桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質水解工藝及降血糖藥的製作方法

2024-04-01 12:36:05

本發明涉及桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質水解工藝及降血糖藥。

背景技術：

糖尿病是一種常見的以慢性高血糖和糖脂代謝、蛋白質代謝紊亂為主要特點的內分泌疾病，其發病原因主要為胰島素分泌絕對不足和胰島抵抗。胰島素不足時，血清葡萄糖含量持續增高，超過腎臟的重吸收能力，致使大量葡萄糖隨尿排洩，引起滲透性利尿，導致機體脫水，腦細胞失水可引起腦功能紊亂直至昏迷，且由於糖尿病病人存在糖的利用障礙，轉而通過分解脂肪產生能量，伴隨著脂肪分解，酮體生成增加，導致糖尿病酮症酸中毒(楊軒璇.中藥降糖藥理作用研究進展[j]，河北中醫，2004；26(4)：305-308)。研究顯示，氧化應激與糖尿病的形成有密切聯繫，氧化應激產生過量的自由基會導致胰島β細胞功能損傷，胰島素分泌量不足及外周胰島素抵抗，誘發糖尿病的形成，並引起糖尿病神經病、糖尿病視網膜病、糖尿病心腦血管疾病等多種併發症(selvarajuv,joshim,sureshs,sanchezja,maulikn,maulikg.diabetes,oxidativestress,molecularmechanism,andcardiovasculardisease--anoverview.toxicolmechmethods2012；22(5):330–335.)。因此治療糖尿病，除了要控制血糖之外，抑制自由基過量產生而導致的組織細胞氧化損傷也十分必要。

桑葉作為一味傳統中藥在古代就被用來治療消渴症，《本草綱目》明確記載桑葉「煎之代茗，能止消渴」。現代藥理學研究發現桑葉中的多糖、黃酮、生物鹼等成分具有降血糖的作用，其中生物鹼的降血糖作用最顯著，它可顯著抑制α-糖苷酶活性，降低碳水化合物的轉化吸收(原愛紅，馬駿，蔣曉峰，等.桑葉中糖苷酶抑制活性組分的篩選及體外活性研究[j].同濟大學學報(醫學版),2005,26(4):8-11.)。桑葉生物鹼中多種已知化合物的降血糖效果已經被諸多報導證實(you-guili,dong-fengji,shizhong,tian-baolin,zhi-qianglv,gui-yanhu&xinwang.1-deoxynojirimycininhibitsglucoseabsorptionandacceleratesglucosemetabolisminstreptozotocin-induceddiabeticmice.scientificreports,2013；3:1377；liy-g,jid-f,zhongs,lvz-q,lint-b。you-guili,dong-fengji,shizhong,zhi-qianglv,tian-baolin.cooperativeanti-diabeticeffectsofdeoxynojirimycin-polysaccharidebyinhibitingglucoseabsorptionandmodulatingglucosemetabolisminstreptozotocin-induceddiabeticmice[j].plosone,2013,8(6):e65892.)。

石榴皮中多酚化合物鞣花酸已被證實具有很強的抗氧化能力，能夠體外清除·oh、超氧陰離子、dpph·，抑制脂質過氧化，在體內能夠降低氧化應激小鼠的肝臟和血液中脂質過氧化標誌物丙二醛(mda)的含量，提高肝臟和血液中總抗氧化能力(t-aoc)，同時提高肝臟中抗氧化酶超氧化物歧化酶(sod)和穀胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)的活力(sunyq,taox,menxm,liym,xuzw,wt.invitroandinvivoantioxidantactivitiesofthreemajorpolyphenoliccompoundsinpomegranatepeel:ellagicacid，punicalin，andpunicalagin.journalofintegrativeagriculture,2017)。但是石榴皮多酚中游離鞣花酸的含量較低，要獲得高含量鞣花酸的石榴皮多酚需使石榴皮多酚中鞣花單寧水解釋放鞣花酸，提高鞣花酸的含量。

因此本發明建立了石榴皮多酚鞣花酸的水解工藝，並利用桑葉生物鹼的α-糖苷酶抑制劑作用及石榴皮多酚中鞣花酸的清除自由基的能力，將兩種藥用成合理配比組成配方，一方面降低餐後血糖，另一方面減少自由基導致的胰島β細胞及其他組織器官氧化損傷，達到治療糖尿病綜合症的目的。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質水解工藝及降血糖藥，通過兩類藥用活性物質的相互協同作用，在降低糖尿病患者餐後血糖，改善糖耐量的同時，修復受損的胰島β細胞功能，達到治療糖尿病綜合症的作用。

