核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條及其用途的製作方法
2023-12-02 19:26:01 7
專利名稱：核酸薄膜層析快速檢測方法及其試紙條及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及特異性核酸序列擴增物的檢測方法，更具體地說，涉及利用核酸薄膜層析快速檢測靶核酸序列擴增物的方法，本發明還涉及了用於快速檢測靶核酸序列擴增物的試紙條及其在檢測傳染病病原體中的用途。
背景技術：
以免疫反應為基礎的酶聯(ELISA)試劑/膠體金(試紙條)技術，已發展得相當成熟，並已有相當規模的市場。此類產品以其操作簡單、價格低廉、檢測速度可靠和快捷等特點，已經進入了各醫院的檢驗科甚至普通人的家庭，給人們診斷疾病帶來了許多方便之處，參見例如周友泉，「免疫膠體金的製備及其在醫學檢驗中的應用」，檢驗醫學信息網(網址http//www.clinet.com.cn/edu/resource/article/2001093010.htm)，以及CN2358455(申請號99203566，發明名稱「B型肝炎表面抗原(HBsAg)膠體金免疫層析試紙」，申請人中國人民解放軍第二五三醫院)。
現有的金標檢測試紙條大都是採用雙夾心法免疫測定原理來檢測某種抗原或抗體。在檢測時，由於層析作用反應複合物沿硝酸纖維膜向前移動，形成抗原-抗體-金標顆粒複合物而富集在包被線上，形成紅色沉澱線。同時在包被膜上還有一條質控線對照，故當有兩條紅線時判為陽性，只有一條紅線時，判為陰性。但以免疫反應為基礎的檢測試劑也有不足之處，真正阻礙這種蛋白質薄膜層析診斷技術發展的不是技術與設備，而是特異性單克隆抗體的製備。單克隆抗體的製備複雜費時，使得蛋白質層析診斷的產品研製周期長，不能很快形成系列產品，難以形成有效的覆蓋面。而且檢驗的靈敏度和特異性有時還不夠理想。
PCR技術經過近二十年的發展，已成為實驗室的常規技術。它是現代分子生物學研究中不可缺少的手段，是一種極為敏感的放大系統。相比於傳統的臨床診斷方法，核酸診斷是分子水平上的診斷技術，可以彌補傳統臨床診斷方法的某些缺陷，比如，核酸診斷能直接揭示病原體的存在，能客觀反映病原體在人體內感染及活動情況，可以作為臨床治療中的一個有效監控手段。另外採用核酸診斷技術還可以檢測到常規檢測方法難以檢測到的病原體，例如可以克服酶免檢測技術中從感染到抗體產生的窗口期問題。因此，以PCR技術為代表的核酸診斷技術在臨床診斷中得到日益廣泛的應用。但PCR技術在臨床診斷上也有局限性和缺點，如1、PCR產物極易造成的實驗室汙染而出現假陽性；2、核酸擴增後結果檢測(瓊脂糖凝膠電泳或ELISA)操作複雜，需要專業的實驗室和儀器設備，而且對操作人員專業技術要求較高；3、瓊脂糖凝膠電泳只能判斷擴增物的大小，其特異性也不高；4、操作時間長，擴增後檢測時間瓊脂糖凝膠電泳需要1-2小時左右，而ELISA檢測則需要2-3小時。
由於以上原因，使PCR技術在臨床診斷中的應用也受到限制。
另外，近年來發展起來的螢光定量PCR技術，又從定性檢測邁上了可以量化的臺階，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無汙染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用於分子生物學研究和醫學研究等領域。所謂的實時螢光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物螢光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。其基本原理是在實時螢光定量PCR反應中，引入了一種螢光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷積累，螢光信號強度也等比例增加。但此種檢測方法需要價格昂貴的設備和試劑，並不適合推廣於基層醫院，特別是農村醫院。
與PCR不同的是近年來陸續出現的恆溫擴增技術。這些擴增技術應用不同的原理和方法，可在某一特定溫度條件下(如37℃)，實現核酸(DNA或RNA)的擴增。國際上已有的恆溫擴增技術如下鏈置換擴增術(Strand Displacement Amplification，SDA)核酸序列擴增術(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)轉錄酶擴增術(Transcription Mediated Amplification，TMA)滾環擴增技術(Rolling Circle Amplification，RCA)圓環恆溫擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)解鏈酶擴增技術(Helicase Dependant Amplification，HAD)此外，一些非特異性的全基因組DNA擴增方法目前已經進入商品化階段。這些核酸擴增術的對象有些是DNA，還有些是RNA。核酸恆溫擴增術的特點是擴增反應的全過程(除初始的雜交步驟外)均在同一溫度下進行，而不象PCR反應那樣，需要經歷幾十個溫度變化的循環過程。恆溫擴增技術的這一特點，使得它們對所需儀器的要求大大簡化，反應時間大大縮短，因而具有巨大的實際應用價值。
無論是PCR或恆溫擴增技術，其擴增產物均為核酸(DNA或RNA)。這些核酸產物均需以一定的技術手段予以檢測。如實時螢光定量PCR是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物螢光信號的雷射掃描從而實時檢測核酸產物量。瓊脂糖凝膠電泳是通過對核酸產物分離後染色，從而直觀地看到擴增產物。但該方法只能判斷擴增物的大小，其特異性不高。
