經改進的斯達汀生產的製作方法

2023-12-02 08:51:41

專利名稱：經改進的斯達汀生產的製作方法
技術領域：
本發明涉及斯達汀的發酵方法。
背景技術：
斯達汀(statin)類的降膽固醇劑是非常重要的藥物，因為它們通過抑制HMG-CoA 還原酶降低血中的膽固醇濃度。後一酶催化膽固醇生物合成中的限速步驟，即(3S)-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A(HMG-CoA)到甲羥戊酸的轉化。市場上存在若干種類型的斯達汀，其中有阿託伐他汀(atorvastatin)、制甲羥酶素、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀 (simvastatin)和普伐他汀。阿託伐他汀通過化學合成製造，而上文提到的其它或者通過直接發酵或者通過前體發酵生產。這些(前體)發酵通過Penicillium、Aspergillus和 Monascus屬的真菌進行。在異源宿主(即如Penicillium chrysogenum等宿主，其天然不生產斯達汀且其中弓I入了來自天然斯達汀生產者例如Penicillium citrinum或Aspergillus terreu 的完整斯達汀途徑基因)中發酵這些化合物時存在常見問題，因為使用的異源菌株的生產力和產率較低。早前公開了若干技術，包括通過UV誘變進行對斯達汀生產菌株的經典改進(J. Gen. Appl. Microbiol. (2004)，Vol. 50，p. 169-176)。另外，描述了用對應於來自 Penicillium citrinum的基因mlcR的多核苷酸對斯達汀生產生物Penicillium citrinum 的轉化。然而，這兩種技術均未導致異源宿主中斯達汀生產的改進。儘管WO 2007/122249 中公開了使用以工業水平進行生產的Penicillium chrysogenum菌株的另一途徑，但是此種途徑的問題在於用於工業生產的微生物不總是可獲得的和/或合適的。仍然存在對替代性途徑的需要。發明詳述術語「表達」包括涉及多肽生產的任何步驟，其可包括轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。當核酸構建體含有編碼序列在特定宿主生物中表達所需的所有控制序列時，術語 「核酸構建體」與術語「表達載體」或「盒」同義。術語「控制序列」在本文中被定義為包括對多肽的表達來說必需的或有利的所有組件。每種控制序列對編碼多肽的核酸而言可以是內源的(native)或外源的(foreign)。 這類控制序列可包括，但不限於啟動子、前導序列、最適翻譯起始序列(如Kozak，1991， J. Biol. Chem. 266 19867-19870中所述)、分泌信號序列、前肽序列、多聚腺苷酸化序列、轉錄終止子。控制序列至少包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。控制序列可以是含有轉錄控制序列的適當的啟動子序列。啟動子可以是在細胞中顯示轉錄調控活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜交的啟動子，它們可得自編碼細胞外或細胞內多肽的基因。啟動子對細胞或多肽而言可以是同源的或異源的。啟動子可以源自供體物種，或源自任何其它來源。控制真核生物中表達水平的一種備選方式是使用內含子。高等真核生物具有由外顯子和內含子組成的基因。術語「外顯子」在本文中被定義為包括開放讀碼框(ORF)的所有組件，其被翻譯為蛋白質。術語「內含子」在本文中被定義為包括所有不包括於開放讀碼框中的組件。術語「開放讀碼框」在本文中被定義為下述多核苷酸，其從甲硫氨酸的密碼子序列ATG開始，隨後是連續的一串編碼所有可能的胺基酸的密碼子，在一定數量後被終止密碼子打斷。該開放讀碼框可以被翻譯為蛋白質。含有分離自基因組的基因的多核苷酸是該基因的所謂的基因組DNA或gDNA序列，其包括所有外顯子和內含子。含有通過反轉錄反應分離自mRNA的基因的多核苷酸是該基因的所謂的拷貝DNA或cDNA序列，其僅包括外顯子，而內含子通過細胞機制被切除。後一類型的DNA尤其適用於在原核宿主中表達感興趣的真核基因。也可以合成製造兩種類型DNA的變體，這使得改變內含子的確切核苷酸序列或改變感興趣的基因中內含子數量成為可能。這也使得向來自原核起源的感興趣的基因中添加內含子以簡化或改進在真核宿主中的表達成為可能。另外，也可以在上述控制序列如啟動子、多聚腺苷酸化位點或轉錄終止子中引入內含子。內含子的存在、不存在、變異或引入是調節真核細胞中基因表達水平的一種手段。術語「可操作地連接」在本文中被定義為下述構型，其中控制序列被適當地置於與 DNA序列的編碼序列相關的位置，使得控制序列能指導多肽的生產。術語「普伐他汀」在本文中被定義為在6'位置上具有α-或β-構象的6'-羥基取代的制甲羥酶素，或α-和構象二者的混合物，並包括閉合的結構(帶有內酯環) 和開放的結構(具有羥基羧酸部件)二者。在本發明的上下文中，制甲羥酶素、普伐他汀、無錫他汀(WUXistatin)、紅曲米素 J(monacolin J)、洛伐他汀和/或辛伐他汀(通常稱作「斯達汀」)「生物合成基因」或「生物合成途徑」包括編碼直接涉及斯達汀分子合成的酶的所有基因，編碼斯達汀分子的分泌中的酶的所有基因，和編碼涉及前兩類基因的轉錄調節的蛋白質的所有基因。此外，還包括能夠生產斯達汀的微生物宿主的所有下述基因，所述基因通過過表達或失活引起生產能力的顯著改變(即分別導致生產至少增加20%的斯達汀或生產至少減少20%的斯達汀)。