PCR所測定(圖3C)。此外，bEND. 3細胞間緊密連接的形 成通過緊密連接被甘露醇中斷後標準物穿過細胞間空間的通過增加進行確定(圖3C)。基 於這些結果，其間形成緊密連接的bEND. 3細胞被用在本發明的模擬血腦屏障系統中。根據bEND. 3細胞的條件和RAGE基因的導入效率，篩選系統的靈敏度可以改變。為 了排除差異，在本發明的更優選實施方式中，可過量表達人RAGE的bEND. 3突變體菌株通過 在潮黴素選擇性載體的幫助下導入人RAGE基因而加以製備。目標細胞可通過在包含潮黴 素的板上培養進行選擇。根據其另一方面，本發明提供利用包含人RAGE過量表達細胞系的模擬BBB系統篩 選抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的物質的方法。
在本發明優選的實施例中，利用螢光(FITC)標記的澱粉狀蛋白β肽分析候選物對RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的抑制活性。首先，過量表達RAGE的Bend. 3細胞系以 在Transwell板中適於其間形成緊密連接的濃度進行製備和培養。將候選物與螢光標記的 澱粉狀蛋白β肽一起加入到Transwell板的上室，其中細胞以連接的方式生長。通過RAGE 使一些澱粉狀蛋白β肽遷移到細胞中，而其餘的由於重力下沉到Transwell板的下室。下 室中收集的澱粉狀蛋白β肽利用螢光分光計進行定量分析。與陰性對照物——其中在沒 有任何候選物的情況下使用螢光(FITC)標記的澱粉狀蛋白β肽——的螢光測量比較得到 了候選物的％ RAGE抑制(圖4)。根據其另外的方面，本發明提供利用下遊信號發射結構篩選抑制RAGE-澱粉狀蛋 白β肽相互作用的物質的系統。如上所解釋，RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用誘導許多信號過程，其最早的是 NFk B易位。因此，候選物的拮抗作用可通過比較用澱粉狀蛋白β肽和候選物處理的系統 中的NFk B易位與僅僅用澱粉狀蛋白β肽處理的系統的NFK B易位進行測定。 在本發明的優選實施例中，分別攜帶人RAGE基因和NF κ B基因的表達載體被共轉 染到CHO (中國倉鼠卵巢)細胞，以便經由NF κ B檢測RAGE的表達。更詳細地，當用人RAGE 和NFk B共轉染的細胞系用澱粉狀蛋白β肽進行處理時，RAGE和澱粉狀蛋白β肽之間的 相互作用引起下遊信號發射來誘導NF-kB易位，因此導致導入的pNFkB-螢光素酶載體的熒 光素酶基因在細胞內表達。表達水平可用螢光分光計進行測量。
實施例通過下面的實施例可以獲得對本發明更好的理解，下面的實施例被提出以舉例說 明本發明，但不應當理解為對本發明的限制。實施例1 利用小鼠bEND. 3細胞建立模擬血腦屏障系統1-1.細胞系的選擇和培養條件bEND. 3細胞系(ATCC CRL2299)被用於構建模擬血腦屏障。使用的是5 10傳 代後早期繼代培養的細胞。為了找到適於形成如血腦屏障中同樣的緊密連接的培養條件， bEND. 3細胞在24-孔Transwell板(Corning)中於不同細胞密度下被培養不同的培養時 間。在這點上，細胞在24-孔Transwell板中以每孔1 X 105、5X IO4和2. 5X104個細 胞進行培養以檢測細胞狀況。當以每孔IXIO5個細胞的密度培養時，細胞太密而不能令人 滿意地粘附到孔的底部，並且因此經歷分化。在光學顯微鏡下，細胞被觀察到狀況差。在每 孔2. 5X IO4個細胞的密度下，細胞需要花一周或更長的時間形成緊密連接。另外，分化所花 的時間被延長。相反，在每孔5X IO4個細胞的密度下在短時間內形成了緊密連接。細胞在 補充有 10% (ν/ν)胎兒牛血清(FBS，Hyclone，Salt Lake City, Utah, USA)和 lmg/ml 青黴 素 / 鏈黴素(P/S ;Sigma，Saint Louis, MO, USA)的 Dulbecco，s ModifiedEagle' s 培養基 (Hyclone, Salt Lake City, Utah, USA)中被穩定且分化4天。這些細胞在5. 0% CO2培養 箱中37°C下進行培養。