用於相互作用分析的方法和系統的製作方法

2024-04-03 06:45:05

專利名稱：用於相互作用分析的方法和系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及分析感測表面處的分子結合相互作用的方法，並且更具體地說，涉及 使用生物傳感器來確定分析物與配位體之間的相互作用的一個或多個相互作用參數的方法。
背景技術：
能夠實時地監視分子(例如，生物分子)之間的相互作用的分析傳感器系統正得 到漸增的關注。這些系統往往基於光學生物傳感器，且常常稱為相互作用分析傳感器或生 物特定相互作用分析傳感器。代表性的此類生物傳感器系統是Biacore AB (烏普薩拉，瑞 典)銷售的BIAC0RE 儀器，其使用表面等離子共振(SPR)來檢測樣本中的分子與感測表面 上固定化的分子結構之間的相互作用。隨著樣本在傳感器表面上方通過，結合的進度直接 地反映相互作用發生的速率。在注入樣本之後是緩衝液流，在此期間檢測器響應反映表面 上的複合物離解的速率。來自BIAC0RE 系統的典型輸出是描述分子相互作用隨時間的進 度、包括締合階段部分和離解階段部分的曲線圖或曲線。常常在計算機屏幕上顯示的此結 合曲線往往稱為「傳感器譜圖(sensorgram) 」。因此，利用BIAC0RE 系統(和模擬傳感器系統)，在未使用標記以及往往沒有對所 包含的物質進行純化的情況下，不僅可能實時地確定樣本中具體分子(分析物)的存在和 濃度，而且可能實時地確定附加相互作用參數，包括分子相互作用中結合(締合)和離解的 動力學速率常數以及表面相互作用的親和度。締合速率常數GO和離解速率常數(kd)可 以通過將對多種不同樣本分析物濃度得到的結果動力學數據擬合到微分方程形式的相互 作用模型的數學描述來獲得。可以由締合速率常數和離解速率常數來計算親和度(表示為 親和度常數ka或離解常數kd)。但是，許多時候，可能難以獲得明確的動力學數據，並且因 此往往通過平衡結合分析來測量親和度更為可靠，這包括對一系列分析物濃度確定平衡或 穩態處的結合水平，平衡或穩態假定處於或接近結合相互作用的締合階段的結束。為了確 保結合曲線的締合階段確實可能已經達到穩態，往往預先確定在為用於親和度測量預設的 條件下已結合的分析物達到平衡的必要樣本注入時間長度(即，與傳感器晶片表面的樣本 接觸時間)。因為達到平衡所花的時間和分析物離解所花的時間都主要通過離解速率常數 來控制，所以還可以由離解常數估計近似注入時間。

發明內容
本發明的目的在於提供一種新方法和生物傳感器系統，用於使用生物傳感器確定 分析物與配位體之間的相互作用的一個或多個相互作用參數，該方法和生物傳感器系統克 服了現有技術的一個或多個缺點。這通過獨立權利要求中定義的方法和生物傳感器系統來 實現。本發明的方法的一個優點在於，它允許對低親和度分析物進行改進且更可靠的相 互作用參數的確定。
通過參考下文詳細描述和附圖將獲得對本發明及其進一步特徵和優點的更全面 的理解。


圖1是基於SPR的生物傳感器系統的側視示意圖。圖2是其中結合曲線具有可見的締合階段和離解階段的代表性傳感器譜圖。圖3示出「正常」親和度分析物曲線擬合的示例。圖4示出基於圖3的數據點的較低範圍的、「低」親和度分析物曲線擬合的示例。圖5示出根據本發明的一個實施例的方法的示意框圖。圖6示出如圖4中的對應擬合。圖7a_7c示出具有多種水平的方法噪聲的模擬數據集的擬合。圖8a_8b示出具有二次非常低親和度(非特定)結合的模擬數據集的擬合。圖9不出注入之後具有抬聞的基線的響應曲線的不例。圖10示出顯示注入期間漸增的響應的響應曲線的示例。