特定的基因是(但不限於)=Penicillium citrinum的制甲羥酶素生物合成基因簇(即mlcA、 mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcH、mlcG、mlcR，見 Entrez 資料庫登記號 AB072893 ；Abe Y, Suzuki Τ,Ono C, Iwamoto K, Hosobuchi M and Yoshikawa H, MoI Genet Genomics 2002, 267 636-646)，Aspergillus terreus 的洛伐他汀生物合成基因簇(即 0RF1、0RF2、ΙονΑ、 0RF5、lovC、lovD、0RF8、lovE、0RF10, IovF, 0RF12、0RF13、0RF14、0RF15、0RF16、細胞色素 P450 單氧合酶、0RF18 ；見 Entrez 資料庫登記號 AF141924 和 AF141925 ；Kennedy J, Auclair K,Kendrew SG,Park C,Vederas JC and Hutchinson CR,Science 1999,284:1368-1372)， Monascus pilosus 的紅曲米素 K 生物合成基因簇(即 mkA、mkB、mkC、mkD、mkE、mkF、mkG、mkH 禾口 mkl ；見 Entrez 資料庫登記號 DQ17659，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer, fcgi ？ db = nuccore&id = 74275560)，及其源自其它物種的基本同源物。實際的斯達汀生物合成途徑可得自單個供體宿主或得自多於一個宿主，或(部分)由合成的多核苷酸組成。就本發明的目的而言，兩條胺基酸序列之間的同一性程度是指兩條序列之間相同的胺基酸的百分比。使用BLAST算法測定同一性程度，所述BLAST在Altschul，et al. (J. Mol. Biol. 215 =403-410(1990))中描述。用於進行BLAST分析的軟體是公眾可以通過 National Center for Biotechnology Information(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)獲得的。BLAST算法參數W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用下述作為默認詞長(W) 11、BL0SUM62 評分矩陣(見 Henikoff&HenikofT，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915 (1989))、比對(B) 50、預期(E) 10、M = 5、N = _4 並比較兩條鏈。基本同源的多肽可僅含有特定胺基酸序列的一個或多個胺基酸的保守取代，或非必需胺基酸的取代、插入或缺失。因此，非必需的胺基酸是在這些序列之一中可以被改變而不顯著改變生物功能的殘基。例如，涉及如何製造表型沉默胺基酸取代的指南在Bowie， J.U.et al. (Science 247 1306-1310 (1990))中提供，其中作者指出存在兩種研究胺基酸序列對改變的耐受的途徑。第一種方法依賴於進化過程，其中突變被自然選擇接受或拒絕。 第二種途徑使用基因工程在被克隆的基因的特定位置上引入胺基酸改變，並選擇或篩選以鑑定維持功能性的序列。如作者所述，這些研究解釋了蛋白質驚人地耐受胺基酸取代。作者還指出在蛋白質的某位置上何種改變可能是允許的。例如，大部分被埋藏的胺基酸殘基需要非極性側鏈，而表面側鏈通常很少有特徵是保守的。其它這類表型沉默取代被描述於 Bowie et al和其中所引用的參考文獻中。術語「保守取代」旨在表示下述取代，其中胺基酸殘基被替換為具有相似側鏈的胺基酸殘基。這些家族是本領域已知的，並包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電的極性側鏈的胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支鏈的胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的胺基酸 (例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。本發明的一個目的是提供經改進的斯達汀(如制甲羥酶素、洛伐他汀、普伐他汀、 辛伐他汀和無錫他汀)生產方法，從而克服具有轉錄活化子(如mlcR)的重組斯達汀生產菌株的低斯達汀生產力的問題。本發明解決了異源微生物(即這樣的微生物，其天然不具有斯達汀生物合成途徑,但整合了來自其它生物如Aspergillus terreus或Penicillium citrinum的斯達汀生物合成途徑)的低斯達汀生產力的問題。如本發明中所述，通過添加被整合的斯達汀途徑 (如來自Penicillium citrinum的制甲羥酶素途徑)的另一轉錄調節子基因解決了所述問題。優選地，被整合的斯達汀途徑(如來自Penicillium citrinum的制甲羥酶素途徑) 的可能的轉錄調節子基因與同源的活化子交換，如洛伐他汀轉錄活化子ΙονΕ。本發明公開了 如果用IovE或具有高度同源性的IovE類似物代替原始的轉錄調節子mlcR，則異源帶有Penicillium citrinum斯達汀途徑的微生物顯示更高的斯達汀生產力。因為IovE自身僅與mlcR中度同源(遺傳水平上的同一性為65%，胺基酸水平上的同一性為40% )，所以本發明的有利結果是出人意料地令人驚訝的。在本發明的第一個方面，提供了包含異源斯達汀生物合成基因轉錄活化子的真菌菌株。在一個實施方案中提供了生產斯達汀的菌株，所述菌株不是Aspergillus terreus,其含有斯達汀生物合成所需的所有基因，並含有來自Aspergi 1 Ius terreus 的IovE基因。優選地，本發明提供了源自生產菌株(例如WO 2007/122249中所述的 Penicillium chrysogenum)的生產制甲羥酶素的宿主細胞。所述生物經歷若干輪經典的菌株改進和隨後的適應和改進過程，以實現目前的高效價青黴素G發酵過程。生物的DNA中大量的改變不僅導致針對產物青黴素G的提高的通量和產量，而且還導致針對150，000-升發酵管中苛刻條件(即氧限制、剪切力、葡萄糖限制等等)的形態學改變和適應。通過缺失內醯胺生物合成機制，獲得了下述菌株，所述菌株缺乏內醯胺生產能力，但是仍然保持所有下述突變，所述突變導致工業規模上的良好性能，例如剪切力抗性、適合按比例放大、針對代謝產物的高代謝通量、適應確定的培養基、工業順流加工(down stream processing)和低粘度模式(即形態學、調節和代謝突變)。在本發明的Penicillin chrysogenum菌株中，至少編碼異青黴素N合酶的β -內醯胺生物合成基因pcbC被失活。