營養不良性疾病的高效全身治療的製作方法

2023-12-12 19:24:58

發明背景

杜氏肌營養不良症(DMD)是最常見的漸進性肌肉退行性疾病，影響大約每3500至5000出生男性中的一個。DMD是由位於X染色體上編碼肌營養不良蛋白的基因缺失或突變引起的。肌營養不良蛋白是肌營養不良蛋白-糖蛋白複合物的裝配所必需的，並為肌纖維的細胞骨架和細胞外基質之間提供機械和功能性連接。功能性肌營養不良蛋白的缺乏引起纖維變性、炎症、壞死和肌肉被疤痕和脂肪組織替代，導致進行性肌無力和在生命的第二和第四個十年由於呼吸和心臟衰竭導致的過早死亡(Moser,H.,Hum Genet,1984.66(1):第17-40頁)。

所謂Becker型肌營養不良(BMD)疾病的一個溫和形式與DMD的區別在於延遲發作，後來就是依賴於輪椅上的支持，以及較長的壽命跨度。BMD是由保持閱讀框和該基因的最關鍵的部分突變造成的，導致截短的但仍有功能的肌營養不良蛋白(Muntoni F等,Lancet Neurol,2003)。

目前沒有可用於DMD(Rodino-Klapac,L.R.等,Curr Neurol Neurosci Rep,2013.13(3):p.332)或BMD的治癒或有效治療方法。常規療法僅限於支持治療，部分地減輕症狀和體徵，但不直接靶向疾病機制也不反轉表型。

當前正在開發用於DMD的多種治療策略，包括體內基因治療、細胞移植治療、藥物救援DMD無義突變和外顯子跳躍策略以修復DNA基因閱讀框。所有這些策略都有需要克服的問題，包括靶向不同的肌肉群、遞送的優化，轉基因的長期表達和潛在的免疫應答(Jamin等,Expert Opin Biol Ther,2014)。

肌營養不良蛋白基因是人類基因組中最大的已知基因，並且由於太大以至於不能容納在已知的基因治療載體系統內。因此，就今天而言，實質有2種用病毒載體的DMD基因治療策略：i)反義寡核苷酸的組成性表達以促進外顯子跳躍，這僅適合於某些突變，以及ii)編碼功能性、縮小尺寸的肌營養不良蛋白(「微肌營養不良蛋白」，也稱為」小型營養蛋白」)的cDNA的組成型表達。

這兩種策略，使用小型反義序列或使用微肌營養不良蛋白的，解決在DMD基因治療中使用AAV載體的主要障礙，即他們的包裝能力。AAV載體可容納約4.7kb，而野生型肌營養不良蛋白的cDNA的大小約為14kb。為了克服這個問題，許多研究已經開發了部分缺失，但高度功能性的肌營養不良蛋白基因，其可以成功包裝於AAV載體內，並顯示出改善，儘管不能完全正常化動物模型中的肌營養不良表型。

mdx小鼠模型通常用於測試編碼微肌營養不良蛋白新構建體。然而，這種模型也有缺點，因為mdx小鼠顯示所述疾病的一個較不嚴重的形式，沒有免疫反應。其它動物模型是GRMD狗，這被認為更可靠的預測基因治療產物在人體中的治療潛力(Kornegay等.,Mamm Genome,2012)。

在所有提出的微肌營養不良蛋白的序列中，Foster H.等(Mol Ther,2008.16(11):p.1825-32)在小鼠中，在重組AAV載體(rAAV2/8)中，在肌肉特異性啟動子(Spc5-12)的控制下，比較了微小肌營養不良蛋白(microdystrophin)基因的兩種不同配置ΔAB/R3-R18/ΔCT和ΔR4-R23/ΔCT。據報導，微小肌營養不良蛋白(microdystrophin)的密碼子人類優化改善了在mdx小鼠模型中的基因轉移和肌肉功能。靜脈注射3.1011vg總rAAV/8允許高效心臟基因轉移和在骨骼肌和隔膜內顯著地肌營養不良蛋白的表達。

關於CXMDj狗，Ohshima S.等(Mol Ther,2009.17(1):第73-80頁)報導了通過肢體灌注，即在壓力下靜脈內注射，將在CMV啟動子控制下的編碼M3微小肌營養不良蛋白(microdystrophin)的rAAV8施用到狗。

Zhang Y.等(Hum Mol Genet,2013.22(18):第3720-29頁)研究了在DMD小鼠中的全身(5.1012vg總)雙重AAV9基因治療。通過同源重組，通過尾靜脈注入的雙重AAV載體重構含有肌營養不良蛋白重複R16和R17的nNOS結合微小肌營養不良蛋白。

同樣地，Odom G.等(Mol Ther,2011.19(1):第36-45頁)論證了在小鼠中，重構編碼ΔH2-R19微小肌營養不良蛋白的表達盒，隨後血管內共遞送兩種共享一個中央同源重組的區域的rAAV6載體(2.1012vg總)。

Wang B.等(J Orthop Res.2009；27(4):第421-6頁)在新生小鼠(dKO和mdx)中腹膜內(i.p.)注射3.1011vg總rAAV1載體。這些AAV載體編碼微小肌營養不良蛋白(microdystrophin)Δ3990，其置於MCK或CMV啟動子控制之下。

Koppanati等(Gene therapy.2010；17(11):第1355-62頁)報導了在mdx小鼠子宮內基因轉移，通過腹膜內注射(i.p.)6.4.1011vg總rAAV8載體，其編碼置於CMV啟動子控制之下的犬微小肌營養不良蛋白。

Schinkel等(Human Gene therapy.2012；23(6):第566-75頁)報導了在mdx小鼠中心臟基因治療，通過靜脈內(IV)注射1012vg總rAAV9載體，其編碼置於CMV啟動子或心臟特異性MLC0.26啟動子控制下的微小肌營養不良蛋白。

Gregorevic等(Mol.Therapy 2008；16(4):第657-64頁)報導了在mdx小鼠中肌肉基因治療，通過靜脈內(IV)注射1013vg總rAAV6載體，其編碼置於CMV啟動子控制下的ΔR4-R23/ΔCT微小肌營養不良蛋白。

Shin等(Gene Therapy 2011；18(9):第910-19頁)報導了在mdx小鼠中心臟基因治療，通過靜脈內(IV)注射3.1012vg總rAAV9載體，其編碼置於CMV啟動子控制下的hΔCS2微小肌營養不良蛋白。

Shin等(J.of Gene Medicine 2008；10(4):第449頁)在小鼠中比較了通過皮下注射或靜脈內注射對於編碼置於CMV啟動子控制下的ΔCS2微小肌營養不良蛋白rAAV8的遞送效率。

Colgan等(Mol.Therapy 2014；22(S1):第S197頁)報導了在dKO小鼠中，微小肌營養不良蛋白和卵泡抑素(follistatin)通過靜脈注射rAAV6載體的組合基因遞送。

在DMD的情況下，有價值的治療的解決方案是具有以下特徵的基因治療產品：

-可以合理的劑量(即，在靶組織中適當的基因轉移)並可能通過獨特的注射全身施用的產品；

-在所述劑量下具有可接受的毒性，並且特別是不會誘導針對肌營養不良蛋白的不良免疫應答的產品；

-具有滿意的向性，即在骨骼肌、而且還包括隔膜和心肌的大區域內具有廣泛的基因轉移的產品；

-能夠改善人類的營養不良疾病的產品。

在實踐中，以前的報導表明，這是一個非常具有挑戰性的任務，並且和若干嘗試已經失敗：

使用CMV啟動子下編碼人類特異性，但不是密碼子優化的微小肌營養不良蛋白(AR4-R23/ACT)的AAV2/6載體的研究導致注射的CXMDj狗肌肉纖維的有限表達，並且在停止免疫抑制後6周，初始肌內注射後22周通過免疫系統被最終破壞(Wang,Z.等,Mol Ther,2007.15:第1160-66頁)。

基於CMV啟動子下編碼人類特異性，但不是密碼子優化的微小肌營養不良蛋白(ΔR3-R21/ΔCT)的肌肉內注射臨床試驗導致非常有限的轉基因表達和不適當的免疫應答(Mendell,JR等,N Engl J Med,2010.363(15):第1429-37頁；Bowles,DE.等,Mol Ther,2012.20(2):第443-55頁)。

因此，在生存期、總體臨床評分、消化系統、心臟和/或呼吸功能方面，本領域需要人類營養不良疾病的有效治療方法。

發明簡述

本發明的目的在於通過表達較短但功能性的稱為微小肌營養不良蛋白的肌營養不良蛋白多肽來減輕或治癒破壞性杜氏肌營養不良症(DMD)。

本發明首次提供一種有前途的基因治療產品，在AAV8衣殼中殼體化的序列優化的微小肌營養不良蛋白，用於治療營養不良性疾病。單次劑量的全身性靜脈內給藥後，不僅是在多個肌肉中高度表達微小肌營養不良蛋白，而且導致肌肉病理的改善和改善的臨床結果測量。

事實上，在狗的模型獲得這麼好的效果，在以下方面：肌肉、消化系統、呼吸系統和心臟搶救、在良好的條件下與延長的壽命相關，關於這種病理目前從未報導。

定義

冠詞「一」和「一個」在本文中用於指一個或多於一個(即，至少一個)所述冠詞的語法對象。通過舉例的方式，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。

「關於」或「近似」在本文中用於涉及可測量值，例如數量、時間期限等時，是指包括從指定的值變化±20％或±10％，更優選的±5％，甚至更優選的±1％，並且還更優選的±0.1％，因為這些變化適於執行所公開的方法。

範圍：貫穿本發明，本發明的各個方面可以以範圍形式呈現。應當理解的是，範圍形式的描述僅僅是為了方便和簡潔，不應該被解釋為對本發明的範圍的硬性限制。因此，範圍的描述應當被認為具有該範圍內具體公開的所有可能的子範圍以及單獨的數值。例如，範圍的描述，例如從1到6應被認為具有具體公開的子範圍如從1到3，從1到4，從1到5，從2到4，從2到6，從3到6等，以及在該範圍內的單獨的數值，例如，1，2，2.7，3，4，5，5.3和6。這適用而不考慮範圍的寬度。

「分離的」是指改變或從自然狀態中移除。例如，核酸或肽天然存在於活的動物內不是「分離的」，但同樣的核酸或肽部分或完全分離自其天然狀態的共存材料是「分離的」。分離的核酸或蛋白質可以以基本上純化的形式存在，或者可以在非天然環境，例如宿主細胞中存在。

