實時監測蛋白水解酶活性的指示劑的製備方法及應用方法
2024-04-01 13:32:05
專利名稱：實時監測蛋白水解酶活性的指示劑的製備方法及應用方法
技術領域：
本發明涉及監測指示劑的製備方法及應用方法，具體涉及實時監測蛋白水解酶活性的指示劑的製備方法及應用方法。
背景技術：
隨著科技水平的不斷進步，生物化學逐漸成為探索活體細胞合成代謝、分解代謝基本原理的主要手段，使人們能夠了解各種酶的功能，並通過晶體學從原子層面揭示蛋白質的結構，為深入研究及有效利用打下基礎。然而，生物化學中並未能提供一種實驗工具，用以定量並在實驗中從時間、空間上精確地監控分子水平的細胞內或細胞外生理病理變化，從而確定活體系統的動態行為。為獲得這些認識，實驗方面及概念上的新工具必不可少。如今，在20世紀60年代分離自維多利亞多管水母的綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein, GFP )以及經改造獲得的突變體構成的「GFP家族」蛋白，使這樣一種工具成為現實並得到飛速發展(Shimomura 0，Johnson FH, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol, 1962 (59) :223_239)。螢光蛋白常用於基因轉錄或作為一種與目的基因結合的報告基因。螢光蛋白基因在N端或C端與異源基因接合夠成編碼融合蛋白的嵌合基因，其表達產物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現出與天然螢光蛋白相似的螢光特性(Jones JJ, Bridges AM, Fosberry AP, et al. Potential of real-time measurement of GFP-fusion proteins. J Biotechnol, 2004 (109) : 201 - 211 )。螢光蛋白的這種特性為蛋白質提供了一種螢光標記，不僅可以用來在活體內追蹤某一特定蛋白的合成、運輸和定位，還用於細胞器的動態觀察、有絲分裂的研究、細胞骨架的成分分析和細胞分泌過程觀察等，甚至也可以對某些DNA序列在活細胞的動態變化進行分析研究(Chalfie M，Tu Y, Euskirchen G, et al。Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994 (263) :802-805.)。與傳統抗體標記技術相比具有更高的靈敏度、簡化細胞固定、滲透壓調整、抗體培養等操作步驟，可用螢光顯微鏡直接進行觀察，而且螢光蛋白沒有毒性，在不同的生物中都能高水平表達且不影響其生理機能。雙分子焚光互補技術(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)是由螢光蛋白研究發展而來的一項新技術。將螢光蛋白在某些特定的位點切開，形成不發螢光的N端與C端2個多肽，稱為N片段和C片段。這兩個片段在細胞內共表達或體外混合時，不能自發的組裝成完整的螢光蛋白，在該螢光蛋白的激發光激發時不能產生螢光。但當這兩個螢光蛋白的片段分別連接到一組相互作用的目標蛋白上，在細胞內共表達或體外混合這兩個融合蛋白時，由於目標蛋白質的相互作用，螢光蛋白的兩個片段在空間上相互靠近互補，重新構建成完整的具有活性的螢光蛋白分子，並在該螢光蛋白的激發光激發下，散發焚光(Kerppola T K. Visualization of molecular interactions using bimolecular fluorescence complementation analysis: characteristics ofprotein fragment complementation. Chem Soc Rev,2009( 10) : 2876- 2886.)。 