優選地，其它內醯胺生物合成基因也被失活，所述基因是編碼L-(a_氨基己二醯基)-L-半胱氨醯-D-纈氨酸合成酶的pcbAB和/或編碼醯基-輔酶A 異青黴素N醯基轉移酶的penDE。更優選地，通過去除基因的部分來失活基因。最優選的是完全去除基因序列。因為這些基因的完全去除產生下述Penicillium chrysogenum菌株，所述菌株缺乏任何β-內醯胺生物合成能力並因此是非常適合於生產所有種類產物的菌株。儘管事實上工業生物可能是非常難以操作的，但是該Penici 11 ium chrysogenum菌株驚人地易於轉化，並能夠以比天然生產宿主高得多的效價生產斯達汀。儘管不是本發明所必需的，但是優選地從能夠在工業環境中生產的生物獲得 Penicillium chrysogenum突變體。這類生物典型地可被定義為具有高生產力和/或基於消耗的碳源的高產物產率和/或基於產生的生物質數量的高產物產率和/或高生產力率和/或高產物效價。這類生物極其適合於轉化為制甲羥酶素宿主細胞。對生產青黴素G 的Penicillium chrysogenum菌株而言，這類高效價是高於1. 5g/L青黴素G，優選地高於 2g/L青黴素G，更優選地高於3g/L青黴素G，最優選地高於4g/L青黴素G的效價。前述數值應用於在複合發酵培養基(每升含有乳糖，40g/L ；玉米浸漬固體；20g/L ；CaCO3,10g/L ； KH2PO4, 7g/L ；苯乙酸，0. 5g/L ；pH 6. 0)中96小時後的發酵效價。合適的工業菌株是實驗部分(一般方法)中提到的菌株。Penicillium chrysogenum的所有工業菌株系經歷了多輪經典的菌株改進，導致三種常見的突變類型(i)直接擴增生物合成基因，導致青黴素代謝產物途徑的酶活性提高(ii)修飾初級代謝基因，最後導致多種適應的代謝重排，均引起針對終產物的更高通量。例子增加的胺基酸構建塊合成，減少的苯乙酸的消耗等等。(iii)細胞結構修飾，導致形態學、膜組成、細胞器組織的改變，從而「有助於」高代謝通量和以工業規模發酵。例子增加的過氧化物酶體數，其為青黴素合成的「裝配線」之
ο與第(ii)和(iii)類相比，在⑴類突變類型中DNA水平有顯著不同。儘管後兩類主要是鹼基對水平上經分離的突變、缺失、重複和/或改變，但是(i)類中的突變是非常不同的60到IOOkb區的擴增，其導致基因組中若干直接的和反向的重複。這有時候導致顯著的遺傳不穩定性，得到不穩定和可變的群體。事實上，這表示在給定的青黴素生產菌株中， (ii)和(iii)類的所有突變是固定的，但是(i)類中突變的精確拷貝數可以波動。使用該原則和本領域技術人員已知的技術，可以獲得穩定的分離株，其中僅一個拷貝的青黴素生物合成基因仍然存在。取決於初始菌株的拷貝數，可以在一、二、三或若干輪篩選和選擇中獲得該狀況。就該特定的特徵而言，然後分離株可與物種的模式株(type strain)NRRL1951及經典菌株改進後其第一代後代直到Wisconsin 54-1255相比，所有菌株均含有一個拷貝的青黴素生物合成基因。主要的差異是來自高生產菌株的一拷貝分離株仍然含有(ii)和 (iii)類的所有其它突變，使其與從NRRL1951到Wisconsin 54-1255的菌株相比成為工業高生產菌株。隨後，可以使用本領域工藝水平(state-of-the-art)重組技術缺失最後一組青黴素生物合成基因。這些步驟的詳細綜述在實施例中給出，並概括於以下的步驟中(a)從Penicillium菌株分離分離株，其具有單個基因組拷貝的青黴素基因簇(b)從步驟(a)中獲得的分離株中缺失基因pcbC(c)從步驟(a)或(b)中獲得的分離株中任選地缺失基因pcbAB和/或penDE。基因可以被部分失活。更優選地，基因序列被完全去除。因為這些基因的完全去除產生下述Penicillium chrysogenum菌株，所述菌株缺乏任何β-內醯胺生物合成能力並因此是非常適合於生產所有種類產物的菌株。可以使用的重組技術是本領域技術人員公知的(艮口單交叉或雙同源重組(Single Cross Over or Double Homologous Recombination))。缺失和置換的一個優選的策略是EP 357，127中描述的基因置換技術。如EP 635，574所述，優選地使用amdS基因作為選擇標記物，進行對基因和/或啟動子序列的特定缺失。藉助於在氟乙醯胺培養基(EP 635，574)上的反選擇，得到的菌株是不含選擇標記物的，並可用於進一步的基因修飾。或者可以使用，或與其它提到的技術組合使用基於 Escherichia coli 中粘粒體內重組的技術，如Chaveroche et al. (2000,Nucl Acids Res, 28，E97)所述。該技術適用於其它絲狀真菌，例如Penicillium chrysogenum。此外，用於去除擴增的基因組片段的相同原則也可用於其它工業生產物種中，其中經典的菌株改進程序已經誘導了基因和基因組重複。另外，此處，(ii)和(iii)類的額外突變是固定的，並確保該菌株能夠在工業發酵過程中茁壯生長。這類Penicillium chrysogenum細胞可以用下述基因裝備，所述基因編碼制甲羥酶素生物合成必需的所有蛋白質和酶。這可以是一個或多個斯達汀生物合成基因，例如被描述為涉及制甲羥酶素生物合成的八個Penicillium citrinum基因(Abe et al., 2002, MoI Genet Genomics 267 636-646 ；Abe et al. ,2002, MoI Genet Genomics 268 130-137)編碼聚酮化合物合酶的mlcA ；編碼聚酮化合物合酶的mlcB ；編碼P450單加氧酶的mlcC ；編碼HMG-CoA還原酶的mlcD ；編碼流出泵的mlcE ；編碼氧化還原酶的mlcF ；編碼脫氫酶的mlcG;編碼轉酯酶的mlcH。Abe et al.還描述了轉錄調節子mlcR，其對於制甲羥酶素生物合成是關鍵性的，並且添加至細胞時也可以提高Penicillium citrinum菌株的制甲羥酶素水平。還可以使用展示類似活性的任何同源基因。在本發明中公開了轉錄調節子基因mlcR可以被來自Aspergillus terreus的 IovE代替。LovE轉錄調節子蛋白質與來自Penicillium citrinum的轉錄活化子MlcR共享40%的序列同一性。因此未預期IovE能夠取代mlcR的功能。