不結球白菜胞質雄性不育基因的分子標記方法

2024-04-01 13:01:05 1

專利名稱：不結球白菜胞質雄性不育基因的分子標記方法
技術領域：
本發明不結球白菜胞質雄性不育基因的分子標記方法，屬於生物技術領域，涉及不結球白菜胞質雄性不育系選育的分子育種，專用於不結球白菜胞質不育基因的篩選。
二、技術背景不結球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)，原產中國，是我國南方普遍種植的最大眾化蔬菜，在蔬菜的周年供應中起著舉足輕重的作用(侯喜林，2003)。不結球白菜為典型的異花授粉作物，雜種優勢明顯，而利用雄性不育系是進行雜種生產的理想材料。
細胞質雄性不育是呈母性遺傳的雄性不育類型，它在植物雜種優勢利用方面具有重要的作用，對其深入研究具有重大的經濟價值和社會價值，同時又是研究核—質互作和花粉發育的模式系統，具有重要的理論研究意義，因而引起國內外學者的普遍關注，成為分子生物學研究領域的一大熱點(凌杏元，2000)。
隨著分子生物學的發展，國內外都很重視開展育性基因的分子標記篩選以及用於標記輔助選擇。Hanson等(1997)用BSA法(Bulked Segregant Analysis)識別了甘藍Ogu胞質雄性不育恢復基因連鎖的分子標記，利用選擇的標記來選擇純合的育性恢復位點的植株。Delourme等(1998)等從138個隨機引物中篩選出與油菜Ogu胞質雄性不育育性基因緊密連鎖的4個RAPD標記片段。Jean等(1998)利用NILS和BSA法鑑定出與pol胞質雄性不育育性位點連鎖的10個RFLP標記和1個RAPD標記。王俊霞等(2000)用BSA法從860個隨機引物中篩選出與pol胞質雄性不育恢復基因連鎖的2個RAPD標記AH19.690和AH6.830。王曉武等(1998)利用BSA分析獲得了1個與甘藍雄性不育基因MS連鎖的ERAPD標記，在輔助2個甘藍自交系回交一代及2個青花菜自交系回交一代的MS基因轉育中預測的準確性超過90％。王永飛等(2002，2003)利用RAPD技術對大白菜細胞質雄性不育系及其保持系分析，獲得了不育系的特異標記CMSOPL01670。王春國等(2005)採用同源序列的侯選基因法，設計特異引物，獲得了花椰菜胞質雄性不育基因的特異PCR標記。蓋樹鵬等(2001，2004)利用RAPD技術，獲得了大蔥胞質雄性不育基因的1個標記S132800，並成功轉化為SCAR標記，同時建立了大蔥不育系分子標記輔助選擇的技術體系。陳學軍等(2003)利用合成的引物在榨菜胞質雄性不育系中獲得了1173bp的特異PCR標記。但至今尚無不結球白菜胞質雄性不育基因標記篩選及其標記輔助選擇的報導，分子標記輔助選擇不受環境條件的限制，可實現苗期選擇，減少工作量，提高選擇效率，從而加快育種進程。

發明內容
技術問題本發明的目的是篩選出一個或幾個與不結球白菜胞質雄性不育基因緊密連鎖的分子標記，這些分子標記用於不結球白菜輔助選擇育種，可大大提高不結球白菜不育系的選擇效率，為雜種優勢的利用提供理想材料。
技術方案 本發明的實施方案如下與不結球白菜胞質雄性不育基因連鎖的分子標記方法，其特徵在於用標記引物OPAX1，引物序列TGCGCTCCTC擴增不結球白菜胞質雄性不育系或育種材料DNA，如果能夠擴增出800bp的片段NAU/RAPD/CMS1800，則標誌著不結球白菜胞質雄性不育基因的存在。
或者用標記引物OPAF12，引物序列GGAACCCACA擴增不結球白菜胞質雄性不育系或育種材料DNA，如果能夠擴增出600bp的片段NAU/RAPD/CMS2600，則標誌著不結球白菜胞質雄性不育基因的存在。
或者用標記引物SCAX1，左端引物序列TGCGCTCCTCCTTGGTGGTG右端引物序列TGCGCTCCTCTCCAAAACTA擴增不結球白菜胞質雄性不育系或育種材料DNA，如果能夠擴增出800bp的片段NAU/SCAR/CMS3800，則標誌著不結球白菜胞質雄性不育基因的存在。
或者用標記引物SCAF12，左端引物序列GGAACCCACAATCCAGAA右端引物序列GGAACCCACACCAGAGACGCAG擴增不結球白菜胞質雄性不育系或育種材料DNA，如果能夠擴增出600bp的片段NAU/SCAR/CMS4600，則標誌著不結球白菜胞質雄性不育基因的存在。
篩選上述標記的過程如下(1)材料選用不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB；(2)用CTAB法提取胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB的單株DNA；(3)採用RAPD和SCAR標記標記進行不結球白菜胞質雄性不育標記的篩選。