在本發明的上下文中，使用通常存在的核酸鹼基的下述縮寫。「A」是指腺苷，「C」是指胞嘧啶，「G」是指鳥苷，「T」是指胸苷，和「U」是指尿苷。

除非另有說明，「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括互為簡併形式並編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白或RNA或cDNA的短語核苷酸序列也可包括內含子，其包括程度為編碼所述蛋白的核苷酸序列可以在一些版本含有一個(多個)內含子。

「編碼」指的是在多核苷酸，如基因、cDNA或mRNA的核苷酸的特定序列的固有的屬性，以作為在生物過程中合成具有限定的核苷酸序列(即rRNA,tRNA和mRNA)或者限定的胺基酸序列、並由此產生的生物學特性的其它聚合物或大分子的模板。因此，基因編碼蛋白質，如果對應於該基因的mRNA的轉錄和翻譯在細胞內或其他生物系統中產生蛋白的話。編碼鏈(其核苷酸序列與mRNA序列相同且通常在序列表中提供)，和用作基因或cDNA轉錄模板的非編碼鏈都可稱為編碼該蛋白或基因或cDNA的其它產品。

如本文所用的術語「多核苷酸」被定義為核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，核酸和本文所用的多核苷酸是可互換的。本領域技術人員具有核酸是多核苷酸，其可水解成單體「核苷酸」的一般知識。單體核苷酸可以水解成核苷。本文所用的多核苷酸包括，但不限於，通過本領域任何可用的手段獲得的所有核酸序列，包括，但不限於，重組方法，即，使用普通的克隆技術和PCR等，以及通過合成方法，從重組文庫或細胞基因組中克隆核酸序列。

如本文所用，術語「肽」，「多肽」和「蛋白質」可互換使用，並且是指由通過肽鍵共價連接的胺基酸殘基組成的化合物。蛋白質或肽必須包含至少兩個胺基酸，並且對於可以組成蛋白質或肽的序列的胺基酸的最大數量沒有限制。多肽包括包含兩個或多個胺基酸通過肽鍵彼此連接的任何肽或蛋白。如本文所用，該術語指短鏈，這在本領域也通常指肽，例如寡肽和寡聚體，和長鏈，其通常在本領域中是指為蛋白質，其中有許多類型。「多肽」包括，例如，生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，二聚體，異二聚體，多肽的變體，修飾的多肽，衍生物，類似物，融合蛋白，等等。所述多肽包括天然的肽，重組肽，合成肽，或其組合。

「相同」是指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列相同性。當兩個進行比較的序列中的位置由相同鹼基或胺基酸單體亞單位佔據，例如在每兩個DNA分子的一個位置由腺嘌呤佔據，則分子在該位置同源或相同。兩個序列之間的同源性/相同性的百分比是兩個序列共享匹配位置的數目除以位置數相比×100的函數。例如，如果兩個序列中10個位置中的6個匹配，則兩個序列60％相同。通常，當兩個序列進行比對時進行對比以得到最大同源性/相同性。

「載體」是物質的組合物，其包含分離的核酸和可用於將所述分離的核酸遞送到細胞內部的物質。許多載體是本領域公知的，包括但不限於，線性多核苷酸，與離子的或兩親性化合物相關的多核苷酸，質粒，和病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質粒或病毒。該術語也應被理解為包括促進核酸轉移到細胞中的非質粒和非病毒化合物，如，例如，聚賴氨酸化合物，脂質體，和類似物。病毒載體的實例包括，但不限於，腺病毒載體，腺相關病毒載體，逆轉錄病毒載體，和類似物。

「表達載體」指包含重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連接於待表達核苷酸序列的控制序列。表達載體包含足夠的用於表達的順式作用元件；用於表達的其它元件可由宿主細胞或在體外表達系統中提供。表達載體包括所有本領域中已知的那些，如粘粒，質粒(例如，裸的或包含在脂質體中的)和病毒(例如，慢病毒，逆轉錄病毒，腺病毒，和腺相關病毒)，其納入所述重組多核苷酸。

如本文所用，術語「啟動子」定義為細胞的合成機制或引進的合成機制識別，啟動多核苷酸序列的特異性轉錄所需要的DNA序列。

如本文所用，術語「啟動子/調控序列」是指一核酸序列，這是可操作地連接至啟動子/調控序列的基因產物的表達所需要的。在一些情況下，該序列可以是核心啟動子序列和在其他情況下，該序列還可包括增強子序列和其他調控元件，它們所述基因產物的表達必需的。所述啟動子/調控序列可以是，例如，是這樣一種，其以組織特異性方式表達所述基因產物。

「組成型」啟動子是一核苷酸序列，當它可操作地連接於編碼或指定基因產物的多核苷酸時，導致所述基因產物在細胞的大多數或所有生理條件下在細胞中產生。

「誘導型」啟動子是一核苷酸序列，當它可操作地連接於編碼或指定基因產物的多核苷酸時，導致所述基因產物基本上只在所述細胞中存在對應於所述啟動子的誘導物時在細胞中產生。

「組織特異性」啟動子是一核苷酸序列，當它可操作地連接於編碼或指定基因的多核苷酸時，導致所述基因產物優先在如果所述細胞是對應於所述啟動子的組織類型的細胞時在細胞中產生。

術語「不正常」，當在生物體，組織，細胞或其組分的上下文中使用時，是指那些生物體，組織，細胞或其組分，其在至少一種可觀察或可檢測的特徵方面(例如，年齡，治療，時間等)不同於那些顯示「正常」(預期)相應特性的生物體，組織，細胞或其組分。對於一種細胞或組織類型，正常或預期的特徵對於不同的細胞或組織類型可能是異常的。

術語「患者」，「受試者」，「個體」等在本文中可互換使用，並且指可適用於本文所述方法的任何動物或其細胞，無論是體外還是原位。在某些非限制性實施方案中，患者，受試者或個體是人。

「疾病」是動物的健康狀態，其中動物不能維持體內平衡，並且其中如果所述疾病沒有改善，則動物的健康繼續惡化。相比之下，動物中的「病症」是健康狀態，其中所述動物能夠維持體內平衡，但是其中動物的健康狀況比不存在所述病症時更差。未經治療，病症不一定引起動物健康狀態的進一步降低。

如果疾病或病症的症狀的嚴重程度，患者經歷的這種症狀的頻率，或兩者都減輕，則疾病或病症被「減輕」或「改善」。這還包括阻止所述疾病或病症的進展。如果疾病或病症的症狀的嚴重程度，患者經歷這種症狀的頻率，或兩者都消除，則疾病或病症被「治癒」。

「治療性」治療是對表現出病理學體徵的受試者施用的治療，目的是減少或消除這些體徵。

如本文所用，「治療疾病或病症」是指降低受試者經歷的疾病或病症的至少一種體徵或症狀的頻率或嚴重程度。疾病和病症在本文中在治療的上下文中可互換使用。

化合物的「有效量」是足以對施用該化合物的受試者提供有益效果的化合物的量。本文所用的短語「治療有效量」是指足以或有效預防或治療(延遲或防止發作，阻止其進展，抑制，減少或逆轉)疾病或病症的量，包括減輕這些疾病的症狀。遞送載體的「有效量」是足以有效結合或遞送化合物的量。

具體實施方式/發明詳述

在一個實施方案中，本發明涉及包含用於治療受試者的營養不良性疾病的基因治療產品的組合物，其中：

-所述基因治療產物包含編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列；

-所述組合物全身施用。

換言之，本發明提供了用於治療受試者的營養不良性疾病的方法，包括向受試者全身施用包含編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列的組合物。

在一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的營養不良性疾病的方法，包括向受試者全身施用包含編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列的基因治療產品。本發明涉及包含編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列的基因治療產品用於製備為治療營養不良性疾病的藥物的用途，其中所述藥物是全身性施用的。

根據第一方面，本發明涉及用於治療受試者的營養不良性疾病的基因治療產品。

通常，基因治療產品由2種組分製成：

-殼體化的重組核酸序列，其限定一旦在靶細胞/組織中表達就提供治療益處的表達盒；和

-病毒衣殼，其允許適當的基因轉移和一定程度的組織嗜性。

根據一個方面，所述基因治療產品包含編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列。

在本發明的框架中，微肌營養不良蛋白是指比天然或野生型肌營養不良蛋白更短的肽或蛋白質。在本發明的上下文中，術語「微肌營養不良蛋白」和「小型肌營養不良蛋白」具有相同的含義。在本申請的其餘部分中，將使用術語「微肌營養不良蛋白」，以及縮寫「MD」或「μDys」。

「功能性」微肌營養不良蛋白是指相應的肽或蛋白質能夠執行野生型肌營養不良蛋白的至少一些功能，並且能夠至少部分減輕與缺少天然肌營養不良蛋白相關的一種或多種症狀，特別是纖維變性，炎症，壞死，肌肉被瘢痕和脂肪組織替代，肌肉無力，消化系統，呼吸系統和心臟衰竭，以及過早死亡。

肌營養不良蛋白的結構已被充分證明(參見圖1)，並且已經公開了其活性片段(Athanasopoulos等,Gene Ther 2004 Suppl 1:S109-21)。如本領域所理解的，活性片段是全長序列的一部分或多個部分，其保留全長序列的生物學功能。

全長肌營養不良蛋白的特徵在於不同的結構域：

-結合肌動蛋白的N-末端結構域；

-4個鉸鏈結構域(H1至H4)；

-24個血小板樣重複或棒結構域(1至24)；

-富含半胱氨酸的結構域；

-C末端結構域。

根據一個實施方案，微肌營養不良蛋白具有至少一個缺失的結構域，有利地至少一個血小板樣重複序列。

根據一個具體實施方案，微肌營養不良蛋白具有ΔR4-R23/ΔCT的構型，其包含4個血小板樣重複序列，即如圖1所示的血小板樣重複序列1,2,3和24。更精確地，這一序列包含肌營養不良蛋白的棒結構域4-23和CT結構域的外顯子71-78的缺失，並且包含肌營養不良蛋白的外顯子79的最後三個胺基酸，其後是三個終止密碼子。

這種稱為ΔR4-R23/ΔCT或MD1的微肌營養不良蛋白具有例如SEQ ID NO：3,4或7所示的胺基酸序列。

在一個實施方案中，編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列(也稱為「開放閱讀框」，ORF)是cDNA。然而，可以使用例如單鏈或雙鏈DNA或RNA。