然而令人驚訝的是，LovE 轉錄調節子蛋白質不僅能夠代替來自Penicillium citrinum的轉錄活化子MlcR的功能， 其甚至導致提高的生產力。或者，與IovE基因同源的基因可以被用於改進異源宿主細胞中的斯達汀生產。優選地，所述基因應當與IovE基因70%同源；更優選地，所述基因應當與 IovE基因80%同源；進一步更優選地，所述基因應當與IovE基因90%同源。同樣的原則可被用於得到其它真核物種(非Aspergillus terreus)的合適的制甲羥酶素生產宿主細胞，及其工業衍生物，例如但不限於:Aspergillus niger、Penicillium brevicompactum、 Penicillium citrinum、Aspergillus oryzae> Trichoderma reesei> Chrysosporium lucknowense、Saccharomyces cerevis iae、Kluyveromyceslactis> Monascus ruber、 Monascus paxii> Mucor hiemalis、Pichia ciferrii 禾口 Pichia pastoris。這些物禾中的工業衍生物經歷若干輪的經典誘變，隨後是針對改進的工業生產特性的篩選和選擇，這使得它們特別適用於本發明。通過去除(即缺失)不想要的產物的部分或全部途徑，該菌株保留其期望的工業發酵特性和朝向代謝產物(包括酶)的高通量。可以通過使用具有改進的動力學特性的同源蛋白質來改進位甲羥酶素的生產。這類「同源物，，或「同源序列，，被定義為編碼下述多肽的DNA序列，所述多肽顯示由分離自供體物種的原始DNA序列編碼的多肽的至少一種活性，並具有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列與特定的DNA序列編碼的蛋白質的胺基酸序列具有一定程度的同一性。具有對制甲羥酶素生物合成基因「基本同源」的胺基酸序列的多肽被定義為具有下述胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與特定的胺基酸序列具有至少25%、更優選地至少30%、更優選地至少40%、更優選地至少50%、進一步更優選地至少60%、進一步更優選地至少70%、進一步更優選地至少80%、進一步更優選地至少90%、進一步更優選地至少98%和最優選地至少99%的同一性程度，該基本同源的肽展示朝向制甲羥酶素和/或制甲羥酶素前體合成的活性。使用該途徑可以獲得多種優點，例如克服反饋抑制、促進分泌和減少副產物形成。同源序列可包括下述多態性，所述多態性由於天然的等位基因變異或菌株內(intra-strain) 變異而存在於來自不同種群或一個種群的細胞中。同源物還可來源於除特定的DNA序列來自的物種之外的物種，或可以是人工設計和合成的。與特定的DNA序列相關的和通過密碼子簡併獲得的DNA序列也是本發明的部分。同源物也可包括全長序列的生物活性片段。尤其感興趣的是通過合成手段分離的同源序列。通過該方法可以在計算機晶片上設計要被引入制甲羥酶素生產宿主細胞中的基因的所有可能的變體。這帶來了下述機會 適應基因的密碼子使用以便於它們在制甲羥酶素生產宿主細胞中被最優表達；去除和引入限制性酶和/或位點特異重組酶的相關序列和製造基因的不同組合。另外，可以使用下述生物合成基因簇，其不是同源的，但是遵循用於抑制素合成的相同的生物合成構建原則。本發明的核酸構建體，例如表達構建體，含有至少一個感興趣的基因，但是通常含有若干個感興趣的基因；每個基因與一條或多條控制序列可操作地連接，所述控制序列指導編碼的多肽在制甲羥酶素生產宿主細胞中的表達。核酸構建體可以在一條DNA片段上或在多條獨立的片段上。這些核酸構建體也可以被整合在一個染色體基因座上或若干個染色體基因座上。為了獲得可能的最高生產力，所有感興趣的基因的平衡表達是關鍵性的。因此，一系列啟動子可以是有用的。絲狀真菌細胞如Penicillium chrysogenum應用的優選的啟動子是本領域已知的，並可以是例如來自Penicillium citrinum的基因的啟動子；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 gpdA 啟動子；PeniciIlium chrysogenum pcbAB、pcbC 和 penDE 啟動子；蛋白酶啟動子如ρ印Α，ρ印B，ρ印C ；葡萄糖澱粉酶glaA啟動子；澱粉酶amyA，amyB啟動子；過氧化氫酶catR或catA啟動子；葡萄糖氧化酶goxC啟動子；β -半乳糖苷酶IacA啟動子；α -葡萄糖苷酶aglA啟動子；翻譯延長因子tefA啟動子；木聚糖酶啟動子如xlnA， xlnB，xlnC，xlnD ；纖維素酶啟動子如eglA，eglB，cbhA ；轉錄調節子的啟動子如areA，creA，XlnR，paCC，prtT，alCR或任何其它。所述啟動子可尤其由技術人員在NCBI網站(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/)上容易地發現。在來自除絲狀真菌物種外其它的制甲羥酶素生產宿主細胞的情況下，對啟動子的選擇由對宿主的選擇決定。優選地，啟動子來自高度表達(在本文中定義為具有至少0.5% (w/w)的總細胞 mRNA的mRNA濃度)的基因。啟動子可以來自中度表達(在本文中定義為具有至少0. 01 % 直到0.5% (w/w)的總細胞mRNA的mRNA濃度)的基因。在另一個優選的實施方案中，啟動子可以來自低表達(在本文中定義為低於0.01% (w/w)總細胞mRNA的mRNA濃度)的基因。更優選地，使用微陣列數據來選擇基因，並從而選擇具有某轉錄水平和調價的這些基因的啟動子。藉此，可以將基因表達盒改造為最適合其要發揮功能的條件。這些啟動子片段可以來自許多來源，即不同的物種、PCR擴增的、合成的等等。控制序列還可以包括合適的轉錄終止序列，這是被真核細胞識別為終止轉錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3』末端可操作地連接。在細胞中有功能的任何終止子都可用於本發明中。