用於重編程細胞的包含純化的經修飾的rna的rna製劑的製作方法

2023-12-02 21:50:31 3

專利名稱：用於重編程細胞的包含純化的經修飾的rna的rna製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過將細胞與純化的RNA製劑接觸來改變或重編程真核細胞(包括人或其它動物細胞)的分化狀態的組合物和方法，所述RNA製劑包含由一種或多種不同的各自編碼重編程因子(例如，iPS細胞誘導因子)的單鏈mRNA分子或由所述單鏈mRNA分子組成。純化的單鏈mRNA分子優選包含至少一個經修飾的核苷(例如，選自假尿苷(縮寫為希臘字母「psi」或「Ψ」)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲基尿苷(m5U)、2' -O-甲基尿苷(Um或m2』_°U)、2-硫尿苷(S2U)和N6-甲基腺苷On6A))，其替代相應的未修飾的經典核苷的至少一部分(例如，替代大體上所有相應的未修飾的A、C、G或T經典核苷)。此外，單鏈mRNA分子優選純化為大體上不含在細胞中激活不期望的反應、減少單鏈mRNA的表達和/或激活RNA傳感器的RNA汙染分子。在某些實施方案中，純化的RNA製劑大體上不含比全長單鏈mRNA分子短或長的、為雙鏈RNA和/或未加帽的RNA的RNA汙染分子。背景2006 年，(Takahashi 和 Yamanaka 2006)報導了編碼 4 個蛋白質因子(0CT4 (Octamer-4 ;P0U 5 類同源框 I)、S0X2 (SRY (性別決定區 Y)-box 2)、KLF4(Kru印pel-樣因子4)和c_MYC)的基因至分化小鼠體細胞的轉導誘導這類細胞成為多能幹細胞(在本文中稱為「誘導多能幹細胞」、「iPS細胞」或「iPSC」)。在該最早的報導後，多能幹細胞還可通過用編碼類似的人蛋白質因子(0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC)的基因(Takahashi等，2007)轉化人體細胞或通過用編碼人0CT4和S0X2因子的基因加上編碼兩個其它人因子NANOG和LIN28 (Lin-28同源物A)的基因轉化人體細胞(Yu等，2007)來進行誘導。所有這類方法使用逆轉錄病毒或慢病毒將編碼重編程因子的基因整合入轉化的細胞的基因組並且體細胞只在較長的一段時間(例如，超過一周)內被重編程為iPS細胞。從分化的體細胞產生iP細胞大有希望成為通過細胞移植治療疾病的可能方法。從個體患者的體細胞產生iPS細胞的可能性還可使得能夠發展具有更小的因免疫排斥而產生的風險的患者特異性療法。此外，從疾病特異性體細胞產生iPS細胞有希望成為研究和開發治療特異性疾病狀態的的藥物的方法(Ebert等，2009，Lee等，2009，Maehr等，2009)。編碼蛋白質重編程因子(或「iPSC因子」)的基因的病毒遞送提供了從體細胞產生iPS細胞的高效方法，但外源DNA至基因組內的整合，無論是隨機還是非隨機的，產生不可預料的結果並且可最終導致癌症(Nakagawa等，2008)。新近報導顯示可通過使用不需要基因組整合的其它方法(以更低的效率)產生iPS細胞。例如，包含0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC的基因的表達質粒至小鼠胚胎成纖維細胞的重複轉染產生iPS細胞得到證明(Okita等，2008)。誘導的多能幹細胞還通過引入表達編碼人0CT4、S0X2、c-MYC, KLF4、NANOG和LIN28的基因的質粒由人體細胞產生(Yu等，2009)。用於產生iPS細胞的其它成功方法包括利用重組蛋白質重編程因子(Zhou等，2009)、非整合腺病毒(Stadtfeld等，2008)或piggyBac轉座子(Woltjen等,2009)遞送重編程因子來處理體細胞。目前，使用這類非病毒遞送技術遞送重編程因子來產生iPS細胞幾乎是無效的。用於潛在臨床應用的產生iPS細胞的其它方法需要增加iPS細胞形成的速度和效率同時維持基因組完整性。發明概述本發明提供了用於重編程真核細胞(包括人或其它動物細胞)的分化狀態的方法，通過將細胞與純化的RNA製劑(包含一種或多種不同的各自編碼重編程因子(例如，iPS細胞誘導因子)的單鏈mRNA分子或由所述單鏈mRNA分子組成)接觸。純化的單鏈mRNA分子優選包含至少一個經修飾的核苷(例如，選自假尿苷(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲 基尿苷(m5U)、2' -O-甲基尿苷(Um或m2』 _°U)、2_硫尿苷(S2U)和N6-甲基腺苷(m6A))，其替代相應的未修飾的A、C、G或T典型核苷的相應未修飾的典型核苷的至少一部分(例如，包括幾乎全部)。此外，優選純化單鏈mRNA分子至大體上不含RNA汙染分子，所述RNA汙染分子可在細胞中激活不期望的反應、減少單鏈mRNA的表達和/或激活RNA傳感器(例如，雙鏈RNA-依賴性酶)。在某些實施方案中，純化的RNA製劑大體上不含比全長單鏈mRNA分子短或長的、為雙鏈RNA和/或未加帽的RNA的RNA汙染分子。在某些優選實施方案中，本發明提供了用於重編程分化的真核細胞(包括人或其它動物體細胞)的組合物和方法，該方法通過將細胞與包含一種或多種不同的各自編碼iPS細胞誘導因子的單鏈mRNA分子或由所述單鏈mRNA分子組成的純化的RNA製劑接觸來進行。在某些實施方案中，本發明提供了用於改變體細胞的分化狀態的方法，包括將編碼iPS細胞誘導因子的mRNA引入體細胞以產生重編程去分化的細胞，其中mRNA包含至少一個5-甲基胞苷(或本文中描述的其它經修飾的鹼基)。在某些實施方案中，本發明提供了用於將展示第一分化狀態或表型的細胞重編程成展示第二分化狀態或表型的細胞的方法，包括向展示第一分化狀態的細胞引入包含編碼至少一種重編程因子的經修飾的mRNA分子的純化的RNA製劑和在其中細胞展示第二分化狀態的條件下培養所述細胞。在某些實施方案中，經修飾的mRNA分子包含至少一種選自假尿苷或5-甲基胞苷的經修飾的核苷。