新穎的hcv非結構多肽的製作方法

2023-05-12 00:44:41

專利名稱：新穎的hcv非結構多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及在抗HCV的免疫原性化合物中使用的突變型非結構C型肝炎病毒(「HCV」)多肽、製備和使用這些多肽的方法、以及含有這些多肽的免疫原性組合物。本發明還涉及含有(a)突變型非結構HCV多肽和(b)不是非結構HCV多肽的病毒多肽的組合物和使用這些組合物的方法。
背景技術：
現已認識到，HCV是遍及全世界的慢性肝炎和肝疾病的主要病因。據估計，世界上大約有4億人感染了HCV，佔世界人口的3％以上。
C型肝炎病毒是一種小型有包膜的RNA黃病毒，它含有約10kb的正鏈RNA基因組。該基因組具有編碼3010-3011個胺基酸的蛋白質的單一的未被中斷的ORF。HCV的結構蛋白質包括一個高度免疫原性的核心蛋白質(C)和兩個有可能在活體內形成雜二聚體的包膜蛋白質(E1和E2)，以及非結構蛋白質NS2-NS5。已知該病毒的NS3區域對多蛋白在轉譯後被加工成單獨的蛋白質是重要的，NS5區域則可編碼一種RNA依賴性的RNA聚合酶。
病毒特異性T淋巴細胞與中和抗體都是已建立的病毒感染中的抗病毒免疫防禦的主要支柱。而CD8+細胞毒性T細胞則是消除病毒感染的細胞，CD4+T輔助細胞更是有效調節抗病毒免疫應答所必需的。CD4+T輔助細胞將特異性抗原識別為與自身HLA II類分子相結合的肽(病毒抗原或顆粒被專職的抗原呈遞細胞所攝取，被加工成肽，並結合於溶酶體區室中的HLA II類分子上，然後被轉移回到細胞的表面上)。幾個觀察結果支持了CD4+T細胞在消除HCV感染方面的重要作用。Tsai等人，1997 Hepatology，25449-458；Diepolder等人，1995 Lancet，3461-6-1009；Missale等人，1996 JCI，98706-714；Botarelli等人，1993；Gastro，104580-587；Diepolder等人，1997，J.Virol，716011。免疫原性肽的最小長度通常為8-11個胺基酸。但是，由於HLA II類分子的肽結合溝似乎在兩端都是開放的，所以更長的肽也可承受。因而，從HLA II類分子上洗脫下來的肽一般長15-25個胺基酸。HLA II類分子具有高度多態性，各等位基因似乎有它自己單獨的肽結合要求。因而，特定個體的HLA II類分子的所有組成部分都可確定哪些病毒肽可被呈遞給T細胞。T細胞受體對該特異性HLA-肽複合物的識別伴隨著適當的共刺激信號可引起T細胞激活、細胞因子分泌和T細胞增殖。
大量的研究證明，HLA II類分子限制性CD4+的一系列應答，可通過使用重組病毒抗原或肽刺激外周血單核細胞而被測定。Botarelli等人，(1993)Gastroenterology，104580-587；Farrari等人，(1994)Hepatology，19286-295；Minutello等人，(1993)C.J.Exp.Med.，17817-25；Hoffmann等人，(1995)Hepatology，21632-638；Iwata等人，(1995)Hepatology，221057-1064；和Tsai等人，(1995)Hepatology，21908-912。
已在慢性C型肝炎患者中檢測到多克隆多特異性CD8+T細胞的應答。此外，CD8+CTL已顯示出在解決黑猩猩急性HCV感染方面的重要作用(Cooper等人，Immunity 1999)。約50％的慢性C型肝炎患者表現出可檢測的病毒特異性CD4+T細胞應答，這種應答最常見於針對HCV核心和/或NS4的情況中，並且它在進行α-幹擾素治療期間獲得的持久性病毒清除力的患者中較為常見。
根據淋巴因子的模式，CD4+T輔助細胞已被分成TH1、TH0或TH2。TH1型的細胞因子一般是IFN-γ、淋巴毒素和白介素-2(IL-2)，據認為這些細胞因子可支持病毒特異性CD8+T細胞和自然殺傷細胞的激活過程。TH2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13對B細胞的激活和分化具有重要性，從而誘導了體液免疫應答。
在急性C型肝炎感染的過程中，對NS3以及可能對其它非結構蛋白質的強烈而持續的TH1/Th0應答與該疾病的自限進程相關。Diapolder等人，(1995)Lancet，3461006-1007的研究顯示，所有的CD4+T細胞克隆都具有TH1或TH0細胞因子的特徵，這表明這些克隆支持體內的細胞毒性免疫機制。大多數的CD4+T細胞克隆都對NS3的一條相對短的片段(即第1207-1278個胺基酸)應答，這表明NS3的這個區域對CD4+T細胞是免疫顯性。超過70％的感染了HCV的患者發展了慢性感染和肝炎，它們當中有大部分發展成肝硬化，並最終發展成肝細胞癌。目前唯一認可的治療是6到12個月的α-幹擾素治療，這種治療僅可使20％的患者達到持續性改善。迄今為止還沒有商業供應共疫苗。
因而，仍需要能促進抗HCV應答的組合物和方法。
發明概要本發明一方面涉及含有突變型C型肝炎(HCV)多肽的分離的多肽，該C型肝炎多肽至少含有NS3、NS4和NS5的一些部分。較佳的是，NS3由刪除了N末端以除去催化結構域的核酸序列編碼。該NS突變型多肽可包括NS3、NS4s、NS4b、NS5a、NS5b或它們的一些部分。例如，在各種實施例中，該突變型NS多肽含有NS3、NS4(NS4a和NS4b)和NS5(NS5a和NS5b)。在另外一些實施例中，該NS多肽由NS3和NS4(例如，NS4a和/或NS4b)或NS3和NS5(例如，NS5a和/或NS5b)組成。還可考慮使用非結構組分的全長或其片段的其它組合。
在另一較佳方面，該類多肽還含有不屬於非結構HCV多肽的病毒多肽。這種多肽較佳是C，或者是C中的抗原片段，更佳是HCV的截短的C。其它多肽較佳是E，或其抗原片段，更佳是HCV的E1或E2。這些多肽不需被天然的HCV基因組編碼，它們包括如截短的或突變型HCV多肽或從其它基因組得到的多肽，如HBV的一些多肽。因而，本發明包括含有在NS3的催化結構域中發生突變的多肽的分離的突變型非結構(「NS」)HCV多肽，該突變從功能上破壞了該催化結構域。該突變可以是如刪除或取代突變。在某些實施例中，該突變型NS多肽含有NS3、NS4和NS5。在另外一些實施例中，在此所述的各種突變型NS多肽還含有不屬於HCV的NS3、NS4或NS5的次級病毒多肽，例如，HCV核心多肽(「C」)或其片段，或者HCV包膜蛋白質(「E」)，例如E1和/或E2。在某些實施例中，C還被截短(如在第121個胺基酸)。
本發明另一方面涉及含有本文所述的任何突變型肝炎C(「HCV」)多肽的組合物，該多肽如至少含有NS3、NS4和NS5的一部分的多肽。較佳的是，NS3由N末端被刪除以破壞該催化結構域的功能(例如，將此結構域除去)的核酸序列編碼。在另一較佳實施例中，該類多肽還含有不是非結構HCV多肽的病毒多肽。這些多肽較佳是C或其抗原片段，更佳是HCV的截短的C。其它多肽較佳是E或其抗原片段，更佳是HCV的E1或E2。這些多肽不需被天然的HCV基因組編碼，它們包括如截短的或突變型HCV多肽或從其它基因組得到的多肽，如HBV的多肽。另一方面，本發明包括含有(a)本文所述的任何一種多肽和(b)藥學可接受的賦形劑(如載體和/佐劑)的組合物。
另一方面，本發明包括編碼本文所述的任何一種突變型HCV多肽的的分離純化的多肽。在某些實施例中，本發明包括含有(a)編碼任何一種突變型HCV多肽的經分離純化的多肽和(b)藥學上可接受的賦形劑的組合物。該多肽可以是如質粒中的DNA，或者它存在於質粒中。此外，本文所述的多肽可被包含在附圖和序列表所示的表達載體中。
另一方面，本發明涉及被含有編碼至少含有NS3、NS4和NS5的一部分的突變型HCV多肽的核酸序列的表達載體轉化的宿主細胞。較佳的是，這些宿主細胞的表達載體還含有至少一種編碼不屬於非結構HCV多肽的病毒多肽的核酸序列。這些多肽較佳是C或其抗原片段，更佳是HCV的截短的C。其它多肽較佳是E或其抗原片段，更佳是HCV的E1或E2。這些多肽不需被天然的HCV基因組編碼，它們包括如截短的或突變型HCV多肽或從其它基因組得到的多肽，如HBV的多肽。在另一較佳的方面，這些表達載體的核酸序列被共表達。在又一較佳方面，這些宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物的細胞。
另一方面，本發明涉及含有編碼含有NS3、NS4和NS5的突變型HCV多肽的核酸序列的表達載體。較佳的是，這些宿主細胞的表達載體還含有至少一種編碼不屬於非結構HCV多肽的病毒多肽的核酸序列。這些多肽較佳是C或其抗原片段，更佳是HCV的截短的C。其它多肽較佳是E或其抗原片段，更佳是HCV的E1或E2。重要的是，這些多肽不需被天然的HCV基因組編碼，它們包括如截短的或突變型HCV多肽或從其它基因組得到的多肽，如HBV的多肽。較佳的是，本發明涉及製備突變型HCV多肽的方法。較佳的是，該方法包括使用含有編碼至少含有NS3、NS4和NS5的一部分的突變型HCV多肽的核酸序列的表達載體轉化宿主細胞和分離所述多肽的步驟。在另一較佳方面，該HCV多肽還含有不屬於非結構HCV多肽的病毒多肽。這些多肽較佳是C或其抗原片段，更佳是HCV的截短的C。其它多肽較佳是E或其抗原片段，更佳是HCV的E1或E2。這些多肽不需被天然的HCV基因組編碼，它們包括如截短的或突變型HCV多肽或從其它基因組得到的多肽，如HBV的多肽。在另一較佳方面，這些宿主細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
另一方面，本發明涉及與含有NS3、NS4和NS5的突變型HCV多肽特異性結合的抗體和製備及使用這些抗體的方法。在一個較佳方面，該HCV多肽還含有不屬於非結構HCV多肽的病毒多肽。這些多肽較佳是C或其抗原片段，更佳是HCV的截短的C。其它多肽較佳是E或其抗原片段，更佳是HCV的E1或E2。這些多肽不需被天然的HCV基因組編碼，它們包括如截短的或突變型HCV多肽或從其它基因組得到的多肽，如HBV的多肽。在另一較佳方面，該抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
又一方面，本發明涉及一種製備突變型NS HCV多肽的方法，其中，該方法包括(a)使用本文所述的任何一種表達載體在該多肽被表達的條件下轉化宿主細胞；(b)分離出該多肽。該宿主細胞可以是如酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞或昆蟲細胞。該多肽可以在胞內表達和分離，或者可被分泌到周圍環境中並從中分離。
又一方面，本發明提供了一種引起受檢對象免疫應答的方法。通過以單劑或多劑給予本文所述的任何一種多核苷酸和/或多肽來引起該免疫應答。
本領域熟練的技術人員可根據本文公開的內容而容易地理解本發明的這些和其它實施例。
附圖的簡短描述


圖1顯示產生pCMV-NS35的克隆技術方案。
圖2顯示9621bp的載體pCMV-NS35。
圖3顯示包括NS35 ORF的核酸序列在內的pCMV-NS35(SEQ ID NO1)的核酸序列以及NS35(SEQ ID NO2)的翻譯。
圖4顯示9621bp的pCMV-delNS35。
圖5顯示包括delNS35 ORF的核酸序列在內的pCMV-NS35(SEQ ID NO3)的核酸序列以及delNS35多肽(SEQ ID NO4)的翻譯。
圖6顯示4276bp的pCMV-II。
圖7顯示pCMV-II(SEQ ID NO5)的核酸序列。
圖8顯示6300bp的pCMV-NS34A。
圖9顯示包括NS34A ORF的核酸序列在內的pCMV-NS34A(SEQ ID NO6)的核酸序列以及NS34A(SEQ ID NO7)的翻譯。
圖10顯示產生pd.ΔNS3NS5的克隆技術方案。
圖11顯示pd.ΔNS3NS5(SEQ ID NO8)的核酸序列和胺基酸序列。
圖12顯示經pd.ΔNS3NS5轉化的釀酒酵母AD3株表達的蛋白質的Westem印跡圖。
圖13顯示pd.ΔNS3NS5.pj的克隆方案。
圖14顯示pd.ΔNS3NS5.pj的核酸序列和胺基酸序列(SEQ ID NO10和11)。
圖15顯示經pd.ΔNS3NS5.pj轉化的釀酒酵母AD3株表達的蛋白質的Western印跡圖，突出表示ΔNS3NS5多肽的表達。
圖16顯示產生pd.ΔNS3NS5.pj.core121RT和pd.ΔNS3NS5.pj.core173RT的克隆技術方案。
圖17顯示pd.ΔNS3NS5.pj.core121的核酸序列和胺基酸序列(SEQ ID NO12和13)。
圖18顯示pd.ΔNS3NS5.pj.core173的核酸序列和胺基酸序列(SEQ ID NO14和15)。
圖19顯示經pd.ΔNS3NS5.pj轉化的釀酒酵母AD3株表達的蛋白質的Western印跡圖，特別展現pd.ΔNS3NS5.core121多肽和pd.ΔNS3NS5.core173多肽的表達。泳道1和7表示See Blue標準。泳道2表示對照酵母質粒。泳道3和4表示ΔNS3NS5.core121RT多肽、菌落1和2。泳道5和6顯示ΔNS3NS5.core173RT多肽、菌落3和4。
圖20顯示產生pd.ΔNS3NS5.pj.core140RT和pd.ΔNS3NS5.pj.core150RT的克隆技術方案。
圖21顯示pd.ΔNS3NS5.pj.core140的核酸序列和胺基酸序列(SEQ ID NO16和17)。
圖22顯示pd.ΔNS3NS5.pj.core150的核酸序列和胺基酸序列(SEQ ID NO18和19)。
圖23顯示經pd.ΔNS3NS5.pj轉化的釀酒酵母AD3株表達的蛋白質的Western印跡圖，特別展現pd.ΔNS3NS5.pj.core140多肽和pd.ΔNS3NS5.pj.core150多肽的表達。泳道1表示See Blue標準。泳道2和3表示ΔNS3NS5.core140RT多肽、菌落5和菌落6。泳道4和5表示pd.ΔNS3NS5.core150RT多肽、菌落7和菌落8。泳道6表示對照酵母質粒。泳道7表示ΔNS3NS5.core121RT多肽、菌落1。泳道8表示ΔNS3NS5.core173RT多肽、菌落5。
發明的詳細描述除非另有說明，否則本發明的實施將使用分子生物學、微生物學、重組DNA技術和免疫學的常規技術，這些技術都在本領域熟練技術人所掌握的知識之內。這些技術在文獻中有完整的解釋。例如參見Sambrook等人，MOLECULARCLONING；A LABORATORY MANUAL(1989)；DNA CLONING，第I和II卷(D.N.Glover等人，1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J.Gait編輯，1984)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B.D.HamesS.J.Higgins編輯，1984)；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION(B.D.HamesS.J.Higgins編輯，1984)；ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney編輯，1986)；IMMOBILIZED CELLS ANDENZYMES(IRL出版社，1986)；B.Perbal，A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULARCLONING(1984)；METHODS OF ENZYMOLOGY叢刊(Academic Press，Inc.)；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALLAN CELLS(J.H.Miller和M.P.Calos編輯，1987，Cold Springs Harbor Laboratory)，Enzymology第154卷和第155卷中的方法(分別由Wu與Grossman和Wu編輯)；Mayer和Walker編輯(1987)，IMMUNOHISTOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULARBIOLOGY(Academic Press，London)；Scopes(1987)，PROTEIN PURIFICATIONPRINCIPALS AND PRACTICE，第二版(Springer-Verlag，New York)；和HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯，1986)。