在一個具體的實施方案中，本發明提供了包含比野生型肌營養不良蛋白cDNA短的核酸序列的組合物。

當用於可容納約4.7kb的AAV載體的情況下，編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列以及其正確表達所需的所有序列不應超過該包裝能力。在一個實施方案中，編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列不超過4500、4000bp，優選3900、3800、3700、3600或甚至3500bp。

編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列有利地是人來源的，但也可以是非人靈長類動物，犬，大鼠或鼠序列。在一個實施方案中，所述核酸序列源自其將被施用的生物體(例如人類中的人序列)。

根據另一個實施方案，編碼所述微肌營養不良蛋白的核酸序列被優化用於給定受試者，有利地用於人。優選地，該優化的序列如下修改：

-修改序列以在mRNA內AUG起始密碼子之前包括共有Kozak序列，以改善翻譯的起始。

-基於人中轉移RNA頻率的優化序列，並且增加GC含量以促進RNA穩定性。因此並且在特定情況下，人類的密碼子優化有利地導致63％的密碼子被修改，並且GC含量增加到超過60％。這當然取決於原始(優化前)微肌營養不良蛋白序列和靶向宿主。

根據一個實施方案，所述編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列對應於：

-序列SEQ ID NO：1的核苷酸586至4185，如SEQ ID NO：5所示；或

-序列SEQ ID NO：2的核苷酸586至4188，如SEQ ID NO：6所示。

根據一個實施方案，所述序列可以是編碼微肌營養不良蛋白的分離的核酸，所述微肌營養不良蛋白與本文公開的肽，尤其是序列SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或甚至SEQ ID NO：7，具有基本同源性或相同性(60％，70％，80％，90％，95％或甚至99％)。

優選地，編碼本發明的肽的分離的核酸的核苷酸序列與編碼功能性微肌營養不良蛋白，特別是序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或甚至SEQ ID NO：8的分離的核酸的核苷酸序列「基本同源/相同」，即約60％同源，更優選地約70％同源，甚至更優選地約80％同源，更優選地約90％同源，甚至更優選地約95％同源，以及甚至更優選地約97％，98％或甚至99％同源。

根據另一方面，由本發明的表達載體攜帶的核苷酸序列與序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2是「基本上同源的/相同的」，即約60％同源，更優選地約70％同源，甚至更優選地約80％同源，甚至更優選地約90％同源，甚至更優選地約95％同源，以及甚至更優選地約97％，98％或甚至99％同源。

在另一個實施方案中，所述組合物包含質粒或載體。根據一個具體實施方案，將分離的核酸插入載體中。簡言之，天然或合成核酸的表達通常通過將核酸或其部分可操作地連接至啟動子，並將該構建物併入表達載體中來實現。待使用的載體適合於複製和，任選地，整合入真核細胞中。典型的載體含有轉錄和翻譯終止子，起始序列和用於調控所需核酸序列表達的啟動子。

在一個實施方案中，所述組合物包含表達載體，有利地是病毒載體。特別感興趣的是包裝能力不允許負載(野生型)肌營養不良蛋白基因，包括(野生型)肌營養不良蛋白cDNA的表達載體。

在一個實施方案中，所述病毒載體選自下組：杆狀病毒載體，皰疹病毒載體，慢病毒載體，逆轉錄病毒載體，腺病毒載體和腺相關病毒(AAV)載體。

根據本發明的具體實施方案，含有表達構建物的病毒載體是腺相關病毒(AAV)載體。

腺相關病毒(AAV)載體已經成為用於治療各種病症的強有力的基因遞送工具。AAV載體具有使它們理想地適合於基因治療的許多特徵，包括缺乏致病性，中等免疫原性和以穩定和有效的方式轉導有絲分裂後細胞和組織的能力。通過選擇AAV血清型，啟動子和遞送方法的適當組合，可以將包含在AAV載體內的特定基因的表達特異性靶向一種或多種類型的細胞。

在一個實施方案中，編碼序列包含在AAV載體內。已知超過100種天然存在的AAV血清型。AAV衣殼中存在許多天然變體，允許鑑定和使用具有特別適合營養不良病理的性質的AAV。AAV病毒可以使用常規分子生物學技術工程改造，使得可以優化這些顆粒以用於核酸序列的細胞特異性遞送，最大程度降低免疫原性，調節穩定性和顆粒壽命，有效降解，精確遞送至細胞核。

如上所述，AAV載體的使用是DNA的外源遞送的共同模式，因為其相對無毒，提供有效的基因轉移，並且可以容易地為特定目的優化。在從人或非人靈長類動物(NHP)分離並且充分表徵的AAV的血清型中，人血清型2是作為基因轉移載體開發的第一個AAV。其他目前使用的AAV血清型包括AAV1，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11和AAV12。此外，非天然工程改造的變體和嵌合AAV也可以是有用的。

用於裝配到載體中的理想的AAV片段包括帽蛋白，包括vp1，vp2，vp3和高可變區，rep蛋白，包括rep78，rep68，rep52和rep40，以及編碼這些蛋白的序列。這些片段可以容易地用於多種載體系統和宿主細胞中。

這樣的片段可以單獨使用，與其他AAV血清型序列或片段組合使用，或與來自其他AAV或非AAV病毒序列的元件組合使用。如本文所用，人工AAV血清型包括但不限於具有非天然存在的衣殼蛋白的AAV。這樣的人工衣殼可以通過任何合適的技術，使用選擇的AAV序列(例如，vp1衣殼蛋白的片段)與可以從不同的選擇的AAV血清型、同一AAV血清型的非連續部分、非AAV病毒來源或非病毒來源獲得的異源序列組合產生。人工AAV血清型可以是但不限於嵌合AAV衣殼，重組AAV衣殼或「人源化」AAV衣殼。因此，示例性AAV或人工AAV包括AAV2/8(US 7,282,199)，AAV2/5(可從國立衛生研究院獲得)，AAV2/9(WO2005/033321)，AAV2/6(US 6,156,303)和AAVrh8WO2003/042397)。在一個實施方案中，用於本文所述的組合物和方法的載體至少含有編碼所選AAV血清型衣殼，例如AAV8衣殼或其片段的序列。在另一個實施方案中，有用的載體至少含有編碼所選AAV血清型rep蛋白(例如AAV8rep蛋白)或其片段的序列。任選地，這樣的載體可以含有AAV cap和rep蛋白。在其中提供AAV rep和cap兩者的載體中，AAV rep和AAV帽序列都可以是一種血清型來源，例如都是AAV8來源。或者，可以使用的載體中rep序列來自的AAV血清型不同於提供cap序列的血清型。在一個實施方案中，rep和cap序列從不同的來源(例如，分開的載體，或宿主細胞和載體)表達。在另一個實施方案中，這些rep序列在框架中與不同AAV血清型的cap序列融合以形成嵌合AAV載體，如AAV2/8(US 7,282,199)。

根據一個實施方案，組合物包含血清型2,5,8或9的AAV。有利地，要求保護的載體是AAV8或AAV9載體，特別是AAV2/8或AAV2/9載體。更有利地，要求保護的載體是AAV8載體或AAV2/8載體。

在用於本發明的AAV載體中，AAV基因組可以是單鏈(ss)核酸或雙鏈(ds)/自身互補(sc)核酸分子。

有利地，將編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列插入AAV載體的ITR(《反向末端重複》)序列之間。典型的ITR序列對應於：

-序列SEQ ID NO：1或序列SEQ ID NO：2的核苷酸1至128(5'ITR序列)；

-序列SEQ ID NO：1的核苷酸4511至4640或序列SEQ ID NO：2的核苷酸4514至4643(3'ITR序列)。

重組病毒顆粒可以通過本領域技術人員已知的任何方法獲得，例如通過共轉染293HEK細胞，通過單純皰疹病毒系統和通過杆狀病毒系統。載體滴度通常表示為每mL病毒基因組(vg/mL)。

在一個實施方案中，表達載體包含調控序列，特別是啟動子序列。這樣的啟動子可以是天然或合成的(人工)啟動子，誘導型或組成型。

在一個實施方案中，啟動子是普遍存在的啟動子或具有低組織特異性。作為實例，表達載體可以攜帶磷酸甘油酸激酶1(PGK)，EF1，β-肌動蛋白，CMV啟動子。

在優選的實施方案中，選擇啟動子序列以便在表達水平方面，但也在組織特異性方面充分控制位於其控制下的核酸序列的表達。在一個實施方案中，表達載體包含肌肉特異性啟動子。這樣的啟動子允許在骨骼肌，並且可能在心肌以及在隔膜中的強力表達。本領域技術人員已知的合適啟動子的示例是例如，結蛋白啟動子，肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子，CK6啟動子和Syn啟動子。另一個啟動子是如序列SEQ ID NO：1或2(核苷酸215至537)所示的合成啟動子C5-12(spC5-12)，其允許在骨骼和心肌中的強力表達。

其他可能的調控序列的非窮盡列表是：

-聚腺苷酸化信號，例如，感興趣的基因的多聚A，SV40或β血紅蛋白(HBB2)的多聚A，有利地位於編碼功能性微肌營養不良蛋白的序列的3'端；SV40的多聚A在序列SEQ ID NO：1(核苷酸4223至4353)和SEQ ID NO：2(核苷酸4226至4356)中公開；

-用於轉錄物穩定化的序列，例如血紅蛋白(HBB2)的內含子1；

-增強子序列；

-miRNA靶序列，其可以抑制編碼功能性肌營養不良蛋白的序列在非靶組織中的表達，其中所述表達是不需要的，例如其可以是毒性的。優選地，相應的miRNA不存在於骨骼肌中，並且可能不存在於隔膜中或心臟中。

根據一個實施方案，所述基因治療產品包含表達載體，有利地為攜帶序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，有利地為SEQ ID NO：1的AAV載體。如上所述，本發明還涵蓋與序列SEQ ID NO：1或2「基本上同源」的序列，即顯示約60％的同源性，更優選地約70％同源性，甚至更優選地約80％同源性，更優選地約90％同源性，甚至更優選地約95％同源性，以及甚至更優選地約97％、98％或甚至99％的同源性。