在某些實施方案中，細胞選自人或動物。在其它實施方案中，純化的RNA製劑i)包含編碼第一 iPS細胞誘導因子的第一單鏈mRNA，其中大體上所有第一單鏈模板mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，和 )大體上不含能夠激活所述體細胞中的RNA傳感器的RNA汙染分子。在某些實施方案中，RNA汙染分子選自僅編碼一部分所述iPS細胞誘導因子的部分mRNA、比全長mRNA短的RNA分子、比全長mRNA長的RNA分子、雙鏈mRNA分子和未加帽的mRNA分子。在某些實施方案中，本發明提供了用於重編程體細胞(例如，去分化或轉分化)的方法，包括將體細胞與純化的RNA製劑接觸以產生重編程細胞，其中純化的RNA製劑i)包含編碼第一 iPS細胞誘導因子的第一單鏈mRNA，其中大體上所有第一單鏈完整mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，ii)大體上不含能夠激活體細胞中的RNA傳感器的重組分子(例如，RNA汙染分子)。在具體實施方案中，RNA汙染分子包括僅編碼一部分iPS細胞誘導因子的部分mRNA，編碼單鏈iPS細胞誘導因子和編碼iPS細胞誘導因子的至少額外部分的單鏈連綴mRNA、雙鏈mRNA分子和未加帽的mRNA分子。在某些實施方案中，第一單鏈mRNA也不編碼第一 iPS細胞誘導因子的額外部分。在某些實施方案中，重編程細胞是去分化細胞(例如，幹細胞或幹細胞-樣細胞)。在其它實施方案中，重編程細胞是轉分化細胞(例如，皮膚細胞被重編程為神經元或其它類型的改變)。在其它實施方案中，第一單鏈mRNA編碼完全第一 iPS誘導因子(例如，mRNA編碼特定iPS誘導因子的完整編碼序列)。在其它實施方案中，接觸還包括將體細胞與生長因子和/或細胞因子接觸(例如，在一段時間後)。在其它實施方案中，接觸還包括將體細胞與免疫反應抑制劑接觸。在某些實施方案中，第一單鏈mRNA的所有或幾乎所有尿苷核苷被假尿苷核苷替代。在其它實施方案中，第一單鏈mRNA的所有或幾乎所有胞苷核苷被5-甲基胞苷核苷或
本文中引述的另一種鹼基替代。在具體實施方案中，本發明提供了產生重編程細胞的方法，包括將體細胞與純化的RNA製劑接觸以產生能夠在培養中存活至少10天(例如，至少10天，至少13天，至少16天，至少20天，至少40天或能夠形成細胞系)的重編程細胞，其中所述純化的RNA製劑包含編碼iPS細胞誘導因子的第一單鏈mRNA，並且其中大部分第一單鏈mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基。在某些實施方案中，純化的RNA製劑不含一定量的RNA汙染分子，所述一定量的RNA汙染分子將在體細胞中激活免疫反應以足以阻止重編程細胞系在培養中存活至少10天(例如，至少10天，至少15天,至少20天,至少40天或更長)。在其它實施方案中，RNA汙染分子包括僅編碼一部分iPS細胞誘導因子的部分mRNA、完全編碼iPS細胞誘導因子和編碼iPS細胞誘導因子的至少額外部分的單鏈連綴mRNA、雙鏈mRNA分子、未加帽的mRNA分子、及其混合物。在某些實施方案中，產生的重編程細胞能夠形成重編程細胞系。在其它實施方案中，純化的RNA製劑不含一定量的RNA汙染分子，所述一定量的RNA汙染分子將在體細胞中激活免疫反應以足以阻止重編程細胞系的產生。在具體實施方案中，RNA汙染分子選自僅編碼一部分iPS細胞誘導因子的部分mRNA、編碼iPS細胞誘導因子和編碼iPS細胞誘導因子的至少額外部分的單鏈連綴mRNA、雙鏈mRNA分子、未加帽的mRNA分子及其混合物。在某些實施方案中，本發明提供了用於產生重編程細胞系的方法，包括a)將體細胞與純化的RNA製劑接觸以產生重編程細胞，其中純化的RNA製劑包含編碼iPS細胞誘導因子的mRNA，並且其中大部分mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，和b)培養去分化的細胞以產生重編程細胞系。在其它實施方案中，純化的RNA製劑不含一定量的汙染分子，所述一定量的RNA汙染分子將在體細胞中激活免疫反應以足以阻止重編程細胞系的產生。在某些實施方案中，免疫反應包括激活體細胞中的RNA傳感器。在某些實施方案中，本發明提供了用於重編程體細胞的方法，包括將體細胞與純化的RNA製劑接觸以產生重編程細胞，其中純化的RNA製劑i)包含編碼第一 iPS細胞誘導因子的第一單鏈mRNA，其中大體上所有第一單鏈mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，和ii)大體上不含a)僅編碼一部分第iPS細胞誘導因子的部分mRNA，和b)雙鏈mRNA分子。在其它實施方案中，第一單鏈mRNA也不編碼第一 iPS細胞誘導因子的額外部分。在具體實施方案中，第單鏈mRNA完全編碼第一 iPS細胞誘導因子。在其它實施方案中，純化的RNA製劑也大體上不含(或基本上不含或實際上不含或不含)編碼第一 iPS細胞誘導因子和編碼第一 iPS細胞誘導因子的至少額外部分的單鏈連綴mRNA。在其它實施方案中，大體上所有第一單鏈完整mRNA為5』加帽的。在其它實施方案中，純化的RNA製劑也大體上不含未加帽的mRNA分子。在某些實施方案中，大體上所有第一單鏈mRNA包含至少一個假尿苷殘基。在其它實施方案中，大體上所有第一單鏈mRNA包含至少一個5-甲基胞苷殘基。在其它實施方案中，大體上所有第一單鏈mRNA包含至少一個假尿苷殘基和至少一個5-甲基胞苷殘基。在某些實施方案中，純化的RNA製劑包括轉染劑。在其它實施方案中，純化的RNA製劑通過包含大量部分mRNA和雙鏈mRNA的RNA樣品的HPLC純化來獲得。在其它實施方案中，純化的RNA製劑基本上不含部分mRNA和單鏈連綴mRNA。在某些實施方案中，純化的 RNA製劑基本上不含或實際上不含或不含雙鏈mRNA分子。在其它實施方案中，純化的RNA製劑基本上不含或實際上不含或不含未加帽的mRNA。在某些實施方案中，大體上所有第一單鏈mRNA被多腺苷酸化。