應注意的是，除非在文中另有說明，否則在本說明書和所附的權利要求書中所使用的「一個(種)」和「這個(種)」包括它們的複數形式。因而，如「一種抗原」包括兩種或多種抗原的混合物，等等。
I.定義本發明的描述將使用到下列術語，它們的定義如下所述。
術語「C型肝炎病毒」(HCV)指引起非A非B型肝炎(NANBH)的病原體。美國專利第5856437號和5350671號描述了HCV的核酸序列和推定的胺基酸序列。由HCV引起的疾病稱為C型肝炎，通常稱為NANAH。術語HCV在文中指病毒種類中引起NANBH的致病菌株、減毒株或從中獲得的缺損的幹擾粒子。
HCV是黃病毒家族中的一員。黃病毒粒子的形態學和組成是已知的，並且在Reed等人的文章〔Curr.Stud.Hematol.Blood Transfus.(1998)，621-37 〕、HEPATITISC VIRUSES IN FIELDS VIROLOGY(B.N.Fields、D.M.Kinpe、P.M.Howley編輯，第3版，1996)中有所論述。最近發現，HCV基因組的一些部分也與瘟病毒群同源。通常，從形態上看，黃病毒群含有被脂質雙分子層包圍的中心核衣殼。病毒子是球形的，直徑約為40-50nm。它們的核的直徑約為25-30nm。沿著該病毒子包膜的外表面的是具有直徑約為2nm的球突的長約5-10nm的突出物。
該HCV基因組由RNA組成。已知含有病毒的該RNA自發突變的比例相對較高。因此，該HCV類或種群中可能存在多種病毒株，這些毒株可能是有毒性或無毒性的。HCV的ORF，包括它的核心、非結構蛋白質和包膜蛋白質的翻譯廣度，可從美國專利第5856437號和第5350671號中檢索到。
術語「多肽」和「蛋白質」指胺基酸殘基的聚合物，這兩個術語並不限於所得產物的最小長度。因而，肽、寡肽、二聚體、多聚體等都包括在這個定義內。全長的蛋白質及其片段都包括在這個定義內。該術語還包括多肽在表達後的修飾，例如，糖基化、乙醯化、磷酸化等。此外，為了實現本發明的目的，「多肽」指包含對天然序列進行修飾如刪除、添加和取代(一般仍保留其性質)，只要仍維持其所需活性的蛋白質。這些修飾可以是人為的，如位點定向誘變，或者是偶發的，如產生該蛋白質的宿主的突變作用或PCR擴增過程產生的錯誤。
如上定義，HCV多肽是一種得自HCV多蛋白的多肽。該多肽一定要從HCV形成，也可通過合成或重組而產生。而且，該多肽可從任何一種HCV毒株中獲得，如從HCV的1、2、3或4各毒株獲得。已知在這些毒株中具有大量的保守的和可變的區域，通常，從這些區域得到的表位的胺基酸序列的序列同源性程度高，如當將兩條序列排列，然後使用本文所述的任何一個程序或算法測定它們的同源性時，其胺基酸序列同源性可超過30％，較佳的是超過40％。因而，例如術語「NS4」多肽指從任何一種HCV毒株得到的天然NS4、NS4類似物、突變蛋白和免疫原性片段，下文將進一步描述。
此外，術語「ΔNS35」、「delNS35」、「ΔNS3NS5」和「ΔNS3-5」在本文中指突變型多肽，它們含有NS3、NS4或NS5的至少一部分，含有NS3蛋白酶活性位點區域中的刪除或突變，以使該蛋白酶失去功能。在一個實施例中，如圖5所示，ΔNS3-5含有1242-3011個胺基酸或基本上與這些胺基酸相同的多肽。本領域普通技術人員和容易掌握如何測定該NS3蛋白酶已經失去功能。如果該蛋白酶能起作用，就可在其表達後獲得具有預期分子量的蛋白質。如實施例2和
圖15所示，進行SDS-page(4-20％)，當使用pd.ΔNS3NS5.PJ克隆#5轉化AD3株時，獲得分子量大約為194kD的蛋白質。本領域熟練的技術人員將容易地確定在發生任何給定的刪除或突變時，是否還會有具有所需分子量的蛋白質表達。
術語「類似物」和「突變蛋白」指所涉及的分子的生物學活性衍生物或它們的仍維持所需活性(如下定義的刺激細胞介導的免疫應答的能力)的片段。通常，術語「類似物」指含有相對於天然的分子，在對其進行的修飾不破壞其免疫原性活性的條件下，添加、取代(一般仍保留其性質)和/或刪除了一個或多個胺基酸的天然多肽序列和結構的化合物。術語「突變蛋白」指具有一個或多個肽模擬物的肽(「類肽」)，如國際出版物第WO 91/04282號中所述。較佳的是，該類似物或突變蛋白與天然的分子至少具有相同的免疫活性。製備多肽類似物和突變蛋白的方法在本領域中是已知的，下文將對其進行描述。
特別優選的類似物包括性狀上保守的取代，即這些取代發生在與它們的側鏈有關的一類胺基酸中。具體而言，胺基酸一般被分成四類(1)酸性——天冬氨酸和穀氨酸；(2)鹼性——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)無電荷的極性胺基酸——甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。有時將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸為芳族胺基酸。例如，有理由預測，單獨用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用穀氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇氨酸，或者使用結構上相關的胺基酸取代類似的保守的胺基酸，這樣的取代將不會過於影響生物學活性。例如，感興趣的多肽可包括達到5-10個保守的或不保守的胺基酸取代，甚或達到15-25個保守的或不保守的胺基酸取代，或者為2-25之間的整數，只要該分子的所需功能仍維持完整。本領域的熟練技術人員可結合本領域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲線圖，容易地測定感興趣的分子中可耐受改變的區域。
術語「片段」指僅由完整的全長多肽序列和結構的一部分組成的多肽。該片段可包括該天然多肽的C末端刪除和/或N末端刪除。具體的HCV蛋白質的「免疫原性片段」一般至少包括該全長分子的約5-10個連續的胺基酸殘基，較佳至少約含有該全長分子的15-25個連續的胺基酸殘基，最佳至少約含有該全長分子的20-50個或以上的連續的胺基酸殘基，這些胺基酸殘基限定了一個表位；或者含有5個到該全長序列胺基酸數目之間的任何整數的胺基酸殘基，只要所述的片段保留了免疫原性活性，其活性的測量可採用本文所述的方法進行。Chien等人，Preoc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)，8910011-10015；Chien等人，J.Gastroent.Hepatol.，(1993)，8S33-39；Chien等人，國際出版物第WO 93/00365；Chien，D.Y.，國際出版物第WO 94/01778；共同擁有並被批准的美國專利系列號為08/403590和08/444818的文獻中描述了各種HCV表位。
術語「表位」在文中指至少約有3-5個、較佳約有5到10或15個、但不超過約1000個胺基酸(或其中的任何整數)的序列；它定義了一條自身或作為更大序列的一部分而與在對其應答中產生的抗體結合的序列。該片段的長度沒有嚴格的上限，它幾乎可含有蛋白質序列的全長，或者它甚至可包括含有HCV多蛋白的兩個或多個表位的融合蛋白。用於本發明的表位並不限於具有其母體蛋白質一部分的該確切序列的多肽。實際上，病毒基因組處於不斷變動的狀態，它們含有幾種在隔離種群間具有高度的變動性的可變的結構域。因而，術語「表位」包括與天然序列相同的序列，以及該天然序列的修飾物，如刪除、添加和取代(一般仍保留其性質)。
可使用本領域周知的各種表位繪圖技術中的任何一種來鑑別包括表位在內的給定多肽的區域。例如參見Methods in Molecular Biology中的Epitope MappingProtocols，第66卷(Glenn E.Morris編輯，1996)，Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，通過如同時在固相支持物上合成大量的對應於蛋白質分子的一些部分的肽，然後在這些肽仍連接在該支持物上的情況下使它們與抗體反應，就可測定各條形表位。這些技術在本領域中是已知的，並在美國專利第4708871；Geysen等人(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813998-4002；Geysen等人(1986)，Molec.Immunol.，23709-715中有所描述。類似地，通過使用如X-射線結晶學和二維核磁共振法測定胺基酸的空間構象，從而可容易地鑑定構象表位。例如參見EpitopeMapping Protocols(同上)。使用如供計算使用的標準的抗原性曲線圖和水療法曲線圖，如從Oxford Molecular Group獲得的Omiga 1.0版軟體，也可鑑別出蛋白質的抗原區域。這個電腦程式採用Hopp/Woods方法〔Hopp等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA(1981)，783824-3828〕繪製抗原性曲線圖，使用Kyte-Doolittle技術〔Kyte等人，J.Mol.Biol.(1982)，157105-132〕繪製水療法曲線圖。
術語「構象表位」在文中指全長蛋白質的一部分，或該部分的類似物或突變蛋白，它具有編碼該全長天然蛋白質內的表位的胺基酸序列的結構特徵。天然的結構特徵包括但不限於糖基化和三維結構。較佳的是，重組產生構象表位，並使它在一種在保留其所需結構特徵的條件下(如表位沒有變性)能被抽提出來的細胞中表達。這樣的細胞包括細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。重組構象表位在HCV多蛋白中的表達和從中分離的技術在如國際出版物第WO 96/04301、WO94/01778、WO 95/33053、WO 92/08734中有所描述。
對HCV抗原(包括多肽和編碼活體內表達的多肽的多核苷酸)或組合物的「免疫學應答」是受檢對象中發展的對感興趣的組合物中存在的分子產生的體液和/或細胞免疫應答。在本發明中，「體液免疫應答」指由抗體分子介導的免疫應答，而「細胞免疫應答」是由T-淋巴細胞和/或其它白細胞介導的應答。細胞免疫的一個重要方面涉及細胞溶解T細胞(「CTL」)的抗原特異性應答。CTL對與由主要組織相容性複合體(MHC)編碼的蛋白質結合併被表達在細胞表面上的肽抗原具有特異性。CTL幫助誘導和促進細胞內微生物的破壞，或者感染了這些微生物的細胞的溶胞作用。細胞免疫的另一方面涉及輔助T細胞的抗原特異性應答。輔助T細胞起到幫助激發非特異性效應細胞抵抗在其表面上顯示與MHC分子結合的肽抗原的細胞的功能、並將這些效應細胞的活性集中於此項功能上的作用。「細胞免疫應答」還指細胞因子、趨化因子和其它由激活的T細胞和/或其它白細胞產生的分子(包括那些從CD4+和CD8+T細胞得到的因子)的產生。
引起細胞免疫應答的組合物或疫苗可通過將與MHC分子結合的抗原呈遞在細胞表面而使脊椎動物受檢對象致敏。該細胞介導的免疫應答可指導抗原在細胞表面上或附近呈遞。此外，可產生抗原特異性T淋巴細胞，以備在以後保護已經免疫的宿主。
可進行各種實驗測定特定的抗原刺激細胞介導的免疫應答的能力，如淋巴細胞增殖(淋巴細胞激活)實驗、CTL細胞毒性細胞實驗，或者通過檢測對已致敏受檢對象中的抗原特異的T-淋巴細胞來測定上述能力。這些實驗在本領域中是周知的。例如參見Erickson等人，J.Immunol.(1993)，1514189-4199；Doe等人，Eur.J.Immunol.(1994)，242369-2376以及下面的實施例。
因而，文中使用的免疫學應答可以是刺激CTL產生的應答，和/或刺激輔助T細胞的產生或激活的應答。感興趣的抗原還可引起抗體介導的免疫應答。因此，免疫學應答可包括一種或多種下述效果使B細胞產生抗體；和/或激活對存在於感興趣的組合物或疫苗中的抗原特異的抑制T細胞和/或γδT細胞。這些應答可中和傳染力、和/或介導抗體-補體、或抗原依賴性細胞毒性(ADCC)，以保護或減輕已經免疫的宿主的症狀。進行本領域中周知的標準的免疫實驗和中和實驗可測定這些應答。
「編碼序列」或「編碼」選定多肽的序列，是指當它處於適當的調節序列的控制下時，它在活體外或活體內被轉錄(對於DNA)和翻譯(對於mRNA)成多肽的一種核酸分子。該編碼序列的界限可由5＇(氨基)末端的起始密碼子和3＇(羧基)末端的翻譯終止密碼子來限定。轉錄終止序列可以位於該編碼序列的3＇端。
「核酸」分子或「多核苷酸」可包括雙鏈和單鏈序列，它包括但不限於從病毒得到的cDNA、原核細胞或真核細胞的mRNA、從病毒得到的基因組DNA序列(如病毒和逆轉錄病毒的DNA)或原核細胞DNA，特別是合成的DNA序列。該術語還包括含有DNA和RNA的任何已知鹼基類似物的序列。
「操作性連接」指各元件的排列，其中，所述成分被排成一定的形狀，以便執行它們的預定功能。因而，操作性連接於編碼序列的給定的啟動子，在存在正確的轉錄因子等時，能使該編碼序列有效表達。該啟動子不需要與該編碼序列鄰接，只要它起到指導該序列表達的功能即可。因而，例如，不參與翻譯但轉錄的序列可存在於啟動子序列和編碼序列之間，與可轉錄的內含子一樣；並且仍可認為該啟動子序列「操作性連接」於該編碼序列。
「重組子」在文中描述一種核酸分子，指其起源和處理與與其在性質上有關的多核苷酸的全部或部分無關的基因組、cDNA、病毒、半合成或合成的多核苷酸。用來描述蛋白質或多肽的「重組子」指由重組子多核苷酸的表達產生的多肽。通常，如下文的進一步描述，感興趣的基因被克隆，然後被表達在轉化的生物體中。宿主生物體在表達條件下表達該外來基因，產生蛋白質。
「控制元件」指幫助與其連接的編碼序列表達的多核苷酸。該術語包括啟動子、轉錄終止序列、上遊調節結構域、多腺苷酸化信號、不翻譯區域(包括5＇-UTR和3＇UTR)、適當時還有前導序列和增強子，這些序列共同使宿主細胞中的編碼序列轉錄和翻譯。
「啟動子」在本文中指能結合宿主細胞中的RNA聚合酶並啟動與之操作性連接的下遊(3＇方向)編碼序列的轉錄的DNA調節區域。用於本發明的啟動子包括以高於背景值的可檢測的水平啟動感興趣的基因的轉錄所需的最小數量的鹼基或元件。在該啟動子序列中有轉錄啟動位點以及負責RNA聚合酶結合的蛋白質結合結構域(共有序列)。真核細胞啟動子常常(但不總是)含有「TATA」框和「CAT」框。