絲狀真菌細胞優選的終止子得自編碼以下的基因Aspergillus oryzae TAKA澱粉酶；Penicillium chrysogenum pcbAB，pcbC禾口penDE終止子；Aspergillu sniger 葡萄糖澱粉酶；Aspergillus nidulans 鄰氨基苯甲酸合酶；Aspergillus niger α -葡萄糖苷酶；Aspergillus nidulans trpC 基因；Aspergillus nidulans amdS ； Aspergillus nidulans gpdA ；Fusarium oxysporum 胰蛋白酶樣蛋白酶。進一步更優選的終止子是來自天然生產者Penicillium citrinum的基因的終止子。在來自除絲狀真菌物種以外其它的制甲羥酶素生產宿主細胞的情況下。對終止序列的選擇將由對宿主的選擇決定。控制序列也可以是合適的前導序列，這是對細胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區。前導序列與編碼多肽的核酸序列的5』端可操作地連接。在細胞中有功能的任何前導序列可以用於本發明中。絲狀真菌細胞優選的前導序列得自編碼Aspergillus oryzae TAKA澱粉醇禾口 Aspergillus nidulans 憐酸丙糖異構醇禾口 Aspergillus niger glaA 的基因。控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，其與核酸3』端可操作地連接，並且在轉錄後被絲狀真菌細胞識別為對經轉錄的mRNA添加多聚腺苷殘基的信號。在細胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列可以被用於本發明中。對絲狀真菌細胞來說優選的多聚腺苷酸化序列得自編碼下述的基因Aspergillus oryzae TAKA澱粉酶；AspergiIlus niger葡萄糖澱粉酶；Aspergillus nidulans鄰氨基苯甲酸合酶；Fusarium oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶禾口 Aspergillus niger α -葡萄糖苷酶。對於待分泌的多肽而言，控制序列也可包括編碼與多肽氨基端連接的胺基酸序列的信號肽-編碼區，其能夠指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核酸編碼序列的5』端可固有地含有與編碼區區段按照翻譯讀碼框天然連接的信號肽-編碼區，所述編碼區區段編碼被分泌的蛋白質。或者，編碼序列的5』端可含有信號肽-編碼區，其對於編碼序列來說是外源的。當編碼序列不正常地含有信號肽-編碼區時，外源信號肽-編碼區可能是必需的。或者，外源信號肽-編碼區可以簡單地替換天然的信號肽-編碼區，從而獲得多肽的增強的分泌。在真核制甲羥酶素生產宿主細胞的情況下，控制序列可包括細胞器靶向信號。這類序列由與多肽連接的胺基酸序列編碼，其能夠針對細胞中最終的目的地(即區室或細胞器)。核酸序列編碼序列的5』或3』端可固有地含有與編碼區區段按照翻譯讀碼框天然連接的這些靶向信號編碼區，所述編碼區區段編碼多肽。多種序列是本領域技術人員公知的， 並可被用於將蛋白質靶向區室如線粒體、過氧化物酶體、內質網、高爾基體、液泡、細胞核等寸。核酸構建體可以是表達載體。表達載體可以是任何載體(例如質粒或病毒)，其可便利地進行重組DNA步驟並可導致編碼多肽的核酸序列的表達。載體的選擇應典型地取決於載體與要引入載體的細胞的相容性。載體可以是線性的或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其複製不依賴於染色體的複製，例如質粒、染色體外元件、小染色體或人工染色體。用於絲狀真菌的自主維持的克隆載體可包括 AMAl-序列(見例如 Aleksenko and Clutterbuck (1997), Fungal Genet. Biol. 21 373-397)。或者，載體可以是下述載體，當其被引入細胞時整合進基因組中，並與其被整合在其中的染色體一起複製。整合型克隆載體可以隨機或在預先確定的靶基因座上整合進宿主細胞的染色體中。在本發明的一個優選的實施方案中，整合型克隆載體包括與宿主細胞基因組中預先確定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用於將克隆載體的整合靶向該預先確定的基因座上。為了促進定向整合，克隆載體優選地在轉化宿主細胞前被線性化。 優選地進行線性化使得克隆載體的至少一端(但是優選任一端)側翼是與靶基因座同源的序列。靶基因座側翼的同源序列的長度優選地至少0. 11Λ，進一步優選地至少0. 21Λ，還更優選地至少0. 51Λ，進一步更優選地至少11Λ，最優選地至少21Λ。優選地通過增強的宿主細胞的同源重組能力來提高核酸構建體通過同源重組定向整合進宿主細胞基因組中(即預先確定的靶基因座中的整合)的效率。細胞的這類表型優選地涉及如WO 05/95624中所述的缺陷的hdfA或hdfB基因，及其任何改進。WO 05/956M公開了獲得包含提高的定向整合效率的絲狀真菌細胞的優選方法。載體系統可以是單個載體或質粒，或者可以是兩個或多個載體或質粒，其共同含有要被引入宿主細胞基因組中的總DNA。然而在本發明中，構建體優選被整合進宿主菌株的基因組中。因為這是隨機的過程，所以這甚至能夠導致基因組基因座中的整合，其高度適合於驅動基因表達，產生大量的酶並由此產生高的生產力。可以通過原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁再生來轉化真菌細胞。用於轉化真菌宿主細胞的合適步驟被描述於EP 238，023 *hlton et al. (1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :1470-1474)中。使用 Agrobacterium tumefaciens 轉化絲狀真菌宿主細胞的合適步驟由 de Groot M. J. et al. (1998,Nat Biotechnol 16 :839-842 ；Erratum in :1998, Nat Biotechnol 16 :1074)描述。也可使用針對Neurospora crassa描述的其它方法，如電穿孔。使用共轉化來轉化真菌細胞，即與感興趣的基因一起還轉化了可選擇的標記物基因。