在其它實施方案中，第一單鏈完整mRNA使用7-甲基鳥苷進行加帽。在某些實施方案中，第一 iPS細胞誘導因子選自KLF4、LIN28、c-MYC、NAN0G、0CT4和S0X2。在其它實施方案中，純化的RNA製劑i)還包括編碼第二 iPS細胞誘導因子的第二單鏈mRNA，其中第二單鏈mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，和ii)還大體上不含a)僅編碼一部分第二 iPS細胞誘導因子的部分mRNA，和b)雙鏈mRNA。在其它實施方案中，純化的RNA製劑大體上也不含編碼第二 iPS細胞誘導因子和編碼第二 iPS細胞誘導因子的至少額外部分的單鏈連綴mRNA。在某些實施方案中，第二 iPS細胞誘導因子選自KLF4、LIN28、c-MYC、NAN0G、0CT4和S0X2。在某些實施方案中，體細胞是成纖維細胞。在其它實施方案中，重編程細胞是多能幹細胞。在其它實施方案中，去分化的細胞表達NANOG和TRA-1-60。在某些實施方案中，細胞是體外的。在其它實施方案中，細胞存在於培養中。在具體實施方案中，細胞存在於MEF條件化培養基中。在某些實施方案中，本發明提供了包含純化的RNA製劑的組合物，其中純化的RNA製劑i)包含編碼第一 iPS細胞誘導因子的第一單鏈mRNA，其中所述第一單鏈mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，和ii)大體上不含能夠激活體細胞中的RNA傳感器的RNA汙染分子。在某些實施方案中，本發明提供了包含純化的RNA製劑的組合物，其中純化的RNA製劑i)包含編碼第一 iPS細胞誘導因子的第一單鏈mRNA，其中第一單鏈完整mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基,和ii)大體上不含a)僅編碼一部分第一 iPS細胞誘導因子的部分mRNAdP b)雙鏈RNA。在某些實施方案中，純化的RNA製劑還大體上不含編碼第一 iPS細胞誘導因子和編碼第一 iPS細胞誘導因子的至少額外部分的單鏈連綴mRNA。在某些實施方案中，純化的RNA製劑i)還包括編碼第二 iPS細胞誘導因子的第二單鏈mRNA，其中第二單鏈完整mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，和ii)大體上不含a)僅編碼一部分第二 iPS細胞誘導因子的部分mRNA，和b)編碼第二種第一 iPS細胞誘導因子和編碼第二 iPS細胞誘導因子的至少額外部分的單鏈連綴mRNA。
在某些實施方案中，本發明提供了包含編碼MYC基因的體外合成的mRNA的組合物，其中體外合成的mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基。在某些實施方案中，組合物大體上不含能夠激活體細胞中的RNA傳感器的RNA汙染分子。在具體實施方案中，本發明提供了用於誘導哺乳動物細胞產生MYC蛋白的方法，所述方法包括將哺乳動物細胞與編碼MYC基因的體外合成mRNA接觸，其中體外合成的mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，從而誘導所述哺乳動物細胞產生MYC蛋白。在其它實施方案中，哺乳動物細胞是樹突細胞。在其它實施方案中，哺乳動物細胞是肺泡細胞、星形膠質細胞、小神經膠質細胞或神經元。在某些實施方案中，本發明提供了治療受試者的方法，包括將受試者與上述和本文中描述的產生MYC蛋白的哺乳動物細胞接觸。在其它實施方案中，本發明提供了合成編碼MYC基因的體外轉錄的RNA分子的方法，包括在使得產生包含至少一個假尿苷或5-甲基胞苷殘基的編碼MYC基因的體外轉錄的RNA分子的條件下組合分離的RNA聚合酶、編碼MYG基因的模板核酸序列、未修飾的核苷 酸和假尿苷或5-甲基胞苷修飾的核苷酸。在產生本發明的實施方案的過程中進行的實驗顯示可給細胞施用mRNA分子，所述mRNA分子誘導產生去分化的細胞(包括多能幹細胞)的過程。因此，本發明提供了用於產生iPS細胞的組合物和方法。令人驚訝地，mRNA的施用可提供iPS細胞的高效產生。本發明還提供了包含假尿苷或經修飾的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子、包含所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的基因治療載體、合成所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的方法以及用於基因替代、基因療法、基因轉錄沉默以及將治療性蛋白質(包括所述分子)體內遞送至組織的方法。本發明還提供了減少RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的免疫原性的方法。在某些實施方案中，本發明提供了用於去分化體細胞的方法，包括將編碼一種或多種iPSC誘導因子的mRNA引入體細胞以產生去分化的細胞。在某些實施方案中，本發明提供了用於去分化體細胞的方法，包括將編碼一種或多種iPSC誘導因子的mRNA引入體細胞和在其中細胞能存活並且被引入細胞的mRNA以充足的量被翻譯以及並且充足的時間以產生去分化細胞的條件下維持細胞。在某些優選實施方案中，去分化的細胞是誘導的多能幹細胞(iPSC)。在某些實施方案中，本發明提供了用於改變真核細胞的分化的狀態(或分化狀態)的方法，包括將編碼一種或多種重編程因子的mRNA引入細胞和在其中細胞能存活並且被引入細胞的mRNA以充足的量被翻譯並且進行充足的時間以產生與向其中引入mRNA的細胞相比較展示改變的分化狀態的細胞的條件下維持細胞。在某些實施方案中，本發明提供了用於改變真核細胞的分化狀態的方法，包括將編碼一種或多種重編程因子的mRNA引入細胞和在其中細胞能存活並且被引入細胞的mRNA以充足的量被翻譯並且進行充足的時間以產生與向其中引入mRNA的細胞相比較展示改變的分化狀態的細胞的條件下維持細胞。