RAPD標記的篩選是用隨機引物OPAX1和OPAF12，在PTC-100TM擴增儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5單位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。PCR反應程序為94℃2min預變性後，接著94℃變性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18個循環，72℃延伸5min，再94℃變性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25個循環，再72℃5min；PCR產物於1.4％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離分析，電泳結束後在UVP成像系統上自動成像，篩選出在不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB間的多態性片段，從而獲得不結球白菜胞質雄性不育基因800bp的RAPD標記片段NAU/RAPD/CMS1800和600bp的RAPD標記片段NAU/RAPD/CMS2600。
利用Takara公司的凝膠回收試劑盒回收、純化特異DNA片段，連接pGEM-T載體，轉化感受態大腸桿菌DH5α，篩選、鑑定重組克隆並由Takara公司進行兩端測序。
根據RAPD擴增特異序列的測序結果，利用軟體Primer Premier設計兩對SCAR引物SCAX1及SCAF12，SCAR標記的篩選是在PTC-100TM擴增儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為為20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物對2.0μl，5單位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。
PCR反應程序為94℃2min預變性後，接著94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環。PCR產物於1.4％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離分析，電泳結束後在UVP成像系統上自動成像，篩選出在不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB間的多態性片段，從而獲得不結球白菜胞質雄性不育基因800bp的SCAR標記片段NAU/SCAR/CMS3800和600bp的SCAR標記片段NAU/SCAR/CMS4600。
(4)獲得兩個RAPD標記片段NAU/RAPD/CMS1800和NAU/RAPD/CMS2600與不結球白菜胞質雄性不育基因連鎖，並將其分別轉化為更為穩定的兩個SCAR標記片段NAU/SCAR/CMS3800和NAU/SCAR/CMS4600。
有益效果 本發明選用的是不結球白菜胞質雄性不育系及其保持係為材料開展不結球白菜胞質雄性不育分子標記的篩選。與目前技術相比，其優點是(1)標記穩定。本研究以不結球白菜胞質雄性不育系及其保持系這一對近等基因係為材料，鑑定出RAPD標記2個，並轉化為2個更穩定的SCAR標記，在2002，2003年分別用這些標記對不結球白菜胞質雄性不育系及其保持系測交及自交後代進行檢測，表明該標記表現穩定，不受年份、環境條件的影響。
(2)輔助選擇方便，節約成本。不結球白菜雄性不育系的常規選育方法周期長，成本高，費時又費力。通過本發明篩選出的與不結球白菜雄性不育基因緊密連鎖的分子標記用於輔助選擇，可以實現苗期選擇，減少工作量，大大提高不結球白菜胞質雄性不育系的選擇效率，從而加快育種進程。
四

圖1 NAU/RAPD/CMS1800標記的篩選左邊三個泳道為引物OPAX1在不結球白菜保持系98HB擴增結果，右邊三個泳道為引物OPAX1在不結球白菜胞質雄性不育系98HA擴增結果，箭頭所示為標記NAU/RAPD/CMS1800。
圖2 NAU/RAPD/CMS2600標記的篩選左邊三個泳道為引物OPAF12在不結球白菜保持系98HB擴增結果，右邊三個泳道為引物OPAF12在不結球白菜胞質雄性不育系98HA擴增結果，箭頭所示為標記NAU/RAPD/CMS2600。
圖3 NAU/SCAR/CMS3800和NAU/SCAR/CMS4600標記的篩選左邊三個泳道為引物對SCAX1在不結球白菜胞質雄性不育系98HA擴增結果，右邊三個泳道為引物對SCAF12在不結球白菜胞質雄性不育系98HA擴增結果，箭頭所示為標記NAU/SCAR/CMS3800和NAU/SCAR/CMS4600。
五具體實施例方式
利用RAPD等分子標記技術尋找與不育基因連鎖的標記，為定位及克隆這些基因提供了極其有用的工具，並為分子標記輔助育種打下良好的基礎。分子標記輔助選擇不受環境條件的限制，可實現苗期選擇，減少工作量，加快育種進程。目前國內外在不結球白菜CMS基因分子標記研究方面尚屬空白。