以免疫反應為基礎的膠體金(試紙條)技術檢測的主要對象是蛋白質抗原。該技術以其直觀，快速，方便，成熟，廉價等優點而十分受歡迎。有人也曾把膠體金(試紙條)技術用於檢測雙鏈DNA，參見例如CN1580776(申請人王繼華，申請號200410027291.X，發明名稱「膠體金層析法檢測雙鏈DNA抗體的試紙條及其製備方法」)。但該發明是把雙鏈DNA整體作為抗原檢測，不能區別不同的DNA序列，因而是非特異性的，不能用於特異性檢測，如傳染病的診斷。
以免疫反應為基礎的膠體金(試紙條)檢測技術是一種目前十分成熟的蛋白質快速檢測技術，利用抗原和抗體的特異性結合的特點，形成抗原-抗體-有色顆粒複合物而富集在包被線上，形成有色沉澱線。
以雙抗體夾心法為例，其基本原理是1、將特異性抗體(常為單克隆抗體)吸附於有色顆粒(如膠體金顆粒，乳膠顆粒等)，在顆粒表面形成抗體包被。
2、將另一特異性抗體(常為針對同一抗原的單克隆抗體，無色)以線條狀固定於膜上(常為硝酸纖維膜或尼龍膜)，形成檢測線。
3、檢測時，當存在病原體特異性抗原時，待檢病原體的特異性抗原首先與顆粒表面的抗體結合，形成抗原-抗體複合物。
4、有色的抗原-抗體複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動。當抗原-抗體複合物遇到固定於膜上的另一特異性抗體線條時，待檢病原體的特異性抗原與線條上的抗體結合，形成抗體-抗原-抗體複合物(雙抗體夾心)。有色的抗體-抗原-抗體複合物滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性。
5、當不存在病原體特異性抗原時，不能形成抗體-抗原-抗體複合物。有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
如上所述，以免疫反應為基礎的膠體金(試紙條)檢測技術是一種目前已十分成熟的蛋白質快速檢測技術，廣泛地應用於免疫診斷，科學研究，防疫檢測，法醫鑑定等領域。
發明內容
如果能將蛋白質快速檢測技術的原理用於核酸診斷，將能把核酸診斷的高度敏感性和特異性與蛋白質檢測技術的成熟性和快速性相結合，創造出一種新型的快速核酸診斷試劑。本發明人經過長期研究，發現用抗原或半抗原小分子標記單鏈寡核苷酸探針，使標記的特異性探針與待檢的特異性靶核酸擴增物雜交，從而形成具備免疫原性的分子複合物，該複合物即可用與蛋白質試紙條檢測相類似的方法被檢測，從而完成本發明。
因此，一方面，本發明提供一種特異性核酸序列擴增物的單探針檢測方法，其包括1)將一種特異性抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；2)將另一種特異性抗體，無色的抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線；3)當存在待檢的特異性核酸時，發生核酸擴增，其中的一條引物用抗原或半抗原A(以下簡稱抗原A)標記，形成一條鏈帶有抗原A的核酸擴增物；4)將步驟3)得到的帶有抗原A的核酸擴增物鏈與一條用抗原或半抗原B(以下簡稱抗原B)標記的探針雜交，形成擴增物抗原A-探針抗原B雜交物；5)將步驟4)得到的擴增物抗原A-探針抗原B雜交物與顆粒表面抗體包被的抗體A結合，形成擴增物抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B有色顆粒複合物；6)步驟5)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線，與線條上的抗體B結合，形成有色的擴增物抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B顆粒複合物，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者7)當特異性核酸不存在時，不發生上述步驟3)-6)，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
另一方面，本發明還提供了一種特異性核酸序列擴增物的雙探針檢測方法，其包括1)將一種特異性抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；2)將另一種特異性抗體，無色抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線；3)當存在待檢的特異性核酸時，發生核酸擴增，未經標記的核酸擴增物與探針A和探針B雜交，其中探針A有A抗原標記，探針B有B抗原標記，從而形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B雜交物；4)將步驟3)形成的擴增物-抗原A-抗原B雜交物與顆粒表面抗體包被中的抗體A結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B有色顆粒複合物；5)步驟4)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線條，與線條上的抗體B結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者6)當待檢的特異性核酸不存在時，不發生上述步驟3)-5)，不能形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B複合物，也不能形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