在某些實施方案中，改變的分化狀態是與向其中引入mRNA的細胞相比較的分化的去分化狀態。例如，在某些實施方案中，展示改變的分化狀態的細胞是與向其中引入mRNA的體細胞(例如，分化為成纖維細胞、心肌細胞或另一種分化的細胞類型的體細胞)相比較為去分化的多能幹細胞。在某些實施方案中，向其中引入mRNA的細胞是一種譜系、表型或功能的體細胞，並且展示改變的分化狀態的細胞是展示與向其中引入mRNA的細胞的不同的品系、表型或功能的體細胞；因此，在這類實施方案中，所述方法導致轉分化(Graf和Enver2009)。本發明的方法不限於其中引入了 mRNA的特定細胞。在任何上述方法的某些實施方案中，其中引入了 mRNA的細胞來源於任何多細胞真核生物。在任何上述方法的某些實施方案中，其中引入了 mRNA的細胞選自人細胞和另一種動物細胞。雖然使用人或其它動物的細胞進行本文中顯示的工作，但申請者還聲明本發明的方法(包括通過將細胞與由一種或多種純化的單鏈mRNA分子組成的純化的RNA製劑接觸來重編程人和動物細胞，所述單鏈mRNA分子各自編碼蛋白重編程因子(例如，轉錄因子))還涉及其它真核細胞(例如植物細胞和真菌細胞)的重編程。在任何上述方法的某些實施方案中，其中引入了 mRNA的細胞是來自無已知疾病的生物體的正常細胞。在任何上述方法的某些實施方案中，其中引入了mRNA的細胞為來自患有已知疾病的生物體的細胞。在任何上述方法的某些實施方案中，其中引入了 mRNA的細胞為不具有已知病理學的細胞。在任何上述方法的某些實施方案中，其 中引入了 mRNA的細胞為展示疾病狀態或已知病理學的細胞(例如，癌細胞或展示糖尿病細胞的代謝性質特徵的胰島β細胞)。本發明在方法的實施方案中不限於使用特定細胞類型(例如，不限特特定的體細胞類型)，所述方法包括引入編碼一種或多種iPSC細胞誘導因子的mRNA以產生去分化的細胞(例如，iPS細胞)。考慮到經歷使用iPS細胞誘導因子的去分化的任何細胞。這類細胞包括但不限於成纖維細胞、角質形成細胞、脂肪細胞、淋巴細胞、T細胞、B細胞、單核臍帶血的細胞、頰黏膜細胞、肝細胞、HeLa, MCF-7或其它癌細胞。在某些實施方案中，細胞存在於體外(例如，培養中)或體內。在某些實施方案中，當在培養中產生時，使用無細胞條件化培養基(例如，MEF-條件化培養基)。如下文中顯示的，所提供的這樣的培養基增強iPS細胞的產生。然而，本發明不限於所使用的培養條件。預期將現在已知或以後被鑑定為對於本發明的方法(例如，從體細胞產生iPS細胞和維持所述細胞)是有用的任何培養條件或培養基與本發明一起使用。例如，雖然不是優選的，但在本發明的某些實施方案中，使用飼養細胞層而不用條件化培養基來培養使用所述方法處理的細胞。在任何此類方法的某些實施方案中，引入mRNA的步驟包括利用轉染劑(例如，TRANSIT mRNA轉染劑，MirusBio，Madison，WI)將mRNA遞送入細胞(例如，人或其它動物體細胞)。然而，本發明不限於所利用的轉染方法的性質。事實上，考慮到已知的或將來鑑定的能夠將mRNA分子體外或體內遞送入細胞的任何轉染方法，包括將mRNA遞送入培養中或生命維持培養基(life-supporting medium)中的細胞(無論所述細胞包括分離的細胞還是包含真核組織或器官的細胞)的方法，或將mRNA體內遞送入生物體例如人、動物、植物或真菌中的細胞的方法。在某些實施方案中，轉染劑包括脂質(例如，脂質體、膠束等)。在某些實施方案中，轉染劑包括納米顆粒或納米管。在某些實施方案中，轉染劑包括陽離子化合物(例如，聚乙烯亞胺或PEI)。在某些實施方案中，轉染法使用電流將mRNA遞送入細胞(例如，通過電穿孔)。在某些實施方案中，轉染法使用微粒轟擊法(bolistics method)將mRNA遞送入細胞(例如，「基因槍」或微粒轟擊遞送系統)。本文中提供的數據顯示，對於被引入細胞的mRNA，本文中描述的實施例中使用的一定量的mRNA導致比其它量的mRNA更高效且更快速地從使用的特定體細胞誘導多能幹細胞。然而，本發明的方法不限於使用特定量的mRNA引入細胞。例如，在某些實施方案中，將總共3個劑量(每一個劑量包含18微克的6種不同mRNA的每一種,每一種RNA編碼不同的人重編程因子)用於將mRNA引入ΙΟ-cm平板中的約3 X IO5個人成纖維細胞(例如，使用含脂質的轉染劑遞送的)，雖然在其它實施方案中，將更高或更低量的mRNA用於引入細胞。本發明不限於使用的mRNA的特定化學形式，雖然mRNA的某些形式可產生更高效的結果。然而，在某些優選實施方案中，mRNA包含至少一個經修飾的核苷(例如，選自假尿苷(Ψ)、5_甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲基尿苷(m5U)、2' -O-甲基尿苷(Um或m2』_°U)、2-硫尿苷(S2U)和N6-甲基腺苷(m6A)),其替代至少一部分相應的未修飾的典型核苷(例如,在某些優選實施方案中，至少一個經修飾的核苷替代所有相應的未修飾的A、C、G或T典型核苷)。在某些實施方案中，mRNA被多腺苷酸化。在某些優選實施方案中，通過多腺苷酸化體外轉錄的(IVT) RNA來製備mRNA，所述方法包括將IVT RNA與聚腺苷酸聚合酶(例如，酵母