控制序列在RNA聚合酶結合到啟動子序列時「指導轉錄」了細胞中的編碼序列，並將該編碼序列轉錄成mRNA，之後，該mRNA被翻譯成由該編碼序列編碼的多肽。
「表達盒」或「表達構建物」指能指導感興趣的序列或基因的表達的裝配物。該表達盒包括上述控制元件，如操作性連接於感興趣的序列或基因(以指導其轉錄)的啟動子，該表達盒還常常包括多腺苷酸化序列。在本發明的某些實施例中，在此所述的表達盒可被包含在質粒構建物中。除了該表達盒的組分外，該質粒構建物還含有一種或多種選擇性標記物、使該質粒構建物以單鏈DNA(如M13複製源)存在的信號、至少一個多克隆位點和「哺乳動物」複製源(如SV40或腺病毒複製源性)。
「轉化」在本文中指將外源多核苷酸插入宿主細胞中，而不考慮插入的方法例如，通過直接攝取、轉染、感染等的轉化。下文進一步描述具體的轉染方法。該外源多核苷酸可維持為未整合的載體，例如，游離型載體，或者可以被整合到宿主基因組中。
「宿主細胞」是已被轉化的細胞，或者能被外源DNA序列轉化的細胞。
「分離的」概念用於多肽時，指與它天然存在於其中的整個生物體是分離且分散的，或者基本上不存在相同類型的其它生物大分子的分子。「分離的」多核苷酸指全部或部分沒有通常在天然條件下與其結合的序列的核酸分子；或者指一種以其天然形式存在但與異源序列結合的序列；或者指與染色體脫離的分子。
術語「純化」在本文中指較佳存在至少75重量％、更佳至少85重量％、尤其佳至少95重量％、最佳至少98重量％的相同類型的生物大分子。
「同源性」指兩條多核苷酸或兩條多肽分子部分之間的同一性百分數。當兩條DNA或多肽在定義的長度內有至少約50％的序列同一性時稱它們「基本同源」，該序列同一性較佳至少約為75％、更佳至少約為80-85％、尤其佳至少約為90％、最佳至少約為95-98％。在本文中，基本同源也指與特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。結合ΔNS35，術語「基本同源」在本文中一般指至少有60％與ΔNS35(見圖5)編碼的多肽的整個序列相同的HCV核酸序列或胺基酸序列，其中，該同一性較佳至少為75％，更佳至少為80％，尤其佳為90％，最佳為95％以上，特別優選98％以上。這些同源的多肽包括片段，包括這些片段的突變體和等位基因變種。較佳使用MPSRCH程序(Oxford Molecular)中執行的Smith-Waterman同源性檢索算法，使用以gap open penalty(等距開放補償)＝12和gap extensionpenalty(等距延伸補償)＝1這兩個參數檢索的親緣差距(affine gap)測定兩條序列間的同一生。因而，例如，本發明包括有80％與ΔNS35編碼的多肽相同的分離物。在本發明的一些方面，本發明的多肽與ΔNS35基本同源。
通常，「同一性」指兩條多核苷酸或多肽序列上準確的核苷酸對核苷酸或者胺基酸對胺基酸對應。通過排列兩個分子的序列直接比較它們的序列信息，計算兩條排列的序列間匹配的準確數量，將其除以最短序列的長度，然後乘以100，從而可得到同一性百分數。在此分析中可輔助使用易於獲得的電腦程式，如ALIGH、Dayhoff、M.O.〔Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff編輯，5 Suppl.，3353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC〕，它適用於Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.，2482-489，1981)。可從Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，從Genetics Computer Group，Madison，WI獲得)獲得測定核苷酸序列同一性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，這些程序也依賴於Smith和Waterman算法。使用製造者建議的和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默認參數可容易地使用這些程序。例如，可使用Smith和Warerman的同源性算法的默認計分表和6個核苷酸位置的間隔懲罰(gap penalty)測定具體的核苷酸序列與參比序列的同一性百分數。
本發明建立同一性百分數的另一方法是使用版權屬於University ofEdinburgh、由John F.Collins和Shane S.Sturrok開發、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)發行的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在這套程序包中使用，其中，在計分表中使用默認參數(例如，gap open penalty＝12，gap extension penalty＝1，gap＝6)。從這批數據產生的「匹配」值反映出「序列同一性」。計算序列間的同一性百分數或相似性百分數的其它合適的程序在本領域中一般都是已知的，例如，另一種排列校正程序是BLAST，可使用默認參數。例如，可使用下述默認參數的BLASTN和BLASTPgenetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50 sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss Protein+Spupdate+PIR。在http//www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST網址上可查到這些程序的詳細描述。
或者，在各同源區域之間形成穩定的複式結構的條件下進行多核苷酸雜交，接著用單鏈特異性核酸酶消化，然後測定消化後片段的大小，從而測出同源性。在如(對具體的體系所定義的)嚴格條件下進行的Southern雜交試驗中，可鑑別基本同源的DNA序列。確定適當的雜交條件在本領域熟練技術人員所掌握的知識之內。例如，參見Sambrook等人，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic AcidHybridization，同上。
「嚴格」指有助於非常相似的序列的結合超過不同序列之間的結合的雜交反應條件。例如，應選擇溫度和鹽濃度的配組條件，使其低於所研究的雜交的計算的Tm溫度，大約為120-200℃。該溫度和鹽配組條件常常在初步實驗中憑經驗確定，在該初步實驗中，固定在過濾器上的基因組DNA雜交到感興趣的序列上，然後被在不同的嚴格條件下洗滌。參見Sambrook等人，第9.50頁。
當進行實驗時，如在Southern印跡中，要考慮的變量是(1)被印跡的DNA的複雜性和(2)探針和被檢測的序列間的同源性。所研究的片段的總量可變化10的數量級，為質粒或噬菌體消化的0.1-1μg到非常複雜的真核細胞基因組中的單拷貝基因的10-9-10-8g。對於複雜性較低的多核苷酸，可大大縮短印跡、雜交和曝露時間、較少量的起始多核苷酸和比活性較低的探針。例如，可使用僅1小時的曝露時間，用1μg的酵母DNA進行2小時的印跡，然後使所得產物與108cpm/μg的探針雜交4-8小時，從而可檢測出單拷貝的酵母基因。對於單拷貝的哺乳動物基因，保守的做法是使用10μg的DNA啟動，印跡過夜，然後在10％葡聚糖硫酸酯中用108cpm/μg以上的探針過夜雜交，之後暴露～24小時，可得出結果。
幾個因素可影響探針和感興趣的片段之間的DNA-DNA雜交物的解鏈溫度(Tm)，從而影響到適當的雜交和洗滌條件。在許多情況下，探針與片段不是100％地同源。其它常常遇到的變數包括雜交序列的長度和總的G+C含量以及離子強度和雜交緩衝液中甲醯胺含量。所有這些因素的影響可用下面的方程近似表示Tm＝81+16.6(log10Ci)+0.4[％(G+C)]-0.6(％甲醯胺)-600/n-1.5(％錯配率)式中，Ci是鹽濃度(單價離子)，n是以鹼基對計的雜交物的長度〔據Meinkoth和Wahl(1984)，Anal.Biochem.，138267-284，對其稍微作了修改〕。通常，在50％的甲醯胺存在的條件下，對於有95-100％與靶片段同源的探針，方便的雜交溫度是42℃，對於有90-95％同源性的探針，該溫度是37℃，對於有85-90％同源性的探針，該溫度是32℃。對於同源性較低的情況，在使用上述方程時須減少甲醯胺的含量，並相應地調整溫度。如果在探針和靶片段之間的同源性是未知的，那麼最簡單的方法是以不嚴格的雜交和洗滌條件開始。如果在放射自顯影后觀察到非特異性條帶或強背景，那麼可在高度嚴格的條件下洗滌該過濾器，然後再將其暴露。如果暴露所需的時間使得此方法不可行，那麼應平行測試幾組雜交和/或洗滌嚴格條件。
「核酸免疫」指將編碼一種或多種經選擇的抗原的核酸分子導入宿主細胞中，用於在活體內表達抗原。該核酸分子可被直接導入能接受的受檢對象中，如通過注射、吸入、口服、鼻內和黏膜給藥等，或者可離體導入已從宿主中取出的細胞中。在後一種情況中，將所得的轉化細胞再導入該受檢對象中，該受檢對象將產生抵抗由該核酸分子編碼的抗原的免疫應答。
「開放讀框」或ORF是編碼多肽的多核苷酸序列的一個區域，該區域可以是編碼序列的一部分，或者是整個編碼序列。
術語「抗體」在本文中指含有至少一個抗原結合位點的一條多肽或一組多肽。「抗原結合位點」是由抗體分子的可變區摺疊成而形成，形成具有內表面形狀並且電荷的分布與抗原的表位特徵互補的三維結合位點，在這個位點可發生特異性結合，形成抗體-抗原複合體。抗原結合位點可由重鏈區和/或輕鏈區(分別表示為VH和VL)形成，這些區域形成高度可變的環提供給抗原結合。術語「抗體」(無限制地)包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合型抗體、改變的抗體、單價抗體、Fab蛋白質和單結構域抗體。在許多例子中，抗體與抗原結合的現象相當於其它的配體/抗配體的結合。
如果需要多克隆抗體，可使用具有HCV表位的免疫原性多肽對經選擇的哺乳動物(如小鼠、家兔、山羊、馬等)進行免疫，然後按已知的方法收集該經免疫的動物的血清。如果該含有抗HCV表位的多克隆抗體的血清含有其它抗原的抗體，那麼通過免疫親和力層析法純化該多克隆抗體。產生和加工多克隆抗血清的技術在本領域中是已知的，例如，可參見Mayer和Walker(1987)編輯的IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY(Academic Press，London)。
本領域中的熟練技術人員也可容易地製備抗HCV表位的單克隆抗體。通過雜交瘤製備單克隆抗體的普通方法是我們所熟知的。可通過細胞融合產生生產抗體的無限增殖細胞系，也可使用其它技術如用癌基因DNA直接轉化B淋巴細胞、或者用EB病毒轉染B淋巴細胞。例如，可參見M.Schreier等人(1980)HYBRIDOMATECHNIQUES；Hammerling等人(1981)，MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS；Kennett等人(1980)，MONOCLONAL ANTIBODIES；也可參見美國專利第4341761號、第4399121號、第4427783號、第4444887號、第4466917號、第4472500號、第4491632號和第4493890號。可篩選具有各種特性的產生抗HCV表位的單克隆抗體系列，即具有同型、表位親和力等特性。在本文中「單結構域抗體」(dAb)是由HL結構域組成的抗體，它特異性地與指定的抗原結合。dAb不含有VL結構域，但可含有其它已知為抗體而存在的抗原結合結構域，如κ和λ結構域。製備dAb的方法在本領域中是已知的。例如可參見Ward等人，Nature，341544(1989)。
抗體也可由VH和VL結構域以及其它已知的抗原結合結構域組成。這些類型的抗體的例子和它們的製備方法在本領域中是已知的(例如可參見美國專利第4816467號)，它們包括以下內容。例如，「脊椎動物抗體」指成四聚體或其集合體的抗體，含有通常集結成「Y」形的輕鏈和重鏈，並且這些鏈之間可具有或不具有共價鍵連接。在脊椎動物抗體中，這些鏈的胺基酸序列與在脊椎動物中原位或體外(如雜交瘤)產生的抗體中發現的那些序列是同源的。脊椎動物抗體包括如純化的多克隆抗體和單克隆抗體，下文將描述它們的製備方法。
「雜交抗體」是其鏈分別與參比的哺乳動物的抗體鏈同源、並且代表它們的新裝配集合的抗體，從而這種四聚體或聚集體可使兩種不同的抗原沉澱。在雜交抗體中，一對重鏈和輕鏈與抗第一種抗原的抗體中的鏈是同源的，而第二對鏈則與抗第二種抗原的抗體中的鏈同源。這就產生了「二價」特性，即同時結合兩種抗原的能力。這些雜交物也可使用嵌合型鏈來形成，具體見下文所述。
「嵌合型抗體」指其重鏈和/或輕鏈是融合蛋白質的抗體。一般而言，該鏈的一部分胺基酸序列與從特定物種或特定類別中得到的抗體中的相應序列是同源的，而該鏈剩下的片段則是與從另一物種和/或類別得到的序列同源。通常，輕鏈和重鏈的可變區都可模仿從脊椎動物的一個種類中得到的可變區或抗體，而恆定區則與從脊椎動物的另一種類得到的抗體中的序列同源。但是，這個定義並不限於該特定的例子。還可包括其重鏈或輕鏈或這兩者是由模擬不同來源的抗體中的序列的序列組合物組成的任何抗體，而不論這些來源是否來自相同的種類，也不論該融合點是否在可變區/恆定區交界。因而，有可能製得恆定區與可變區都不模擬已知抗體序列的抗體。之後，也就有可能如構建其可變區對特定抗原具有較高親和力的抗體，或者其恆定區可引起增強的補體結合作用的抗體，或者對特定恆定區具有的特性進行其它一些改進的抗體。
另一例子是「改變的抗體」，它指脊椎動物抗體中天然的胺基酸序列已被改變的抗體。利用重組DNA技術，可重新設計抗體，以獲得所需的特徵。可能的改變方式很多，從改變一個或多個胺基酸到重新完全設計一個區域如恆定區。恆定區中的變化通常是為了獲得所需的細胞加工特性，如補體結合中的變化、與細胞膜相互作用和其它效應器功能。可改變可變區，以改變抗原結合特徵。也可將該抗體設計成輔助將分子或物質指定發送到特定細胞和組織位點中的抗體。可使用分子生物學中已知的技術如重組技術、位點定向突變技術等，獲得所需的改變。
另一例子是「單價抗體」，它是由連接到另一條重鏈的Fc(即莖)區域的重鏈/輕鏈二聚體組成的聚集體。這類抗體可逃避抗原的調節作用。例如可參見Glennie等人，Nature，295712(1982)。該抗體的定義還包括抗體的「Fab」片段。該「Fab」區指與含有這些重鏈和輕鏈的支鏈部分的序列大體相等或相似的重鏈和輕鏈的那些部分，這些區域已顯示出具有與特定的抗原的免疫學結合的能力，但它們缺少效應器Fc部分。「Fab」包括一條重鏈和一條輕鏈的聚集體(通常稱為Fab＇)，和含有2H和2L鏈的四聚體〔常稱為F(ab)2)，它們能選擇性地與指定的抗原或抗原家族發生反應。Fab抗體可被分成與上述那些抗體類似的亞類，即「脊椎動物Fab」、「雜交Fab」、「嵌合型Fab」和「改變的Fab」。抗體的Fab片段的製備方法在本領域中是已知的，包括如蛋白水解和使用重組技術合成。
「抗原-抗體複合體」指由對抗原上的表位特異的抗體形成的複合體。
「免疫原性多肽」指在存在或缺乏佐劑的條件下，單獨地或者連接在載體上的引起哺乳動物的細胞和/或體液免疫應答的多肽。
「抗原決定簇」指抗原或半抗原上特定抗體分子或特定細胞表面受體與其結合的位點。