BiFC技術一經出現迅速得到廣泛應用，已經成功用於多種蛋白質的相互作用，如大腸桿菌 (Morell Mj Espargaro A, Aviles FX，et al. Detection of transient protein-protein interactions by bimoIecuIar fluorescence complementation: the Abl_SH3 case. Proteomics. 2007 (7) : 1023-1036)、酵母細胞(Sung MKj Huh WK. Bimolecular fluorescence complementation analysis system for in vivo detection of protein-protein interaction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2007(9):767-775)、絲狀真菌(Hoff B，Kiick U. Use of bimolecular fluorescence complementation to demonstrate transcription factor interaction in nuclei of living cells from the filamentous fungus Acremonium chrysogenum. Curr Genet，2005 (2) : 132-138)、哺乳動物細胞(Kerppola TK . Bimolecular fluorescence complementation: visualization of molecular interactions in living cells. Methods Cell Biol，2008 (85):431-470) 等。此技術的優點在於適用範圍廣泛，所研究的蛋白處於其天然的環境之中，能夠直觀的觀察蛋白質的相互作用，並且與應用廣泛研究體內蛋白質相互作用的酵母雙雜交技術相比耗時比較短。焚光共振能量轉換技術(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是螢光蛋白研究過程中發展的另一項研究蛋白質相互作用的技術。當一個螢光分子(如螢光蛋白，作為供體)的發射譜與另一個螢光分子(作為受體)的吸收譜有重疊時，若這兩個螢光分子距離靠近，則會通過供體和受體之間電磁偶極相互作用發生非輻射的能量轉移。由於要發生能量轉移要求供體和受體之間的距離小於10納米(Day R N, Davidson M W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev, 2009( 10 )J887-2921.)，因此可用於研究分子的空間關係及相互作用。現已經發展了數十種不同吸收發射譜的螢光蛋白，已有許多實用的螢光蛋白組合(Shcherbo D，Souslova E A, Goedhart J, et al. Practical and reliable FRET /FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol，2009 (9) : 24.)，使得基於螢光蛋白的FRET成為應用最廣泛的螢光技術之一。而且隨著更多長波螢光蛋白的出現，發射譜在不斷拓寬，又發展出了多色螢光共振轉移技術進一步拓展了該技術的應用(Galperin E，Verkhusha V V，Sorkin A .Three- chromophore FRET microscopy to analyze multi-protein interactions in living cells. Nat Methods,2004(3): 209-217·)。對螢光蛋白研究的不斷深入，使得螢光蛋白在生物科學中的應用得到極大的推進，實際上在各類期刊雜誌上有大量關於螢光蛋白的文章，這對生物科學實驗的如何實施、 如何解釋都有巨大的影響，也為新的實驗方法、技術的出現創造條件。