RNA聚合酶或大腸桿菌(E. coli)多聚腺苷聚合酶)接觸。在某些實施方案中，使用編碼多聚腺苷酸尾的DNA模板在IVT期間多腺苷酸化mRNA。無論RNA是使用聚腺苷酸聚合酶被多腺苷腺化的還是在DNA模板的IVT過程中被多腺苷酸化的，在某些優選實施方案中，mRNA包含多聚腺苷酸尾(例如，具有50-200個核苷酸，例如優選100-200、150-200個核苷酸或超過150個核苷酸的多聚腺苷酸尾)，雖然在某些實施方案中，使用更長或更短的多聚腺苷酸尾。在某些實施方案中，給方法中使用的mRNA加帽。為了使細胞中的表達的效率最大化，優選大部分mRNA分子包含帽。在某些優選實施方案中，通過在加帽酶系統存在的情況下溫育未加帽的初級RNA來體外合成方法中使用未加帽的mRNA分子。在某些優選實施方案中，通過體外轉錄(IVT)編碼待合成的RNA的DNA分子來合成加帽酶反應中使用的初級RNA。編碼待合成的RNA的DNA包含RNA聚合酶啟動子，RNA聚合酶結合所述啟動子並且從其起始轉錄。在本領域還已知mRNA分子通常具有位於翻譯起始密碼子之前和未被翻譯的翻譯終止密碼子之後的不同序列的區域。這些區域(分別稱為5』端非翻譯區(5, UTR)和3』端非翻譯區(3' UTR))可影響mRNA穩定性、mRNA定位和與它們連接的mRNA的翻譯效率。已知某些5』和3』 UTR例如α和β球蛋白的5』和3』 UTR提高mRNA穩定性和mRNA的表達。因此。在某些優選實施方案中，編碼重編程因子(例如，iPSC誘導因子)的mRNA展示在細胞中導致更高的mRNA穩定性和更高的mRNA表達的5』 UTR和/或3』 UTR(例如，α球蛋白或β球蛋白5』 UTR和/或3』 UTR ;例如，非洲爪蟾或人α球蛋白或β球蛋白5』 UTR和/或3』 UTR,或例如菸草蝕紋病毒(TEV) 5』 UTR)。可使用任何RNA聚合酶進行IVT，只要mRNA從編碼RNA的DNA模板的合成特異性地且充分地起始於各自同源的RNA聚合酶啟動子並且獲得全長mRNA。在某些優選實施方案中，RNA聚合酶選自T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶和T3RNA聚合酶。在某些其它實施方案中，通過在IVT反應中使用二核苷酸帽類似物共轉錄地合成加帽的RNA(例如，使用AMPLICAP 17 試劑盒或 MESSAGEMAX T7 ARCA-CAPPED MESSAGE Transcription 試劑盒；EPICENTRE或CellScript，Madison, WI, USA)。如果共轉錄地進行加帽，則優選二核苷酸帽類似物為抗-反向帽類似物(anti-reverse cap analog) (ARCA)。然而,使用單獨的IVT反應,然後用加帽酶系統進行加帽(這導致約100%的RNA被加帽)優於共轉錄加帽，所述共轉錄加帽通常導致僅約80%的RNA被加帽。因此，在某些優選實施方案中，本發明的方法中使用的高百分比的mRNA分子被加帽(例如，大於80%、大於90%、大於95%、大於98%、大於99%、大於99. 5%或、大於99. 9%的mRNA分子的群體被加帽)。在某些優選實施方案中，本發明的方法中使用的mRNA具有擁有帽I (capl)結構的帽，意指相對於帽核苷酸的倒數第二個核苷酸的核糖的2』羥基被甲基化。然而，在某些實施方案中，方法中使用的mRNA具有擁有帽O結構的帽，意指相對於帽核苷酸的倒數第二個核苷酸的2』羥基未被甲基化。對於某些但非全部轉錄物，利用具有擁有帽I結構的mRNA轉染真核細胞，與用相同mRNA(但具有擁有帽O結構的帽)轉染相同細胞相比較，在轉染的細胞中導致更高的蛋白質表達水平或更長的蛋白質表達持續時間。在某些實施方案中，本發明的方法中使用的mRNA具有經修飾的帽核苷酸。在於本文中實施例中提供的實驗之前進行的某些實驗中，本申請發現，當用包含尿苷或假尿苷(替代尿苷)的0CT4mRAN轉染1079或IMR90人成纖維細胞時，含假尿苷的mRNA以比包含尿苷的mRNA更高的水平翻譯或進行更長的持續時間。因此，在某些優選實施方案中，本發明的方法中使用的mRNA中包含的一個或多個或全部尿苷被假尿苷替代(例如，通過在IVT反應中替代假尿苷_5』三磷酸以合成RNA，替代尿甘-5』 -三磷酸)。然而，在某些實施方案中，本發明的方法中使用的mRNA包含尿苷並且不包含假尿苷。在某些優 選實施方案中，mRNA包含至少一個經修飾的核苷(例如，選自假尿苷(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲基尿苷(m5U)、2, -O-甲基尿苷(Um或m2』_°U)、2_硫尿苷(S2U)和N6-甲基腺苷(m6A))，其替代至少一部分相應的未修飾的典型核苷(例如，替代大體上所有相應的未修飾的A、C、G或T典型核苷)。在某些優選實施方案中，mRNA包含至少一個選自由假尿苷(Ψ)和5-甲基胞嘧啶(m5C)組成的組的經修飾的核苷。在某些優選實施方案中，mRNA包含假尿苷(Ψ)和5-甲基胞嘧啶(m5C)兩者。此外，為了實現指定的目標，以本發明的任何方法引入真核細胞的mRNA的一個或多個核苷酸的核酸鹼基、糖部分或核苷酸間連接可包含經修飾的核酸鹼基、糖部分或核苷酸間連接。本發明也不限於以本發明的任何方法將其遞送入真核細胞的mRNA的來源。在某些實施方案例如實施例中描述的那些實施方案中，通過體外轉錄包含線性化質粒載體中克隆的基因的DNA模板或通過體外轉錄利用PCR或RT-PCR合成的DNA模板(即，通過PCR擴增產物的IVT)，使用加帽酶系統或通過共轉錄加帽(通過在IVT過程中整合二核苷酸帽類似物(例如，ARCA))進行加帽以及使用聚腺苷酸聚合酶多腺苷酸化來合成mRNA。在某些優選實施方案中，通過DNA模板的IVT合成mRNA，所述DNA模板包含線性化的質粒載體中克隆的基因或PCR或RT-PCR擴增產物，其中DNA模板編碼3』聚腺苷酸尾。在某些其它實施方案中，被以本發明的任何方法遞送入真核細胞的mRNA直接來源於細胞或生物樣品。例如，在某些實施方案中，通過使用RNA擴增反應擴增來自細胞或生物樣品的mRNA，以及使用加帽酶系統或通過共轉錄加帽(通過在IVT過程中整合二核苷酸帽類似物(例如，ARCA))進行加帽來獲得來源於細胞或生物樣品的mRNA，並且，如果擴增的mRNA還未包含來自RNA擴增反應的模板編碼的多聚腺苷酸尾，則使用多聚腺苷酸聚合酶多腺苷酸化擴增的mRNA。關於包括引入編碼一種或多種iPS細胞誘導因子的mRNA以產生去分化的細胞(例如，iPS細胞)，本發明不限於所使用的iPS細胞誘導因子的性質。考慮目前已知或以後發現的用於去分化的編碼一種或多種蛋白誘導因子的任何mRNA用於本發明。在某些實施方案中，使用一個或多個編碼 KLF4、LIN28、c-MYC、NAN0G、0CT4 或 S0X2 的 mRNA。0ct-3/4 和Sox基因家族的某些成員(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)已被鑑定為參與誘導過程的轉錄調節劑。