接種後3小時，細胞開始粘附到Transwell板，並且每天對細胞監測 TEER。緊密連接的形成通過TEER(跨內皮電阻)、RT-PCR和標準物穿過細胞的滲透進行測定。1-2. TEER(跨內皮電阻)Millicell-ERS (Millipore)被用於測量細胞電阻。細胞在24-孔Transwell板中 進行培養。從接種後3小時——此時細胞開始粘附到板——到培養開始的第4天，在五個 預定的時間點測量細胞的電阻。首先，電極被穩定並且被用於測量未包含細胞的空白孔的 電壓。空白孔的測量被稱為R-空白。然後，測量所有其中包含細胞的孔的電壓並且測量的 平均值被稱為R-樣品。細胞的電阻通過從R-樣品減去R-空白得到。如圖3B所示，觀察 到細胞在培養的3小時至4天內TEER增加，這表明隨著培養時期的增加形成了更強的細胞 間緊密連接。1-3.反轉錄 PCR(RT-PCR)在mRNA水平測定緊密連接肽ZO-I和緊蛋白的表達。在這一點上，細胞在接種後4 天利用胰島素-EDTA從Transwell板的上插入物中分離，並且用PBS進行洗滌。細胞在離 心後得到為小球並且被用於利用TriZol試劑(Invitrogen)從中分離全部的RNA。cDNA在 反轉錄酶(π反轉錄酶)的存在下利用寡聚(dT)引物從全部的RNA中合成並被用作利用靶 向ZO-I和緊蛋白的引物對的PCR的模板。結果顯示在圖3C中。對PCR條件和引物的描述如下。*PCR 條件反轉錄-42°C90min,94°C IOmin聚合酶鏈式反應循環1) 94"C 5min (1 個循環)循環2) DNA 變性 _94°C，30secDNA 退火-60"C，30secDNA 聚合-72 °C，Imin (30 個循環)循環3)72°C，5min(l 個循環)引物1) ZO-I (PCR產物大小為594個鹼基對)正向5，-TTTTGTCCCACTTGAATCCC-3，(SEQID NO. 1)反向5，-AGCTCTTGGGTCATGCACTT-3，(SEQID NO. 2)2)緊蛋白(PCR產物大小為406個鹼基對)正向5，-CAGGTTCGCTTATCTTGGGA-3，(SEQID NO. 3)反向5，-TCCGTAGCCAAAGCCACTAT-3，(SEQID NO. 4)1-4.比較穿過細胞間空間的通過細胞被接種在24-孔Transwell板的插入物上並且被培養5天，如上面的實施例 所述。F-NadOyM, Sigma, Cat No. 28803)、FD4 (ImM，Sigma，Cat No. FD4)禾口 FD40 (25 μ M， Sigma,Cat No. FD40S)——全部用螢光(FITC)標記——被用作用於細胞間通過比較的標準 物。甘露醇(0.8M)——已知幹擾細胞間緊密連接的形成——被加入到一些孔中，而其它孔 沒有用甘露醇處理。此後，向孔中加入標準物，接著在120min內在20min的定期間隔下檢 測Transwell板的下室中的螢光密度。發現螢光密度隨著時間增加，但是在用甘露醇處理 的孔中檢測到比未用甘露醇處理的孔高的強度。圖3D顯示FD40的結果。
F-Na, FD4和FD40大小分別為376Da、4, OOODa和40，OOODa0當形成緊密連接時， 可在細胞間穿過的物質受到其大小的限制。因此，標準物質可被用作陽性或陰性對照。例 如，當緊密連接充分形成時，由於蛋白大小的不同，FD40在通過細胞間空間的通過上不同於 F-Na和FD4。當緊密連接的形成被甘露醇打斷時，大的FD40被發現具有與小的F-Na和FD4 相似的細胞間通過程度，因此證實了緊密連接的形成。從實施例1-2至1-4的實驗獲得的結果確定了 bEND. 3細胞之間形成的緊密連接， 並且細胞因此被鑑定適合用於模擬血腦屏障的構建。實施例2 過量表汰人RAGE的小鼠bEND. 3細胞系的津立人RAGE基因(SEQ ID NO. 5)經由潮黴素選擇性載體導入bEND. 3細胞。首先，潮黴素選擇性載體是pcDNA3. 1/Hygro (+)載體(Invitrogen，Cat no. V870-20)，如圖7所示。人RAGE基因和pcDNA3. 1/Hygro (+)載體分別用兩種限制 性內切酶Xhol和Kpnl進行消化，接著在連接酶的存在下相互連接。