另一方面，本發明還提供了用於核酸序列擴增物的通用標準試紙條。
另一方面，本發明還提供了上述檢測方法和試紙條在檢測傳染病病原體中的用途。
附圖的簡要說明附
圖1是關於本發明的單探針檢測方法的基本原理示意圖；附圖2是關於本發明的雙探針檢測方法的基本原理示意圖；附圖3顯示本發明的核酸序列擴增物檢測的試紙條的基本結構；附圖4是核酸檢測試紙條的檢測結果示意圖；附圖5是顯示核酸擴增後試紙條與凝膠電泳檢測法的敏感度比較結果；附圖6是顯示用實施例3的方法，採用單探針檢測淋球菌PCR-試紙條的檢測結果；和附圖7是顯示用實施例4的方法，採用雙探針檢測淋球菌PCR-試紙條的檢測結果發明內容詳述在一方面，本發明提供了特異性核酸序列擴增物的檢測方法，其包括1)將一種特異性抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，如膠體金顆粒、乳膠顆粒等，在顆粒表面形成抗體包被；2)將另一種特異性抗體，無色的抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線，所述膜通常為硝酸纖維膜或尼龍膜；3)當存在待檢的特異性核酸時，發生核酸擴增，其中的一條引物用抗原A標記，形成一條鏈帶有抗原A的核酸擴增物；4)將步驟3)得到的帶有抗原A的核酸擴增物鏈與一條用抗原B標記的探針雜交，形成擴增物抗原A-探針抗原B雜交物；5)將步驟4)得到的擴增物抗原A-探針抗原B雜交物首先與顆粒表面抗體包被的抗體A結合，形成擴增物抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B有色顆粒複合物；6)步驟5)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線時，與線條上的抗體B結合，形成有色的擴增物抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B顆粒複合物(雙抗體雙抗原夾心)，從而滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者7)當特異性擴增物不存在時，不發生上述步驟3)-6)，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
更具體地，本發明提供了一種特異性核酸序列擴增物的通用標準試紙條單探針檢測方法，其包括1)設計兩條特異性擴增引物，其中一條引物B用抗原或半抗原B標記(以下簡稱抗原B)；在適宜的擴增條件下，當有被檢核酸存在時，特異性核酸片段被擴增並被抗原B標記；當被檢核酸不存在時，無特異性核酸片段擴增物；2)設計一條特異性探針A，探針序列與擴增物片段序列鹼基互補，因此可以特異性雜交，形成擴增物-探針雜交複合物；3)將探針A用抗原或半抗原A標記(以下簡稱抗原A)；4)將一種標準的通用抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；5)將另一種標準的通用抗體，無色的抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線；6)當存在待檢的特異性擴增物時，核酸擴增物與探針A雜交，其中探針A有A抗原標記，引物B有B抗原標記，從而形成擴增物-探針抗原A-引物抗原B雜交物；7)將步驟6)形成的擴增物-探針抗原A-引物抗原B雜交物與顆粒表面抗體包被中的抗體A結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-引物抗原B有色顆粒複合物；8)步驟7)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線條，與線條上的抗體B結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-引物抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者9)當特異性擴增物不存在時，不發生上述步驟6)-8)，不能形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B複合物，也不能形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-引物抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
上述方法的基本原理如附圖1中所示。