然而，其它基因，包括Klf家族(Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族(C-myc, L-myc和N-myc)的某些成員Nanog和LIN28，經鑑定增加誘導效率。需要時，可使用任何一種或多種這類因子。雖然本發明的組合物和方法可用於產生iPS細胞，但本發明不限於這類細胞的產生。例如，在某些實施方案中，將編碼一種或多種重編程因子的mRNA引入細胞以產生與向其中引入mRNA的細胞相比較具有改變的分化狀態的細胞。例如，在某些實施方案中，編碼一種或多種iPS細胞誘導因子的mRNA用於產生不為iPS細胞的去分化的細胞。這類細胞用於研究、藥品篩選和其它應用。在某些實施方案中，本發明還包括使用通過上述方法產生的去分化細胞的方法。例如，這類細胞用於研究、藥物篩選和人或其它動物的治療性應用。例如，在某些實施方案中，產生的細胞用於鑑定和表徵iPS細胞誘導因子以及與分化或去分化相關的其它因子。在某些實施方案中，將產生的去分化細胞移植入生物體或體外或體內存在的組織。在某些實施方案中，將具有產生的細胞的生物體、組織或培養系統暴露於測試化合物，觀察或測量所述測試化合物對細胞或生物體、組織或培養系統的作用。 在某些其它實施方案中，進一步處理使用上述方法產生的去分化細胞(例如，iPS細胞)以產生與從其產生去分化細胞的體細胞相比較具有相同的分化狀態或細胞類型的分化的細胞。在某些其它實施方案中，進一步處理使用上述方法產生的去分化細胞(例如，iPS細胞)以產生與從其產生去分化細胞的體細胞相比較具有不同的分化狀態或細胞類型的分化的細胞。在某些實施方案中，從產生的去分化細胞(例如，產生的iPS細胞)產生分化的細胞，這通過將編碼一種或多種重編程因子的mRNA引入在一個或多個處理過程中產生的iPS細胞並且在條件(其中細胞能存活並且分化為與向其中引入編碼一種或多種重編程因子的mRNA的產生的去分化細胞(例如，產生的iPS細胞)相比較具有改變的分化狀態或細胞類型的細胞)下維持向其中引入mRNA的細胞。在這些實施方案的某些實施方案中，具有改變的分化狀態的產生的分化細胞用於研究、藥物篩選或治療性應用(例如，在人或其它動物中)。例如產生的分化細胞用於鑑定和表徵與分化相關的重編程因子。在某些實施方案中，將產生的分化細胞移植入生物體或體外或體內存在的組織。在某些實施方案中，將具有產生的分化細胞的生物體、組織或培養系統暴露於測試化合物，觀察或測量所述測試化合物對細胞或生物體、組織或培養系統的作用。在方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的充足時間少於I周，所述方法包括將編碼一種或多種iPSC誘導因子的mRNA引入體細胞和在其中細胞能存活並且被引入細胞的mRNA以充足的量被表達並且進行充足的時間以產生去分化細胞的條件下維持細胞(例如，其中去分化細胞是誘導的多能幹細胞)。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於50個去分化細胞(例如，iPSC)/3X105個向其中引入mRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於100個去分化細胞(例如，iPSC)/3X IO5個向其中引入mRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於150個去分化細胞(例如，iPSC)/3X IO5個向其中引入mRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於200個去分化細胞(例如，iPSC)/3X105個向其中引AmRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於300個去分化細胞(例如，iPSC)/3X105個向其中引入mRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於400個去分化細胞(例如，iPSC)/3X IO5個向其中引入mRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於500個去分化細胞(例如，iPSC)/3X105個向其中引AmRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於600個去分化細胞(例如，iPSC)/3X IO5個向其中引入mRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於700個去分化細胞(例如，iPSC)/3X IO5個向其中引入mRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於800個去分化細胞(例如，iPSC)/3X105個向其中引AmRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於900個去分化細胞(例如，iPSC)/3X IO5個向其中引入mRNA的輸入細胞。在該方法的某些優選實施方案中，產生去分化細胞的重編程效率大於或等於1000個去分化細胞(例如，iPSC)/3X105個向其中引入mRNA的輸入細胞。因此，在某些優選實施方案中，該方法的效率為包括利用病毒載體(例如，慢病毒載體)遞送重編程因子的公布的方案的2倍。在 某些優選實施方案中，該方法的效率為包括利用病毒載體(例如，慢病毒載體)遞送重編程因子的公布的方案的5倍。在某些優選實施方案中，該方法的效率為包括利用病毒載體(例如，慢病毒載體)遞送重編程因子的公布的方案的10倍。在某些優選實施方案中，該方法的效率為包括利用病毒載體(例如，慢病毒載體)遞送重編程因子的公布的方案的20倍。在某些優選實施方案中，該方法的效率為包括利用病毒載體(例如，慢病毒載體)遞送重編程因子的公布的方案的25倍。