具體實施例方式如上文提到的，本發明涉及評估第一物種與第二物種之間的分子結合相互作用的 穩態結合數據以確定該相互作用的親和度，其中使用第一與第三控制物種之間的結合相互 作用的穩態結合數據來估計第一物種與第二物種之間的相互作用的最大響應R_。通常，通 過基於傳感器的技術獲得試驗結合數據，該技術研究分子相互作用並實時地將結果呈示為 相互作用進度。但是，在更詳細地描述本發明之前，將描述預設要使用本發明於其中的一般 上下文。除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明相關領域中的 技術人員所共識的相同的含義。再有，除非另外說明，否則單數形式「一」和「該」意味著包 括複數個的引述。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考書目通過引用全部併入。如上文提到的，本發明涉及由分子結合相互作用的多個數據集評估該相互作用的 穩態結合數據以確定該相互作用的一個或多個相互作用參數，其中使用來自數據集的穩態 結合數據以外的其他相互作用數據來估計該數據集的穩態結合數據的可靠性。通常，通過 基於傳感器的數據獲得試驗結合數據，該試驗結合數據研究分子相互作用並實時地將結果 呈示為相互作用進度。但是，在更詳細地描述本發明之前，將描述預設要使用本發明於其中 的一般上下文。化學傳感器或生物傳感器通常基於非標記技術，檢測傳感器表面的屬性的變化， 例如質量、折射率或固定化層的厚度，但是也有傳感器依賴於某種類型的標記。典型的傳感 器檢測技術包括但不限於，質量檢測方法，如光學，熱光和壓電或聲波方法(包括，例如表 面聲波(SAW)和石英晶體微天平(QCM)方法)；以及電化學方法，如電位測量、電導測量、電 流測量和電容/阻抗方法。就光檢測方法來說，代表性的方法包括檢測質量表面濃度的那 些方法，如反射型光學方法，包括外部和內部反射型方法，它們是角度、波長、偏振或相位分 辨的，例如瞬逝波橢圓偏振法和瞬逝波光譜法(EWS或內部反射型光譜法)，二者均可以包CN 102667448 A說明書2/10 頁 通過參考下文詳細描述和附圖將獲得對本發明及其進一步特徵和優點的更全面 的理解。括經由表面等離子共振(SPR)的瞬逝場增強、布魯斯特角折射儀、臨界角測折射率法、受抑 全反射(FTR)、散射的全內反射(STIR)(其可以包括散射增強標記)、光波導傳感器；外部反 射成像、基於瞬逝波的成像(如臨界角分辨的成像)、布魯斯特角分辨的成像、SPR角分辨的 成像等。再者，可以提到「本身的」或與反射型方法組合的測光和成像/顯微鏡檢查方法， 其基於例如，表面增強的拉曼光譜法(SERS)、表面增強的諧振拉曼光譜法(SERRS)、瞬逝波 螢光(TIRF)和磷光法，以及波導幹涉儀、波導洩漏模光譜法、反射幹涉光譜法(RIfS)、透射 幹涉測量法、全息光譜法和原子力顯微鏡檢查法(AFR)。可商業購得的生物傳感器包括前文提到的Biacore AB(烏普薩拉，瑞典)銷售的 BIAC0RE 儀器，其基於表面等離子共振(SPR)並允許實時地監視結合的配位體與關注的分 析物之間的表面結合相互作用。在此上下文中，「配位體」是對於給定分析物具有已知或未 知親和度的分子，且包括固定化在表面上的任何捕獲或捕捉試劑，而「分析物」包括其任何 特定結合的配對物。雖然下文的詳細描述和示例是在SPR光譜法以及更具體為BIACORE 系統的上下 文中說明本發明的，但是要理解，本發明並不局限於此檢測方法。更確切地，可以採用其中 分析物結合到固定化在感測表面上的配位體的任何基於親和度的檢測方法，只要感測表面 處的變化能夠被測量，該變化是分析物到其上固定化的配位體的結合的量化指示即可。SPR的現象是眾所周知的，足以說當在某些條件下光在不同折射率的兩種介質之 間的介面反射時出現SPR，並且該介面塗覆以金屬膜(通常為銀或金)。在BIACORE 儀器 中，該介質是樣本和通過微流控流系統與樣本接觸的傳感器晶片的玻璃。