發明內容
本發明的目的是提供一種實時監測蛋白水解酶活性的指示劑的製備方法及應用方法，是在螢光蛋白的結構和功能的基礎上，對其進行結構改造，產生蛋白水解酶活性指示齊U(PAI)，正常情況下沒有螢光，被蛋白水解酶水解後產生螢光，以此為工具在體內實時監測蛋白水解酶在生理及病理過程中的變化，在體外監測樣品中蛋白水解酶的活性。本發明的技術解決方案是用於實時監測蛋白水解酶活性的工具為由螢光蛋白改造而成的蛋白水解酶活性指示劑(PAI)，該指示劑的製備方法是對螢光蛋白進行循環置換， 用蛋白水解酶識別序列將N端和C端連接改變它們的空間結構，同時產生新的N端和C端， 經循環置換後的螢光蛋白即為蛋白水解酶活性指示劑(PAI)，PAI沒有螢光，在經相應的蛋白水解酶作用後，PAI變成由螢光蛋白的N端和C端兩部分肽段組成，這兩部分經螢光互補產生螢光，PAI能由基因直接編碼； 該指示劑的具體製備步驟如下
(1)將螢光蛋白游離的N端與C端通過分子生物學技術縮短，但保證螢光蛋白發螢光的功能，產生的N端和C端命名為N1和C1 ；
(2)在螢光蛋白內部的某位點將肽鍵切斷，形成新的游離的N端與C端，命名為N2和
C2 ；
(3)用蛋白水解酶識別位點(較短的多肽序列)連接縮短後的螢光蛋白的N1端與 C1端，構成一個完整的蛋白，該蛋白即為蛋白水解酶活性指示劑，Protease Activity 工ndicator，命名為PAI。本發明的指示劑的應用方法包括以下步驟
(1)構建質粒
(a)將螢光蛋白游離的N端與C端通過分子生物學技術縮短，保證螢光蛋白功能較短序列，最短最好，但不是必須的；
(b)在螢光蛋白的某特定位點，在EGFP及其衍生的螢光蛋白的不限與此的第IM與155 殘基之間，將其切斷，形成N端與C端兩部分多肽片段；
(c)連接縮短後的N端與C端，同時插入某一蛋白水解酶的識別位點，使兩個多肽成為一個完整的蛋白，即為蛋白水解酶活性的指示劑(PAI)；
(d)將表達以上指示劑(PAI)的cDNA連接到合適的載體上，構建完整質粒，用於在生命體系中表達；
(2)在體內或體外通過指示劑(PAI)螢光的有無強弱的變化，監測蛋白水解酶活性的變化。本發明涉及的核苷酸序列和胺基酸序列如下
目前發現的所有的螢光蛋白都有相似的空間結構，即β-桶裝結構，而發光基團則位於桶裝結構中與外部環境相對獨立，蛋白兩端(尤其是N端)的胺基酸結構及空間位置對螢光發光基團的自發形成至關重要；因此，本發明以具有桶裝結構的任何螢光蛋白為基礎進行創新改造，包括GFP及其衍生的螢光蛋白(如EGFP、ECFP, EBFP, EYFP, Venus、 Cerulean 等)、copGFP、DsRed 及其衍生的螢光蛋白(mRFP、mCherry)。下面為一種以Venus為基礎生產的用於監測蛋白水解酶Caspase-3活性的蛋白水解酶活性指示劑(PAI-C3)的cDNA (基因)減
該基因對應編碼的胺基酸序列為
劃單下劃線的序列編碼Venus螢光蛋白的C端多肽；劃雙下劃線的序列編碼Venus螢光蛋白的N端多肽；中間的序列編碼Caspase-3水解酶的識別和水解位點(DEVDG)。此處螢光蛋白的C端和N端可替換為其它具有β-桶裝結構的螢光蛋白； Caspase-3的水解位點可替換為其它水解蛋白的位點，如Caspase-Ι — Caspasel3、 Trypsin、HIV-I Protease、site-1 Protease 等。本發明具有以下優點
1、各種生理、病理原因引起相應的蛋白水解酶活化後，識別作用位點並將其水解切斷； 活化後的蛋白水解酶同樣能水解含其識別序列的PAI，並將PAI水解成N端和C端兩部分多肽，由於這兩部分多肽片段空間上相互靠近互補，會自發地通過疏水相互作用重新構建成一個具有空間結構的蛋，(N1端可自由移動，並且通過雙分子螢光互補自發地形成螢光發光基團，在該螢光蛋白的激發光激發下，發射螢光。2、能發螢光的蛋白經過循環置換插入蛋白水解酶識別序列，同時產生新的隊端和 C2端，游離的N端與C端對螢光蛋白中心的發光基團的自發形成起決定性的作用，在用蛋白水解酶的識別序列強行連接N1端與C1端時，改變了 N1和C1的空間位置，引起螢光蛋白空間構像的改變。