該方法在某些優選實施方案中，該方法的效率為包括利用病毒載體(例如，慢病毒載體)遞送重編程因子的公布的方案的30倍。在某些優選實施方案中，該方法的效率為包括利用病毒載體(例如，慢病毒載體)遞送重編程因子的公布的方案的35倍。在某些優選實施方案中，該方法的效率為包括利用病毒載體(例如，慢病毒載體)遞送重編程因子的公布的方案的40倍。本發明還提供了方法中使用或有用的和/或通過本文中描述的方法產生的組合物(系統、試劑盒、反應混合物、細胞、mRNA)。例如，在某些實施方案中，本發明提供了編碼iPS細胞誘導因子的mRNA、用假尿苷替代尿苷的mRNA。本發明還提供了包含轉染劑和編碼iPS細胞誘導因子的mRNA的組合物(例如，轉染劑與mRNA的混合物)。在某些實施方案中，組合物包含編碼多種(例如，2種或更多種，3種或更多種，4種或更多種，5種或更多種或6種)iPS細胞誘導因子包括但不限於KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG, 0CT4 和 S0X2 的 mRNA。組合物還包含對於實施本文中描述的任何方法是充足的、必需的或有用的任何其它試劑或組分。這類試劑或組分包括但不限於轉染劑、培養基(例如，MEF條件化培養基)、細胞(例如，體細胞、iPS細胞)、容器、盒子、緩衝劑、抑制劑(例如，RNA酶抑制劑)、標記物(例如，螢光、發光、放射性標記物等)、陽性和/或陰性對照分子、用於產生加帽的mRNA的試劑、乾冰或其它冷凍劑、使用說明書、細胞培養設備、檢測/分析設備等。本發明提供了包含假尿苷或經修飾的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子、包含所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的基因治療載體、包括所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的基因療法和基因轉錄沉默法、減小所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的免疫原性的方法以及合成所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的方法。在一個實施方案中,本發明提供了包含假尿苷殘基的信使RNA。在另一個實施方案中，本發明提供了編碼目的蛋白的RNA分子，所述RNA分子包含假尿苷殘基。在另一個實施方案中，本發明提供了體外轉錄的RNA分子，所述分子包含假尿苷或經修飾的核苷。在另一個實施方案中，本發明提供了體外合成的寡核糖核苷酸，其包含假尿苷或經修飾的核苷，其中經修飾的核苷為1115(、11^、1111、^、Ψ或2' -O-甲基-U。在另一個實施方案中，本發明提供了基因治療載體(包括體外合成的多核苷酸分子)，其中多核苷酸分子包含假尿苷或經修飾的核苷。在另一個實施方案中，本發明提供了雙鏈RNA(dsRNA)分子，所述分子包含假尿苷或經修飾的核苷作為其序列的部分並且還包含siRNA或shRNA。在另一個實施方案中，dsRNA分子在長度上超過50個核苷酸。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了用於誘導哺乳動物細胞產生重組蛋白質的方法，包括將哺乳動物細胞與體外合成的編碼重組蛋白質的RNA分子、體外合成的包含假尿苷或經修飾的核苷的RNA分子接觸，從而誘導哺乳動物細胞產生重組蛋白質。在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的貧血症的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼紅細胞生成素的RNA分子接觸，從而治療受試者的貧血症。在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的血管痙攣的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼可誘導的一氧化氮合酶(iNOS)的RNA分子接觸，從而治療受試者的血管痙攣。在另一個實施方案中，本發明提供了用於提高受試者的細胞的存活率的的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼熱激蛋白的RNA分子接觸，從而提高受試者的細胞的存活率。在另一個實施方案中，本發明提供了用於在進行擴大血管的方法後降低血管的再狹窄的發病率的方法，包括將血管的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼熱激蛋白的RNA分子接觸，從而降低受試者的再狹窄的發病率。在另一個實施方案中，本發明提供了用於增加毛髮從受試者的頭皮的毛囊生長的方法，包括將頭皮的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼端粒酶或免疫抑制蛋白的RNA分子接觸，從而增加毛髮從毛囊生長。在另一個實施方案中，本發明提供了誘導具有抗氧化劑活性的酶在細胞中表達的方法，包括將細胞與體外合成的RNA分子、編碼酶的體外合成的RNA分子接觸，從而誘導具有抗氧化劑活性的酶在細胞中表達。在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的囊性纖維化的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、編碼囊性纖維化跨膜傳導調節劑(TransmembraneConductance Regulator, FTR)的RNA分子,從而治療受試者的囊性纖維化。另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的X連鎖丙種球蛋白缺乏血症(X-linked agammaglobulinemia)的方法,包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼Bruton』 s酪氨酸激酶的RNA分子接觸，從而治療X連鎖丙種球蛋白缺乏血症。