另一方面，本發明還提供了一種特異性核酸序列擴增物的檢測方法，其包括1)將一種特異性抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；2)將另一種特異性抗體，無色抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線；3)當存在待檢的特異性核酸時，發生核酸擴增，未經標記的核酸擴增物與探針A和探針B雜交，其中探針A有A抗原標記，探針B有B抗原標記，從而形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B雜交物；4)將步驟3)形成的擴增物-抗原A-抗原B雜交物與顆粒表面抗體包被中的抗體A結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B有色顆粒複合物；5)步驟4)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線條，與線條上的抗體B結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者6)當待檢的特異性核酸不存在時，不發生上述步驟3)-5)，不能形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B複合物，也不能形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
更具體地，本發明提供了一種特異性核酸序列擴增物的通用標準試紙條雙探針檢測方法，其包括1)設計兩條特異性擴增引物；在適宜的擴增條件下，當有被檢核酸存在時，特異性核酸片段被擴增；當被檢核酸不存在時，無特異性核酸片段擴增物；2)設計兩條特異性探針A和B。探針序列與擴增物片段序列鹼基互補，因此可以特異性雜交，形成擴增物-探針雜交複合物；3)將探針A用抗原A標記；4)將探針B用抗原B標記；5)將一種標準的通用抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；6)將另一種標準的通用抗體，無色的抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線；7)當存在待檢的特異性擴增物時，核酸擴增物與探針A和探針B雜交，其中探針A有A抗原標記，探針B有B抗原標記，從而形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B雜交物；8)將步驟7)形成的擴增物-抗原A-抗原B雜交物與顆粒表面抗體包被中的抗體A結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B有色顆粒複合物；9)步驟8)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線條，與線條上的抗體B結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者10)當特異性擴增物不存在時，不發生上述步驟7)-9)，不能形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B複合物，也不能形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
上述雙探針法核酸紙條檢測的基本原理如附圖2所示。
在本發明的檢測方法中，所使用的抗原A和抗原B可以是標準的通用抗原或半抗原。尤其適用於本發明方法的用於標記探針A和探針B的抗原或半抗原選自生物素、地高辛或螢光染料，如Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam、FitC，等。優選的抗原或半抗原為生物素、地高辛或FitC。探針A和探針B應選用不同的抗原或半抗原標記。
在本發明的檢測方法中，所使用的標準的通用抗體，抗A抗體可選自親和素、抗地高辛抗體或抗螢光染料抗體，如抗Cy3抗體、抗Cy5抗體、抗Tetramethylrhodamine抗體、抗AlexaFluor抗體、抗Rhodamine抗體、抗Fam抗體、抗FitC抗體等。其中優選的抗體為生物素、抗地高辛抗體或抗FitC抗體。用於吸附抗A抗體的有色顆粒可以是，如膠體金顆粒、乳膠顆粒等。在本發明的檢測方法中，所使用的另一種標準的通用抗體，無色的抗B抗體可選自上述標準的通用抗體，但應選用與抗A抗體不同的抗體。所述膜通常為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
本發明說明書中所使用的技術術語解釋引物DNA合成的起始物。一般為一對單鏈寡核苷酸，在與模板雜交後，DNA合成從其3』末端開始。
探針探測靶核酸(DNA或RNA)的單鏈寡核苷酸。通常有可檢測的信號分子標記，如半抗原，螢光等。
標記將可檢測的信號分子(如半抗原，螢光，放射性等)與單鏈寡核苷酸相偶連的方法。
雜交特指互補的DNA單鏈通過鹼基配對形成雙鏈結構。
核酸脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通稱。
抗原和半抗原具備免疫原性的物質。通常為大分子蛋白質或細胞組分。但有些小分子也具備免疫原性，被稱為半抗原(Hapten)。半抗原常被用於標記探針。
抗體能與抗原或半抗原特異性結合的蛋白質分子。
複合體由兩種或兩種以上分子特異性結成的結合物。
免疫試紙條用於快速檢測的醫學工具。又稱為呈色薄膜層析。
核酸聚合酶合成核酸長鏈的酶類。分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。
另一方面，本發明提供了用於核酸擴增物檢測的試紙條，其包括在帶有不乾膠的襯墊按順序有樣品墊1、有色顆粒結合物墊2、纖維膜3和吸水濾紙墊4，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上還設有檢測線5和質控線6，其中有色顆粒結合物墊2上的有色顆粒有抗A抗體包被，檢測線5上有抗B抗體包被，質控線6上有抗A抗體。有色顆粒是膠體金顆粒或乳膠顆粒，纖維膜通常為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