3、本發明的指示劑能在體內(在細胞內和動物上)導入該基因，通過表達蛋白來實時監測蛋白水解的活性(即蛋白水解酶的激活)，不需要破壞樣品、收集樣品，靈敏、直觀、便捷、省時。4、本發明的指示劑PAI能在體外以PAI為底物方便、快速、準確地監測樣品中的蛋白水解酶的活性。5、本發明的指示劑可以應用於任何蛋白水解酶活性的監測，特別是對於特定蛋白水解酶在生理及病理過程中活性改變的監測，為了解蛋白水解酶的功能及在生理病理過程中的作用提供有效方法；對於那些作為治療靶點的蛋白水解酶，相應的PAI能成為它們有效的底物，由於螢光的方便檢測和操作，因此能方便地建立這些蛋白水解酶抑制劑的高通量篩選平臺。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術解決方案，這些實施例不能理解為是對技術解決方案的限制。
正常情況下，體內蛋白水解酶以酶原的形式存在，即無活性的前體；在病理或某些特殊的生理條件下，這些前體會被活化成有功能的形式即蛋白水解酶，發揮重要的生物學功能；通常情況下，傳統的方法是收集生物樣品，然後進行免疫蛋白印跡檢測蛋白水解酶的活性；傳統的方法費時費力，然而用我們在發明專利中描述的方法，能十分方便、快速、實時地檢測蛋白水解酶的活性，而不破壞生物樣本的完整性。實施例1 以細胞凋亡中的關鍵酶caspase-3為例說明對此蛋白水解酶的監測， Caspase-3在細胞凋亡中起了重要作用，用我們描述的方法能方便、實時地監測細胞中 Caspase-3的活性，具體操作如下(本實施例中採用的螢光蛋白為Venus)
(1)構建質粒
(a)將螢光蛋白游離的N端與C端通過分子生物學技術縮短，保證螢光蛋白功能的較短序列；
(b)在螢光蛋白的154與155之間將其切斷，形成N端與C端兩部分；
(c)連接原來的、經縮短後的N端與C端，同時插入caspase-3的識別位點DEVD-G(Asp、 Glu、Val、Asp、Gly)，即為 PAI ；
(d)將表達該蛋白(PAI)的cDNA連接到合適的載體上，構建完整質粒表達PAI(此質粒命名為ρ PAI)；
(2)將ρPA I轉染進細胞，以宮頸癌細胞HeLa為例)，表達PAI ；
(3)用H2O2誘導細胞凋亡；
(4)用螢光顯微鏡或螢光分光光度計監測細胞樣品中螢光的變化。
結果表明見表一，與對照相比，未誘導凋亡前，細胞沒有螢光產生，在誘導細胞凋亡後， 細胞出現螢光，而且Capases-3的抑制劑Z-VAD能抑制細胞螢光的產生；說明在凋亡過程caspase-3被激活，作用於PAI，使PAI產生螢光；PAI能作為細胞內敏感的蛋白水解酶 Caspase-3活性的指示劑。表一雙氧水(H202)誘導HeLa細胞凋亡，激活Caspase-3，可通過PAI檢測
權利要求
1.實時監測蛋白水解酶的指示劑的製備方法，用於實時監測蛋白水解酶活性的工具為由螢光蛋白改造而成的蛋白水解酶活性指示劑(PAI)，其特徵在於該指示劑的製備方法是對螢光蛋白進行循環置換，用蛋白水解酶識別序列將N端和C端連接改變它們的空間結構，同時產生新的N端和C端，經循環置換後的螢光蛋白即為蛋白水解酶活性指示劑(PAI)，PAI沒有螢光，在經相應的蛋白水解酶作用後，PAI變成由螢光蛋白的N端和C端兩部分肽段組成，這兩部分經螢光互補產生螢光，PAI能由基因直接編碼。
2.根據權利要求1所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的製備方法，其特徵在於該指示劑的具體製備步驟如下(1)將螢光蛋白游離的N端與C端通過分子生物學技術縮短，但保證螢光蛋白發螢光的功能，產生的N端和C端命名為N1和C1 ；(2)在螢光蛋白內部的某位點將肽鍵切斷，形成新的游離的N端與C端，命名為N2和C2 ；(3)用蛋白水解酶識別位點(較短的多肽序列)連接縮短後的螢光蛋白的N1端與C1端，構成一個完整的蛋白，該蛋白即為蛋白水解酶活性指示劑，Protease Activity工ndicator，命名為PAI。