由此獲得的重 組人 RAGE-pcDNA3. 1/Hygro (+)載體在 Lipofectamin LTX 試劑(Invitrogen, Cat. No. 15338-100)結合 Plus 試劑(Invitrogen，Cat. No. 11514-015)的幫助下轉染到 bEND. 3 細胞中。bEND. 3細胞在包含潮黴素(200 μ g/ml，AMRESC0，Cat. No. K547)的板上進行培養。 溫育2 3周後形成的集落被挑選出來並且在肉湯中進行培養以建立表達人RAGE基因的 細胞系。多次傳代後，細胞系被發現穩定地表達人RAGE基因，如蛋白印跡法分析所化驗。實施例3 測定對利用模擬BBB運輸澱粉狀蛋白β肽的拮抗效率通過用螢光分光計測量穿過細胞旁路通道的螢光(FITC)標記的澱粉狀蛋白β肽 (β -α -澱粉狀 β -蛋白，aa 1-42, FITC 結合的 / 示蹤的，Cat. No. M-2585. 1000，Bachem) 的螢光性，分析候選物對RAGE的抑制活性。人RAGE過量表達細胞系在Transwell板的上插入物中以形成緊密連接的濃度進 行培養，其後細胞被分成兩組。一個是陰性對照，向其中僅僅加入FITC-結合的澱粉狀蛋 白β肽。向其它組中如入FITC-結合的澱粉狀蛋白β肽與候選物。下室的螢光性利用熒 光分光計在120min內在20min的定期間隔下進行測量。就測量的平均值對兩組進行比較 (圖4)。如圖4所示，候選物6、24、25和32被發現具有對RAGE的抑制活性，因為螢光標記 的澱粉狀蛋白β肽被檢測到在下室中比對照低的水平(其中候選物24是它們當中最高 的相比對照物的100%，60%通過)。更詳細地，首先，Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩衝液(K buffer ；Sigma, Cat. No. K4002)被製備並且被用作候選物的溶液。分別地，人RAGE-表達細 胞在Transwell板的上室中以每孔5X IO4個細胞的密度進行培養4天以允許形成緊密連 接。然後，上室和下室用K緩衝液洗滌兩次。200μ1 K緩衝液中的候選物溶液被小心地倒 入上室中，而向下室中加入Iml K緩衝液。在20min的定期間隔下，在2小時內從下室中收 集200 μ 1等分的K緩衝液。K緩衝液樣品被置於白板(96孔，SPL，Cat. No. 31196)中並且 用螢光分光計測量螢光性。候選物的通過速度被表示為五次測量的平均值相對於對照物的 平均值的百分比。如圖4所示，候選物24對RAGE的抑制性被發現比候選物6、25和32大， 如下室中檢測的較低的平均螢光強度所確定(相對於對照物的100%，候選物24的60%通 過速度)。其它的候選物顯示大約80%通過速度。此後，分析細胞的TEER，並且螢光分析之前和之後沒有發現變化，這表明增加的通 過速度沒有歸因於緊密連接被候選物毒性的中斷。
實施例4利用下遊信號發射結構構件篩選RAGE-典墳狀蛋白β肽相互作用的系統比較分別僅用澱粉狀蛋白β肽處理的以及其與拮抗劑候選物聯合處理的系統之間的NFk B易位。4-1.建立用人RAGE和NF κ B共轉染的細胞系pNFkB-螢光素酶載體(圖5)和人RAGE基因被共轉染到CHO (中國倉鼠卵巢)細 胞以構造穩定的突變體細胞系。首先，合成增強子DNA (增強子鹼基序列(TGGGGACTTTCCGC) 5)，其對於NF κ B的表 達是有效的)。該增強子被插入pLuc-MCS載體(Stratagene，Cat. no. 219087)的MCS (多克 隆位點)。當在各種應激條件下激活時，位於胞質溶膠中的NF κ B被易位到細胞核中。在該 MCS中，NFkB基因被克隆在靠近用螢光基因標記的位置，所以細胞被應激至何種程度可以 通過測量螢光強度進行估測。如此構建的PNFkB-螢光素酶載體被導入用RAGE轉化的CHO 細胞系以建立用人RAGE禾Π NF κ B共轉染的突變體CHO細胞系。共轉染在Lipofectamin LTX(Invitrogen,Cat. No. 15338-100)結合 Plus (Invitrogen，Cat. No. 11514-015)的幫助 下進行。