為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質提取工藝，包括桑葉降血糖藥用活性物質提取方法和石榴皮降血糖藥用活性物質提取方法，所述桑葉降血糖藥用活性物質提取方法，依次包括以下步驟：

a.採摘：採摘桑葉，每年5月至10月；

b.乾燥：將採摘的桑葉乾燥，乾燥溫度不大於50℃；

c.粉碎：粉碎粒度30目至80目；

d.加入酒精，然後超聲波提取：酒精濃度50-70％，料液的重量比為1：30-50，提取時間4-6小時，提取溫度30-50℃，超聲功率：1000-1300w，提取完成後細篩過濾去除濾渣，得到提取液進行8000-10000rpm離心，得到上清液；

e.將d步驟產生的上清液旋蒸去除酒精，離心收集上清液，上清液用酸型陽離子交換樹脂吸附12-24小時，自來水衝洗去雜後，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積後離心得上清夜；

f.重複步驟e，將上清液用強酸型陽離子交換樹脂吸附2-4小時，自來水衝洗去雜後，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積後冷凍或噴霧乾燥，得到桑葉生物鹼的原料粉1；

所述石榴皮降血糖要用活性物質提取方法，依次包括以下步驟：

g.採摘：採摘桑葉，每年5月至10月；

h.乾燥：將採摘的桑葉乾燥，乾燥溫度不大於50℃；

i.粉碎：粉碎粒度30目至80目；

j.加入酒精，然後超聲波提取：酒精濃度50-70％，料液的重量比為1：30-50，提取時間4-6小時，提取溫度30-50℃，超聲功率：1000-1300w，提取完成後細篩過濾去除濾渣，得到提取液進行8000-10000rpm離心，得到上清液；

k.將d步驟產生的上清液旋蒸去除酒精，離心收集上清液，上清液用酸型陽離子交換樹脂吸附12-24小時，自來水衝洗去雜後，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積後離心得上清夜；

l.重複步驟e，將上清液用強酸型陽離子交換樹脂吸附2-4小時，自來水衝洗去雜後，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積後冷凍或噴霧乾燥，得到桑葉生物鹼的原料粉1；

所述石榴皮降血糖藥用活性物質提取方法，依次包括以下步驟：

a)採摘成熟石榴果實，剝下果皮於不大於50℃條件下乾燥；

b)將乾燥石榴皮粉碎，過30目至80目篩；

c)提取：石榴皮粉按1:30-1:50(w/v)加入蒸餾水，超聲功率：1000-1300w，60℃-80℃提取4-6小時；提取完成後真空抽濾除去濾渣，收集富含多酚的上清液；

d)將c步驟中的多酚上清液中按50:1-100:1(v/v)的比例加入10-40u/l單寧酶液，並用磷酸鹽緩衝液調節酸鹼度至ph5-ph5.5，37℃-45℃反應過夜；

e)將d步驟中反應液8000-1000r/min離心，傾出上清液，沉澱用水洗滌後烘乾保存，傾出的上清液85-100℃水浴中5-15分鐘滅活單寧酶，8000-1000r/min離心，棄去蛋白沉澱，上清液用弱極性大孔樹脂吸附過夜，蒸餾水衝洗去除緩衝鹽、糖類等雜質，樹脂用80-95％乙醇洗脫，收集洗脫液旋轉蒸發去掉酒精，濃縮至小體積後烘箱烘乾或冷凍乾燥得到乾燥固體，該固體與前述烘乾的沉澱合併，共同於研磨儀中磨成細粉，該細粉即為石榴皮多酚的原料粉2。

採用桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質提取工藝得到的活性物質製作降血糖藥，將原料粉1、原料粉2按1:0.5-1:2的比例進行配比，充分混合均勻。

與現有技術相比，本發明的優點是：以石榴皮為原料，獲得具有清除自由基能力強的多酚鞣花酸，與以桑葉為原料提取得到的高含量α-葡糖苷酶抑制劑合理配比後，使其協同發揮作用，開發出新的降糖藥物。該產品能夠降低糖尿病患者空腹血糖、餐後血糖，並減小自由基對胰島β細胞的氧化損傷，改善糖尿病的併發症狀。本發明所用植物材料資源豐富、價格低廉，提取製作工藝簡單，提取溶劑為水，純化洗脫液為乙醇，安全環保，適宜於工業化生產。

