一種小麥莖基腐病菌的分離方法
2024-04-01 06:18:05 1
一種小麥莖基腐病菌的分離方法
【專利摘要】一種小麥莖基腐病菌的分離方法，先採集小麥植株，在通風陰涼條件下攤開放置1-2天後，從基部第一、二莖節處變褐色部分剪取1.8-2.2㎝莖段；用清水衝洗，然後用75%酒精消毒15s，再用無菌水漂洗；之後放入底鋪有無菌濾紙的培養皿裡，加入1-2mL無菌水，然後置於生化培養箱中，25℃、黑暗條件下培養，直至莖段上長出菌絲；挑取菌絲，種到添加乳酸的PSA培養基上，於25℃生化培養箱中黑暗培養；用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉至PSA斜面培養基上，置於生化培養箱中，25℃、黑暗條件下培養3天後，進行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。發明方法分離成功率高，處理後的莖稈可很快長出菌絲，轉入PSA上後也能很快長出小麥莖基腐病菌的典型菌落，成功率達95%以上。
【專利說明】一種小麥莖基腐病菌的分離方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種病菌的分離方法，具體的說是一種小麥莖基腐病菌的分離方法。
【背景技術】
[0002] 在進行病原真菌的形態、生理、生態及致病性的分子生物學等理論性研究工作中， 以及進行品種抗病性鑑定和篩選對病原菌有抑制作用的藥劑等應用性研究工作中，常常需 要病原真菌的純培養物。植物患病組織內的真菌菌絲體，如果給予適宜的環境條件，一般都 能恢復生長和繁殖。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病 組織或其它基物中將病原菌單獨分離出來，稱作植物病原真菌的分離。植物病原真菌的分 離在植物病理學科研工作中也具有十分重要的位置：對分離到的病原真菌進行保存可以滿 足植物病理學及微生物學日常的教學需要，使學生對植物病原真菌有更直觀的認識。
[0003] 近年來，隨著氣候變暖及秸杆還田等耕作栽培措施的推廣，小麥莖基腐病在我國 各大麥區發生普遍並造成一定的損失，為害日益嚴重，逐漸引起農業科技工作者的重視。 小麥莖基腐病從小麥分櫱到成熟期均可發生，可使莖基部葉鞘和莖杆變褐，莖節壞死，嚴 重時可使植株死亡、枯白，出現白穗，影響小麥產量。小麥莖基腐病由多種病原真菌侵染 引起，主要的致病性真菌類群包括鐮孢菌（Fusarium spp.)、小麥根腐離懦孢（Bipolaris sorokinianum)及其它一些真菌，其中前兩者的分離比率很高，但不同小麥生態區域的致病 菌種類存在一定差異。鑑於小麥莖基腐病在我國小麥生產區呈流行蔓延的趨勢，有必要加 緊對其防治策略的研究。由於引起小麥莖基腐病的病原菌均屬於兼性寄生真菌，可從發病 小麥植株的莖基部分離獲得純培養，為以後的病原菌種類確認、抗病性品種鑑定及藥劑篩 選等工作提供便利。小麥莖基腐病菌的分離是進行後續研究的基礎。
[0004] 植物病原真菌的分離包括組織分離法和稀釋分離法。由於組織分離法存在著費 時、費力、成本高、操作要求高等特點，故不適宜對大量的小麥莖基腐病病株進行病原菌分 離。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種小麥莖基腐病菌的分離方 法，省時、安全，可大用於大量的小麥莖基腐病病株進行病原菌分離；分離成功率高，處理後 的莖杆可很快長出菌絲，轉入PSA上後也能很快長出小麥莖基腐病菌的典型菌落，成功率 達95%以上。
[0006] -種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、採集有白穗症狀且莖杆基部第一、二莖節處的葉鞘或莖杆變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將採集到的小麥植株在室內通風陰涼條件下攤開放置1-2天；然後從放置後 的小麥植株基部第一、二莖節處變褐色部分剪取1. 8-2. 2 cm莖段；將所剪取的莖段用清水 衝洗乾淨，然後用75%酒精消毒15s，再用無菌水漂洗2-3次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養皿裡，向培養皿中加入l-2mL無 菌水，然後置於生化培養箱中，25°C、黑暗條件下培養1-2天，以便於植株表面的水分揮發； 直至莖段上長出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養基上，然後 置於25°C生化培養箱中黑暗培養2-3天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養基中加入lmL質量百分比為25%的乳酸； 步驟五、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉至PSA斜面培養基上，置於生化培養箱 中，25 °C、黑暗條件下培養3天後，進行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0007] 所述PSA培養基，每lOOmlPSA培養基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0,餘量為水。有益效果是： 1、本發明小麥莖基腐病菌的分離方法，將從田間採回的小麥植株室內通風陰涼條件下 放置1-2天，待上面的水分揮發後再進行後續處理，能讓莖杆上儘快長出菌絲；；為了排 除細菌汙染，莖段保溼前應先用75%的酒精消毒，時間太短達不到消毒效果，太長則對要分 離的小麥莖基腐病菌造成傷害，以15 s為宜；另外，每200 mL PSA中應預先加入25%的乳 酸1 mL，酒精結合乳酸的效果，既達到抑制細菌滋生的作用，又有利於小麥莖基腐病菌的分 離。本發明方法分離成功率高，處理後的莖杆可很快長出菌絲，轉入PSA上後也能很快長出 小麥莖基腐病菌的典型菌落，成功率達95%以上。