其可以與感興趣的基因物理連接(即在質粒上)，或位於獨立的片段上。轉染後，針對該選擇標記物基因的存在篩選轉化體，並隨後分析感興趣的基因的存在。可選擇的標記物是提供針對殺生物劑或病毒的抗性、針對重金屬的抗性、針對營養缺陷型的原養型等等的產物。有用的可選擇標記物包括amdS(乙醯胺酶)、argB (鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)、 bar (膦絲菌素醯基轉移酶)、hygB (潮黴素磷酸轉移酶)、niaD (硝酸鹽還原酶)、pyrG (乳清苷-5』 -磷酸鹽脫羧酶)、sC或sutB (硫酸鹽腺嘌呤基轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)、ble (腐草黴素抗性蛋白質)或其等同物。同樣的原則可被用於得到原核物種的合適的制甲羥酶素生產宿主細胞，及其工業存 生物，例如但不限於:Streptomyces clavuligerus、Streptomyces avermitilis、 Streptomyces peucetius、 Streptomyces coelicolor、 Streptomyces lividans、 Streptomyces carbophilus、Amycolatopis orientalis、Corynebacterium glutamicum 禾口 Escherichia coli。這些物種的工業衍生物經歷了若干輪的經典誘變，隨後是針對改進的工業生產特性的篩選和選擇，這使得它們特別適用於本發明。通過去除(即缺失)不想要的產物的部分或全部途徑，該菌株保留其期望的工業發酵特性和朝向代謝產物(包括酶) 的高通量。此處，所有斯達汀生物合成基因需要通過本領域工藝水平(state-of-the-art) 方法被修飾，從而在原核細胞中被功能性地表達。本領域技術人員應當明白這涉及可與上文針對真核生物所列出的比較的多個步驟，包括但不限於·獲得cDNA或合成的DNA (以排除真核內含子)·任選地施用密碼子最優化·在原核生物中裝配啟動子·在原核生物中裝配終止子 通過載體功能引入原核生物中。在本發明的第二實施方案中，提供了一種宿主微生物，其包含將制甲羥酶素轉化為普伐他汀必須的基因。優選地使用下述真菌宿主，所述真菌宿主包含制甲羥酶素生物合成必需的基因(一種或多種以下基因編碼聚酮化合物合酶的mlcA ；編碼聚酮化合物合酶的mlcB ；編碼P450單加氧酶的mlcC ；編碼HMG-CoA還原酶的mlcD ；編碼流出泵的mlcE ；編碼氧化還原酶的mlcF ；編碼脫氫酶的mlcG ；編碼轉酯酶的mlcH，轉錄調節子ΙονΕ，包括所有同源的功能活性基因)，並且還整合了編碼P450制甲羥酶素羥化酶的基因。優選地，所述P450制甲羥酶素羥化酶基因來自Amycolatopsis Orientalis0更優選地，P450制甲羥酶素羥化酶基因與來自WO 2008/071673的SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 680%同源。進一步更優選地，P450制甲羥酶素羥化酶基因與來自WO 2008/071673的SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5相同。本發明的範圍不限於這些特定的例子。在第三個實施方案中公開了下述宿主微生物，所述微生物提供斯達汀紅曲米素J 的生產必需的基因。使用不是Aspergillus terreus的真菌宿主。最優選地，真菌宿主是 Penicillium chrysogenum。真菌宿主包括紅曲米素J生物合成所需的基因(Abe et al., 2002, MoI Genet Genomics 267 :636-646 ；Abe et al. ,2002, MoI Genet Genomics 268 130-137 中描述的所有 mlc 基因，而 Iov 基因描述於 Kennedy et al.，1999，Science 284, 1368-1372中)編碼聚酮合酶的IovB ；編碼P450單氧合酶的mlcC ；編碼HMG-CoA還原酶的mlcD ；編碼流出泵的mlcE ；編碼氧化還原酶的mlcF ；編碼脫氫酶的mlcG ；編碼轉酯酶的 mlcH，轉錄調節子ΙονΕ。可以通過使用如本發明所述的具有經改進的動力學特性的同源蛋白，來進一步改進使用此類微生物宿主進行的紅曲米素J生產。在第四個實施方案中公開了提供洛伐他汀生產所需基因的微生物。所述微生物 (優選地是真菌，但不是Aspergillus terreus,進一步更優選地是絲狀真菌，最優選地是 Penicillium chrysogenum)可包含導致洛伐他汀生產的基因的下述組中的一種或多種 (所有 mlc 基因描述於 Abe et al. ,2002,Mo I Genet Genomics 267 :636-646 ；Abe et al.,2002，MoI Genet Genomics 268 :130-137 中，而 Iov 基因描述於 Kennedy et al.，1999， Science 284，1368-1372中)編碼聚酮合酶的mlcB ；編碼聚酮合酶的IovB ；編碼P450單氧合酶的mlcC ；編碼HMG-CoA還原酶的mlcD ；編碼流出泵的mlcE ；編碼氧化還原酶的mlcF ； 編碼脫氫酶的mlcG;編碼轉酯酶的mlcH，轉錄調節子ΙονΕ。本發明不限於提到的基因，其還包括同源蛋白質。在本發明的第五個實施方案中，公開了生產紅曲米素J的微生物，所述微生物還可以被用於生產辛伐他汀。在生產紅曲米素J的微生物的生長期間，向培養物添加化合物 2，2- 二甲基丁酸或2，2- 丁酸前體如2，2- 二甲基丁酸酯，最優選地添加2，2- 二甲基丁酸硫酯。結果，辛伐他汀得以生產。為了形成2，2_ 二甲基丁酸的硫酯化合物，優選地使用硫醇化合物甲基巰基丙酸、乙基巰基丙酸或N-乙醯基半胱胺。然而，本發明不限於使用所公開的硫酯。其它硫酯也是本發明的合適化合物。或者，可以通過下述方式修飾生產生物，所述方式使得生產生物從供應的原材料生產2，2-二甲基丁酸側鏈自身。在本發明的第二方面中，提供了在本發明第一方面中所述真菌菌株中生產斯達汀的方法。