附圖說明

下面結合附圖對本發明作進一步說明：

圖1為採用本工藝生產的藥劑對小鼠糖耐量的影響對比圖；

圖2為採用本工藝生產的藥劑對stz誘導損傷的胰島β細胞保護作用對比圖；

圖3本工藝生產的藥劑對stz誘導損傷的胰島β細胞保護作用顯微鏡圖；

圖4為本工藝生產的藥劑對dpph自由基的清除作用。

具體實施方式

桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質提取工藝，包括桑葉降血糖要用活性物質提取方法和石榴皮降血糖要用活性物質提取方法，所述桑葉降血糖要用活性物質提取方法，依次包括以下步驟：

a.採摘：採摘桑葉，每年5月至10月；

b.乾燥：將採摘的桑葉乾燥，乾燥溫度不大於50℃；

c.粉碎：粉碎粒度30目至80目；

d.加入酒精，然後超聲波提取：酒精濃度50-70％，料液的重量比為1：30-50，提取時間4-6小時，提取溫度30-50℃，超聲功率：1000-1300w，提取完成後細篩過濾去除濾渣，得到提取液進行8000-10000rpm離心，得到上清液；

e.將d步驟產生的上清液旋蒸去除酒精，離心收集上清液，上清液用酸型陽離子交換樹脂吸附12-24小時，自來水衝洗去雜後，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積後離心得上清夜；

f.重複步驟e，將上清液用強酸型陽離子交換樹脂吸附2-4小時，自來水衝洗去雜後，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積後冷凍或噴霧乾燥，得到桑葉生物鹼的原料粉1；所述石榴皮降血糖要用活性物質提取方法，依次包括以下步驟：

a)採摘成熟石榴果實，剝下果皮於不大於50℃條件下乾燥；

b)將乾燥石榴皮粉碎，過30目至80目篩；

c)提取：石榴皮粉按1:30-1:50(w/v)加入蒸餾水，超聲功率：1000-1300w，60℃-80℃提取4-6小時；提取完成後真空抽濾除去濾渣，收集富含多酚的上清液；

d)將c步驟中的多酚上清液中按50:1-100:1(v/v)的比例加入10-40u/l單寧酶液，並用磷酸鹽緩衝液調節酸鹼度至ph5-ph5.5，37-45℃反應12-24h；

e)將d步驟中反應液8000-1000r/min離心，傾出上清液，沉澱用水洗滌後烘乾保存，傾出的上清液85-100℃水浴中5-15分鐘滅活單寧酶，8000-1000r/min離心，棄去蛋白沉澱，上清液用弱極性大孔樹脂吸附過夜，蒸餾水衝洗去除緩衝鹽、糖類等雜質，樹脂用80-95％乙醇洗脫，收集洗脫液旋轉蒸發去掉酒精，濃縮至小體積後烘箱烘乾或冷凍乾燥得到乾燥固體，該固體與前述乾燥沉澱合併，共同於研磨儀中磨成細粉，該細粉即為石榴皮多酚的原料粉2。

採用桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質提取工藝得到的活性物質製作降血糖藥，將原料粉1、原料粉2按1:0.5-1:2的比例進行配比，充分混合均勻。

採用上述工藝生產的原料粉可以選自以下劑型：片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、口服液、混懸劑、溶液劑。有效成分含量：桑葉生物鹼≥20％，鞣花酸含量≥20.0％。以下是對採用本工藝生產的原料進行藥理藥效實驗。

1.試驗目的

觀察本工藝生產的藥劑對小鼠糖耐量的影響、對stz誘導損傷的胰島β細胞保護作用及對自由基的清除作用，為本工藝生產的藥劑降糖作用提供初步的實驗依據。

2.受試藥物

本工藝生產的藥劑片原料，形狀：棕色粉末，批號：170321，貯存方法：避光、乾燥、常溫(25℃以下)保存，配製方法：臨用前在用0.9％生理鹽水溶解至所需濃度。

3.試驗動物

品種品系：c57/b6小鼠，級別：spf級，性別：雌性，體重：18-20g，數量：50隻，來源：中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司[生產許可證：scxk(滬)2012-0005]。

4.實驗條件

溫度：22±1℃，溼度：50-70％，光照：150-200lx，12小時明暗交替，噪音<50db。飲水：自來水置於飲水瓶中自由飲用。飼料：全價營養顆粒飼料。飼養方式：自由飲食，小鼠飼養籠中給予充足的飼料和水，每籠飼養8隻小鼠。

5.試劑與儀器

5.1試劑

蔗糖(中國醫藥上海化學試劑公司)；鏈脲佐菌素(stz)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)購自美國sigma公司；血糖試劑條(美國強生公司)；胰島β細胞株ins-1(中國科學院上海細胞庫)。胎牛血清(杭州民康生物技術有限公司)；rpmi1640培養基(杭州昊天生物技術有限公司)；dmso(中國醫學科學院生物工程研究所)；臺盼藍染色液(北京索萊寶科技有限公司)；水溶性維生素e(日本東京化工有限公司)。