根據本發明，組合物至少包含所述基因治療產品和可能的其它活性分子(其它基因治療產品，化學分子，肽，蛋白質等)，專用於治療相同疾病或另一種疾病。

根據具體實施方案，所述組合物不包含任何免疫抑制劑。

本發明然後提供包含本發明的核酸或本發明的載體的藥物組合物。此類組合物包含治療有效量的治療劑(本發明的核酸或載體)和藥學上可接受的載體。在具體實施方案中，術語「藥學上可接受的」是指由聯邦或州政府的監管機構批准的或在美國或歐洲藥典或其他公認的藥典中列出的用於動物和人的。

術語「載體」是指與治療劑一起施用的稀釋劑，佐劑，賦形劑或媒介。這樣的藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油，動物，植物或合成來源的那些，例如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是優選的載體。鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用於可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括澱粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，硬脂酸鈉，甘油單硬脂酸酯，滑石，氯化鈉，脫脂奶粉，甘油，丙二醇，水，乙醇等。

如果需要，組合物還可以含有少量的潤溼劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採取溶液，懸浮液，乳液，緩釋製劑等形式。合適的藥物載體的實例描述於E.W.Martin的「《雷明頓藥物科學》(Remington's Pharmaceutical Sciences)」。這樣的組合物將含有治療有效量的治療劑，優選以純化形式，與合適量的載體一起，以提供用於向受試者適當施用的形式。

在優選的實施方案中，根據常規程序將組合物配製為適合於靜脈內施用於人的藥物組合物。通常，用於靜脈內施用的組合物是在無菌等滲水性緩衝液中的溶液。必要時，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因，以在注射部位緩解疼痛。

在一個實施方案中，根據本發明的組合物適合於在人中施用。組合物優選為液體形式，有利地為鹽水組合物，更有利地為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)組合物或林格氏乳酸鹽溶液。

可有效治療營養不良性疾病的本發明治療劑(即核酸或載體)的量可通過標準臨床技術確定。此外，可以任選地使用體內和/或體外測定來幫助預測最佳劑量範圍。在製劑中使用的精確劑量還將取決於施用途徑、重量和疾病的嚴重性，並且應當根據醫生的判斷和每個患者的情況來決定。

合適的施用應該允許將治療有效量的基因治療產品遞送到靶組織，特別是骨骼肌和可能的平滑肌(例如食管)，隔膜和心臟。在本發明的上下文中，當基因治療產品是包含編碼功能性微肌營養不良蛋白的核酸序列的病毒載體時，治療劑量定義為施用於受試者每千克(kg)體重的含有微營養不良蛋白序列的病毒顆粒的量(病毒基因組的vg)。

可用的給藥途徑是局部(局部)，腸內(全系統效應，但通過胃腸道(GI)道遞送)或胃腸外(全身作用，但通過GI道以外的途徑遞送)。本文公開的組合物的優選給藥途徑是胃腸外給藥，其包括肌內給藥(即進入肌肉)和全身給藥(即進入循環系統)。在本文中，術語「注射」(或「灌注」或「輸注」)包括血管內的，特別是靜脈內(IV)和肌內(IM)給藥。注射通常使用注射器或導管進行。

在一個實施方案中，組合物的全身遞送包括在局部治療部位附近，即在弱化肌肉附近的靜脈或動脈中施用組合物。在某些實施方案中，本發明包括組合物的局部遞送，其產生全身效應。這種給藥途徑，通常稱為「局部(局部)輸注」，「通過孤立肢體灌注給藥」或「高壓經靜脈肢體灌注」已經成功地用作肌營養不良症中的基因遞送方法(Zheng Fan等.(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)。

根據一個方面，通過輸注或灌注將組合物施用於分離的肢體(局部-區域)。換言之，本發明包括在腿和/或手臂中通過血管內施用途徑，即靜脈(經血管)或動脈在壓力下局部遞送組合物。這通常通過使用止血帶暫時阻止血液循環，同時允許灌注產品的區域擴散來實現，例如，公開於Toromanoff等(2008,Molecular Therapy 16(7):1291-99),Arruda等(2010,Blood 115(23):4678-88)和Fan等(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)。

在一個實施方案中，將組合物注射到受試者的肢體中。在一個實施方案中，受試者是哺乳動物，優選人，狗或非人靈長類動物。當受試者是人時，所述肢體可以是手臂或腿。根據一個實施方案，組合物在受試者身體的下部施用，例如，在膝蓋下方，或在受試者的身體的上部，例如在肘下方。

在一個實施方案中，將組合物施用於外周靜脈，例如，頭靜脈。待輸注的組合物的體積可以在肢體體積的約5％至40％之間變化的範圍內。典型的劑量可以在5和30ml/kg體重之間變化。在一個實施方案中，待施加的壓力(止血帶壓力或最大管線壓力)低於100 000Pa，有利地低於50 000Pa。在優選實施方案中，施加的壓力為約300託(40 000Pa)。

在一個實施方案中，使用止血帶停止肢體的血液循環，止血帶收緊幾分鐘至多於一小時，通常在約1至80分鐘之間，例如約30分鐘。在優選的實施方案中，在施用之前，期間和之後應用止血帶，例如在輸注之前約10分鐘，在輸注期間約20分鐘和輸注之後約15分鐘。更一般地，施加壓力幾分鐘，通常在約1至80分鐘之間，例如約30分鐘。在優選的實施方案中，在施用之前，期間和之後施加壓力，例如在輸注之前約10分鐘，在輸注期間約20分鐘和在輸注之後約15分鐘。

在一個實施方案中，平均流速為5至150ml/min，有利地為5至80ml/min，例如10ml/min。當然，流速還決定血液循環停止的時間段和施加的壓力。

在局部-區域施用的情況下，注射的劑量可以在1012和1014vg/kg患者體重之間變化，優選在1012和1013vg/kg之間。

根據本發明的優選的施用方法是全身施用。系統性注射打開了全身注射的方式，以便到達包括心臟和膈肌的受試者身體的整個肌肉，然後是實際治療這些全身性和仍然不可治癒的疾病。在某些實施方案中，全身遞送包括將組合物遞送至受試者，使得組合物在受試者的整個身體中可及。

根據優選的實施方案，全身給藥通過在血管中注射組合物進行，即血管內(靜脈內或動脈內)給藥。根據一個實施方案，通過外周靜脈作靜脈內注射施用組合物。

全身給藥通常在以下條件下進行：

-1至10mL/min，有利地1至5mL/min的流速，例如3mL/min；

-總注射體積可以在1至20mL之間變化，優選5mL載體製劑/kg受試者體重。注射體積不應超過總血量的10％，優選地約6％。

當全身遞送時，組合物優選以小於或等於1015vg/kg或甚至1014vg/kg的劑量施用，有利地為1012vg/kg至1014vg/kg，更有利地為5.1012vg/kg至1014vg/kg/kg，例如1,2,3,4,5,6,7,8或9.1013vg/kg。也可考慮較低劑量例如1,2,3,4,5,6,7,8或9.1012vg/kg，以避免潛在的毒性和/或免疫反應。如技術人員已知的，優選在效率方面給出令人滿意的結果的儘可能低的劑量。

在具體實施方案中，治療包括單次施用組合物。

如將在下面的實施例中說明的，本發明的基因治療產品的施用不認為與不良免疫反應相關。因此，根據一個實施方案，所述施用不與任何進一步或額外的免疫抑制治療(免疫抑制)組合。

在一個實施方案中，觀察基因治療產品的存在和/或功能性微營養不良蛋白的表達以及相關的治療益處，持續長達1個月，或3個月或6個月，或甚至1年，2年，5年，10年，甚至受試者的整個生命。

根據本發明，受試者是哺乳動物，優選人或狗，但也可以是小鼠，大鼠或非人靈長類動物。

「營養不良疾病」是指與肌營養不良蛋白基因缺陷相關的疾病。該缺陷可以是導致低水平的表達或缺失表達的缺失或突變，在開放閱讀框中引入提前終止密碼子或產生無活性的蛋白質。優選的營養不良性疾病是由肌營養不良蛋白基因的突變引起的杜氏和貝克肌營養不良(DMD/BMD)。所述突變可導致肌營養不良蛋白表達的缺失或低水平，或者產生部分或完全失活的，可能截短的蛋白質。

可受益於本發明的組合物的受試者包括所有診斷為肌營養不良或有發展為這類肌肉營養不良的風險的患者。然後可以基於肌營養不良蛋白基因中的突變或缺失的鑑定，通過本領域技術人員已知的任何方法來選擇待治療的受試者，包括例如肌營養不良蛋白基因的測序，和/或通過本領域技術人員已知的任何方法評價肌營養不良蛋白的表達或活性水平。因此，所述受試者包括已經表現出營養不良疾病症狀的受試者和具有發展所述疾病風險的受試者。在一個實施方案中，所述受試者包括已經表現出營養不良性疾病症狀的受試者。在另一個實施方案中，所述受試者是流動患者和早期非流動患者。

這種組合物特別意在用於基因治療，特別是用於治療杜氏肌營養不良(DMD)或貝克肌營養不良(BMD)，有利地是DMD。

本發明的第一個目的是提供安全(無毒)治療。另一個目的是提供有效的治療，其允許推遲，減緩或防止疾病的發展，並且可能改善可以在臨床水平上容易監測的患者的表型。

在受試者中，可以使用本發明的組合物：

-用於改善肌肉功能。特別感興趣的是骨骼肌，以及心肌和膈肌；

-用於改善步態；

-用於改善心臟功能；

-用於改善呼吸功能；

-用於改善消化功能；和/或

-用於延長生存期，更一般地改善生活的質量和期望。

根據一個方面，本發明涉及用於改善肌肉功能，步態，消化功能，心臟功能和/或呼吸功能，和/或用於延長生存期，有利地無副作用(細胞和/或體液免疫應答)的方法，包括向有需要的受試者施用治療量的如上所公開的基因治療產品。

有利地，所述改善在給藥後長達1個月，或3個月或6個月或9個月，更有利地在給藥後長達1年，2年，5年，10年或甚至在受試者整個生命中觀察到。

在一個實施方案中，所述改善導致症狀嚴重程度和/或頻率的減輕，和/或延遲出現，其中所述症狀選自下組：頻繁跌倒，不能行走，吞咽困難，心肌病，涎分泌過多(ptyalism)，運動技能降低(跑，蹦，跳)，呼吸異常，假性肥大，腰椎突起和肌肉僵硬。