[0008] 2、本發明小麥莖基腐病菌的分離方法僅需對發病莖杆進行簡單處理，無需從一個 病斑的病健交界處切取4-5塊3X3mm的組織小塊，也無需升汞溶液或次氯酸鈉消毒、無菌 水清洗及濾紙吸乾等步驟，操作簡單；採用組織分離法進行小麥莖基腐病菌分離時，一般 每個病株的操作過程需要10-15 min，而此法則可在1 min內完成1個病株的酒精消毒、培 養皿保溼的步驟，1 min完成挑菌絲培養的步驟，操作迅速。
[0009] 3、現有技術的組織分離法同一莖杆上切下的幾個組織小塊用酒精及NaCIO消毒 時各需一副培養皿，三次無菌水清洗時又需要三幅培養皿，每次消毒及清洗培養皿均需更 換一次，1個病株需要5副培養皿才可以分離完畢；而此法保溼及分離時4-5個病株用1 個培養皿即可，操作中無需升汞或NaCIO等化學試劑，所需耗材及試劑很少，節約了試驗成 本，且安全、對人體無害。
【具體實施方式】
[0010] 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、採集有白穗症狀且莖杆基部第一、二莖節處的葉鞘或莖杆變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將採集到的小麥植株在室內通風陰涼條件下攤開放置1-2天；然後從放置後 的小麥植株基部第一、二莖節處變褐色部分剪取1. 8-2. 2 cm莖段；將所剪取的莖段用清水 衝洗乾淨，然後用75%酒精消毒15s，再用無菌水漂洗2-3次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養皿裡，向培養皿中加入l_2mL無 菌水，然後置於生化培養箱中，25°C、黑暗條件下培養1-2天，以便於植株表面的水分揮發； 直至莖段上長出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養基上，然後 置於25°C生化培養箱中黑暗培養2-3天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養基中加入lmL質量百分比為25%的乳酸； 步驟五、選取生長一致的菌落，鏡檢分生孢子形態，包括顏色、細胞數目、產孢結構等， 判斷病菌種類； 步驟六、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉至PSA斜面培養基上，置於生化培養箱 中，25°C、黑暗條件下培養3天後，進行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0011] 所述PSA培養基，每lOOmlPSA培養基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0, 餘量為水。實施例1 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、採集有白穗症狀且莖杆基部第一、二莖節處的葉鞘或莖杆變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將採集到的小麥植株在室內通風陰涼條件下攤開放置1天；然後從放置後的 小麥植株基部第一、二莖節處變褐色部分剪取1. 8 cm莖段；將所剪取的莖段用清水衝洗幹 淨，然後用75%酒精消毒15s，再用無菌水漂洗2次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養皿裡，向培養皿中加入l_2mL無 菌水，然後置於生化培養箱中，25°C、黑暗條件下培養1天，以便於植株表面的水分揮發；直 至莖段上長出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養基上，然後 置於25°C生化培養箱中黑暗培養2天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養基中加入lmL質量百分比為25%的乳酸； 步驟五、選取生長一致的菌落，鏡檢分生孢子形態，包括顏色、細胞數目、產孢結構等， 判斷病菌種類； 步驟六、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉至PSA斜面培養基上，置於生化培養箱 中，25°C、黑暗條件下培養3天後，進行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0012] 所述PSA培養基，每lOOmlPSA培養基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0, 餘量為水。實施例2 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、採集有白穗症狀且莖杆基部第一、二莖節處的葉鞘或莖杆變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將採集到的小麥植株在室內通風陰涼條件下攤開放置2天；然後從放置後的 小麥植株基部第一、二莖節處變褐色部分剪取2. 