該金屬膜是晶片 表面上的薄金層。SPR導致特定反射角處反射的光的強度降低。最小反射光強度的此角度 隨靠近與反射光相反一側(在BIACORE 系統中為樣本側)表面的折射率而變化。圖1中示出BIACORE 系統的示意圖。傳感器晶片1具有金膜2支撐捕獲分子(配 位體)3，例如抗體，捕獲分子(配位體)3暴露於經由流通道5的含有分析物4 (例如，抗原) 的樣本流。來自光源7 (LED)的單色p-偏振光6通過稜鏡8耦合到玻璃/金屬介面9，在玻 璃/金屬介面9中光被完全反射。由光檢測單元11 (光檢測器陣列)來檢測反射光束10 的強度。BIACORE 儀器的技術方面以及SPR現象的詳細論述可以參見美國專利號 5，313，264。有關生物傳感器感測表面的基質塗層的更詳細信息在例如美國專利號 5，242，828和5，436，161中給出。此外，與BIACORE 儀器結合使用的生物傳感器晶片的技 術方面的詳細論述可以參見美國專利號5，492，840。當樣本中的分子結合到傳感器晶片表面上的捕獲分子時，表面處的濃度改變， 並且由此表面處的折射率改變，並且檢測到SPR響應。繪製相互作用過程期間響應對時 間的曲線圖將提供相互作用的進度的量化測量。此類繪圖或動力學或結合曲線(結合 等溫線)常常稱為傳感器譜圖，有時在本領域中也稱為「親和度軌跡」或「親和度譜圖 (affinogram) 」。在BIACORE 系統中，以共振單位表示SPR響應值。一個RU表示最小反射 光強度的角度中0.0001°的變化，對於大多數蛋白質和其他生物分子，這對應於傳感器表 面上約1 pg/mm2的濃度變化。當包含分析物的樣本接觸傳感器表面時，在稱為「締合」的步 驟中，結合到傳感器表面的捕獲分子(配位體)與分析物相互作用。此步驟在傳感器譜圖 上由樣本最初接觸到傳感器表面時RU的增加指示。相反，「離解」通常發生在樣本流被例如緩衝液流置換時。此步驟在傳感器譜圖上由分析物從表面結合的配位體離解時隨時間推移 RU下降來指示。圖2中呈示傳感器晶片表面處可逆相互作用的代表性傳感器譜圖(結合曲線)，該 感測表面具有固定化的捕獲分子或配位體，例如抗體，其與樣本中的結合配對物或分析物 相互作用。生物傳感器系統基於上文提到的其他檢測原理產生的結合曲線將具有相似的外 觀。垂直軸(y軸)指示響應(此處以共振單位RU計)，而水平軸(x軸)指示時間(此處 以秒計)。最初，緩衝液通過感測表面上方，這得到傳感器譜圖中的基線響應A。在樣本注 入期間，由於分析物的結合，觀察到信號增加。結合曲線的此部分B常常稱為「締合階段」。 最後，處於或接近締合階段結束處達到穩態條件，其中共振信號在C處平穩(但是可能不總 是達到此狀態)。要注意，本文的術語「穩態」與術語「平衡」作為同義詞來使用(在其他上 下文中，術語「平衡」可能被保留來描述理想相互作用模型，因為實踐中結合可以隨時間推 移而恆定，即使系統未處於平衡中)。在樣本注入結束時，以持續的緩衝液流置換樣本，信號 的下降反映分析物從表面離解或釋放。結合曲線的此部分D常常稱為「離解階段」。通過再 生步驟結束此分析，在再生步驟中，在傳感器表面上注入能夠從表面移除結合的分析物的 溶液，同時(理想地)保持配位體的活性。這在傳感器譜圖的部分E中指示。緩衝液的注 入恢復基線A，並且現在表面已為新的分析準備就緒。從締合階段B和離解階段D的外形，分別獲得有關結合和離解動力學的信息，並且 C處的共振信號的高度表示親和度(由相互作用得到的響應與表面上質量濃度的變化相關 聯)。下文將對此作更詳細的解釋。表面結合速率
假定分析物A與表面結合(固定化)的捕獲分子或配位體B之間的可逆反應，這不是 擴散或質量轉移受限的，並且遵循準一階動力學
權利要求