所述功能的改善可以基於本領域已知的方法評估，例如：

-評估表達肌營養不良蛋白的肌纖維的百分比；

-步行測試；

-通過測力計測量的強度評估；

-通過運動功能測量評估精確肢體的運動功能；

-使用運動監測器評估全身活動；

-通過3軸加速度記錄評估步態；

-通過超聲心動圖，都卜勒分析和斑點跟蹤分析評估心臟功能；

-通過評估隔膜動力學評估呼吸功能；

-通過臨床隨訪評估重要功能，特別是心臟，呼吸和消化功能；

-通過臨床評分評估生活質量和預期壽命。

如實施例中所示，與未治療的受試者相比，所要求保護的治療方法允許改善臨床狀態和上文公開的各種參數。

根據一個實施方案，本發明涉及治療營養不良性疾病的方法，包括向受試者施用如上公開的基因治療產品，其中：

-至少30％的肌纖維，有利地40％，更有利地至少50％的肌纖維表達肌營養不良蛋白；和/或

-臨床得分維持在對應於健康受試者的得分的至少50％，有利地至少60％或甚至70％的水平。

有利地，所述效果在給藥後長達1個月，或3個月或6個月或9個月，更有利地在給藥後長達1年，2年，5年，10年，或甚至受試者整個生命中更長。

如本領域已知的，肌肉中肌營養不良蛋白表達的水平易於由本領域技術人員確定，有利地通過免疫組織化學法，例如通過使用如上公開的抗肌營養不良蛋白抗體作肌肉活檢免疫染色。臨床評分的計算對於本領域技術人員來說也是常規的。如上面關於狗所詳述的，可以基於吞咽困難，呼吸，涎分泌過多(ptyalism)和全身活動來計算該得分。關於患者，Bushby和Connor已經例如列出了，杜氏肌營養不良中的試驗的臨床結果測量(Clin Investig(Lond).2011；1(9)：1217–1235)。

除非另有說明，本發明的實踐採用分子生物學(包括重組技術)，微生物學，細胞生物學，生物化學和免疫學的常規技術，這些都在本領域技術人員的能力範圍內。這樣的技術在文獻中充分解釋，例如「分子克隆：實驗室手冊」，第四版(Sambrook，2012)；「寡核苷酸合成」(Gait，1984)；「動物細胞培養」(Freshney，2010)；「酶學方法」「實驗免疫學手冊」(Weir，1997)；「哺乳動物細胞基因轉移載體」(Miller和Calos，1987)；「分子生物學簡單方法」(Ausubel，2002)；「聚合酶鏈式反應：原理，應用和疑難解答」，(Babar，2011)；「最新免疫學方法」(Coligan，2002)。這些技術適用於生產本發明的多核苷酸和多肽，並且因此在製備和實施本發明時可以考慮。在下面的部分中將討論用於特定實施方案的特別有用的技術。

本文引用的每個專利，專利申請和出版物的公開內容通過引用整體併入本文。

無需進一步描述，相信本領域普通技術人員能夠使用前述說明和以下說明性實施例，製備和利用本發明的化合物並實施要求保護的方法。

實驗實施例

通過參考以下實驗實施例和附圖進一步詳細描述本發明。提供這些實施例僅僅是為了說明的目的，而不是限制性的。

下面給出的結果是在GRMD(金毛犬肌營養不良)狗模型中獲得的。它是營養不良病理學的最佳動物模型，以便在臨床試驗之前評估基因治療產品在效果(治療劑量，穩定性，毒性，...)以及免疫應答方面的潛力。

圖1：全長肌營養不良蛋白(A)，各種微肌不良營養蛋白(B)和表達構建物(C)的示意圖。

圖2：研究計劃-GRMD犬全身治療的一般方案。

圖3：A/通過靜脈內全身遞送施用rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體至GRMD2犬(ICI)3個月後獲得的肌肉活檢。

a/m.股二頭肌注射前

b/健康狗

c/m.橈側腕伸肌右：

82％的cMD+纖維(在82％的纖維中檢測到cMD)

2.8vg/dg(每個二倍體基因組的載體基因組)

d/m.指總伸肌右：

59％的cMD+纖維(在59％的纖維中檢測到cMD)

4.1vg/dg

e/m.橈側腕伸肌左：

62％的cMD+纖維(在62％的纖維中檢測到cMD)

6.2vg/dg

f/m.指總伸肌左：

66％的cMD+纖維(在66％的纖維中檢測到cMD)

2.6vg/dg

B/通過靜脈內全身遞送施用rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體至GRMD2犬(ICI)8個月後獲得的肌肉活檢：

a/m.股二頭肌右：

58％的cMD+纖維(在58％的纖維中檢測到cMD)

1.0vg/dg

b/m.股二頭肌左：

56％的cMD+纖維(56％的纖維中檢測到cMD)

0.8vg/dg

圖4：在2月齡時全身接受1014vg/kg rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體的GRMD組中獲得的臨床評分數據。

*表示狗不再活著

圖5：全身步態指數的數據。使用通過判別分析構建的模型計算曲線，並且表示對於未處理的GRMD和健康的狗獲得的數據。對於後者，示出了平均質心曲線和95％置信區間。

圖6：在經治療和未經治療的GRMD犬上監測的運動膜片範圍(ROM)。健康犬顯示的ROM值在90和110％之間。

圖7：使用犬μDys肽池的IFNγELISpot(PBMC的動力學)。數據在GRMD狗2(ICI)中獲得，其在2個月齡時全身接受了1014vg/kg的rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體。

圖8：在注射的狗血清中通過Western印跡檢測抗肌營養不良蛋白IgG抗體。數據在GRMD狗2(ICI)中獲得，其在2月齡時全身接受了1014vg/kg的rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體。在用pCMV-犬-MD(cμDys)轉染(或不轉染)的293細胞的細胞提取物上測試每種血清的反應性。已經測試了注射前(第0天)和注射後(第3周，第1.5個月，第2.5個月，第4個月和第7.5個月)的血清。陽性對照包括抗肌營養不良蛋白抗體MANEX 1011C和來自抗肌營養不良蛋白免疫的GRMD狗的陽性犬血清(C+)。

材料和方法：

1/動物

在GRMD狗模型(Kornegay等,Mamm Genome,2012)中進行了完全全身注射微營養不良蛋白載體(rAAV2/8-SPc5.12-cMD)的評價。對選定的雄性狗進行DMD突變的基因分型，其由引起不準確的mRNA加工的肌營養不良蛋白基因的內含子6的3'共有剪接位點(A>G)中的單鹼基變化組成。

如下表1所示處理狗(無免疫抑制)：

對照狗對應於非注射的GRMD犬和健康狗。

2/微肌營養不良蛋白載體

rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體編碼在肌肉特異性啟動子(SPc5.12)控制下的mRNA序列優化的犬肌營養不良蛋白(cMD)。

犬特異性mRNA序列優化的cMD cDNA的構建，引入了肌營養不良蛋白的CT結構域的外顯子71-78和杆狀結構域4-23(ΔR4-R23；圖1)的缺失，其含有肌營養不良蛋白外顯子79的最後三個胺基酸，隨後是三個終止密碼子並摻入SV40聚腺苷酸化位點。cDNA序列被修飾以包括共有Kozak序列。基於人類中的轉移RNA頻率優化mRNA序列並增加GC含量以提高RNA穩定性。微肌營養不良蛋白(GENEART,雷根斯堡,德國)的mRNA序列優化導致在犬抗肌營養不良蛋白中GC含量從48％增加至61％，以及23.6％的密碼子的被修飾。cMD基因cDNA的大小為3603bp，並且該載體的含側翼反向末端重複(ITR)的轉基因盒的大小為4643bp，其對應於野生型AAV2基因組長度的4682bp的99.2％。去除肌營養不良蛋白基因的5'-和3'-非翻譯區以減少肌營養不良蛋白盒的側翼ITR大小。表達處於肌肉特異性合成啟動子(SPc5-12)的控制之下(Wang,B.,等,Gene Ther,2008.15(22)：第1489-99頁)。

這個表達盒(SEQ ID NO：2，包括AAV_ITR，Spc512啟動子，犬MD cDNA和SV40PolyA)被證明在基於Duchenne beagle的CXMDJ模型中肌內注射後導致廣泛和穩定的肌營養不良蛋白表達(Koo,T.,等,J Gene Med,2011.13(9):p.497-506)。此外，這種構建物改善肌肉病理並且減少目標肌肉組織中的炎症反應。

3/rAAV2/8-SPc5.12-cMD的製備

在杆狀病毒/Sf9系統中產生含有由SPc5-12啟動子調節的犬微營養不良蛋白cDNA的重組腺相關病毒載體rAAV2/8-SPc5.12-cMD。產生兩個杆狀病毒批次，一個表達rep(編碼AAV2Rep蛋白)和cap(編碼AAV8Cap蛋白)AAV基因，第二個是AAV2轉移載體。產生病毒，庫存並用於在200升一次性生物反應器(Sartorius)中共感染SF9細胞。在三天培養後，收集細胞，裂解，通過澄清處理裂解液，在免疫親和柱上純化，通過切向流過濾濃縮，配製，無菌過濾和填充。純化基於攜帶結合AAV1，AAV2，AAV3，AAV5，AAV6和AAV8的單鏈抗體的商業凝膠(購自GE Healthcare的AVB)。該過程的總產率>20％，並產生145單位的4.5ml產物，病毒滴度>1013vg/ml。

4/全身給藥

已經通過全身遞送用治療性候選物(rAAV2/8-SPc5.12-cMD)載體注射GRMD狗。該試驗組以1014vg/kg(總計約5×1014vg/動物)給藥。通過外周靜脈，在插管頭靜脈中以3mL/min的流速進行簡單的全身注射。總注射體積約為25mL的載體製劑(5ml/kg)，代表6％的總血液體積(10％是推薦的上限)，其結果是非常好的耐受性。

實驗動物在2個月齡時注射，並如表1所示跟進。它們都對在血清中缺少AAV8中和因子進行了預篩選。在靜脈內(IV)注射載體之前，從實驗中丟棄顯示出深度虛弱和/或吞咽損傷的GRMD狗。從未使用免疫抑制方案，並且提供的唯一醫療護理被限制為保持動物的舒適和健康。在適當時間獲得適當的管理文件(倫理和轉基因生物處理)。所有程序均按照「實驗動物的護理和使用指南」進行，並由特設動物使用和護理委員會批准。