2 cm莖段；將所剪取的莖段用清水衝洗幹 淨，然後用75%酒精消毒15s，再用無菌水漂洗3次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養皿裡，向培養皿中加入l_2mL無 菌水，然後置於生化培養箱中，25°C、黑暗條件下培養2天，以便於植株表面的水分揮發；直 至莖段上長出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養基上，然後 置於25°C生化培養箱中黑暗培養3天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養基中加入lmL質量百分比為25%的乳酸； 步驟五、選取生長一致的菌落，鏡檢分生孢子形態，包括顏色、細胞數目、產孢結構等， 判斷病菌種類； 步驟六、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉至PSA斜面培養基上，置於生化培養箱 中，25°C、黑暗條件下培養3天後，進行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0013] 所述PSA培養基，每lOOmlPSA培養基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0, 餘量為水。實施例3 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其操作步驟為： 步驟一、採集有白穗症狀且莖杆基部第一、二莖節處的葉鞘或莖杆變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將採集到的小麥植株在室內通風陰涼條件下攤開放置2天；然後從放置後的 小麥植株基部第一、二莖節處變褐色部分剪取2. 0 cm莖段；將所剪取的莖段用清水衝洗幹 淨，然後用75%酒精消毒15s，再用無菌水漂洗2次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養皿裡，向培養皿中加入l_2mL無 菌水，然後置於生化培養箱中，25°C、黑暗條件下培養1. 5天，以便於植株表面的水分揮發； 直至莖段上長出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養基上，然後 置於25°C生化培養箱中黑暗培養2天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養基中加入lmL質量百分比為25%的乳酸； 步驟五、選取生長一致的菌落，鏡檢分生孢子形態，包括顏色、細胞數目、產孢結構等， 判斷病菌種類； 步驟六、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉至PSA斜面培養基上，置於生化培養箱 中，25°C、黑暗條件下培養3天後，進行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
[0014] 所述PSA培養基，每lOOmlPSA培養基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為 6.0, 餘量為水。試驗例 從河南省鄭州市、洛陽市、許昌市三地採集小麥莖基腐病標本120餘株，從中選取症狀 典型的(莖杆基部第一、二莖節處的葉鞘或莖杆變褐色）的植株100株，分為兩組，一組採用 常規的組織分離法進行分離小麥莖基腐病菌；第二組採用本發明方法進行分離小麥莖基腐 病菌； 一組的採用組織分離法分離時，對莖杆進行清水處理後，每個莖段在病健交界處切取 3 X 3mm的組織塊，依次用75%酒精消毒15s、2-3%的NaCIO消毒3min，然後在無菌水中衝洗 三遍，無菌濾紙吸乾水後放於含乳酸的PSA上培養，3-4天後觀察，挑取生長一致的菌落鏡 檢後保存。由於此法要經過莖杆分段再切塊、多次消毒、清水衝洗及濾紙吸乾等步驟，一個 病株處理完畢約需10-15 min，病株多時相當費力；且兩次消毒及三次清洗時需要的培養皿 較多(約200副)，培養時每個病株又需要1個培養皿。
[0015] 採用本發明方法進行分離時，莖杆經清水處理後，直接剪取第一、二莖節變褐的莖 段，約2-3cm，75%酒精消毒15s後在無菌水中衝洗一遍，然後將莖段放於皿底有無菌濾紙的 培養皿裡保溼培養，每個培養皿放5個莖段，50個病株需10個培養皿即可；2天後，莖段上 已長出菌絲；用接種針挑取莖段上的菌絲，轉至含乳酸的PSA上培養，每個PSA平板可轉5 個莖段上的菌絲，培養2d後挑選生長一致的菌落鏡檢後進行菌株保存。採用莖段保溼培養 法，經過一周的時間50株小麥莖基腐病病株全部分離完畢，共得到小麥莖基腐病菌48株。
【權利要求】
1. 一種小麥莖基腐病菌的分離方法，其特徵在於：其操作步驟為： 步驟一、採集有白穗症狀且莖杆基部第一、二莖節處的葉鞘或莖杆變褐色的小麥植株， 備用； 步驟二、將採集到的小麥植株在通風陰涼條件下攤開放置1-2天；然後從放置後的小 麥植株基部第一、二莖節處變褐色部分剪取1. 8-2. 2 cm莖段；將所剪取的莖段用清水衝洗 乾淨，然後用75%酒精消毒15s，再用無菌水漂洗2-3次，備用； 步驟三、將剪取的莖段放入皿底鋪有無菌濾紙的培養皿裡，向培養皿中加入l_2mL無 菌水，然後置於生化培養箱中，25°C、黑暗條件下培養1-2天，直至莖段上長出菌絲，備用； 步驟四、用接種針從每個莖段上挑取菌絲，分別接種到添加乳酸的PSA培養基上，然後 置於25°C生化培養箱中黑暗培養2-3天； 所述乳酸的添加量為每200mLPSA培養基中加入lmL質量百分比為25%的乳酸； 步驟五、用接種針從菌落邊緣挑取小塊菌落，轉至PSA斜面培養基上，置於生化培養箱 中，25°C、黑暗條件下培養3天後，進行菌株保存，即分離出小麥莖基腐病菌。
2. 如權利要求所述的小麥莖基腐病菌的分離方法，其特徵在於：所述PSA培養基，每 100ml PSA培養基中含馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，pH值為6. 0,餘量為水。
【文檔編號】C12R1/77GK104087515SQ201410300309
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】侯穎, 徐建強, 夏彥飛, 範倩倩, 範利峰 申請人:河南科技大學