本發明的實施程序是(一)材料與方法 不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB這一近等基因系來自南京農業大學蔬菜研究所(Hou X.L.Cao S.C and He Y.K.Creation ofa new germplasm of CMS non-heading Chinese cabbage.Acta Horticulturae，2004，175～81，南京農業大學蔬菜研究所自該專利申請之日起20年內保證對外提供)。胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB測交及自交後代進行育性調查、分子標記的篩選及連鎖分析，重組率計算公式為重組率＝重組型植株數/總株數×100％。
(二)分子標記分析 主要利用RAPD標記及SCAR標記。
用CTAB法提取胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB的單株DNA(史公軍，侯喜林.不結球白菜RAPD反應體系的優化.江西農業大學學報，2004.11～5)首先用含有標記引物OPAX1，引物序列TGCGCTCCTC；和標記引物OPAF12，引物序列GGAACCCACA的300對隨機引物對不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB的DNA多態性進行初步分析。在PTC-100TM擴增儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20μl，其中10×Buffer 2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5單位/μl Taq酶0.2μ1，模板DNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。 PCR反應程序為94℃2min預變性後，接著94℃變性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18個循環，72℃延伸5min，再94℃變性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25個循環，再72℃5min；PCR產物於1.4％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離分析，電泳結束後在UVP成像系統上自動成像，篩選出在不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB間的多態性片段。
利用Takara公司的凝膠回收試劑盒回收、純化特異DNA片段，連接pGEM-T載體，轉化感受態大腸桿菌DH5α，篩選、鑑定重組克隆並由Takara公司進行兩端測序。
根據測序結果進行SCAR標記引物的設計，利用軟體Primer Premier設計18～22bpSCAR引物對SCAX1LTGCGCTCCTCCTTGGTGGTG，SCAX1RTGCGCTCCTCTCCAAAACTA；SCAF12LGGAACCCACAATCCAGAA，SCAF12RGGAACCCACACCAGAGACGCAG，在PTC-100TM擴增儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為為20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5單位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl。。PCR反應程序為94℃2min預變性後，接著94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環。PCR產物於1.4％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離分析，電泳結束後在UVP成像系統上自動成像，篩選出不結球白菜胞質雄性不育基因的SCAR標記。
(三)結果與分析 分子標記篩選結果表明，共發現2個RAPD標記與不結球白菜胞質雄性不育基因連鎖，即用引物OPAX1擴增出的800bp的NAU/RAPD/CMS1800和用引物OPAF12擴增出的600bp的NAU/RAPD/CMS2600。通過設計的SCAR引物對將其分別轉化為更為穩定的兩個SCAR標記NAU/SCAR/CMS3800和NAU/SCAR/CMS4600，其中引物對SCAX1L和SCAX1R可擴增出800bp的DNA片段，而用引物對SCAF12L和SCAF12R可擴增出600bp的DNA片段。通過對不結球白菜胞質雄性不育系及其保持系後代單株進行連鎖分析，發現所篩選到的標記與不結球白菜胞質雄性不育基因緊密連鎖(表1)。此外，標記在不同年份，不同環境表現穩定，因此篩選到的與不結球白菜雄性不育基因緊密連鎖的分子標記用於輔助選擇，可有效開展不結球白菜胞質雄性不育系的選育，大大提高選擇效率，從而加快育種進程。