5/全身治療的評價

發病率和死亡率每天評估兩次。發現死亡的動物將在病理學家在場時進行屍體剖檢，並在適當時收集組織樣品以嘗試系統地確定死亡原因。

該方案的臨床和生物學耐受性

在所有狗中，在注射後定期監測臨床實驗室參數，包括電解質，腎和肝功能測試和全血細胞計數。在整個方案期間，還仔細和每周評估每個狗的臨床狀態，包括心臟，呼吸，消化，運動和神經功能。

通過Q-PCR評估載體脫落和載體生物分布

通過Q-PCR定期對尿，血清，中間肌肉活檢，來自四肢的主要骨骼肌其中屈肌和伸肌，心臟和隔膜，肝臟，脾臟，腎臟，淋巴結和睪丸進行載體脫落和載體生物分布(檢測)，直到安樂死。使用Qiamp病毒RNA微型試劑盒(Qiagen)從流體中提取rAAV DNA。從140μL血清中提取rAAV。1/8的提取物(10μL)用於Q-PCR分析。使用Gentra Puregene試劑盒(Qiagen)和Tissue Lyzer II(Qiagen)從組織中提取基因組DNA(gDNA)。使用納米分光光度計(Implen)測定每種gDNA樣品的濃度。

在StepOne Plus(Applied Biosystem)上使用50ng一式兩份的gDNA或10μL流體提取物進行定量PCR。使用設計用於特異性擴增SPc5.12-cMD盒的引物和探針確定載體拷貝數。使用設計用於擴增犬葡萄糖醛酸酶基因的引物和探針來確定gDNA拷貝數。對於每個樣品，將Ct(循環閾值)值與用不同稀釋度的線性化標準質粒(含有SPc5.12-cMD盒或犬葡萄糖醛酸酶基因)獲得的值進行比較。結果以每個二倍體基因組的載體基因組(vg/dg)表達。對於流體，僅進行轉基因特異性Q-PCR，並且結果以每μl提取流體的載體基因組表達。通過分析摻入不同稀釋度的標準質粒的從脾臟，睪丸，肝臟，腎臟或骨骼肌提取的10μL流體提取物或50nggDNA，來預先檢查在gDNA存在下，Q-PCR抑制是否不存在。

通過Q-RT-PCR評估不同組織中的轉基因表達

在多種骨骼肌，心臟和隔膜，肝臟，脾臟和任何其他表現出高載體拷貝數的組織中通過Q-RT-PCR評估微肌營養不良蛋白表達。簡言之，根據製造商的說明書，用TRIzol試劑(英傑公司)從肌肉，肝臟和脾臟中提取總RNA，並用來自TURBO DNA free試劑盒(Ambion)的無RNA酶的DNAseI處理。使用隨機引物和M-MLV逆轉錄酶(英傑公司)進行逆轉錄。為每個樣品加工無逆轉錄酶(RT-)的陰性對照。在StepOne Plus(Applied Biosystem)上對稀釋的一式兩份cDNA進行定量PCR。使用設計用於特異性擴增該序列的引物來確定cMD信使的相對定量。通過已知在狗的不同組織中相似表達的犬RPL32(核糖體蛋白L32)信使的Q-PCR分析將結果標準化(Peters,I.R.,等,.Vet Immunol Immunopathol,2007.117(1-2)：第55-66頁)。通過分析摻有不同稀釋度的標準質粒的稀釋的cDNA來檢查在肌肉、肝臟和脾的cDNA的存在下，是否不存在Q-PCR抑制。

對於每個樣品，將Ct(循環閾值)值與用不同稀釋度的標準質粒(含有cMD表達盒或犬RPL32信使的序列)獲得的值進行比較。結果以相對量(RQ)表示：

RQ＝2-ΔCt＝2-(Ct靶標-Ct外源對照)

通過蛋白質印跡分析肌營養不良蛋白表達

使用特異性Western印跡分析，評估注射的狗的不同肌肉中的微肌營養不良蛋白的表達：

-在一些骨骼肌，以及心臟和隔膜，在安樂死時採樣，

-在將發現高水平的轉基因拷貝數的肝臟，脾臟和任何其他組織中，在安樂死時。

從組織樣品中提取總蛋白。在SDS-PAGE上分離蛋白質提取物，轉移到硝酸纖維素膜上。在Red Ponceau染色後，將膜在TBS中的5％脫脂乳中封閉，並與抗肌營養不良蛋白MANEX1011C抗體和第二抗-小鼠IgGHRP偶聯的抗體雜交。

免疫組化分析肌營養不良蛋白表達

通過免疫化學方法，在注射的狗的骨骼肌中評價微肌營養不良蛋白的表達：

-在中間肌肉活檢，

-在所有骨骼肌，以及心臟和隔膜，在安樂死時採樣，

-在肝臟，脾臟，睪丸，腎臟和淋巴結，安樂死時採樣。

通過免疫組織化學方法評估微肌營養不良蛋白的表達和定位。使用來自Novocastra的小鼠肌營養不良蛋白抗體(NCL-DYS-B)在每個肌肉的橫切片上進行微肌營養不良蛋白多肽免疫染色。肌營養不良蛋白相關蛋白的恢復是通過β肌營養不良蛋白聚糖，β-肌蛋白聚糖，γ-肌蛋白聚糖和Utrophin的免疫染色來評估的，包括在肌漿膜上與層粘連蛋白共定位。

評估肌肉中的局部病理模式

病理學評估是討論基因治療產品在靶組織水平的實際益處的關鍵。使用形態測量分析，EC委員會認證的病理學家評估注射的狗的骨骼肌中的病理模式。這些分析在具有大多數I型纖維(近肢肌肉，椎旁肌肉)的姿勢肌肉；具有大多數II型纖維(來自遠端肢體肌肉的屈肌和伸肌)的運動肌；呼吸肌，隔膜，肋間和咀嚼肌上進行。也對心臟進行了廣泛評估，由於不平行的取向，捕獲纖維直徑有特定困難。

內膜纖維化在膠原I的免疫組織化學揭示(免疫過氧化酶測定)和標記區域的百分比的自動測量之後評價。

總纖維化在膠原I的免疫組織化學揭示(免疫過氧化酶測定)之後，在與內膜纖維化的同一載玻片上評價。還進行總標記區域的百分比的自動測量。

橫紋肌纖維化通過在肌肉組織的相同區域中的總纖維化和肌內膜纖維化之間的差計算。

Anocytosis(纖維直徑的變化)通過手工形態測定法評價：每分析的肌肉橫截面測定至少200個肌纖維和6個區域的最小纖維直徑。

壞死通過茜素紅(Alizarin Red)染色測量鈣富集來評價。標記區域的百分比在手動閾值後測量。

再生在用發育性肌球蛋白重鏈同種型的特異性抗體作免疫組織化學揭示肌管(免疫過氧化物測定)之後評價。標記區域的百分比在手動閾值後測量。

炎症在同一載玻片上免疫組織化學揭示T和B淋巴細胞和巨噬細胞後評價(免疫過氧化酶測定)。標記區域的百分比在手動閾值後確定。

評估不同組織中的病理模式

使用HE染色和解剖病理學專門技術在安樂死的狗的不同組織中評估脫離靶組織(肝臟，脾臟，腎臟，...)所致的潛在不良副作用。

骨骼肌的NMR成像和光譜指數

非侵入性肌肉成像和光譜指數在安樂死前一周進行。狗被送到巴黎的肌肉學研究所(Institute of Myology，Pierre Carlier的團隊)，並接受3T西門子Trio掃描儀核磁共振(NMR)以定量和連續描述與未治療和健康動物相比的營養不良肌肉異常。除此之外，在Bruker biospec掃描儀中在4T下實現/獲取伸肌橈側腕(extensor carpi radialis)的P31光譜。相對於未治療和健康犬的組中疾病進展的在先NMR研究期間的參考數據定位每個單獨的測量Thibaud,J.L.,等,Neuromuscul Disord,2012.22 Suppl 2:p.S85-99；Wary,C.,等,NMR Biomed,2012.25(10):p.1160-9.胸椎和骨盆/前肢在3T掃描儀中成像。如Thibaud,J.L.,等(Neuromuscul Disord,2007.17(7):p.575-84)所述，獲取標準和脂肪飽和的T1-，T2-和質子-密度-加權圖像。還進行T1的測量和在釓-螯合物注射後肌肉增強的兩小時動力學研究。已經鑑定了在健康和未治療的GRMD犬之間不同的十個指數，其能夠解釋基因治療治療對大肌肉區域的效果。

功能評估：臨床分級

臨床檢查也每天進行兩次，包括食物和水的消耗，活動(全身性動作，對外部刺激的反應)和身體外觀(面部，毛皮，四肢)。在每次麻醉期間對所有動物進行包括體重在內的全面檢查。

使用先前公開的方案(Rouger,K.,等,Am J Pathol,2011.179(5):第2501-18頁)，通過在注射後每周進行的臨床分級來評價動物關於肌肉疾病的一般臨床狀態。該評價包括11項運動標準和6項與一般健康狀況(包括吞咽困難，涎分泌過多，全身活動和呼吸)有關的項目。每個項目得分從0到2，0對應於無症狀，2對應於最大嚴重程度。全局臨床評分表示為最大臨床評分(對於健康狗定義為100％)的百分比，並建立趨勢曲線(移動平均值為3)以表示臨床評分演變。將注射的狗中獲得的臨床評分演變與非注射的GRMD狗的臨床評分演變進行比較。

功能評估：步態分析(肌肉功能)

由Locometrix量化的步態分析每月進行兩次。是由3個正交放置的加速度計組成的3D加速度計設備。這種結構允許沿著狗的背腹，頭尾和中間-橫軸記錄加速度。可以使用該設備分析速度，步頻，步長，規律性，總功率，背腹功率，頭尾功率，中間-橫軸功率和力，並且在GRMD狗中該疾病進展期間，這些指數中的一些被修改(Barthelemy,I.,等,BMC Musculoskelet Disord,2011.12:第75頁)。

功能評價：心功能評價

每月使用超聲心動圖和都卜勒分析來評估治療的狗的心臟功能，這是一種允許檢測收縮性缺陷的敏感方法。

數據採集：

根據美國獸醫內科學院的推薦(Thomas,W.P.,等,JVet Intern Med,1993.7(4):第247-52頁)，使用配備有5-7.5和2-5MHz相控陣換能器的Vivid 7超聲單元(GE，沃基肖，威斯康辛州)，在持續ECG的監視下，對有意識的狗以站立位置進行常規超聲心動圖和2D彩色組織都卜勒成像(TDI)。轉移所有數據，由兩名不知道狗的臨床狀態的檢查者使用特定軟體(Echo Pac 5.4，GE)進行離線分析。如下所述測量一些參數用於評估心肌收縮性。