「治療」在本文中指下述任一種情況(i)預防感染或再感染，如用傳統的疫苗治療；(ii)使症狀減少或消除；(iii)使相關病原體基本上消除或完全消除。治療可以是預防性的(感染之前)或治療性的(感染之後)。
「脊椎動物受檢對象」指cordata亞門的所有成員，包括但不限於人和其它靈長類動物，包括非人靈長類動物如黑猩猩和其它類人猿和猴子種類；農畜，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養動物如狗和貓；實驗動物，包括齧齒動物如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥類，包括家養的、野生的和獵鳥，如雞、火雞和其它雞類鳥、鴨、鵝等。該術語並不指出特定的年齡。因而，它包括成年的和新生的個體。由於可對這些脊椎動物的免疫系統進行類似的操作，所以本發明包括上述任何一種脊椎動物種類。
II.本發明的實施方式在詳細描述本發明之前，應理解本發明並不受到特殊製劑或處理參數的限制，當然這些都是可以改變的。還應理解文中使用的術語其目的僅是描述本發明的特殊實施例，而並無限制意圖。
雖然在實施本發明時可使用大量的與本文所述類似或相同的組合物和方法，但是本文所描述的是優選的材料和方法。
總述因為HCV是如此的趨異，並且需要體液免疫應答以及細胞免疫應答一起來抵抗這種人類的病原體，所以HCV疫苗的目標是對範圍廣泛的各種抗原產生寬幅的免疫力。雖然針對包衣糖蛋白而產生的抗體可能有助於中和病毒，但從含有其它區域的疫苗中仍得到額外的優點。針對多肽而產生的T輔助細胞應答也可能有助於設計產生細胞毒性T細胞的疫苗。非結構區域代表了這樣一種候選抗原，但由蛋白酶加工產生的幾種多肽，卻使得純化變得複雜。因此，獲得不被NS3蛋白酶加工的非結構盒將是有利的。
本發明使用涉及NS3的N末端刪除以除去該催化結構域的組合物和方法解決這些和其它問題。這樣，該非結構區域的餘下的一些或全部部分(通過NS5B)被表達成完整的多肽。已在哺乳動物細胞和酵母細胞中證明了這些種類的表達。此外，在某些方面，編碼HCV核心多肽(或其片段)的多核苷酸被加到(如操作性連接)該非結構盒的羧基末端。由於該核心編碼區域在HCV分離物中相對高度保守，所以這個區域的存在可增強免疫應答。因為核心部分在其C末端具有疏水性強的結構域(第174-191個胺基酸)，所以較短形式的核心部分也被設計在該多肽上。如文中的詳細描述，當將截短到第121個胺基酸的核心和截短到第173個胺基酸的核心經遺傳工程處理設計到突變型NS多肽的C末端上時，前者的表達要高於後者。大多數融合到C末端被截短的核心中的非結構區域合併到多肽中所形成的產物是新穎的，並具有疫苗免疫的優點。此外，因為我們的目標並不需要產生對這種多肽應答的抗體，所以不需要維持一種天然的構象，從而使得純化更容易進行。
突變型HCV非結構多肽HCV株的基因組含有大約9000-12000個核苷酸的單一的開放讀框，這個開放讀框被轉錄成多蛋白。解離該HCV多蛋白，得到至少10種不同的產物，順序是NH2-核心-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。本發明的突變型HCV多肽中的NS3的N末端被刪除，這種刪除除去了它的催化結構域或使該結構域失活。較佳的是，這些多肽還含有該非結構區域的餘下部分，雖然在某些實施例中，這些多肽可含有短於餘下的NS多肽的全部的序列，例如突變型NS多肽可含有NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b的任一種組合(如NS3NS3-NS5a-NS5b、NS3-NS4a-NS4b、NS3-NS4a-NS4b-NS5a、NS3-NS4b-NS5a-NS5b、NS3-NS4a-NS5a、NS3-NS4b-NS5a、NS3-NS4b-NS5b等)。
該HCV NS3蛋白質起到蛋白酶和解旋酶的作用，它大約出現在該多蛋白的第1027個胺基酸到第2657個胺基酸(相對於HCV-1編號)。參見Choo等人(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882451-2455。HCV NS4大約出現在該多蛋白的第1658-1972個胺基酸，NS5a大約出現在第1973-2420個胺基酸，HCV NS5b大約出現在第2421-3011個胺基酸(相對於HCV-1編號)(Choo等人，1991)。
本文所述的突變型多肽可以是全長的多肽，或者是NS3、NS4(NS4a和NS4b)、NS5a和NS5b多肽。可採用幾種方法鑑別NS3、NS4(NS4a和NS4b)、NS5a、NS5b、NS3NS4NS5a和NS3NS4NS5aNS5b的表位。例如，通過如使用針對該多肽或蛋白質的單克隆抗體進行免疫親和力純化處理，可分離出NS3、NS4、NS5a、NS5b多肽或含有上述多肽的任何組合的融合蛋白質。然後，通過蛋白水解解離該純化的蛋白質，製得包括該蛋白質整個序列的短肽系列，從而篩選出分離的蛋白質序列。從如100聚體的多肽開始，使用每一條多肽測試HCV激活的T細胞上的T細胞受體識別的表位的存在，然後從已鑑別的100聚體多肽中檢測逐漸變小和重疊的片段，用於繪製感興趣的表位的圖譜。
通過進行如51Cr釋放試驗(見實施例2)或淋巴細胞增殖試驗(見實施例4)，可鑑別出HCV激活的T細胞上的T細胞受體識別的表位。在51Cr釋放試驗中，通過將編碼感興趣表位的多核苷酸克隆到一個表達載體中，然後將此表達載體轉化到靶細胞中，從而構建具有感興趣的表位的靶細胞。非結構多肽可在該融合蛋白質中以任何順序出現。如果需要，在該融合蛋白質中可出現至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個以上的一種或多種這些多肽。HCV存在多種病毒株，並且這些病毒株中的任何一株的NS3、NS4、NS5a和NS5b多肽都可用在融合蛋白質中。
已測定了一批HCV病毒株和分離物的核酸序列和胺基酸序列，包括NS3、NS4、NS5a、NS5b基因和多肽的核酸序列和胺基酸序列。例如，Kubo等人(1989)，Japan.Nucl.Acids.Res，1710367-10372；Takeuchi等人(1990)，Gene，91287-291；Takeuchi等人(1990)，J.Gen.Virol.，713027-3033以及Takeuchi等人(1990)，Nucl.Acids Res.，184626中描述了分離物HCV J1.1。兩個獨立的分離物HCV-J和BK的完整的編碼序列分別由Kato等人〔(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879524-9528〕和Takamizawa等人〔(1991)，J.Virol.，651105-1113〕描述。
描述HCV-1分離物的出版物包括Choo等人(1990)，Brit.Med.Bull.，46423-441；Choo等人(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882451-2455和Han等人(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88171 1-1715。在Okamoto等人(1991)，JapanJ.Exp.Med.，60167-177中描述了HCV分離物HC-J1和HC-J4。Weiner等人(1991)，Virol.，180842-848中描述了HCV分離物HCT 18-、HCT 23、Th、HCT27、EC1和EC10。在Enomoto等人(1990)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1701021-1025中描述了HCV分離物Pt-1、HCV-K1和HCV-K2。在Tsukiyama-Kohara等人(1991)，Virus Genes，5243-254中描述了HCV分離物A、C、D和E。
每一條含有NS3、NS4和NS5的至少一部分的突變型HCV多肽都可從相同或不同的HCV株或分離物獲得。因而，多肽的每一個非結構區域可從相同的HCV株或分離物或從各不相同的HCV株或分離物獲得。除了本文所描述的突變型HCV非結構多肽外，這些蛋白質還可含有從該HCV多蛋白得到的其它多肽。例如，包括從該HCV多蛋白的核心區得到的多肽在內是合乎需要的。這個區域出現在該HCV多蛋白的第1-191個胺基酸(相對於HCV-1編號)。在這些融合蛋白質中可以使用該全長蛋白質或其表位，如在第10-53個胺基酸、第10-45個胺基酸、第67-88個胺基酸、第120-130個胺基酸之間發現的那些表位，或者在以下文獻中鑑別出來的任何核心表位Houghton等人，美國專利第5350671；Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)，8910011-10015；Chien等人，J.Gastroent.Hepatol.(1993)，8S33-39；Chien等人，國際出版物第WO 93/00365號；Chien，D.Y.，國際出版物第WO 94/01778；和共同擁有的美國專利第6150087號。當存在時，額外的非結構HCV多肽如核心部分可從相同的HCV株或分離物或從不同的HCV株或分離物獲得。
較佳的是上述突變型蛋白質以及這些蛋白質的單獨成分通過重組獲得。可將編碼這些蛋白質的多核苷酸導入可在合適的表達系統中表達的表達載體中。各種細菌、酵母、哺乳動物、昆蟲和植物的表達系統在本領域中都可以獲得，並且其中的任一種都可以被使用。可任意地在無細胞的翻譯系統中翻譯編碼這些蛋白質的多核苷酸。這些方法在本領域中是周知的。也可通過固相蛋白質合成來構建這些蛋白質。
如果需要，這些突變型多肽或者它們的單獨的成分也可含有其它胺基酸序列(如胺基酸連接物或信號序列)和用於蛋白質純化的配體(如穀胱甘肽-S-轉移酶和葡萄球菌A蛋白)。
多核苷酸本發明的多核苷酸在實際上並不一定要從已查明的核苷酸序列中衍生得到，而可以任何方式產生，包括如化學合成或DNA複製或反轉錄或轉錄。此外，可採用本領域已知的方法將對應於指定序列的區域的組合修改成與計劃用途一致的形式。
編碼所需多肽的DNA，不論它是否是融合的或成熟的形式，也不論它是否含有允許分泌的信號序列，都可將它連接到適合於任何常規宿主的表達載體中。目前使用真核和原核宿主系統形成重組多肽，下文給出了一些較常用的控制系統和宿主細胞。然後從溶解的細胞中或從培養基中分離出這些宿主細胞中產生的多肽，然後將它們純化至計劃用途所需的程度。
可使用本領域已知的技術進行純化，例如，示差提取(differential extraction)、鹽分級分離、離子交換樹脂層析、親和層析、離心、不溶蛋白質的鹼性再增溶等。例如，可參見描述純化蛋白質的各種方法的Methods in Enzymology。
多核苷酸含有的序列少於整個HCV基因組，它們可以是RNA或單鏈或雙鏈DNA。較佳的是，可分離出不含有其它成分(如蛋白質和脂質)的這些多核苷酸。本發明的多核苷酸也可含有其它核苷酸序列，如編碼連接物的序列、信號序列或用於蛋白質純化的配體如穀胱甘肽-S-轉移酶和葡萄球菌A蛋白。
可從得自存在於如HCV感染的個體的血漿、血清或肝勻漿中的核酸序列的基因組庫中分離編碼突變型HCV非結構多肽的多核苷酸，或者可在實驗室中合成，例如使用自動合成儀。也可使用擴增方法如PCR從HCV基因組DNA或cDNA擴增多核苷酸。
此外，雖然不是本發明的HCV的NS3、NS4或NS5的多肽也可含有基本上完整的病毒結構域，但是，在許多應用中所需要的是，該多肽應含有該病毒的抗原區域或免疫原性區域。多肽的抗原區域一般都相當小，一般為8-10個胺基酸或更少。小到5個胺基酸的片段也可表現出抗原區域的特徵。這些片段可對應於如C、E1或E2表位的區域。因此，以C、E1或E2的cDNA作為基礎，可將編碼C、E1或E2多肽的短片段的DNA重組地表達為融合蛋白質或分離的多肽。此外，使用化學合成可方便地獲得短的胺基酸序列。
本文所述的編碼多肽的多核苷酸都可含有這些多肽的編碼序列，這些編碼序列可以是天然的或非天然的人工產生的序列。使用標準的分子生物學技術可將這些多核苷酸連接，形成上述融合蛋白的編碼序列。如果需要，可將多核苷酸克隆到表達載體中，然後轉化到如細菌、酵母、昆蟲、植物或哺乳動物細胞中，這樣本發明的融合蛋白質可在這些細胞培養物中表達，並從中分離出來。
在各種重組宿主細胞包括如細菌、酵母、昆蟲、植物和脊椎動物細胞中含有這些結構域的多肽的表達，產生了可用於診斷、檢測的重要的免疫學試劑和疫苗。
用於從病毒中提取基因組、製備和探測cDNA庫、給克隆產物測序、構建表達載體、轉化細胞、進行免疫學試驗如放射免疫測定和ELISA、在培養基中培育細胞等各種常用的技術在本領域中是已知的，並且可獲得描述這些技術的實驗手冊。但是，作為一般的指南材料，下文將提供目前可得到的這些方法和用於實施它們的材料的一些來源。
當使用與指定的宿主相適配的適當的控制序列時，原核宿主細胞和真核宿主細胞來都可用來表達所需的編碼序列。在原核宿主中，最常使用的是大腸桿菌。原核生物的表達控制序列包括啟動子(可任選含有操縱基因部分)和核糖體結合位點。與原核宿主適配的轉移載體通常可從如pBR322(含有賦予氨苄青黴素和四環素抗性的操縱子)和各種pUC載體(也含有賦予抗生素抗性標記物的序列)中獲得。這些標記物可用於通過選擇而獲得的成功的轉化子。常用的原核細胞控制序列包括β-內醯胺酶(青黴素酶)和乳糖啟動子系統〔Chang等人(1977)，Nature，1981056〕、色氨酸(trp)啟動子系統〔Goeddel等人(1980)，Nucleic Acid Res.，84057〕、從trp和lac的UV5啟動子序列得到的λ衍生的P[L]啟動子和N基因核糖體結合位點〔Shikatake等人(1981)，Nature，292128〕和雜交體tac啟動子〔De Boer等人(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，292128〕。前述各系統與大腸桿菌特別適配；如果需要，也可使用其它具有相應的控制系統的原核宿主如芽胞桿菌屬(Bacillus)和假單胞桿菌屬(Pseudomonas)。
真核宿主包括培育系統中的哺乳動物和酵母細胞。可作為表達宿主的哺乳動物細胞系在本領域中是已知的，包括從American Type Culture Collection(ATCC)得到的多種無限增殖的細胞系，包括Hela細胞系、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、幼齡倉鼠腎(BHK)細胞系和其它一批細胞系。用於哺乳動物細胞的合適的啟動子在本領域中也是已知的，包括病毒啟動子，如從猿猴病毒40(SV40)〔Fiers(1978)，Nature，273113〕、Rous肉瘤病毒(RSV)、腺病毒(ADV)和牛乳頭瘤病毒(BPV)得到的啟動子。哺乳動物細胞可能還需要終止序列和poly A附加序列；提高表達的增強子序列也可包括在內，以及引起該基因的擴增的序列。這些序列在本領域中是已知的。適合用於哺乳動物細胞中的複製的載體可包括病毒複製子，或確保編碼NANBV表位的適當序列整合到宿主基因組中的序列。
也可使用痘苗病毒系統在哺乳動物細胞中表達外源DNA。為了表達異源基因，該外來DNA通常被插入該痘苗表達的胸苷激酶基因，然後挑選出感染的細胞。這個方法在本領域中是已知的，更進一步的信息可在這些文獻中獲得Mackett等人，J.Virol.，49857-864(1984)和DNA Cloning中的第2卷第7章，IRL出版社。