核酸擴增物檢測試紙條的基本結構如附圖3所示。
本發明將以免疫反應為基礎的蛋白質試紙條檢測技術改造成核酸診斷試劑，其要點在於將待檢的靶核酸擴增物轉變為具備免疫原性的分子或分子複合物。如此，以免疫反應為基礎的蛋白質試紙條檢測技術基本方法均可應用與核酸試紙條檢測。
將待檢的靶核酸擴增物轉變為具備免疫原性的分子或分子複合物的基本方法是用抗原或半抗原(以下簡稱抗原)標記探針，使標記的特異性探針與待檢的靶核酸擴增物雜交，從而形成具備免疫原性的分子複合物，該複合物即可用與蛋白質試紙條檢測相類似的方法被檢測。
與現有技術中檢測雙鏈DNA抗體的方法不同，本發明使用了抗原或半抗原標記物，單鏈寡核苷酸探針，並以分子雜交的方式檢測特異性靶基因單鏈DNA。與免疫膠體金(試紙條)技術相比，本發明的不同之處不僅在於標記物，探針和雜交，而且還在於檢測對象的不同由檢測蛋白質變為檢測核酸。
由於本發明是以特異性的探針檢測特異性的靶核酸擴增物，能夠保證檢測的高度特異性，從而保證了檢測結果的準確性。本發明的新穎之處在於既有免疫膠體金(試紙條)技術的直觀，快速，方便，成熟，廉價等優點，又有PCR或恆溫擴增技術的高度靈敏性，還有本發明所提供的高度特異性。因此，本發明的方法是一種理想的特異性檢測手段。
此外，在免疫反應為基礎的膠體金蛋白質試紙條檢測技術中，所使用的抗體都必須是特異性的，如梅毒特異性抗螺旋體抗體(TP-Ab)，抗B型肝炎表面抗原(HBsAg)抗體等。因此，一種試紙條只能檢測一種病原體。而本發明提供了使用通用的抗體A和抗體B的方法。用本發明方法製作的標準試紙條可用於檢測任何病原體的核酸序列擴增物。其特異性由擴增引物和探針共同保證，而不是由試紙條決定。
作為一個核酸擴增物檢測的通用技術平臺，本發明的方法及其試紙條可以廣泛用於傳染病病原體臨床檢測，突發性公共衛生事件的戰略性技術儲備，農牧業和食品工業，海關檢驗檢疫，環境檢測，生物武器檢測，人類遺傳病檢測，婚前、產前檢查及優生優育和法醫鑑定和血緣鑑定等領域。
常見的病原體包括細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體、寄生蟲等。這些都可以是本發明的核酸擴增物檢測試紙檢測的對象。由這些病原體引起的疾病多達數百種，這可以是本發明的核酸擴增物檢測試紙及相關的試劑盒應用的範圍，例如呼吸系統的流感和禽流感，SARS、肺結核等，性病系列的淋病、愛滋病，梅毒，支原體性病，衣原體性病，單皰病毒，HPV等。
核酸診斷試劑不僅可以鑑別這些病原體，而且可以鑑別它們的亞型、有毒菌株、突變株和抗藥性等。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可作為突發性公衛事件的戰略性技術儲備。國家已投入巨資建立全國性的傳染病預防和控制系統，診斷烈性傳染病的快速診斷試劑將作為這些中心的常規儲備，以便在突發性公衛事件發生時可迅速鑑別病原體，有效控制。這方面的檢測對象包括例如禽流感、SARS、霍亂、鼠疫、炭疽病、伊波拉、流行性出血熱等。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於食品工業，食物中毒常有發生，因此對牛奶、飲料、肉類製品等的出廠前檢驗很有必要。如黴菌，大腸桿菌，沙門氏菌，肉毒桿菌等。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於農業，對主要農作物的有害微生物的鑑別診斷，將產生巨大的經濟和社會效益。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於牧業，在牲畜、魚類和家禽的疾病診斷方面有廣闊的市場。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於海關進出口檢疫。這也是一個穩定而可靠的市場。例如外貿進口，為防止境外有害微生物、病蟲卵、轉基因產品傳入我國。需要有一套完整、靈敏、可靠的快速診斷系統。例如外貿出口，向進口國提供一套完整的檢疫資料，將大大地促進我國農牧業、林業、食品工業等產品的外貿出口，減少貿易糾紛。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於對土壤、水源、空氣等環境有害微生物的檢測及鑑別。一套簡便、靈敏、快速的現場檢驗方法對環境檢測具有重要意義。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於檢測生物武器。各國都在發展檢測生物武器的技術，我國也應及早準備。常見的生物武器病原體有霍亂、鼠疫、炭疽病、伊波拉、流行性出血熱以及人工改造過的細菌和病毒等。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於檢測基因突變。現代分子遺傳學已經證明人類的絕大多數疾病在不同程度上都與基因有關。根據單核苷酸多態性(SNP)的研究，每個人的基因組型都不一樣。因此對各種疾病的易感性和對藥物的敏感性也不一樣。由此提出了「個性化醫學」。如重要疾病易感性預測。根據每個人的基因型決定他對藥物的敏感性和耐受性，精確給藥等。常見的基因突變引起的疾病有上百種，包括基因缺失，基因易位等基因突變。本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於開發人類遺傳病系列診斷產品，以滿足這個巨大的市場需求。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於婚前檢查，產前檢查，優生優育等。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於犯罪現場血液、精液、毛髮及其它樣品的DNA鑑定，以及犯罪嫌疑人DNA的鑑定。