3.根據權利要求1所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的製備方法，其特徵在於以Venus為基礎生產的用於監測蛋白水解酶Caspase-3活性的蛋白水解酶活性指示劑(PAI-C3)的 cDNA (基因)ATMfWAMTAajiWtLWKrfrATCA.報K:CAA( ma^^Α(Κ Μ:ΟΟΓ — <χ GTOif AOrTCCiCCOArCAC TACC ACiC ΛΛ CAC CfT r ATC eera.ACOGCCtXGTCC'TCCTGCCC-GACAACX^CTACTiaAGC'TACCV^GTCCGCCX^T&AHCTOAAGGAC^ACOQCA,-、CIAC▲似 CCCOC6CCGA 孤^該基因對應編碼的胺基酸序列為？.!.'.uiiC^^^i λιsAn^ii·! AX'. 1 Γχ !^f 工.『_:Ζ C P ['.jJi.ki. ^jjW χ 1: ··*! I1^l1IL: h Fx ·31:..,..1^ ( t 丄；^tT!1!/j.劃單下劃線的序列編碼Venus螢光蛋白的C端多肽；劃雙下劃線的序列編碼Venus螢光蛋白的N端多肽；中間的序列編碼Caspase-3水解酶的識別和水解位點(DEVDG)。
4.根據權利要求3所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的製備方法，其特徵在於此處螢光蛋白的C端和N端可替換為其它具有β-桶裝結構的螢光蛋白；Caspase-3的水解位點可替換為其它水解蛋白Caspase_l—Caspasel3、Trypsin、HIV-I Protease、site-1Protease。
5.實時監測蛋白水解酶的指示劑的應用方法，其特徵在於該應用方法包括以下步驟(1)構建質粒(a)將螢光蛋白游離的N端與C端通過分子生物學技術縮短，保證螢光蛋白功能較短序列，最短最好，但不是必須的；(b)在螢光蛋白的某特定位點，在EGFP及其衍生的螢光蛋白的不限與此的第IM與155殘基之間，將其切斷，形成N端與C端兩部分多肽片段；(c)連接縮短後的N端與C端，同時插入某一蛋白水解酶的識別位點，使兩個多肽成為一個完整的蛋白，即為蛋白水解酶活性的指示劑(PAI)；(d)將表達以上指示劑(PAI)的cDNA連接到合適的載體上，構建完整質粒，用於在生命體系中表達；(2)在體內或體外通過指示劑(PAI)螢光的有無強弱的變化，監測蛋白水解酶活性的變化。
6.根據權利要求3所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的製備方法，其特徵在於以權利要求3中所述的基因(cDNA)為基礎衍生的各種表達載體製備成的監測蛋白水解酶活性的試劑或試劑盒。
7.根據權利要求2所述的實時監測蛋白水解酶的指示劑的製備方法，其特徵在於以權利要求4中所述的PAI為基礎生產的監測蛋白水解酶活性的試劑或試劑盒。
全文摘要
本發明公開了實時監測蛋白水解酶活性的指示劑的製備方法及應用方法，是通過對螢光蛋白結構的改造，插入蛋白水解酶的作用位點，觀察螢光蛋白螢光的有無及強弱的變化，來實現蛋白水解酶活性的監測；具體如下對螢光蛋白進行循環置換，用蛋白水解酶識別序列將N端和C端連接改變它們的空間結構，同時產生新的N端和C端，經循環置換後的螢光蛋白即為蛋白水解酶活性指示劑(PAI)，在經相應的蛋白水解酶作用後，PAI變成由螢光蛋白的N端和C端兩部分肽段組成，這兩部分經螢光互補產生螢光。本發明以指示劑為工具在體內實時監測蛋白水解酶在生理及病理過程中的變化，在體外監測樣品中蛋白水解酶的活性，靈敏、直觀、便捷、省時。
文檔編號G01N21/64GK102558310SQ20121004285
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者張矯, 李兵輝 申請人:李兵輝