常規參數：測量左心室(LV)尺寸，後壁和室間隔壁的厚度。

計算左心室縮短和射血分數(Teichholz方法)。二尖瓣流入的脈衝都卜勒用於測量早期相對於晚期舒張流速(E/A)的比率。

組織都卜勒成像：從在後壁中的乳頭肌水平的短軸視圖和在隔壁和側壁基底部分水平的尖4腔視圖獲得徑向心肌速度和應變率的測量值。

斑點跟蹤成像：在短軸視圖中，測量5個預定段中的每一個中的節段應變。平均周向和徑向通過手動計算所獲得的測量的平均值來確定。在4個腔室視圖中，總體縱向應變用程序自動測量，該程序對從6個自動檢測的段的分析導出的測量值進行積分。預注射數據和模擬注射的GRMD用作參考。

功能評價：呼吸功能評價

呼吸功能每月評價，並通過使用對有意識的狗進行胸部放射鏡採集來完成。在提取呼氣末和吸氣末後圖像之後，計算2個指數：

-膜片的尾部回縮指數(RI)反映膜片的回縮；

-隔膜運動範圍(ROM)反映了隔膜的移動性：它是在(i)在吸氣末和呼氣末獲得的2個圖像的疊加之後獲得的，(ii)測量每個圖像上尾部腔靜脈孔的中心點位置之間的距離，(iii)將該距離通過第13胸椎(T13)的長度歸一化。

這2個指數與膈肌的收縮和移動性相關，其在GRMD狗的疾病進展期間被修改(Barthelemy,I.,等,Myology congress,2011)。在GRMD狗中獲得的結果相對於在未注射的未處理動物中獲得的結果進行定位。

呼吸功能的臨床隨訪：

呼吸功能也通過觀察呼吸運動/周期來評估，其修改揭示一些呼吸異常，那可能是隔膜和其他呼吸肌無力的結果。

通過由專業獸醫每兩個月進行的臨床檢查來評價關於呼吸異常的顯現和惡化的動物狀態。特別地，評價呼吸運動/周期的數量和規律性。

功能評價：消化功能評價

消化功能的臨床隨訪：

如在DMD患者中所見，吞咽困難(即吞咽困難)是GRMD狗中疾病進展的典型症狀，作為明顯的口腔和咽部肌肉虛弱的結果(van den Engel-Hoek,J Neurol,2013,260(5):1295-303)。

通過由專業獸醫每兩個月進行的臨床檢查來評價關於吞咽困難的顯現和惡化的動物狀態。特別地，評價舌頭大小，口腔內異常量的唾液的存在和動物吃固體或軟食物的能力。

免疫反應的隨訪

在整個研究期間，收集來自參與研究的狗的血液樣品(血漿，血清和外周血單核細胞-PBMC)以監測：

-針對rAAV8的體液免疫應答

-針對微肌營養不良蛋白的體液免疫應答

-針對rAAV8的細胞免疫應答

-針對微肌營養不良蛋白的細胞免疫應答

-注射後早期的炎症性免疫應答

血液樣品根據法國L2生物安全性要求處理，並進行血液學和臨床生物化學處理。定期獲得專用血清樣品用於以下免疫學評估：(i)抗AAV抗體和抗肌營養不良蛋白抗體；(ii)通過Luminex測量炎症細胞因子；(iii)補體激活。還在治療之前和之後收集全血以分離外周血單核細胞(PBMC)，隨後監測針對AAV和/或肌營養不良蛋白多肽的潛在細胞免疫應答。

對rAAV8載體的體液免疫應答：

在載體注射後的不同時間點評價狗血清：(i)通過定製ELISA檢測IgG的和對rAAV8特異性的IgM存在；(ii)通過定製中和測定揭示的rAAV8中和能力。

對肌營養不良蛋白的體液免疫應答：

通過Western-Blot分析常規地進行IgG抗肌營養不良蛋白抗體的檢測。簡言之，將含有犬肌營養不良蛋白的細胞提取物進行SDS-PAGE，然後轉移到Hybond ECL硝酸纖維素膜上。過夜飽和後，將膜與來自注射動物的實驗犬血清一起溫育。隨後，通過與過氧化物酶偶聯的兔抗狗IgG抗體雜交，隨後通過增強的化學發光檢測進行檢測。陽性對照包括抗肌營養不良蛋白MANEX 1011C抗體(Wolfson遺傳性神經肌肉疾病中心(Wolfson Center for Inherited Neuromuscular Diseases))。

對AAV8和肌營養不良蛋白多肽的細胞免疫應答評估如下：簡言之，用編碼AAV8的VP蛋白或犬肌營養不良蛋白多肽的慢病毒載體(LV)進行IFN-γELISPOT測定。LV載體用於轉導PBMC。使用覆蓋犬肌營養不良蛋白多肽的犬序列的重疊肽文庫的補充方法也用於刺激淋巴細胞。

炎症免疫應答(細胞因子)通過Luminex技術在載體施用前和施用後不同時間點觀察IL2，IL4，IL6，IL8，IL10，IL15，IFN和TNF進行定量。

結果：

如圖2所示，通過外周靜脈的簡單全身注射，2個月大的GRMD犬已被注射1×1014vg/kg的上述rAAV2/8-SPc5.12-cMD載體。載體施用後瞬間以及長達數月從未檢測到臨床，生物化學和血液學不良反應。

肌肉活檢：

在全身注射後3和8個月，獲取GRMD狗的來自一些不同肌肉的中間活檢。

根據上述方法，研究了在載體的全身遞送後3個月，表達肌營養不良蛋白多肽的肌纖維的百分比。GRMD狗2的結果如圖3A所示。

連同表達治療性轉基因的纖維的百分比，每個二倍體細胞的載體基因組數(vg/dg)在遵循上文所述的方法學之後說明。對於平均2-4vg/dg，在活組織檢查中，表達肌營養不良蛋白的纖維的平均百分比從59％到82％(圖3A c/到f/)，這被解釋為非常令人鼓舞。可以注意到主要細胞浸潤的缺乏和相當顯著保存的組織結構。

在載體的全身遞送後8個月，對於1vg/dg，在活組織檢查中表達肌營養不良蛋白的纖維的百分比為約50％(圖3B)。

所有可用的數據彙編在下表2中：

N/A：不適用，因為活檢的質量低

此外，在注射後7，5個月的GRMD狗3的組織中發現的載體基因組拷貝的進一步定量顯示在下表中：

表3：在處死時(注射後7,5個月)在GRMD3的肌肉中發現的載體基因組拷貝。

以非常有趣的方式，觀察到即使在這個晚期時間點，在身體的所有骨骼肌中檢測到大量的轉基因顆粒(甚至在注射部位的遠端，即右頭靜脈)，還有在心臟和隔膜中。這有利於轉基因在整個生物體內的優良的生物分布。

臨床評價：

如上所述對5隻經治療的GRMD狗的臨床評價的初步數據針對8隻其他未經治療的年齡匹配的GRMD狗進行。圖4顯示了在載體注射後的不同時間點，基本上根據吞咽困難、呼吸、多涎、全身活性的臨床評分的改善。100％評分對應於健康個體。即使臨床結果同一組內的治療個體之間可能不同(在未治療的GRMD之間通常是這種情況)，這些結果表明治療的GRMD動物表現出迄今相當穩定的表型，優於大多數未治療的動物。在治療的狗中評價的臨床評分保持在對應於在健康狗中獲得的最大評分(100％)的至少50％的水平，一些動物高於70％，而大多數未經治療的動物的臨床評分迅速下降至40％以下甚至更少(圖4)。

值得注意的是，臨床隨訪表明，即使在一歲大，治療的GRMD狗能夠跑，跳躍障礙，以他們的後肢站立。這對於未經治療的GRMD犬而言從未觀察到，其預期壽命很少超過一年。

圖4所示的數據還支持治療的狗的心臟和呼吸功能的改善，以及與未治療的狗相比延長的生存期，連同改善的生活質量。

步態表徵：

如上所述，使用裝置每兩個月進行步態評估。在3軸上記錄加速度：背腹(DV)，內外側(ML)和頭尾(CC)。通過7個步態變量(步頻，規律性，總功率，頭尾功率，背腹功率，中間-側向功率和步長)的統計判別因子分析的步態特徵示於圖5。

在注射的狗中獲得的結果相對於以前在25隻未治療的GRMD和9隻正常狗的組中疾病進展的3D加速度計研究期間收集的參考數據定位(Barthelemy,I.,等,BMC Musculoskelet Disord,2011.12:第75頁)。

數據顯示，μdys治療的GRMD狗產生了與年齡匹配的未治療的GRMD犬中觀察到的非常不同並且大大改善的整體步態指數。注射後僅3到4個月後，它們迅速改善他們的步態表現，顯示與健康狗十分接近的步態。從這些數據，看起來μdys治療的GRMD狗呈現出接近同一品種的健康狗的步態。

心臟和呼吸功能：

圖4所示的臨床評分支持心臟和呼吸功能的改善。

更具體地，圖6支持改善的呼吸功能，儘管狗之間存在顯著的變化，但是在治療的GRMD犬中顯示出ROM指數更好的值，與隔膜的改善的活動性相關。

這些數據也證實了下表4中報導的狗的臨床隨訪：

GRMD犬的呼吸異常的特徵在於呼吸運動/周期的改變。與DMD患者一樣，這些異常是膈肌和其他呼吸肌無力的結果。表4顯示了在治療的GRMD(μDys)狗中呼吸異常顯現的延遲或甚至抑制。

消化功能：

吞咽困難(吞咽困難)是GRMD犬的疾病進展的典型症狀。與DMD患者一樣，吞咽困難是明顯的口腔和咽部肌肉虛弱的結果。

已經研究了治療對消化功能的可能好處，並且結果報告在下表5中：

這種臨床隨訪揭示了在治療的GRMD(μDys)狗中吞咽困難出現的延遲，具有症狀嚴重程度較輕。

免疫反應/毒性：

注射後3和8個月(圖3)的蛋白質檢測以及圖4所示的良好臨床評分表明對重組AAV載體和微肌營養不良蛋白不存在不良和有害的免疫應答。

肌肉活檢(圖3)以及圖4所示的良好臨床評分支持所述基因治療產品的無毒性。

在生物安全性方面，通過幹擾素γElispot使用在PBMC的動力學上孵育的cMDYF肽庫來評價針對cMD的細胞免疫應答(圖7)。無論注射劑量如何，注射的動物無一表現出可檢測的幹擾素γ分泌，表明不存在針對cMDYF的細胞免疫應答。