酵母表達系統對於本領域的普通技術人員來說也是已知的。酵母啟動子是任何能結合酵母RNA聚合酶並啟動編碼序列(如結構基因)的下遊(3＇)轉錄成mRNA的DNA序列。啟動子具有一個轉錄起始區域，該區域通常位於接近該編碼序列的5＇端的位置上。這個轉錄起始區域一般包括一個RNA聚合酶結合位點(「TATA」框)和一個轉錄起始位點。酵母啟動子還可含有另一稱為上遊激活序列(UAS)的結構域，這個結構域在存在時通常在該結構基因的遠端。這個USA可對表達進行調節(可誘導)。在缺乏USA的情況下產生組成型表達。調節性表達可以是正的或負的，從而增強或減弱轉錄。
酵母是具有活潑的代謝途徑的發酵生物，因此，編碼該代謝途徑中的酶的序列提供了特別有效的啟動子序列。例子包括醇脫氫酶(ADH)(EP-A-0284044)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、果糖磷酸激酶、3-磷酸甘油酯變位酶和丙酮酸酯激酶(PyK)(EPO-A-0329203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有效的啟動子序列〔Myanohara等人(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，801〕。
此外，不是天然產生的合成的啟動子也可具有酵母啟動子的功能。例如，一個酵母啟動子的USA序列可與另一酵母啟動子的轉錄激活區域連接，得到合成的雜交啟動子。這些雜交啟動子的例子包括連接於GAP轉錄激活區域的ADH調節序列(美國專利第4876197號和第4880734號)。雜交啟動子的其它例子還包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因中的任一調節序列與糖酵解酶基因如GAP或PyK的轉錄激活區相結合而組成的啟動子(EP-A-0164556)。此外，酵母啟動子可包括如非酵母來源的具有結合酵母RNA聚合酶並啟動轉錄的能力的天然啟動子。這種啟動子的例子包括尤其是〔Cohen等人(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，771078；Henikoff等人(1981)，Nature，283835；Hollenberg等人(1981)，Curr.Topics Microbiol.Immunol.，96119；Hollenberg等人(1979)，「細菌的抗生素抗性基因在釀酒酵母中的表達」，Plasmids of Medical，Environmental and commercialImportance(K.N.Timmis和A.Puhler編輯)；Mercerau-Puigalon等人(1980)，Gene，11163；Panthier等人(1980)，Curr.Genet.，2109〕。
DNA分子可在酵母細胞內表達。可直接使啟動子序列與該DNA分子連接，在這種情況下，該重組蛋白質的N末端的第一個胺基酸將始終由ATG起始密碼子編碼的甲硫氨酸。如果需要，可通過在活體外與溴化氰一起培育，從該蛋白質上將該N末端上的甲硫氨酸解離下來。
融合蛋白質給酵母表達系統以及哺乳動物、杆狀病毒和細菌病毒系統提供了另一種選擇。通常，編碼內源酵母蛋白質或其它穩定的蛋白質的N-末端部分的DNA序列被融合到異源編碼序列的5＇端上。在表達後，這個構建物將提供一種兩條胺基酸序列的融合蛋白。例如，酵母或人的超氧化物歧化酶(SOD)基因可連在外源基因的5＇端上，並在酵母中表達。兩條胺基酸序列的連接處的DNA序列可以編碼或不編碼一個可解離的位點。例如，可參見EP-A-0196056。另一例子是泛在蛋白融合蛋白質。這種融合蛋白質由較佳保留了加工酶(如泛在蛋白質特異性加工蛋白酶)從該外源蛋白質解離該泛在蛋白的位點的泛在蛋白區域製得。因此，通過此方法可分離出天然的外源蛋白質(如WO88/024066)。
或者，也可通過產生編碼由使外源蛋白質在酵母中分泌的前導序列片段組成的融合蛋白質的嵌合型DNA分子，從而使該外源蛋白質從細胞中分泌到生長培養基中。較佳的是，在該前導片段和該外源基因之間存在可編碼的能在體內或體外解離的加工位點。該前導序列片段通常編碼一個由疏水胺基酸組成的指導該蛋白質從細胞中分泌的信號肽。
可從分泌酵母蛋白質的基因〔如酵母轉化酶基因(EP-A-0012873；JPO第62096086號)和A因子基因(美國專利4588684號)〕得到編碼合適的信號序列的DNA。或者，存在非酵母來源的前導序列，如幹擾素前導序列，它們也可使酵母產生分泌功能(EP-A-0060057)。
較佳的分泌功能前導序列是那些可利用用酵母α-因子基因的片段的前導序列，該片段同時含有「pre」信號序列和「pro」區域。可使用的α-因子片段包括該pre-pro α-因子前導序列的全長(大約83個胺基酸殘基)以及截短的α-因子前導序列(通常約長25-50個胺基酸殘基)(美國專利4546083和4870008；EP-A-0324274)。使用可產生分泌作用的α-因子前導片段的另外的前導序列包括使用第一酵母的pre序列與來自第二酵母α-因子的pro區域製得的雜交α-因子前導序列。(如，可參見WO 89/02463)。
通常，被酵母識別的轉錄終止序列是位於翻譯終止密碼子的3＇端的調節區域，它與啟動子一起側接在編碼系列上。這些序列指導了mRNA的轉錄，而該mRNA則可被翻譯成由該DNA編碼的多肽。轉錄終止序列和酵母識別的其它終止序列的例子如那些編碼糖酵解酶的序列。
通常，上述成分，包括啟動子、前導序列(如果需要)、感興趣的編碼序列和轉錄終止序列都一起被歸入表達構建物中。表達構建物常常被維持在一個複製子中，如能穩定維持在宿主(如酵母或細菌)中的染色體外元件(如質粒)。該複製子可能具有兩套複製系統，從而使得它可以維持在如酵母中進行表達，以及在原核宿主中進行克隆和擴增。這類酵母-細菌穿梭載體的例子，包括Yep24(Botstein等人(1979)，Gene，817-24)〕、pC1/1(Brake等人(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，814642-4646〕和YRp17〔Stinchcomb等人(1982)，J.Mol.Biol.，158157〕。此外，複製子可以是高拷貝數或低拷貝數的質粒。高拷貝數質粒的拷貝數範圍一般約為5-200，通常約為10-150。宿主含有的高拷貝數質粒較佳至少約10個、更佳至少約20個。可選擇進入高拷貝數或低拷貝數的載體，這依賴於所選擇的載體和宿主中的外源蛋白質的性能。如可參見Brake等人，同上。
或者，表達構建物可與一個整合載體一起整合到酵母基因組中。整合載體一般含有至少一條與酵母染色體同源、並使它能被整合的序列，較佳含有兩條同源序列側接該表達構建物。整合過程似乎可由該載體中的同源DNA和該酵母染色體之間的重組而形成〔Orr-Weaver等人(1983)，Methods in Enzymol.，101228-245〕。通過選擇適當的同源序列作為整合載體中的內含物，使得它被引入酵母中的特定位置上。參見Orr-Weaver等人，同上。可整合一種或多種表達構建物，以可能影響所產生的重組蛋白質的水平〔Rine等人(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，806750〕。該載體中含有的染色體序列可以單一片段的形式存在於該載體中，或者以兩條與該染色體中鄰近片段同源並側接於該載體中的表達構建物的片段的形式出現，前一種情況導致了整個載體的整合，後一種情況則僅使該表達構建物形成穩定整合。
通常，染色體外的表達構建物和整合表達構建物都可含有可選擇的標記物，這樣可選擇出已被轉化的酵母株。可選擇的標記物可包括可在該酵母宿主中表達的生物合成性基因，如ADE2、HIS4、LEU2、TRPl和ALG7，以及G418抗性基因，這兩類基因分別賦予酵母細胞以衣黴素抗性和G418抗性。此外，合適的可選擇的標記物還可使酵母具有在毒性化合物(如金屬)的存在下維持生長的能力。例如，CUPl的存在使得酵母可在銅離子的存在下繼續生長〔Butt等人(1987)，Microbiol，Rev.，51351〕。
或者，可將上述一些成分一起加到轉化載體中。轉化載體一般由可選擇的標記物組成，如上述該標記物要麼維持在複製子中，要麼進入整合的載體中。
表達載體和轉化載體，不論是染色體外的複製子還是整合的載體，都已被開發而用來轉化到許多種酵母中。例如，尤其是各種表達載體已經被開發用於下述酵母中白假絲酵母(Candida albicans)〔Kurtz等人(1986)，Mol.Cell.Biol.，6142〕、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)〔Kunze等人(1985)，J.Basic Microbiol.，25141〕、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)〔Gleeson等人(1986)，J.Gen.Microbiol.，1323459；Roggenkamp等人(1986)，Mol.Gen.Genet.，202302〕、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)〔Das等人(1984)，J.Bacteriol.，1581165〕、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)〔De Louvencourt等人(1983)，J.Bacteriol.，154737；Van den Berg等人(1990)，Bio/Technology，8135〕、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguillerimondii)〔Kunze等人(1985)，J.Basic Microbiol.，25141〕、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastons)〔Cregg等人(1985)，Mol.Cell.Biol.，53376；美國專利第4837148號和第4929555號〕、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)〔Hinnen等人(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929；Ito等人(1983)，J.Bacteriol.，153163〕、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)〔Beach和Nurse(1981)，Nature，300706〕和Yarrowia lipolytica〔Davidow等人(1985)，Curr.Genet.，10380471；Gaillardin等人(1985)，Curr.Genet.，1049〕。
將外源DNA導入酵母宿主中的方法在本領域中是已知的，一般包括原生質球或經鹼性陽離子處理的完整的酵母細胞的轉化。轉化方法一般隨所要轉化的酵母種類而變。例如，可參見假絲酵母屬Kurtz等人(1986)，Mol.Cell.Biol.，6142；Kunze等人(1985)，J.Basic Microbiol.，25141；漢遜酵母屬Gleeson等人(1986)，J.Gen.Microbiol.，1323459；Roggenkamp等人(1986)，Mol.Gen.Genet.，202302；克魯維酵母屬Das等人(1984)，J.Bacteriol.，1581165；De Louvencourt等人(1983)，J.Bacteriol.，154737；Van den Berg等人(1990)，Bio/Technology，8135；畢赤酵母屬Cregg等人(1985)，Mol.Cell.Biol，53376；Kunze等人(1985)，J.Basic Microbiol.，25141；美國專利第4837148號和第4929555號；釀酒酵母屬Hinnen等人(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929；Ito等人(1983)，J.Bacteriol.，153163；Ito等人(1983)，J.Bacteriol.，153163；裂殖酵母屬Beach和Nurse(1981)，Nature，300706；YarrowiaDavidow等人(1985)，Curr.Genet.，10380471；Gaillardin等人(1985)，Curr.Genet.，1049。
細菌的表達技術在本領域中是已知的。細菌啟動子是能結合細菌RNA聚合酶並啟動編碼序列(如結構基因)的下遊(3＇)轉錄(成mRNA)的任何DNA序列。啟動子具有一個轉錄起始區，該區一般接近該編碼序列的5＇端。這個轉錄起始區一般含有RNA聚合酶結合位點和轉錄起始位點。細菌啟動子還具有另一稱為操縱子的結構域，該結構域可疊加在開始RNA合成的鄰近RNA聚合酶結合位點上。因為基因阻遏蛋白可結合該操縱子從而抑制特定基因的轉錄，所以該操縱子允許對轉錄進行負調節(可誘導的)。結構型表達可在負調節元件如操縱子缺乏的條件下發生。此外，基因激活蛋白質結合的序列可產生正調節，該序列如果存在，則一般存在於該RNA聚合酶結合序列的近端(5＇)。基因激活蛋白質的一個例子是代謝物激活蛋白質(CAP)，這種蛋白質可幫助啟動大腸桿菌(E.coli)中lac操縱子的轉錄〔Raibaud等人(1984)，Annu.Rev.Genet.，18173〕。因此，調節性表達可以是正的或負的，從而增強或減弱轉錄過程。
表達載體和轉化載體，不論是染色體外複製子還是整合的載體，都已被開發而用來轉化到許多種細菌中。例如，尤其是各種表達載體已經被開發用於下述細菌中枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)〔Palva等人(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，795582；EP-A-0036259和EP-A-0063953；WO 84/04541〕；大腸桿菌(Shimatake等人(1981)，Nature，292128；Amann等人(1985)，Gene，40183；Studier等人(1986)，J.Mol.Biol.，189113；EP-A-0036776、EP-A-0136829和EP-A-0136907〕；乳脂鏈球菌(Streptococcus cremoris)〔Powell等人(1988)，Appl.Environ.Microbiol.，54655〕；變鉛青鏈球菌(Streptococcus lividans)〔Powell等人(1988)，Appl.Environ.Microbiol.，54655〕；變鉛青鏈黴菌(Streptomyces lividans)(美國專利第4745056號)。