在第一個實施方案中，所述斯達汀是普伐他汀，並且本發明的方法優選地包括下述步驟(a)向宿主細胞提供一種或多種包含感興趣的基因的多核苷酸，所述感興趣的基因編碼制甲羥酶素生物合成的最低需要；(b)用下述多核苷酸轉化所述宿主細胞，所述多核苷酸包含編碼制甲羥酶素羥化酶的感興趣的基因和/或包含影響所述感興趣的基因表達的DNA序列；(c)選擇經轉化的細胞的克隆；(d)培養所述經選擇的細胞；(e)任選地對所述被培養的細胞補充營養來源；和(f)任選地從所述培養物中分離普伐他汀。在第二個實施方案中，可以通過使用具有改進的動力學特性的同源蛋白質來改進位甲羥酶素羥化酶表達宿主細胞中普伐他汀的生產。這類「同源物」或「同源序列」被定義為編碼下述多肽的DNA序列，所述多肽顯示由分離自供體物種的原始DNA序列編碼的多肽的至少一種活性，並具有下述胺基酸序列，所述胺基酸序列與特定的DNA序列編碼的蛋白質的胺基酸序列具有一定程度的同一性。具有對制甲羥酶素羥化酶合成基因「基本同源」的胺基酸序列的多肽被定義為具有下述胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與特定的胺基酸序列具有至少25 %、更優選地至少30 %、更優選地至少40 %、更優選地至少50 %、進一步更優選地至少60%、進一步更優選地至少70%、進一步更優選地至少80%、進一步更優選地至少90%、進一步更優選地至少98%和最優選地至少99%的同一性程度，該基本同源的肽展示朝向普伐他汀合成的活性。使用該途徑獲得了多種優點，例如克服了反饋抑制、促進了分泌和減少了副產物形成。同源序列可包括下述多態性，所述多態性由於天然的等位基因變異或菌株內(intra-strain)變異而存在於來自不同種群或一個種群的細胞中。同源物還可來源於除特定的DNA序列來自的物種之外的物種，或可以是人工設計和合成的。與特定的DNA序列相關的和通過密碼子簡併獲得的DNA序列也是本發明的部分。尤其重要的是通過合成手段分離的同源序列。通過該方法可以在計算機晶片上設計編碼合適的P450酶的基因的所有可能的變體。這打開了下述機會適應基因的密碼子使用以便於它們在制甲羥酶素生產宿主細胞和/或制甲羥酶素羥化酶表達宿主細胞中被最優表達；去除和引入限制性酶和/或位點特異重組酶的相關序列；製造基因的不同組合等等。或者，可以施用體外進化途徑如易錯PCR(error prone PCR)、家族改組(family shuffling)和/或定向進化作為獲得具有改進的動力學特性的同源序列的方法。同源物也可包括全長序列的生物活性片段。另外，也可使用不是同源的，但是確實能催化從制甲羥酶素或任何制甲羥酶素前體形成普伐他汀的基因。在第三個實施方案中，可以如下改進位甲羥酶素到普伐他汀轉化的效率分離 P450酶需要的特定的氧化還原再生系統並將其引入表達制甲羥酶素羥化酶的宿主細胞中。在宿主細胞中引入這類系統的方法與下述方法相同，所述方法被描述用於引入上文所列的制甲羥酶素羥化酶。這樣的氧化還原再生系統可以得自與下述物種相同的物種， 編碼制甲羥酶素羥化酶(即P450)的多核苷酸來自所述物種或在其中異源表達；所述物種的例子是 Penicillium 物種(HflPenicillium chrysogenum、Penicillium citrinum)、 Aspergillus 物種(即 Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus terreus) > Mucor 物種(即 Mucor hiemalis) > Monascus 物種(即 Monascus ruber> Monascus paxii)、 Streptomyces 物種(即 Streptomyces carbophilus、 Streptomyces flavidovirens、 Streptomyces coelicolor、 Streptomyces lividans、 Streptomyces exfoliates、Streptomyces avermitilis、Streptomyces clavuligerus) > Amycolatopsis 物種(即Amycolatopsis orientalis NRRL 18098、Amycolatopsis orientalis ATCC 19795)、Bacillus 物種(即 Bacillus subtilus、Bacillus amyloliquefaciens> Bacillus licheniformis)、Corynebacte:rium 物種(即 Corynebacterium glutamicum)或 hcherichia物種(即hcherichia coli)。也可以使用備選的系統。備選系統的例子包括， 但不限於將本發明的制甲羥酶素羥化酶整合進IV類p450系統中從而將其與氧化還原配偶體(見例如 Roberts et al. ,2002, J Bacteriol 184 :3898-3908 和 Nodate et al. ,2005, Appl Microbiol Biotechnol Sep 30; 1-8)融合，或通過產生 NAD (P) H 的非-p450 連接酶如亞磷酸鹽脫氫酶(Johannes et al.，2005，Appl Environ Microbiol. 71 :5728-5734) 或通過非酶手段(見例如 Hollmann et al. ,2006, Trends Biotechnol 24:163-171)。由此獲得的宿主細胞可被用於生產普伐他汀。在第四個實施方案中，如下進行普伐他汀的一步發酵將制甲羥酶素生產宿主細胞與制甲羥酶素羥化酶表達宿主細胞混合，隨後將兩種宿主細胞作為混合培養物培養，應理解由制甲羥酶素生產宿主細胞生產和分泌的制甲羥酶素應被制甲羥酶素表達宿主細胞輸入並轉化為普伐他汀。在本發明的第五個實施方案中，改進斯達汀生產力的相同原則可應用於生產紅曲米素J和/或洛伐他汀的Aspergillus terreus菌株通過添加異源轉錄活化子(在該情況下為MlcR)或任何同源基因或蛋白質的交換，提高生物合成基因的轉錄。本發明的第三方面中公開了第一方面的斯達汀的用途。第一方面的微生物理想地適用於生產斯達汀如制甲羥酶素、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀和無錫他汀。本發明的範圍不限於這些提到的例子。