表1標記在胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB後代中的分離情況

權利要求
1.不結球白菜胞質雄性不育基因的分子標記方法，其特徵在於用標記引物OPAX1，引物序列TGCGCTCCTC擴增不結球白菜胞質雄性不育系或育種材料DNA，如果能夠擴增出800bp的片段，則標誌著不結球白菜胞質雄性不育基因的存在；或者用標記引物OPAF12，引物序列GGAACCCACA擴增不結球白菜胞質雄性不育系或育種材料DNA，如果能夠擴增出600bp的片段，則標誌著不結球白菜胞質雄性不育基因的存在；或者用標記引物SCAX1，左端引物序列TGCGCTCCTCCTTGGTGGTG右端引物序列TGCGCTCCTCTCCAAAACTA擴增不結球白菜胞質雄性不育系或育種材料DNA，如果能夠擴增出800bp的片段，則標誌著不結球白菜胞質雄性不育基因的存在；或者用標記引物SCAF12，左端引物序列GGAACCCACAATCCAGAA右端引物序列GGAACCCACACCAGAGACGCAG擴增不結球白菜胞質雄性不育系或育種材料DNA，如果能夠擴增出600bp的片段，則標誌著不結球白菜胞質雄性不育基因的存在。
2.根據權利要求1所述不結球白菜胞質雄性不育基因的分子標記方法，其中分子標記引物的篩選過程如下(1)材料選用不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB；(2)用CTAB法提取胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB的單株DNA；(3)標記引物的篩選用隨機引物在PTC-100TM擴增儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物2.0μl，5單位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA 20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl，PCR反應程序為94℃2min預變性後，接著94℃變性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，18個循環，72℃延伸5min，再94℃變性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，25個循環，再72℃5min；PCR產物於1.4％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離分析，電泳結束後在UVP成像系統上自動成像，篩選出在不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB間的多態性片段，從而獲得不結球白菜胞質雄性不育基因800bp的RAPD標記片段和600bp的RAPD標記片段；其用標記引物分別為OPAX1和OPAF12；根據RAPD擴增特異序列的測序結果，利用軟體Primer Premier設計兩對SCAR引物SCAX1及SCAF12，SCAR標記的篩選是在PTC-100TM擴增儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為為20μl，其中10×Buffer2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mMdNTP1.0μl，10μM引物對2.0μl，5單位/μl Taq酶0.2μl，模板DNA20ng，5mM TM0.2μl，加ddH2O至20μl；PCR反應程序為94℃2min預變性後，接著94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環。PCR產物於1.4％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離分析，電泳結束後在UVP成像系統上自動成像，篩選出在不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB間的多態性片段，從而獲得不結球白菜胞質雄性不育基因800bp的SCAR標記片段和600bp的SCAR標記片段，其標記引物分別為SCAX1和SCAF12。
全文摘要
本發明提供了不結球白菜胞質雄性不育基因的分子標記方法，屬於分子遺傳學領域。對不結球白菜胞質雄性不育系98HA及其保持系98HB進行RAPD及SCAR分子標記的篩選，獲得不結球白菜胞質雄性不育基因的兩個標記NAU/RAPD/CMS文檔編號C12N15/11GK1936022SQ20061008616
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月6日 優先權日2006年9月6日
發明者侯喜林, 史公軍 申請人:南京農業大學