將外源DNA導入細菌宿主中的方法在本領域中是已知的，通常包括經CaCl2或其它試劑如二價陽離子和DMSO處理的細菌的轉化。也可採用電穿孔法將DNA導入細菌細胞中。通常，轉化方法可根據要轉化的不同的細菌種類而改變。例如，可參見Masson等人(1989)，FEMS Microbiol.Lett.，60273；Palva等人(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，795582；EP-A-0036259和EP-A-0063953；WO84/04541，芽胞桿菌屬(Bacillus)，Miller等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85856；Wang等人(1990)，J.Bacteriol.，172949；彎曲菌屬(Campylobacter)，Cohen等人(1973)，Proc.Natl.Acad.Sci.，692110；Dower等人(1988)，Nucleic Acids Res.，166127；Kushner(1978)，「用Co1E1衍生的質粒轉化大腸埃希桿菌的改進方法「，Genetic EngineeringProceedings of the International Symposium on GeneticEngineering(H.W.Boyer和S.Nicosia編輯)；Mandel等人(1970)，J.Mol.Biol.，53159；Taketo(1988)，Biochim.Biophys.Acta，949318；埃希桿菌屬(Escherichia)；Chassy等人(1987)，FEMS Microbiol.Lett.，44173；乳桿菌屬(Lactobacillus)；Fiedler等人(1988)，Anal.Biochem，17038，假單孢菌屬(Pseudomonas)；Augustin等人(1990)，FEMS Microbiol.Lett.，66203，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，Barany等人(1980)，J.Bacteriol.，144698；Harlander(1987)，「電穿孔法轉化乳鏈球菌」，Streptococcal Genetics(J.Ferretti和R.Curtiss III編輯)；Perry等人(1981)，Infect.Immun.，321295；Powell等人(1988)，Appl.Environ.Microbiol.，54655；Somkuti等人(1987)，Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology，1412，鏈球菌屬(Streptococcus)。
此外，可通過杆狀病毒系統使病毒抗原在昆蟲細胞中表達。Summer和Smith編寫的杆狀病毒實用指南是「A Manual of Methods for Baculovirus Vectors andInsect Cell Culture Procedures」(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555)。為了將異源基因結合到杆狀病毒基因組中，首先要將該基因克隆到含有一些杆狀病毒序列的轉移載體中。這種轉移載體在與野生型病毒被共轉染到昆蟲細胞中時，將與該野生型病毒重組。通常，該轉移載體將被遺傳加工，使該異源基因破壞該野生型杆狀病毒的多面體基因。這種破壞使得重組病毒的選擇易於進行，因為感染了該重組病毒的細胞在表型上與感染了野生型病毒的細胞不同。可使用經純化的重組病毒感染細胞，以使其表達該異源基因。如果信號肽連接在該異源基因框架上，就會有外源蛋白質分泌到培養基中，否則，該蛋白質將結合在該細胞的溶胞產物中。更進一步的信息可參見Smith等人，Mol.Cell.Biol.，32156-2165(1983)或Luckow和Summers，Virology，1731-39(1989)。
也可在植物細胞中進行杆狀病毒表達。許多植物細胞培養物和全植物遺傳表達系統在本領域中是已知的。植物細胞遺傳表達系統的例子包括在專利如美國專利第5693506號、第5659122號和第5608143號中所述的那些系統。Zenk〔Phytochemistry，303861-3863(1991)〕已描述了植物細胞培養物中遺傳表達的另外一些例子。除了上述文獻外，在下述文獻中還可檢索到植物蛋白信號肽的描述Vaulcombe等人，Mol.Gen.Genet.，20933-40(1987)；Chandler等人，PlantMolecular Biology，3407-418(1984)；Rogers，J.Biol.Chem.，2603731-3738(1985)；Rothstein等人，Gene，55353-356(1987)；Whittier等人，Nucleic Acids Research，152515-2535(1987)；Wirsel等人，Molecular Microbiology，33-14(1989)；Yu等人，Gene，122247-253(1992)。在R.L.Jones和J.MacMillin，「赤黴素」，Advanced Plant Physiology，Malcolm B.Wilkins編輯，1984，Pitman PublishingLimited，London，第21-52頁中描述了由植物激素、赤黴酸和由赤黴酸誘導的分泌酶調節植物基因表達的描述。描述其它代謝性調節基因的文獻有Sheen，PlantCell，21027-1038(1990)；Maas等人，EMBO J.，93447-3452(1990)；Benkel和Hickey，Proc.Natl.Acad.Sci.，841337-1339(1987)。
可從中分離出原生質體並將其培養，以得到完整的再生植物的所有植物都可使用本發明進行轉化，以便可回收含有轉基因的全植物。已知在實踐上，所有的植物後可從培養細胞或組織中再生，包括但不限於甘蔗、甜菜、棉花、水果和其它樹木、豆類和蔬菜類的所有主要物種。合適的植物包括如從草莓屬(Fragaria)、蓮屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢喜豆屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、牻牛兒屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿蔔屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、芸苔屬(Brassica)、蘿蔔屬(Raphanus)、芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、莨菪屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、矮牽牛屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬約喇納屬(Majorana)、菊苣屬(Cichoriurn)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Hererocallis、龍面花屬(Nemesia)、天竺葵屬(Pelargonium)、黍屬(Panicum)、狼尾屬(Pennisetum)、毛莨屬(Ranunculus)、千裡光屬(Senecio)、蛾蝶屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、毒麥屬(Lolium)、玉米屬(Zea)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)和曼陀羅屬(Datura)。
可採用任何方法將多核苷酸導入宿主細胞中，從而實現轉化，這些方法包括如將該多核苷酸包裝在病毒中，然後用該病毒轉導宿主細胞，使該細胞直接攝取該多核苷酸。所選用的轉化方法取決於要轉化的宿主。通過直接攝取的細菌轉化一般採用氯化鈣或氯化銣處理〔Cohen(1972)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692110；Maniatis等人(1982)，MOLECULAR CLONING；A LABORATORY MANUAL(ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。通過直接攝取的酵母轉化可採用Hinnen等人的方法進行(1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929)。通過直接攝取的哺乳動物轉化可採用Graham和Van der Eb的磷酸鈣沉澱法(1978，Virology，52546)或該方法的各種已知的改良法進行。
使用本領域已知的技術構建載體。使用合適的限制酶，在它們的製造商通常所指定的條件下進行位點特異性的DNA解離。根據Methods in Enzymology(1980，65499-560)中所得的常規方法，可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳技術分離解離得到的片段。可在混合物中存在適當的脫氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)的條件下，使用大腸桿菌聚合酶I(Klenow)使粘性末端的解離片段的末端便鈍。也可使用S1核酸酶進行處理，得到任何單鏈DNA部分的水解產物。
在標準的緩衝液和溫度條件下，使用T4 DNA連接酶和ATP進行連接；粘性末端連接需要的ATP和連接酶的量比平整末端需要的少。當將載體片段用作連接混合物的一部分時，常使用細菌鹼性磷酸酶(BAP)或牛小腸鹼性磷酸酶處理該載體片段，以除去它的5＇-磷酸酯，從而防止該載體的再連接；或者，可讓限制酶消化不需要的片段，從而防止連接。將連接混合物轉化到合適的克隆宿主中(如大腸桿菌)，然後根據如抗生素抗性選擇來成功的轉化子，然後將其篩選出來，進行正確的構建。
可如Warner(1984，DNA，3401)所述，使用寡核苷酸自動合成儀製備合成的寡核苷酸。如果需要，可在32p-ATP的存在下，採用標準的反應條件，用多核苷酸激酶處理該合成的鏈，使它們標記上32P。如Zoller(1982，Nucleic Acids Res.，106487)所述，可使用已知的技術包括如位點定向誘變修改DNA序列，包括那些從cDNA庫中分離得到的序列。
使用標準的基因傳送方法，可將本發明的表達構建物，包括所需的融合蛋白或含有這些融合蛋白的單個成分的單獨病毒構建物，用於核酸免疫處理，以激活HCV特異性T細胞。基因傳送方法在本領域中是已知的。例如可參見美國專利第5399346號、第5580859號和第5589466號。可直接將基因傳送給脊椎動物受檢對象，或者以離體方式將該基因傳送給從該受檢對象得到的細胞中，然後再將這些細胞種到該受檢對象體內。例如，這些構建物可以質粒DNA的形式傳送，如它們被包含在質粒如pBR322、pUC或Co1E1中。
此外，在將表達構建物傳送到細胞中之前，可先將這些表達構建物包裝在脂質體中。通常使用能穩定結合或捕獲並保留核酸的脂質體製得脂質包囊。濃縮的DNA和脂質製品的比例可變化，但是，一般約為1∶1(毫克DNA微摩爾脂質)，或者脂質的量多一些。關於將脂質體用作傳送核酸的載體的總述，可參見Hug和Sleight，Biochim.Biophys.Acta.(1991)，10971-17；Straubinger等人，Methods ofEnzymology(1983)，第101卷，第512-527頁。
本發明使用的脂質體製品含有陽離子(正電荷)、陰離子(負電荷)和中性製品，特別優選陽離子脂質體。陽離子脂質體易於獲得。例如，從GIBCO BRL，GrandIsland，NY〔還可參見Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)，847413-7416〕獲得商標為Lipofectin的N[1-2，3-二油醯氧基)丙基]-N，N，N-三乙基銨(DOTMA)脂質體。可從商業上得到的其它脂質體包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。可使用本領域周知的技術，由易於獲得的材料製備其它陽離子脂質體。例如，可參見Szoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)，754194-4198；描述DOTAP脂質體〔1，2-二(油醯氧基)-3-(三甲基銨基)丙烷〕的合成的PCT出版物第WO 90/11092號。可採用本領域已知的方法製備各種脂質體-核酸複合體。例如，可參見Straubinger等人，METHODS OF IMMUNOLOGY(1983)，第101卷，第512-527頁；Szoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)，754194-4198；Papahadjopoulos等人，Biochim.Biophys.Acta(1975)，394483；Wilson等人，Cell(1979)，1717；Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta(1976)，443629；Ostro等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1977)，76836；Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)，763348；Enoch和Strittmatter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)，76145；Fraley等人，J.Biol.Chem.(1980)，22510431；Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)，75145；和Schaefer-Ridder等人，Science(1982)，215166。
也可將DNA傳送到與Papahadjopoulos等人〔Biochim.Biophys.Acta(1975)，394483-491〕以及美國專利第4663161號和第4871488號中所述的類似的螺旋狀脂質組合物中。
已開發了大量的基於病毒的系統，用它們將基因轉移到哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒可給基因傳送系統提供一個適宜的平臺，如鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺瘤病毒、莫洛尼鼠類白血病毒和Rous肉瘤病毒。可使用本領域已知的技術將經選擇的基因插入載體中，然後將所得載體包裝到逆轉錄病毒粒子中。然後分離出該重組的病毒，將其在活體內或離體條件下傳送到受檢對象的細胞中。已描述了大量的逆轉錄病毒系統〔美國專利第5219740號，Miller和Rosman，Biotechniques(1989)，7980-990；Miller，A.D.，Human Gene Therapy(1990)，15-14；Scarpa等人，Virology(1991)，180849-852；Burns等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)，908033-8037；和Boris-Lawrie和Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)，3102-109。簡言之，可容易地從多種多樣的逆轉錄病毒中構建本發明的逆轉錄病毒基因傳送載體，包括如B、C和D型逆轉錄病毒以及泡沫病毒和慢病毒如FIV、HIV、HIV-1、HIV-2和SIV(見RNA Tumor Viruses，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1985)。可從保管單位或收藏單位如American TypeCulture Collection(「ATCC」，10801 University Blvd，Manassa，VA 20110-2209)容易地獲得這些逆轉錄病毒，或者可採用可獲得的普通技術，由已知的來源分離得到。