實施例一般方法如其它地方所述，進行標準的DNA步驟(Sambrook, et al. ,1989, Molecular cloning -.a laboratory manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。如果應用了特定的DNA方法，則將其列出。使用保真酶如 Phusion聚合酶(Finnzyme)或Herculase聚合酶(Stratagene)來擴增DNA。限制性酶來自 Invitrogen 或 New England Biolabs0 使用的所有 Penicillium chrysogenum 菌株描述於專利申請WO 2007/147827中。以下實施例中稱作「 β -內醯胺負型」菌株的菌株構建描述於WO 2007/147827的比較實施例3中。真菌生長在礦物培養基中進行，所述礦物培養基含有(g/L)葡萄糖(5)；乳糖 (35)；尿素(4.5) ； (NH4)2S04(1. 1) ；Na2SO4 (2. 9) ；KH2PO4 (5. 2) ；K2HPO4 (4. 8)和 10mL/L 微量元素溶液，所述微量元素溶液含有(以g/Ι為單位)檸檬酸(150) ；FeSO4. 7H20(15)； MgSO4. 7H20 (150) ；H3BO3 (0. 0075) ；CuSO4. 5H20(0. 24) ；CoSO4. 7Η20 (0. 375) ；ZnSO4. 7H20 (5)； MnSO4. H2O (2. 28) ；CaCl2. 2Η20 (0. 99)；滅菌前 pH 為 6. 5。比較實施例1從Penicillium citrinum NRRL8082分離制甲羥酶素基因簇從Penicillium citrinum NRRL8082分離染色體DNA。因為整個基因簇由於其大小而難以通過PCR擴增，所以將其分為三個片段181Λ、141Λ和61Λ。14和61Λ的片段被容易地PCR擴增，並根據供應商的說明使用Gateway (Invitrogen)用所謂的LR gateway反應克隆進輸入載體PD0NR221和pD0NRP2-P3中。在兩步步驟中克隆181Λ片段。首先擴增101Λ 和81Λ的片段。兩個片段被獨立地克隆進pCR2. 1 Τ0Ρ0 T/A (Invitrogen)中並隨後通過限制性酶克隆和連接融合在一起，如WO 2007/147827中所述。最後，使用Gateway技術將片段轉移至pD0NR41Zeo載體。通過測序驗證被擴增的片段。使用所謂的多位點(Gateway反應(見hvitrogen手冊)，含有制甲羥酶素生物合成基因簇的所有基因的這三個基因片段可以被重組進跨越整個區域的一個片段中。表1 用於擴增制甲羥酶素生物合成基因簇的寡核苷酸
權利要求
1.包含下述異源斯達汀(Statin)生物合成基因轉錄活化子的真菌菌株，所述活化子是基因IovE或與IovE至少75 %同源的多核苷酸，其特徵在於所述真菌菌株不是 Aspergillus terreus。
2.包含多肽LovE或與LovE至少50%同源的多肽的真菌菌株，特徵是所述真菌菌株不是 Aspergi1Ius terreus。
3.根據權利要求1到2中任一項的真菌菌株，其為Penicilliumchrysogenum。
4.根據權利要求1到3中任一項的真菌菌株，其生產選自以下列表的斯達汀，所述列表由制甲羥酶素(compactin)、洛伐他汀(Iovastatin)、紅曲米素J(monacolin J)、普伐他汀 (pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)禾口無錫他汀(wuxistatin)組成。
5.用於生產斯達汀的方法，包括發酵根據權利要求1到4中任一項的真菌菌株。
6.根據權利要求5的方法，其中所述斯達汀是制甲羥酶素，所述方法還包括向所述真菌菌株中引入基因mlcA、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH或具有相似活性的同源基因中的一個或多個。
7.根據權利要求5的方法，其中所述斯達汀是普伐他汀，所述方法還包括向所述真菌菌株中引入基因mlcA、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG、mlcH和編碼P450制甲羥酶素羥化酶的基因或具有相似活性的同源基因中的一個或多個。
8.根據權利要求5的方法，其中所述斯達汀是紅曲米素J，所述方法還包括向所述真菌菌株中引入基因loVB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH基因或具有相似活性的同源基因中的一個或多個。
9.根據權利要求5的方法，其中所述斯達汀是洛伐他汀，所述方法還包括向所述真菌菌株中引入基因lovB、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH或具有相似活性的同源基因中的一個或多個。
10.根據權利要求5的方法，其中所述斯達汀是辛伐他汀，所述方法還包括向所述真菌菌株中引入基因loVB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG和mlcH(或具有相似活性的同源基因) 中的一個或多個，並且其中，向所述真菌菌株的培養物添加2，2- 二甲基丁酸或2，2- 二甲基丁酸前體。
11.根據權利要求1到4中任一項的菌株用於製備斯達汀的用途。
12.根據權利要求11的用途，其中通過由異源基因編碼的酶生產所述斯達汀。
全文摘要
本發明提供了用於發酵生產制甲羥酶素、洛伐他汀、普伐他汀或辛伐他汀的方法，所述方法包括培養包含來自Aspergillus trerreus的lovE轉錄調節子基因的多核苷酸的宿主(優選絲狀真菌)。另外，本發明提供了用於生產上述斯達汀的、包含來自Aspergillus terrreus的lovE轉錄調節子基因的多核苷酸的宿主。
文檔編號C12N15/63GK102171328SQ200980137712
公開日2011年8月31日 申請日期2009年9月21日 優先權日2008年9月24日
發明者德 勃戈 馬爾科·亞歷山大·范, 馬庫斯·漢斯 申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司