另一方面，本發明的核酸擴增物檢測方法和試紙條可用於血緣鑑定，基因身份證，人群基因資料庫等方面。
核酸試紙條檢測方法的發明將大大簡化核酸擴增後的檢測程序。結果判讀簡單明了、直觀(檢測示意結果如附圖4)。
本專利所申請的核酸試紙條快速檢測技術作為一種新型的核酸擴增後檢測技術，具有以下優點·操作簡單只需要把核酸擴增後的樣品直接滴到核酸試劑檢測版上即可，不需要專業人員操作，不僅可用於大醫院，也可適用於農村，邊遠地區和基層醫院；·快速檢測5分鐘後判讀結果；·靈敏與瓊脂糖凝膠電泳相比，檢測靈敏度提高近100-200倍；·特異性高由於在檢測過程中加入了1-2特異性探針，使結果更加準確；·價格便宜費用大大低於傳統的凝膠電泳和ELISA檢測。
如下實施例舉例說明本發明的檢測方法及其檢測效果。實施例僅用來舉例，並不構成對本發明保護範圍的任何限制，本發明的保護範圍在所附的權利要求書說明。
實施例實施例1核酸檢測試紙條材料的處理和製備1)聚酯膜(連接墊)處理a)聚酯膜處理液配製Tris-HCl(PH9.0)100毫摩吐溫-200.5％PVP100毫克純化水 至10毫升混勻待用；b)將聚酯膜平鋪在不鏽鋼盆中，倒入處理液，以淹沒所有聚酯膜為止；c)在潔淨環境中浸泡過夜；d)取出聚酯膜，放入37℃烘箱過夜；e)取出後乾燥密封保存。
2)玻纖(樣品墊)處理a)玻纖處理液配製Tris-HCl(pH9.0)0.4摩爾Na2CO30.2摩爾吐溫-201％，PVP100毫克純化水 至10毫升攪拌過夜；b)將玻纖切成相應寬度，平鋪在不鏽鋼網架上，用槍或針筒均勻噴上相對應的溶液量；c)玻纖連同網架一同放入37℃烘箱過夜；d)取出後乾燥密封保存。
3)噴膜a)噴膜機b)測試線抗體親和素(1.3毫克/毫升)，噴膜量2微升/釐米；c)質量控制線抗地高辛抗體(1.3毫克/毫升)，噴膜量2微升/釐米。
d)噴膜後在45℃烘箱中乾燥4-5個小時；放在乾燥環境中備用。
4)乳膠顆粒包被a)將10％的乳膠顆粒用1×MES稀釋成1％的濃度，混勻，置4℃離心機，12000轉/分，離心10-20分鐘。
b)去上清液，再加入等量的1×MES，超聲3秒，3次(根據具體情況增減)再置4℃離心機，12000轉/分，離心10-20分鐘，如此重複清洗2-4次c)洗完後加入等量的1×MES(使濃度約為1％)，超聲，使溶液充分混勻，加入1.3毫克/毫升的抗體(如抗FITC抗體或抗地高辛抗體)，充分混勻，10-30分鐘。
d)加入0.16毫克/毫升的EDAC(一般EDAC原液配成濃度為毫克/毫升)，混勻0.5小時以上。
e)置4℃離心機，12000轉/分，離心15-20分鐘，去上清液，加入等量的乳膠稀釋液，超聲1秒3-4次(根據具體情況增減)，如此用稀釋液清洗3次以上。
f)最後加入乳膠稀釋液，使其終濃度約為1％，超聲混勻後置4℃保存備用。
5)試紙條組裝a)黏膜在室溫和溼度小於30％環境下，取片材一張，剪取與片材同長度硝酸纖維素膜一條。撕去片材中間黏膜處的不乾膠，雙手拉緊硝酸纖維素膜，膜下邊對齊撕去不乾膠處的下邊，相距約2毫米左右放下，放下後切勿再次挪動NC膜，以防膜被損壞。
b)在一個潔淨且相對溼度小於30％的室溫環境中，分別取出處理好的片材、帶乳膠的聚酯膜(下簡稱聚酯膜)、玻纖、濾紙等，按所需切好；c)聚酯膜上邊對準NC膜下邊，貼上約2毫米左右，粘好；d)玻纖下邊對片材底邊，上邊覆蓋乳膠1/3-1/2左右為佳，壓緊；e)濾紙上邊對片材上邊，下邊覆蓋NC膜約2-3毫米，壓緊；f)粘上不乾膠；g)用切割機以4毫米寬度切成條；h)放入乾燥密封的環境中保存。
以上所述儀器及試劑在商業上可由市售或直接從國內和國外公司獲得，如上海虹光公司，北京舒伯偉公司，美國的Milipore公司，Ahlstrom公司，Jackson Immuno Research Laboratoties，INC.，Sigma公司，Arista公司，印度的MDI公司等。
實施例2核酸試紙條檢測方法的靈敏性將PCR擴增產物以1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，1/512，1/1024和1/2048的比例稀釋。分別取5微升用於瓊脂糖凝膠電泳。凝膠電泳條件為1X TBE緩衝液，電壓100V，電泳時間30分。同時分別取5微升用於核酸試紙條檢測。5微升樣品與探針在100微升雜交液(TBS，Tris-HCl，pH7.5，10毫摩，氯化鈉150毫摩)中雜交後，點於樣品墊，5分鐘後觀察結果。
核酸擴增後試紙條與凝膠電泳的敏感度比較結果顯示於附圖5中，由附圖5的結果可以看出，與傳統的凝膠電泳相比，其敏感度增加100-200倍。
實施例3採用單探針法，淋球菌的核酸PCR擴增物的檢測●PCR擴增氯化鉀(500毫摩)2微升Tris-HCl(pH8.3，100毫摩) 2微升氯化鎂(20毫摩) 2微升dNTP(2毫摩)2微升正向引物(生物素標記，2微摩)2微升反向引物(2微摩)2微升淋球菌 4000個Taq DNA聚合酶 0.5單位總量20微升95℃30秒60℃30秒72℃30秒共35循環●試紙條檢測PCR擴增物 8微升反向FITC標記探針(2微摩)2微升TBS(Tris-HCl 10毫摩pH7.5，氯化鈉150毫摩)100微升95C，5分鐘，冷卻至室溫後，點在試紙條上5分鐘後觀察結果。
單探針法淋球菌PCR-試紙條檢測結果見附圖6。