也已經描述了大量的腺病毒載體，如腺病毒2型和5型載體。與整合到宿主基因組中的逆轉錄病毒不同，腺病毒始終存在於染色體外，這樣使得它產生插入性突變的風險最小化〔Haj-Ahmad和Graham，J.Virol.(1986)，57267-274；Bett等人，J.Virol.(1993)，675911-5921；Mittereder等人，Human Gene Therapy(1994)，5717-729；Seth等人，J.Virol.(1994)，68933-940；Barr等人，Gene Therapy(1994)，151-58；Berkner，K.L.，BioTechniques(1988)，6616-629；和Rich等人，HumanGene Therapy(1993)，4461-476〕。
也可用分子共軛載體傳送基因，這類載體如Michael等人，J.Biol.Chem.(1993)，2686866-6869和Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)，896099-6103中所述的腺病毒嵌合型載體。
甲病毒屬的成員，如但不限於從新培斯病毒和澤姆利基森林病毒、VEE，也已被發現可用作傳送感興趣的基因的病毒載體。關於用於實施本發明的新培斯病毒源性載體的描述，可參見Dubensky等人，J.Virol.(1996)，70508-519；和國際出版物第WO 95/07995號和WO 96/17072號。
可使用的其它載體包括但不限於猿猴病毒40、巨細胞病毒。也可使用細菌載體，如沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)、志賀菌、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、分支桿菌BCG株和產單核細胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。也可使用微型染色體如MC和MC1、噬菌體、粘粒(插入了噬菌體λcos位點的質粒)和複製子(細胞中能在它們的控制下進行複製的遺產元件)。
也可將病毒構建物包裹、吸附到顆粒狀載體中，或者使它們與這類載體結合。這類載體將經選擇的分子的大量拷貝呈遞給免疫系統，並可促使這些分子在局部淋巴結被捕獲和滯留。這些粒子可被巨噬細胞吞噬，並可通過細胞因子的釋放而增強抗原呈遞作用。粒子狀載體的例子包括那些從聚甲基丙烯酸甲酯聚合物得到的載體，以及從聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(通稱為PLG)得到的微粒。例如，可參見Jeffery等人，Pharm.Res.(1993)，10362-368；和McGee等人，J.Microencap.(1996)。
可採用多種其它方法將表達載體傳送到細胞中。這些方法包括DEAE葡聚糖介導的轉染法、磷酸鈣沉澱法、聚賴氨酸或聚鳥氨酸介導的轉染法，或使用其它不溶性無機鹽如磷酸鍶、矽酸鋁類包括皂土和高嶺土、氧化鉻、矽酸鎂、滑石粉等進行的沉澱作用。其它有效的轉染方法包括電穿孔法；超聲波穿孔法；原生質體融合法；脂質體、類肽的傳送法或微注射法。例如，可參見Sambrook等人，同上，關於轉化感興趣的細胞技術的討論；Felgner，P.L.，AdvancedDrugDeliveryReviews(1990)，5163-187，關於用於基因轉移的傳送系統的綜述。一個使用電穿孔法傳送DNA的特別有效的方法在國際出版物第WO 00/45823中有所述及。
此外，使用粒子狀載體如金和鎢的biolistic傳送系統特別有用於傳送本發明的表達構建物。這些粒子被要傳送的構建物所包裹，然後高速度加速傳送，這樣的處理一般在減壓下使用從「基因槍」釋放的發射功率進行。關於這些技術及使用這些技術的設備的描述，可參見如美國專利第4945050號、第5036006號、第5100792號、第5179022號、第5371015號和第5478744號。
組合物本發明還提供含有上述HCV多肽或多核苷酸的組合物。這些組合物可用於診斷，例如，在診斷試劑中使用突變型多肽(或編碼這些多肽的多核苷酸)。使用多肽或多核苷酸的診斷學對於本領域的熟練技術人員來說是已知的。
此外，可由一種或多種從本文所述的多肽如ΔNS35多肽得到的免疫原性多肽製備免疫原性化合物。含有作為活性成分的免疫原性多肽的免疫原性化合物的製備，對於本領域的熟練技術人員來說是已知的。通常將這些免疫原性化合物製成可注射的液體溶液形式或懸浮液形式；也可將其製成在注射前可配製成溶液、或懸浮液的固體形式。也可將該製品乳化，或者將該蛋白質包被在脂質體中。
本發明的免疫原性組合物和診斷組合物較佳含有藥學上可接受的載體。該載體本身不可使宿主產生有害的抗體。藥學上可接受的載體對於本領域的熟練技術人員來說是已知的。這些載體包括但不限於大型代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖(如乳膠功能化的瓊脂糖凝膠(sepharose)、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠等)；聚乳酸；聚乙醇酸；胺基酸聚合物如聚穀氨酸、聚賴氨酸等；胺基酸共聚物；和滅活的病毒粒子。
本發明的組合物中還可含有藥學上可接受的鹽，如無機鹽類，包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽；以及有機酸鹽類，如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。特別有用的蛋白質基質是血清白蛋白、匙孔血藍蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、破傷風類毒素和其它本領域熟練技術人員所周知的蛋白質。本發明的組合物還可含有液體或賦形劑，如水、鹽水、甘油、葡萄糖、乙醇等的一種或任意組合，以及潤溼劑、乳化劑或pH緩衝劑之類的物質。脂質體也可用作本發明組合物的載體，這些脂質體如上所述。
如果需要，可將促進免疫原呈遞給淋巴細胞的共刺激分子(如B7-1或B7-2)或細胞因子(如GM-CSF、IL-2和IL-12)加到本發明的組合物中。視需要，還可在本發明的組合物中加入佐劑。可使用的佐劑包括但不限於(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳化製劑(有或沒有其它特異的免疫刺激製劑，如胞壁醯肽(見下文)或其它細菌細胞壁成分〕，如(a)MF59(PCT出版物第WO 90/14837)，含有5％角鯊烯(Squalene)、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(可任意含有不同量的MTP-PE)，使用微流化床如110Y型微流化床(Microfluidics，Newton，MA)製成亞微型顆粒；(b)SAF，含有10％角鯊烯、0.4％Tween 80、5％pluronic嵌段聚合物L121和thr-MDP(見下文)，將它們微流化，製成亞微粒乳化液，或者使它們經渦流處理而形成顆粒較大的乳化液；(c)RibiTM佐劑體系(BAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MY)，含有2％Squalene、0.2％Tween 80和選自單磷醯基脂A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)中的一種或多種細菌細胞壁成分，較佳是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂苷佐劑，如可使用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)，或者由它獲得的顆粒如ISCOM(免疫刺激複合體)；(4)完全福氏佐劑(Complete Freund＇s Adjuvant，CFA)和不完全福氏佐劑(Incomplete Freund＇s Adjuvant，IFA)；(5)細胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、幹擾素(如γ-幹擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細菌ADP核糖基化毒素的解毒突變體，如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌熱不穩定性毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129等，例如，可參見WO 93/13302和WO 92/19265；(7)其它起到增強該組合物的有效性的免疫刺激製劑作用的物質；(8)吸附大分子的微粒體，如待授權美國專利申請系列號第09/285855號(1999年4月2日申請)和國際專利申請系列號PCT/US99/17308(1999年7月29日申請)中所述的。較佳是alum和MF59。可通過測量針對含有HCV抗原序列的免疫原性多肽的抗體的量來確定佐劑的有效性，該抗體是由於免疫原性化合物中使用了所述多肽而產生，該化合物中也含有各種佐劑。
如上述，胞壁醯肽包括但不限於N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇氨醯基-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、-乙醯基-正胞壁醯基-L-丙氨醯基-D-異穀氨醯胺(CGP 11637，稱為nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙氨醯基-D-異穀氨醯胺基-L-丙氨酸-2-(1＇，2＇-二棕櫚醯基-sa-丙三基-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)等。
因此，可在疫苗中使用這些重組的或合成的HCV多肽，並將它們用於診斷。而且，針對這些多肽產生的抗體也可用作診斷劑，或者用於被動免疫治療。此外，可使用針對這些多肽的抗體分離和鑑別HCV粒子。
也可從HCV病毒粒子中分離出天然的HCV抗原。這些病毒粒子可在組織培養物中的HCV感染的細胞中或者感染的宿主體內生長。
給藥和輸送可採用任何合適的傳送方法向受檢對象給予本文所述的多核苷酸和多肽組合物(如免疫原性化合物)。上面已經討論了將核酸傳送到宿主細胞中的方法。此外，可通過注射，一般是皮下注射、肌肉內注射、經皮注射或皮下注射(transdermally andtranscutaneously)等經腸道外方法給予HCV多核苷酸和/或多肽。可經鼻給予或口服某些佐劑，如LTK63、LTR72或PLG製劑。其它製劑適於採用另一種給藥方法，包括栓劑。對於栓劑，傳統的粘合劑和載體可包括如聚(亞烷基)二醇或甘油三酯；可用含有0.5-10％、較佳1-2％活性成分的混合物製成這些栓劑。其它口服製劑包括通常使用的賦形劑，如藥用級的甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物可以是溶液、懸浮液、藥片、丸狀、膠囊、持續釋放的製劑或粉末的形式，含有10-95％、較佳25-70％的活性成分。
可將本發明的多肽製成中性或鹽形式的免疫原性化合物。藥用鹽包括酸加成鹽(與該肽的游離氨基形成)，包括與無機酸(如鹽酸或磷酸)或有機酸(如乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等)形成的酸加成鹽。還可由無機鹼如鈉、鉀、銨、鈣或三價鐵的氫氧化物以及有機鹼如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因鹼等得到與游離的羧基形成的鹽。
以與其劑型相應的方式給予這些免疫原性化合物，給藥量應是預防有效量和/或治療有效量。給藥量視要治療的受檢對象、該受檢對象的免疫系統合成抗體的能力以及所需的保護程度而定，一般是每劑5-250微克多肽。所給予的活性成分的準確量由醫師判斷，並且對不同患者該量不同。
可以單劑療程給予該免疫有效化合物，或者較佳以多劑療程給予。多劑療程是指將初級免疫接種過程的給藥分為1-10個分離的劑份，在隨後的需要維持和/或增強免疫反應的時間間隔中給予其它劑份，例如在1-4個月時給予第二劑份，之後，如果需要，在幾個月後可接著給予劑。給藥過程可包括一起或順次給予多核苷酸和多肽(例如，先用多核苷酸組合物引起免疫應答，然後再用多肽組合物加強)。這套給藥方式至少還要部分地根據個體的需要以及醫師的判斷而確定。
在某些實施例中，本文所述的這些多核苷酸和多肽是用來激活T細胞。除了簡化構建和修改這些實際優點外，編碼突變型NS多肽的多核苷酸的給予還導致突變型NS多肽在宿主中的合成。因而，這些免疫原以天然的翻譯後修飾、結構和構象被呈遞給宿主免疫系統。這些多核苷酸較佳經肌肉內注射到大型哺乳動物(如人)中，劑量為0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5或10mg/kg。
可將這些蛋白質和/或多核苷酸給予未受HCV感染或已受HCV感染的哺乳動物。組合物中多核苷酸或融合蛋白質的具體劑量或可受到許多因素的影響，包括但不限於給予該組合物的哺乳動物的物種、年齡和一般症狀以及給予該組合物的方式。進行常規實驗方法可容易地就可測定本發明組合物的有效量。可使用體外和體內模型測定適當的劑量。通常，給予大型哺乳動物如狒狒、黑猩猩或人的劑量為0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5或10mg/kg。如果需要，在給予這些組合物之前、之後或者一起給予共刺激分子或佐劑。
抗體和診斷針對HCV表位的抗體，包括單克隆和多克隆抗體在內，對診斷都特別有用，那些中和性抗體則可用在被動免疫治療中。尤其是，可使用單克隆抗體來產生抗獨特型抗體。
抗獨特型抗體屬於免疫球蛋白類，它們攜帶有針對需要保護的感染性因子的抗原的「內部影像」。產生抗獨特型抗體的技術在本領域中是已知的。例如，可參見Grzych(1985)，Nature，31674；MacNamara等人(1984)，Science，2261325，Uytdehaag等人(1985)，J.Immunol.，1341225。還可使用這些抗獨特型抗體治療和/或診斷NANBH，以及用它們解釋HCV抗原的免疫原性區域。
可使用例如針對病毒表位的單克隆抗體、針對一條病毒多肽的表位的單克隆抗體的組合、針對不同病毒多肽的表位的單克隆抗體、針對同一病毒抗原的多克隆抗體、針對不同病毒抗原的多克隆抗體或單克隆抗體與多克隆抗體的混合物，進行病毒抗原的免疫檢測。
免疫檢測方案可以以如競爭作用、或直接反應或夾心式試驗為基礎。這些方案還可使用如固相支持物，或者可採用免疫沉澱法進行。大多數的檢測方法涉及標記抗體或多肽的使用。這類標記物包括如螢光素、化學發光物、放射性分子或染料分子。使用探針放大信號的試驗也是已知的。這些檢測方法的例子包括使用生物素和抗生物素蛋白的檢測法和酶標記和介導的免疫檢測法，如ELISA。