5.2儀器設備

spectramaxm5多功能酶標儀，美國分子儀器公司；onetouchrultra血糖儀，強生(上海)醫療器材有限公司；countstar細胞計數儀，上海睿鈺生物科技有限公司；co2培養箱，美國therom公司；超淨工作檯，新加坡esco公司。

6.試驗方法

6.1小鼠篩選

取體重為18-20g的雌性c57/b6小鼠，禁食不禁水12小時，篩選空腹血糖在4-6mmol/l的糖尿病小鼠20隻。

6.2糖耐量實驗

試驗小鼠禁食不禁水12小時後尾靜脈取血，用onetouchrultra血糖儀測定小鼠的空腹血糖值。本工藝生產的藥劑組口服給予藥劑50mg/kg，對照組口服給予相等劑量的生理鹽水溶液，30分鐘過後各組即時口服給予0.3g/ml的蔗糖溶液(用生理鹽水配製)0.1ml/10g，測定給糖後30min、60min、120min的血糖。

6.3胰島β細胞保護作用

將胰島β細胞ins-1以1*105個/ml的密度接種於24孔板中，每孔250μl。實驗組加入不同劑量本工藝生產的藥劑溶液，每孔250μl使本工藝生產的藥劑終濃度分別為0.125、1.25μg/ml，空白對照組加入同體積rpmi1640完全培養液，每組設6復孔。

另外，實驗孔加入16mmstz溶液125μl，同時加入0.125、1.25μg/ml本工藝生產的藥劑溶液125μl，每個濃度設6個復孔，並設正常對照組(細胞，未加stz)、stz損傷模型組(細胞，加stz，不加藥物)。培養箱中培養48h後，每孔棄去培養液，加入pbs洗滌細胞，0.25％胰酶消化，收集細胞，離心棄去上清液，加入500μlpbs，吹打均勻，即為細胞懸液。20μl臺盼藍染料與20μl細胞懸液混勻，用countstar細胞計數儀進行細胞計數。

6.4dpph自由基清除試驗

依據用無水乙醇配製0.25mg/ml的dpph自由基溶液，4℃避光保存。將待測試劑用dmso稀釋成60、40、20、10和5mg/l共5個梯度濃度，向96孔酶標板的微孔中分別加入100μl被測液和100μl自由基溶液，37℃孵育30min後，測定516nm處od值。以無水乙醇代替自由基溶液作為本底對照，以dmso代替被測液作為空白對照。根據下面公式計算自由基清除率：dpph自由基清除率＝[1－(od樣品－od本底)/od空白]×100％

7.數據處理

用spss12軟體進行統計分析，所有數據以均數±標準差表示，計量資料應用t檢驗評價試驗結果。

8試驗結果

8.1本工藝生產的藥劑對糖尿病小鼠糖耐量的影響

從圖1結果可見，與對照組相比，本工藝生產的藥劑量組小鼠在口服給予蔗糖後血糖和血糖曲下面積均明顯降低(p<0.01)。

8.2本工藝生產的藥劑對胰島β細胞的影響

由圖2、圖3可知，stz可顯著損傷胰島β細胞ins-1，本工藝生產的藥劑對stz損傷的胰島β細胞ins-1具有明顯的保護作用，活細胞數量顯著高於stz損傷組(p<0.01)，且有隨著劑量增加而提高的趨勢，發揮這一作用可能是因為本工藝生產的藥劑具有顯著的清除自由基的功能。顯微觀察與細胞計數測定結果基本一致，如圖3所示，正常對照組ins-1細胞扁平，貼壁牢固，呈不規則多邊形；stz致ins-1細胞數量減少，形狀變圓，貼壁不牢，萎縮脫落；本工藝生產的藥劑可減輕stz對ins-1細胞的損傷，細胞數量增加，貼壁生長，細胞形態明顯改善趨向正常。

註：與stz模型組比較，**p<0.01。

8.3本工藝生產的藥劑對自由基的清除作用

由圖4可以看出，本工藝生產藥劑對dpph自由基有很強的清除作用，與常用的抗氧化劑水溶性維生素e相當。優越的清除自由基能力可能是本試劑能夠保護胰島β細胞的重要原因之一。

以上所述僅為本發明的具體實施例，但本發明的技術特徵並不局限於此，任何本領域的技術人員在本發明的領域內，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發明的專利範圍之中。