實施例4採用雙探針法，以生物素和FITC分別標記兩條探針，淋球菌的核酸PCR
擴增物的檢測●PCR擴增氯化鉀(500毫摩)2微升Tris-HCl(pH8.3，100毫摩) 2微升氯化鎂(20毫摩) 2微升dNTP(2毫摩)2微升正向引物(2微摩)2微升反向引物(2微摩)2微升淋球菌 4000個Taq DNA聚合酶 0.5單位總量20微升95℃30秒60℃30秒72℃30秒共35循環●試紙條檢測PCR擴增物8微升反向生物素標記探針(2微摩)2微升反向FITC標記探針(2微摩) 2微升TBS(Tris-HCl，pH7.510毫摩，氯化鈉150毫摩)100微升95C，5分鐘，冷卻至室溫後，點在試紙條上5分鐘後觀察結果。
採用雙探針法，淋球菌PCR-試紙條的檢測結果見附圖7。
權利要求
1.一種特異性核酸序列擴增物的檢測方法，其包括1)將一種特異性抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，如膠體金顆粒、乳膠顆粒等，在顆粒表面形成抗體包被；2)將另一種特異性抗體，無色的抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線，所述膜通常為硝酸纖維膜或尼龍膜；3)當存在待檢的核酸時，發生特異性核酸擴增，其中的一條引物用抗原A標記，形成一條鏈帶有抗原A的核酸擴增物；4)將步驟3)得到的帶有抗原A的核酸擴增物鏈與一條用抗原B標記的探針雜交，形成擴增物抗原A-探針抗原B雜交物；5)將步驟4)得到的擴增物抗原A-探針抗原B雜交物首先與顆粒表面抗體包被的抗體A結合，形成擴增物抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B有色顆粒複合物；6)步驟5)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線時，與線條上的抗體B結合，形成有色的擴增物抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B顆粒複合物(雙抗體雙抗原夾心)，從而滯留在線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者7)當待檢的核酸不存在時，不發生上述步驟3)-6)，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
2.一種特異性核酸序列擴增物的通用標準試紙條單探針檢測方法，其包括1)設計兩條特異性擴增引物，其中一條引物B用抗原或半抗原B標記；在適宜的擴增條件下，當有被檢核酸存在時，特異性核酸片段被擴增並被抗原B標記；當被檢核酸不存在時，無特異性核酸片段擴增物；2)設計一條特異性探針A，探針序列與擴增物片段序列鹼基互補，因此可以特異性雜交，形成擴增物-探針雜交複合物；3)將探針A用抗原A標記；4)將一種標準的通用抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；5)將另一種標準的通用抗體，無色的抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線；6)當存在待檢的特異性擴增物時，核酸擴增物與探針A雜交，其中探針A有A抗原標記，引物B有B抗原標記，從而形成擴增物-探針抗原A-引物抗原B雜交物；7)將步驟6)形成的擴增物-抗原A-抗原B雜交物與顆粒表面抗體包被中的抗體A結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-引物抗原B有色顆粒複合物；8)步驟7)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線條，與線條上的抗體B結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-引物抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者9)當特異性擴增物不存在時，不發生上述步驟6)-8)，不能形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B複合物，也不能形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-引物抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
3.一種特異性核酸序列擴增物的檢測方法，其包括1)將一種特異性抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，如膠體金顆粒、乳膠顆粒等，在顆粒表面形成抗體包被；2)將另一種特異性抗體，無色的抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線，所述膜通常為硝酸纖維膜或尼龍膜；3)當存在待檢的特異性核酸擴增物時，未經標記的核酸擴增物與探針A和探針B雜交，其中探針A有A抗原標記，探針B有B抗原標記，從而形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B雜交物；4)將步驟3)形成的擴增物-抗原A-抗原B雜交物與顆粒表面抗體包被中的抗體A結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B有色顆粒複合物；5)步驟4)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線條，與線條上的抗體B結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者6)當特異性核酸擴增物不存在時，不發生上述步驟3)-5)，不能形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B複合物，也不能形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