其中導入人RAGE的CHO細胞系以與用人RAGE轉化的小鼠bEND. 3細胞相同的方 式建立。如實施例2所述，人RAGE基因被插入潮黴素選擇性載體，其又被導入CH0，接著在 包含潮黴素的板上進行選擇。由此形成的集落在肉湯中進行擴增。4-2.螢光素酶報導分子試驗在實施例4-1中製備的其中共轉染有人RAGE和NF κ B的細胞系中，RAGE的激活通 過測量與RAGE結合的螢光素酶基因的表達進行測定。細胞用PBS進行洗滌，細胞裂解緩衝 液(40mM 麥黃酮(pH 7.8)，、50mM NaCl、2mM EDTAUmM MgS04、5mM DTT. 1% Triton X-100 被混合併且在蒸餾水中稀釋5倍)以50 μ L的量加入到24-孔Transwell板的每個孔中， 接著在室溫下溫育15min以分開細胞。5 20 μ L由此形成的細胞懸浮液在5_ml圓底聚苯 乙烯管(BD Falcon)中與100 μ L螢光素酶分析試劑(40mM麥黃酮(pH 7. 8)、0. 5mM ATP、 IOmM MgS04、0. 5mM EDTAUOmM DTT. 0. 5mM輔酶A、0. 5mM螢光素)充分混合，其後發光計被 用於在2小時內對整個24-孔Transwell板進行讀數，其中積分時間為每孔10 30sec。 其中僅僅使用澱粉狀蛋白β肽的對照顯示高的螢光素酶表達水平，這是由於RAGE和澱粉 狀蛋白β肽之間的相互作用。相反，當澱粉狀蛋白β肽與候選物24組合加入時，測量到 較低的螢光素酶表達水平，這表明候選物24起到抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的 作用。通過對澱粉狀蛋白β肽傳輸的拮抗效率試驗以及利用下遊信號發射結構的試驗 所獲得的結果一起證實了，根據本發明的基於模擬BBB的系統對於篩選RAGE-澱粉狀蛋白 β肽相互作用抑制物質可能非常有用。
權利要求
篩選RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質的方法，其包括a)製備RAGE-表達細胞系；b)在Transwell板的上室中以形成細胞間緊密連接的方式培養所述細胞系；c)向所述Transwell板的上室中加入澱粉狀蛋白β肽和用於抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的候選物；和d)比較所述Transwell板的下室中澱粉狀蛋白β肽的濃度與當沒有使用候選物時在所述下室中獲得的澱粉狀蛋白β肽濃度。
2.根據權利要求1的方法，其中所述細胞系是小鼠腦微血管內皮細胞(bEND.3)。
3.根據權利要求1的方法，其中所述RAGE是人RAGE。
4 根據權利要求1的方法，其中所述澱粉狀蛋白β肽用螢光物質進行標記。
5.根據權利要求4的方法，其中所述螢光物質是螢光素酶。
6.篩選RAGE-澱粉狀蛋白β肽抑制物質的系統，其包括RAGE-表達細胞系，其在 Traswell板中以形成細胞間緊密連接的方式進行培養。
7.根據權利要求6的系統，其中所述細胞系是bEND.3。
8.根據權利要求6的系統，其中所述RAGE是人RAGE。
9.篩選針對RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的拮抗劑的方法，其包括使澱粉狀蛋白 β肽和抑制RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用的候選物與用分別攜帶RAGE和NF κ B的重組 表達載體共轉染的細胞系接觸，和測量NF κ B的表達模式。
10.根據權利要求9的方法，其中所述攜帶NFκ B的重組表達載體包括在靠近NF κ B基 因的位置處的螢光素酶基因。
11.根據權利要求9的方法，其中所述細胞系是CHO(中國倉鼠卵巢)細胞系。
全文摘要
提供的是利用Transwell板和RAGE-表達細胞系篩選RAGE-澱粉狀蛋白β肽相互作用抑制物質的系統和方法。
文檔編號G01N33/68GK101828115SQ200880111808
公開日2010年9月8日 申請日期2008年10月15日 優先權日2007年10月15日
發明者墨仁姬, 孫成敏 申請人:首爾國立大學校產學協力財團