1.ー種使用生物傳感器來確定分析物與配位體之間的相互作用的ー個或多個相互作用參數的方法，所述方法包括如下步驟 A :提供將所述配位體與之固定化的傳感器表面， B :將所述傳感器表面與控制分析物接觸， C :根據所述控制分析物至所述配位體的結合位點的結合登記所述傳感器響應， D :確定所述控制分析物與所述配位體之間的所述相互作用的控制飽和響應(Rmax。)， E :使用所述分析物與所述控制分析物的相對摩爾響應貢獻將所述控制飽和響應(Rmaxc)轉換到分析物飽和響應(RmaxA) F :將所述傳感器表面與包含不同濃度的所述分析物的一個或多個樣本接觸， G :根據所述分析物至所述結合位點的結合登記所述傳感器響應，以及H:使用所述分析物飽和響應(RmaxA)將所登記的傳感器響應擬合到預定相互作用模型以確定所述相互作用參數。
2.如權利要求I所述的方法，其中，以使之能夠佔據所有結合位點的濃度提供所述控制分析物，從而根據ー個相互作用事件提供所述控制飽和響應(Rmaxe)的直接確定。
3.如權利要求I所述的方法，其中，根據所述控制分析物與所述配位體之間的非穩態相互作用確定所述控制飽和響應(Rmaxc)。
4.如權利要求I至3中任一項所述的方法，其中，通過所述分析物與所述控制分析物之間的摩爾量比來逼近步驟E中所述分析物和所述控制分析物的所述相對摩爾響應貢獻。
5.如權利要求I至4中任一項所述的方法，其中，對多個分析物重複步驟E至H。
6.如權利要求5所述的方法，其中，在對預定數量的分析物執行步驟E至H之後，重複步驟B至D。
7.如權利要求I至6中任一項所述的方法，其包括如下步驟 1 :從根據所述分析物的不同濃度下登記的傳感器響應進行全局確定Rmaxeltjbal以及使用控制分析物和關聯的Rmaxe進行確定RmaxA中選擇用於確定每個分析物的Rmax的方法； J :通過選自如下集合的一個或多個結合行為準則來評估所述分析物-配位體相互作用的結合行為 a)高登記的R b)注入之後抬聞的基線 c)注入期間漸增的響應d)RmaxGlobal與RmaxA之間的比率 K :基於步驟J中的評估，建議用於計算每種分析物的所述相互作用參數的結合模型。
8.ー種用於檢測分子結合相互作用的分析系統，包括 (i)生物傳感器，其包括至少ー個感測表面、用於檢測所述至少一個感測表面處分子結合相互作用的檢測部件、以及用於產生表示結合曲線的檢測數據的部件，其中每個曲線表示結合相互作用隨時間推移的進度，以及 (ii)用於按權利要求I至7中任一項中定義的執行如權利要求I所述的步驟A至H的數據處理部件。
9.ー種包括程序代碼部件的電腦程式，在所述程序在計算機上運行吋，所述程序代碼部件用於根據權利要求I至7中任ー項來確定分析物與配位體之間的相互作用的ー個或多個相 互作用參數。
全文摘要
一種使用生物傳感器來確定分析物與配位體之間的相互作用的一個或多個相互作用參數的方法，方法包括如下步驟A提供將配位體與之固定化的傳感器表面，B將傳感器表面與控制分析物接觸，C根據控制分析物至配位體的結合位點的結合登記傳感器響應，D確定控制分析物與配位體之間的相互作用的控制飽和響應(RmaxC)，E使用分析物與控制分析物的相對摩爾響應貢獻將控制飽和響應(RmaxC)轉換到分析物飽和響應(RmaxA)。F將傳感器表面與包含不同濃度的分析物的一個或多個樣本接觸，G根據分析物至結合位點的結合登記傳感器響應，以及H使用分析物飽和響應(RmaxA)將登記的傳感器響應擬合到預定相互作用模型以確定相互作用參數。
文檔編號G01N33/53GK102667448SQ201080053950
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月29日 優先權日2009年11月30日
發明者O.卡爾森 申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司