4.一種特異性核酸序列擴增物的通用標準試紙條雙探針檢測方法，其包括1)設計兩條特異性擴增引物；在適宜的擴增條件下，當有被檢核酸存在時，特異性核酸片段被擴增；當被檢核酸不存在時，無特異性核酸片段擴增物；2)設計兩條特異性探針A和B，探針序列與擴增物片段序列鹼基互補，因此可以特異性雜交，形成擴增物-探針雜交複合物；3)將探針A用抗原A標記；4)將探針B用抗原B標記；5)將一種標準的通用抗體，抗A抗體吸附於有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；6)將另一種標準的通用抗體，無色的抗B抗體以線條狀固定於膜上形成檢測線；7)當存在待檢的特異性擴增物時，核酸擴增物與探針A和探針B雜交，其中探針A有A抗原標記，探針B有B抗原標記，從而形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B雜交物；8)將步驟7)形成的擴增物-抗原A-抗原B雜交物與顆粒表面抗體包被中的抗體A結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B有色顆粒複合物；9)步驟8)得到的有色顆粒複合物在溶液中通過毛細現象沿纖維膜向上流動至抗體B檢測線條，與線條上的抗體B結合，形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，從而滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，此為陽性；或者10)當特異性擴增物不存在時，不發生上述步驟7)-9)，不能形成擴增物-探針抗原A-探針抗原B複合物，也不能形成擴增物-探針抗原A-顆粒抗體A-探針抗原B-線條抗體B有色顆粒複合物，有色顆粒將不能與膜上的檢測線結合而越過此線，不能形成肉眼可見的有色線條，此為陰性。
5.權利要求1-4的任何之一所述的檢測方法，其中用於標記探針A和探針B的抗原或半抗原選自生物素、地高辛或螢光染料，所述螢光染料選自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam或FitC；探針A和探針B應選用不同的抗原或半抗原標記；所使用的標準的通用抗體，抗A抗體和無色的抗B抗體可選自親和素、抗地高辛抗體或抗螢光染料抗體，所述抗螢光染料抗體選自抗Cy3抗體、抗Cy5抗體、抗Tetramethylrhodamine抗體、抗AlexaFluor抗體、抗Rhodamine抗體、抗Fam抗體或抗FitC抗體；抗B抗體應選用與抗A抗體不同的抗體。
6.權利要求5所述的方法，其中抗原或半抗原為生物素、地高辛或FitC；抗體為親和素、抗地高辛抗體或抗FitC抗體。
7.權利要求1-4的任何之一所述的方法，其中用於吸附抗A抗體的有色顆粒是膠體金顆粒或乳膠顆粒，所述的膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
8.用於核酸擴增物檢測的試紙條，其包括在帶有不乾膠的襯墊(7)上按順序有樣品墊(1)、有色顆粒結合物墊(2)、纖維膜(3)和吸水濾紙墊(4)，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上還設有檢測線(5)和質控線(6)，其中有色顆粒結合物墊(2)上的有色顆粒有抗A抗體包被，檢測線(5)上有抗B抗體包被，質控線(6)上有抗A抗體。
9.權利要求8所述的用於核酸擴增物檢測的試紙條，其中抗A抗體和無色的抗B抗體可選自親和素、抗地高辛抗體或抗螢光染料抗體，所述抗螢光染料抗體選自抗Cy3抗體、抗Cy5抗體、抗Tetramethylrhodamine抗體、抗AlexaFluor抗體、抗Rhodamine抗體、抗Fam抗體或抗FitC抗體；抗B抗體應選用與抗A抗體不同的抗體。
10.權利要求9所述的用於核酸擴增物檢測的試紙條，其中所述抗體選自親和素、抗地高辛抗體或抗FitC抗體；。
11.權利要求8所述的用於核酸擴增物檢測的試紙條，其中有色顆粒是膠體金顆粒或乳膠顆粒，所述的纖維膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
12.權利要求8所述的試紙條用於檢測核酸及其擴增物的用途。
全文摘要
本發明公開了一種特異性核酸序列擴增物的單探針檢測方法，還公開了一種特異性核酸序列擴增物的雙探針檢測方法，還公開了用於核酸擴增物檢測的試紙條，以及試紙條的用途。本發明的方法使用通用的抗體A和抗體B，因而用本發明方法製作的標準試紙條可用於檢測任何來源的核酸序列擴增物，其特異性由擴增引物和探針共同保證。
文檔編號G01N33/544GK1811447SQ200610003429
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月8日 優先權日2006年2月8日
發明者尤其敏, 胡林, 林源吉, 吳汀瀅, 羅英 申請人:杭州優思達生物技術有限公司