還通過免疫western印跡評價了針對cMD的體液免疫應答(圖8)。所有可用的結果彙編在下表6中：

這裡，在注射1014vg/kg AAV-cMD載體的5隻狗中的2隻中檢測到抗μ肌營養不良蛋白抗體的存在。重要的是，針對cMD的這種體液免疫應答只是短暫的(最大檢測範圍＝在注射後2周和4個月之間)，並且似乎不與任何臨床有害作用相關，表明在這些動物中可能發生免疫耐受。

生存期：

圖4清楚地顯示生存期延長：

-在8-9個月時，8隻未治療的GRMD狗中僅有2隻仍然存活。相反，所有經治療的GRMD狗仍然存活且健康；

-以一般方式，未治療的GRMD犬的預期壽命為約12個月，在該年齡時具有非常差的臨床狀態。相反，經過長期隨訪測試的2隻治療的GRMD狗(μDys1和2)在該截止時間後保持存活(分別為19和17個月的年齡)，並且處於良好的臨床狀態。

治療劑量：

該研究顯示，就在狗中的效果和毒性而言，全身給藥的相對低劑量1014vg/kg是合適的劑量。

結論：

總之，這些功能數據與中間肌肉活檢中的肌營養不良蛋白多肽的實質性表達(>50％表達微肌營養不良蛋白的纖維)良好相關。它們顯示MD微肌營養不良蛋白構建物的治療效果，並且支持全身遞送可能有益於停止/減少疾病的進展。從這個GRMD的系統性試驗組獲得的結果表明，從分子，病理學和功能方面測量的一些結果支持人類中系統性基因治療。

該研究證明了這樣的概念：全身靜脈注射單劑量後，編碼序列優化的微肌營養不良蛋白並衣殼化在AAV8衣殼中的SPc5.12-cMD治療盒，為杜氏肌病(Duchenne myopathy)的狗模型提供臨床益處。不僅微肌營養不良蛋白多肽在多種肌肉中高度表達，而且還導致步態改善和改善的臨床結果測量，延長的生存期，無不良免疫反應。以本發明人的知識，這是令人鼓舞和令人意想不到的結果的第一次報導，特別是在全身用藥的情況下。

序列表

吉尼松公司

皇家霍洛威和貝德福德新學院

營養不良性疾病的高效全身治療

G143-B-43539 PCT

EP14174848.3

2014-06-27

PCT/EP2015/058964

2015-04-24

BiSSAP 1.3

4640

DNA

人工序列

AAV_ITR_Spc512-人 MD1

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60

tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120

gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctag 180

acatggctcg acagatcgag ctccaccgcg gtggcggccg tccgccctcg gcaccatcct 240

cacgacaccc aaatatggcg acgggtgagg aatggtgggg agttattttt agagcggtga 300

ggaaggtggg caggcagcag gtgttggcgc tctaaaaata actcccggga gttattttta 360

gagcggagga atggtggaca cccaaatatg gcgacggttc ctcacccgtc gccatatttg 420

ggtgtccgcc ctcggccggg gccgcattcc tgggggccgg gcggtgctcc cgcccgcctc 480

gataaaaggc tccggggccg gcggcggccc acgagctacc cggaggagcg ggaggcgcca 540

agctctagaa ctagtggatc ccccgggctg caggaattcg ccaccatgct gtggtgggag 600

gaagtggagg actgctacga gagagaggac gtgcagaaga aaaccttcac caagtgggtg 660

aacgcccagt tcagcaagtt cggcaagcag cacatcgaga acctgttcag cgacctgcag 720

gatggcagga gactgctgga tctgctggag ggactgaccg gccagaagct gcccaaggag 780

aagggcagca ccagagtgca cgccctgaac aacgtgaaca aggccctgag agtgctgcag 840

aacaacaacg tggacctggt gaatatcggc agcaccgaca tcgtggacgg caaccacaag 900

ctgaccctgg gcctgatctg gaacatcatc ctgcactggc aggtgaagaa cgtgatgaag 960

aacatcatgg ccggcctgca gcagaccaac agcgagaaga tcctgctgag ctgggtgagg 1020

cagagcacca gaaactaccc ccaggtgaac gtgatcaact tcaccacctc ctggagcgac 1080

ggcctggccc tgaacgccct gatccacagc cacagacccg acctgttcga ctggaacagc 1140

gtggtgtgtc agcagagcgc cacccagaga ctggagcacg ccttcaacat cgccagatac 1200

cagctgggca tcgagaagct gctggacccc gaggacgtgg acaccaccta ccccgacaag 1260

aaaagcatcc tgatgtatat tacctctctg tttcaggtgc tgccccagca ggtgtccatc 1320

gaggccatcc aggaagtgga aatgctgccc aggcccccca aagtgaccaa ggaggagcac 1380

ttccagctgc accaccagat gcactatagc cagcagatca ccgtgtccct ggcccagggc 1440

tatgagagaa ccagcagccc caagcccaga ttcaagagct acgcctacac ccaggccgcc 1500

tacgtgacca cctccgaccc caccagaagc cccttcccca gccagcacct ggaggccccc 1560

gaggacaaga gcttcggcag cagcctgatg gagagcgaag tgaacctgga cagataccag 1620

accgccctgg aggaagtgct gtcttggctg ctgtccgccg aggacaccct gcaggcccag 1680

ggcgagatca gcaacgacgt ggaagtggtg aaggaccagt tccacaccca cgagggctac 1740

atgatggatc tgaccgccca ccagggcaga gtgggcaata tcctgcagct gggcagcaag 1800

ctgatcggca ccggcaagct gagcgaggac gaggagaccg aagtgcagga gcagatgaac 1860

ctgctgaaca gcagatggga gtgcctgaga gtggccagca tggagaagca gagcaacctg 1920

caccgcgtgc tgatggacct gcagaaccag aagctgaagg agctgaacga ctggctgacc 1980

aagaccgagg agcggaccag aaagatggag gaggagcccc tgggccccga cctggaggac 2040

ctgaagagac aggtgcagca gcacaaagtg ctgcaggagg acctggaaca ggagcaggtg 2100

cgcgtgaaca gcctgaccca catggtggtc gtggtggacg agagcagcgg cgaccacgcc 2160

acagccgccc tggaagagca gctgaaagtg ctgggcgaca gatgggccaa catctgccgg 2220

tggaccgagg acagatgggt gctgctgcag gacatcctgc tgaagtggca gagactgaca 2280

gaggagcagt gcctgtttag cgcctggctg agcgagaagg aggacgccgt gaacaagatc 2340

cacaccaccg gcttcaagga ccagaacgag atgctgagca gcctgcagaa gctggccgtg 2400

ctgaaggccg atctggagaa gaaaaagcag agcatgggca agctgtactc cctgaagcag 2460

gacctgctgt ccaccctgaa gaacaagagc gtgacccaga aaaccgaggc ctggctggac 2520

aatttcgccc ggtgctggga caatctggtg cagaaactgg agaagagcac cgcccagatc 2580

agccaggccg tgaccaccac ccagcccagc ctgacacaga ccaccgtgat ggagaccgtg 2640

accacagtga ccaccaggga gcagatcctg gtgaagcacg cccaggagga gctgccccct 2700

cccccccctc agaagaagcg gcagatcaca gtggacaccc tggagagact gcaggagctg 2760

caggaagcca ccgacgagct ggacctgaag ctgagacagg ccgaagtgat caagggcagc 2820

tggcagcctg tgggcgatct gctgatcgac agcctgcagg accacctgga gaaagtgaag 2880

gccctgcggg gcgagatcgc ccccctgaag gagaatgtga gccacgtgaa cgacctggcc 2940

agacagctga ccaccctggg catccagctg agcccctaca atctgagcac cctggaagat 3000

ctgaacaccc ggtggaaact gctgcaggtg gccgtggagg atagagtgag gcagctgcac 3060

gaggcccaca gagacttcgg ccctgcctcc cagcacttcc tgagcaccag cgtgcagggc 3120

ccctgggaga gagccatctc ccccaacaaa gtgccctact acatcaacca cgagacccag 3180

accacctgct gggaccaccc taagatgacc gagctgtacc agagcctggc cgacctgaac 3240

aatgtgcggt tcagcgccta cagaaccgcc atgaagctgc ggagactgca gaaggccctg 3300

tgcctggacc tgctgagcct gagcgccgcc tgcgacgccc tggaccagca caacctgaag 3360

cagaacgacc agcccatgga cattctgcag atcatcaact gcctgaccac catctacgat 3420

cggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcccc tgtgcgtgga catgtgcctg 3480

aattggctgc tgaacgtgta cgacaccggc aggaccggca gaatcagagt gctgtccttc 3540

aagaccggca tcatcagcct gtgcaaggcc cacctggagg ataagtaccg ctacctgttc 3600

aagcaggtgg ccagcagcac cggcttctgc gatcagagga gactgggcct gctgctgcac 3660

gatagcatcc agatccctag gcagctgggc gaagtggcca gctttggcgg cagcaacatc 3720

gagccctctg tgaggagctg cttccagttc gccaacaaca agcccgagat cgaggccgcc 3780

ctgttcctgg attggatgag gctggagccc cagagcatgg tgtggctgcc tgtgctgcac 3840

agagtggccg ccgccgagac cgccaagcac caggccaagt gcaacatctg caaggagtgc 3900

cccatcatcg gcttccggta caggagcctg aagcacttca actacgacat ctgccagagc 3960

tgctttttca gcggcagagt ggccaagggc cacaagatgc actaccccat ggtggagtac 4020

tgcaccccca ccacctccgg cgaggatgtg agagacttcg ccaaagtgct gaagaataag 4080

ttccggacca agcggtactt tgccaagcac cccaggatgg gctacctgcc cgtgcagacc 4140

gtgctggagg gcgacaacat ggagaccgac accatgtgat gatgagcggc cgcttccctt 4200

tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 4260

acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 4320

tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 4380

tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt 4440

ggtaaaatcc gataaggact agagcatggc tacgtagata agtagcatgg cgggttaatc 4500

attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 4560

ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 4620

gtgagcgagc gagcgcgcag 4640

4643

DNA

人工序列

AAV_ITR_Spc512-犬 MD1