可進行酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)測量抗原或抗體的濃度。這種方法依賴於酶與抗原或抗體的結合，它使用結合的酶活性作為定量標記。為了測量抗體，將已知的抗原固定到固相材料(如微平板或塑料杯)上，使其與測試血清稀釋系列培育，之後洗滌，與經酶標記的抗免疫球蛋白培育，再次洗滌。適合用於標記的酶在本領域中是已知的，例如，辣根過氧化物酶。通過加入特異性底物，然後通過比色分析測定產物的形成或底物的利用，從而可測得酶結合到該固相材料上的活性。這個酶結合活性與抗體結合的量形成直接函數關係。
為了測量抗原，將已知的具體抗體固定到固相材料上，加入含有抗原的測試材料，培育後洗滌該固相材料，然後加入第二種標記了酶的抗體。洗滌後，加入底物，通過比色分析估計酶活性，這個活性與抗原濃度有關。
HCV融合蛋白質如NS3突變體和核心融合蛋白質也可用於生產HCV特異性多克隆抗體和單克隆抗體。HCV特異性多克隆抗體和單克隆抗體與HCV抗原形成特異結合。
給予哺乳動物如小鼠、家兔、山羊或馬以該融合蛋白質可產生多克隆抗體。從經免疫的動物得到血清，通過如用硫酸銨進行沉澱處理，從該血漿中純化出抗體，接著進行層析，較佳是親和層析。生產和加工多克隆抗血清的技術在本領域中是已知的。
也可容易地生產針對存在於這些融合蛋白質中的HCV特異性表位的單克隆抗體。從接種了突變型NS3多肽或NS-核心融合蛋白質的哺乳動物如小鼠得到的正常的B細胞可與如HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞融合，產生雜交瘤。進行RIA或ELISA，然後通過克隆到半固體瓊脂中或通過有限稀釋進行分離，可鑑別出生產HCV特異性抗體的雜交瘤。進行另一輪的篩選，分離出生產HCV特異性抗體的克隆。
針對HCV表位的抗體，不論是單克隆還是多克隆，在檢測樣品(如從感染了HCV的人得到的血清樣品)中HCV或HCV抗原的存在方面都特別有用。HCV抗原的免疫檢測可能使用到一種或幾種抗體。HCV抗原的免疫檢測可使用如針對HCV表位的單克隆抗體、針對一條HCV多肽的表位的單克隆抗體的組合、針對不同HCV多肽的表位的單克隆抗體、針對同一HCV抗原的多克隆抗體、針對不同HCV抗原的多克隆抗體或單克隆抗體與多克隆抗體的混合物。免疫檢測方案可以如使用標記抗體的競爭作用、直接反應或夾心式檢測為基礎。這類標記物可以是如螢光素、化學發光物或放射性標記物。
可在免疫親和柱層析中進一步將多克隆和單克隆抗體用於分離HCV粒子或抗原。通過使抗原保持它們的免疫選擇活性的方式如吸附或共價連接將抗體連接到固相支持物上。視需要可使用間隔基團，這樣該抗體的抗原結合位點保持為可接近的狀態。然後可使用這些固定的抗體結合從生物樣品(如血液或血清)得到的HCV粒子或抗原。如通過改變pH值就可從層析柱基質中回收結合著的HCV粒子或抗原。
引起免疫應答的方法由上述多肽激活的在體內或體外表達的HCV特異性T細胞較佳識別HCV多肽如突變型NS3多肽的表位，包括突變型HCV多肽的表位。HCV特異性T細胞可以是CD8+或CD4+細胞。
HCV特異性CD8+T細胞較佳是能殺死具有與MHC I類分子形成複合物的NS3、NS4、NS5a、NS5b表位的HCV感染細胞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。HCV特異性CD8+T細胞也可以表達γ-幹擾素(IFN-γ)。可進行如51Cr釋放試驗檢測HCV特異性CD8+T細胞。51Cr釋放試驗測定HCV特異性CD8+T細胞溶解具有非結構(如突變型NS)表位的靶細胞的能力。也可採用免疫學方法檢測表達IFN-γ的HCV特異性CD8+T細胞，較佳採用經突變型NS多肽體外刺激後的IFN-γ細胞內染色的方法。
由上述多肽和這些蛋白質的單獨組分的混合物激活的在活體內或活體外表達的HCV特異性CD4+細胞，較佳識別與HCV感染細胞上的MHC II類分子結合的突變型非結構多肽的表位，包括突變型蛋白質的表位，並隨該突變型肽的刺激而增殖。
可進行淋巴細胞增殖試驗檢測HCV特異性CD4+T細胞。淋巴細胞增殖試驗測定HCV特異性CD4+T細胞因對表位的應答而增殖的能力。
可使用突變型NS(或其它與核心部分、包膜或其它病毒多肽的融合物)體外或體內激活HCV特異性T細胞。尤其可使用HCV特異性T細胞的激活來提供各種模型系統，以使對HCV的CTL應答最優化，並對HCV感染提供預防性的或治療性的措施。對於體外激活，較佳如上述藉助於質粒或病毒載體(如腺病毒載體)將蛋白質提供給T細胞。
可從感染了HCV的哺乳動物的血液、較佳從其外周淋巴器官如淋巴結、脾或胸腺中得到T細胞的多克隆種群。較佳的動物包括小鼠、黑猩猩、狒狒和人。該HCV起到擴增該哺乳動物體內激活的HCV特異性T細胞的數量的作用。然後通過體外將HCV表位肽加到這些T細胞中再刺激從該哺乳動物得到的HCV特異性T細胞。之後，尤其可使用該HCV特異性T細胞測試增殖作用(如本領域已知的淋巴細胞增殖試驗、IFN-γ的產生和體外溶解具有HCV NS表位的靶細胞的能力。
以闡述而非限制本發明的方式給出下列實施例。本領域普通的技術人員將認識到在本發明的實質和範圍內作出的改動。
實施例實施例1構建物pCMV-II產生含有人CMV啟動子、增強子、內含子A、多接頭和在刪除了pUC的骨架中的牛生長激素終止子(Life Technologies)的pCMV-II(圖7，SEQ IDNO5)。
pT7-HCV在多接頭修飾的pUC載體中產生pT7-HCV，使其在合成的T7啟動子之前含有全長HCV cDNA。pT7-HCV還含有完整的5＇UTR，以及3＇UTR的poly A型式。
pCMV.ΔNS35產生pCMV.ΔNS35(圖5，SEQ ID NO3)需要進行兩個步驟。首先，從pT7-HCV得到PCR產物，它的結構如下連接ACCATGG Kozak序列的5＇EcoRI位點；連接胺基酸#1242直至StuI位點的啟動ATG。其次，從全長基因組克隆中分離出StuI-XbaI片段。該基因組克隆由pUC載體中融合到具有3＇端poly A型式的該全長HCV cDNA的T7啟動子組成。最後，將EcoRI-StuI和StuI-XbaI片段連接到該pCMV-II表達載體中，將所得產物轉化到HB101反應潛能細胞中，然後將這些細胞接種到氨苄青黴素(100μg/ml)上。進行Miniprep分析，得到所需的克隆，然後在製造商的說明書的指導下，使用Quigen Gigaprep試劑盒進行大規模的擴增。將所得的克隆命名為pCMV.ΔNS35(圖5，SEQ ID NO3)。
pd.ΔNS3NS5如
圖10中的示意性顯示，使用從哺乳動物表達質粒pCMV.KM.ΔNS35得到的限制片段構建酵母表達質粒pd.ΔNS3NS5(SEQ ID NO8)。pCMV.KM.ΔNS35除了在病毒骨架上含有卡那黴素抗性基因外，其餘與pCMV.ΔNS35(圖5，SEQ ID NO3)相同。使用EcoRI和NheI消化pCMV.KM.ΔNS35，得到2895bp的EcoRI-NheI片段。使用HindIII與EcoRI之間的寡核苷酸(HE)將此EcoRI-NheI片段連接到pRSET HindIII-NheI亞克隆載體上。驗證序列後，用HindIII和NheI消化pRSETHindIII-NheI#6，得到2908bp的HindIII-NheI片段。
使用XbaI使pCMV.KM.ΔNS35直線化，然後將所得產物連接到從XbaI-SalI合成的寡核苷酸(XS)上。用NheI和SalI消化所得連接物，獲得2481bp NheI-SalI片段。將該片段連接到pET3a NheI-SalI亞克隆載體上。驗證序列後，用NheI和SalI消化pET3a NheI-SalI#2，得到2481bp的NheI-SalI片段。然後將BamHI-HindIIIADH2/GAPDH啟動子片段與HindIII-NheI和NheI-SalI片段連接克隆到pBS24.1BamHI-SalI酵母表達載體中。
pd.ΔNS3NS5.PJ製備pd.ΔNS3NS5.PJ(
圖13和14，SEQ ID NO10)，在該HCV編碼區域的5＇和3＇端產生「較佳的連接點」。在pd.ΔNS3NS5的5＇端，在酵母ADH2/GAPDH啟動子和多肽的ATG之間有6個額外的鹼基。在3＇端，在該多肽的終止密碼子和該酵母表達載體的α-因子終止子之間有52個不翻譯的鹼基序列。用ScaI和SphI消化pd.ΔNS3NS5#17，可產生pd.NS3NS5.PJ，獲得4963bp的ScaI-SphI片段。用SphI和SalI消化pd.NS5b3011，得到321bp的SphI-SalI片段，此片段在該多肽的3＇端有一個「較佳連接點」。使該ScaI-SphI片段和SphI-SalI片段與從HindIII-ScaI(HS)的合成寡核苷酸連接，以獲得該5＇端的「較佳連接點」，然後將所得產物連接到pSP72 HindIII-SalI亞克隆載體中。
驗證pSP72 HindIII-SalI克隆#6中的合成系列的區域。用HindIII和BlnI或者BlnI和SalI消化pSP72 HindIII-SalI克隆#6，分別得到2441bp的HindIII-BlnI片段和2895bp的BlnI-SalI片段。將該BamHI-HindIII ADH2/GAPDH啟動子與片段HindIII-BlnI和BinI-SalI片段一起連接到pBS24.1 BamHI-SalI酵母表達載體中。
pd.ΔNS3NS5.PJ.core.121RT和pd.ΔNS3NS5.PJ.core.173RT產生這兩條片段，使其編碼ΔNS3NS5多肽C末端的HCV核心第1-121個胺基酸(稱為pd.ΔNS3NS5.PJ.core.121RT，SEQ ID NO12)和該C末端的HCV核心第1-173個胺基酸(稱為pd.ΔNS3NS5.PJ.core.173RT，SEQ ID NO14)。該核心序列的第9個胺基酸由Lys突變為Arg，第11個胺基酸由Asn突變為Thr，稱之為core 121RT或core173RT。
pd.ΔNS3NS5.PJ.core.121RT和pd.ΔNS3NS5.PJ.core.173RT為了獲得pd.ΔNS3NS5.PJ.core.121RT(
圖17，SEQ ID NO12)和pd.ΔNS3NS5.PJ.core.173RT(
圖18，SEQ ID NO14)，如
圖16所示，對大腸桿菌表達質粒pSODCF2.HCVcore191RT#2進行PCR，擴增得到NotI-Sal HCVcore121RT和HCVcore173RT。將該core 121RTNot-SalI PCR產物或該core 173RT Not-SalI PCR產物與從PstI-NotI得到的合成寡核苷酸(PN)連接到pT7Blue2 PstI-SalI亞克隆載體上。確證序列後，用PstI和SalI消化pT2Blue2core121RT克隆#9和pTBlue2core173RT克隆#11，分別得到403bp和559bp的PstI-SalI片段，將它們用於進一步的克隆。
如上述，在克隆pd.ΔNS3NS5.PJ的過程中從pSP72 HindIII-SalI克隆#6中分離出一個121bp的NotI-PatI片段。將NotI-PstI和PstI-SalI片段裝配到用NotI和SalI消化pd.NS3NS5.PJ克隆#5(如上述)得到的載體中。
ΔNS3NS5和Core 140和Core 150發現HCV核心表位(第121-135個胺基酸的HCV核心)引起狒狒的CTL。由於pd.ΔNS3NS5.PJ.core.121RT正好在這個潛在重要的表位之前終止，並且它的表達要好於較長的pd.ΔNS3NS5.PJ.core.173RT構建物(實施例2)，所以製成含有這個表位的兩個中間構建物，就有可能獲得折中的表達水平。這兩個新的構建物將HCV核心第1-140個胺基酸或HCV核心第1-150個胺基酸融合到ΔNS3NS5.PJ的C末端中。
pd.ΔNS3NS5.PJ.core.140RT(圖21，SEQ ID NO16)和pd.ΔNS3NS5.PJ.core.150RT(圖22，SEQ ID NO18)如圖20所示，對pd.ΔNS3NS5.PJ.core.173RT克隆#6進行PCR，從中擴增得到PstI-SalI HCVcore140RT片段和PstI-SalIHCVcore150RT片段。將任一HCV核心PstI-SalI PCR產物連接到pT7Blue2 PstI-SalI亞克隆載體中。確證序列後，用PstI-SalI消化pT7Blue2core140RT克隆#22和pT7Blue2core150RT克隆#26，分別得到460bp和490bp的PstI-SalI片段，將所得片段用於進一步的克隆。
如上述，在克隆pd.ΔNS3NS5.PJ的過程中從pSP72 HindIII-SalI克隆#6中分離出一個121bp的NotI-PstI片段。將NotI-PstI和PstI-SalI片段裝配到用NotI和SalI消化pd.NS3NS5.PJ克隆#5(如上述)得到的載體中。實施例2蛋白質表達本文上述各種編碼HCV-1ΔNS3和NS5抗原(第1242-3011個胺基酸)的構建物都可在酵母中表達。用pd.ΔNS3NS5轉化釀酒酵母AD3株，然後檢測其表達。在預期的194kD的分子量位置上沒有觀察到被染色蛋白質的條帶(
圖12)。還用pd.ΔNS3NS5.PJ克隆#5轉化AD3株，然後檢測其表達。檢測到所期望的194kD分子量位置上的蛋白質條帶(
圖15)。
用pd.ΔNS3NS5.PJ.core121RT克隆#6和pd.ΔNS3NS5.PJ.core173RT克隆#15轉化AD3株，然後檢測它們的表達。分別在期望的分子量206kD和210kD處觀察到蛋白質條帶。pd.ΔNS3NS5.PJ.core173RT構建物的表達水平比pd.ΔNS3NS5.PJ.core121RT構建物的低得多(見
圖19)。因此，蛋白質表達水平和HCV核心長度之間有聯繫。
用pd.ΔNS3NS5.PJ.core140RT克隆#29和pd.ΔNS3NS5.PJ.core150RT克隆#35轉化AD3株，然後檢測其表達。通過染色，在期望的分子量為208kD和209kD處觀察到條帶，這個水平與pd.ΔNS3NS5.PJ.core173RT的接近(圖23)。實施例3免疫應答的引起A.免疫接種為了評價這些突變型NS多肽的免疫原性，使用豚鼠、家兔、小鼠、獼猴和/或狒狒進行研究。如下進行該研究單獨用DNA免疫接種(一次或多次)；DNA免疫接種後接著用蛋白質免疫接種(增強)；DNA免疫接種後接著用蛋白質免疫接種；用PLG粒子接種。經肌肉內或經黏膜接種。
B.體液免疫應答在免疫接種後的不同時間進行抗NS抗體ELISA(酶聯免疫吸附檢測)，檢測經免疫的動物的血清樣品中的體液免疫應答。簡言之，在從經免疫的動物的血清中篩選出針對NS或突變型NS蛋白質的抗體。將所選擇的HCV蛋白質塗布在ELISA微滴定板的孔中，使其過夜，然後洗滌4次；接著，使用PBS-0.2％Tween(Sigma)進行阻斷。棄去阻斷溶液後，加入稀釋的小鼠血清。以各種稀釋液測試血清。洗滌該微滴定板後，用第二種偶聯了過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體(Pierce，Rockford，IL)進行培育。再洗滌該ELISA板，然後在每個孔中加入3，3＇，5，5＇-四甲基聯苯胺(TMB，Pierce)。測量各孔的光密度。一般以產生半量最大光密度(O.D.)的血清稀釋度的倒數記錄滴度。同樣，可採用本領域已知的方法測量