在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的腺苷脫氨酶嚴重聯合免疫缺陷症(AM SCID)的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼ADA的RNA分子接觸，從而治療ADA SCID。在另一個實施方案中，本發明提供了用於產生重組蛋白質的方法，包括將體外翻譯裝置與體外合成的多核糖核苷酸接觸，體外合成的多核苷酸包含假尿苷或經修飾的核苷，從而產生重組蛋白質。在另一個實施方案中，本發明提供了用假尿苷經修飾的核苷合成包含經修飾的核苷酸的體外轉錄的RNA分子的方法，包括將分離的聚合酶與未修飾的核苷酸和修飾的核苷酸的混合物接觸。在另一個實施方案中，本發明提供了體外轉錄裝置，包括未修飾的核苷酸、包含假尿苷或經修飾的核苷的核苷酸和聚合酶。在另一個實施方案中，本發明提供了體外轉錄試劑盒，包括未修飾的核苷酸、包含假尿苷或經修飾的核苷的核苷酸和聚合酶。每一種可 能性代表本發明的單獨實施方案。


下列附圖形成本說明書的部分並且被包括以進一步顯示本發明的某些方面。可通過參考與本文中所示的具體實施方案的詳細描述組合的這些附圖的一個或多個附圖來更好地理解本發明。圖I顯示了翻譯如實施例中所述製備的編碼6種人重編程因子的每一種的mRNA以及在轉染入人新生兒1079成纖維細胞後其被定位至預測的亞細胞位置。未處理的人1079成纖維細胞:照片A、E、I、M、Q和U顯示未用編碼重編程因子的mRNA轉染的未處理的人1079成纖維細胞的相差圖像，照片B、F、J、N、R和V顯示在用特異於每一種重編程因子的抗體對細胞進行染色後相同視野的螢光圖像；這些結果顯示在未處理的人1079成纖維細胞中幾乎不存在或不存在這類內源重編程因子蛋白。處理的人1079成纖維細胞照片C、G、K、0、S和W顯示用編碼指定的重編程因子的mRNA轉染的人1079成纖維細胞的相差圖像，照片D、H、L、P、T和X顯示在轉染後24小時用特異於每一種重編程因子的抗體對細胞進行染色後的相同視野的螢光圖像。這些結果顯示每一種重編程因子蛋白在用編碼各自重編程因子的mRNA轉染後24小時在人1079成纖維細胞中表達並且重編程因子蛋白被定位在預測的亞細胞位置。A-T放大20倍。U-X放大10倍。圖2 顯示編碼人重編程因子(KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4 和 S0X2)的 mRNA在人體細胞中產生iPS細胞。圖2顯示在用編碼重編程因子的mRNA的最終轉染後第12天iPS細胞集落的明視場(A、C)和免疫螢光(B、D)圖像。在集落#1(B、D)中觀察到NANOG染色。圖像A和B放大10倍。C和D放大20倍。圖3顯示來源於人1079和MR90體細胞的iPS集落對於NANOG和TRA-1-60呈陽性。圖3顯示來源於1079細胞(A、D)和IMR90細胞(G)的iPS集落的相差(A、D、G)和免疫螢光(B、C、E、F、H、I)圖像。(A)中顯示的相同iPS集落對於NANOG (B) TRA-1-60 (C)都呈陽性。(D)中顯示的iPS集落呈NANOG-陽性(E)和TRA-1-60-陽性(F)。從MR90成纖維細胞(G)產生iPS集落對於NANOG(H)和TRA-1_60(I)也都呈陽性。所有圖像放大20倍。
圖4顯示通過在MEF條件化培養基中用編碼重編程因子的mRNA轉染細胞實現快速、效率增強的iPS集落形成。在最終轉染後3天選擇200多個集落；在ΙΟ-cm培養皿中，用 36 μ g 的每一種重編程 mRNA(即，編碼 KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4 和 S0X2)轉染IMR90細胞3次。代表性iPSC集落顯示為4倍(A、B)、10倍(C-E)和20倍放大(F)。在用編碼6種重編程因子的mRNA進行終mRNA轉染後8天，在用18 μ g(G、I)或36 μ g(H)的6種mRNA的每一種轉染的IMR90細胞中計數了超過1000個iPSC集落。通過放大4倍(G-H)和放大10倍(I)來顯示代表性集落。圖5顯示1079-和MR90-來源的iPSC集落對於NANOG和TRA-1-60呈陽性。在用36 μ g的6種重編程因子的每一種的mRNA進行終mRNA轉染後8天，1079來源的iPSC集落(A、D和G中顯示的)對於NANOG (B、E和H)和TRA-1-60 (C、F和I)呈陽性。在用18 μ g (J-L)或36 μ g (M-O)的6種重編程因子的每一種的mRNA進行終mRNA轉染後8小時，IMR90來源的iPS集落也對於NANOG (K、N)和TRA-1-60 (L、O)呈陽性。圖6.利用天然RNA轉染的MDDC進行的TNF_a α的產生顯示未修飾的體外合成的RNA以及細菌RNA和哺乳動物線粒體RNA是高免疫原性的，雖然其它哺乳動物RNA是 弱免疫原性的。用單獨的Lipofectin 或與R-848 (I μ g/ml)或RNA (5 μ g/ml)複合的I ,ipoibcinrX'溫育人MDDC，所述RNA來自293細胞(總RNA，細胞核RNA和細胞質RNA)、小鼠心臟(polyA+mRNA)、人血小板線粒體RNA、牛tRNA、細菌tRNA和總RNA (大腸桿菌)(用或未用RNA酶降解的)。8小時後，利用ELISA測量上清液中的TNF-α。顯示了平均值土SEM。結果代表3個獨立實驗。圖7.通過RNA進行的TLR-依賴性激活顯示m6A和s2U修飾阻斷TLR3信號轉導，然而所有修飾阻斷TLR7和TLR8信號轉導，並且修飾程度較低的細菌RNA和未修飾的體外轉錄的RNA激活所有3種TLR。(A)在變性瓊脂糖凝膠上分析不具有(無)或具有m5C、m6A、Ψ、m5U或S2U核苷修飾的體外轉錄的RNA-1571的等分(I μ g)，然後進行溴化乙錠染色和 UV-照明。(B)用單獨的Lipofectin 丄ipofecti.n -R-848 (I μ g/ml)或 RNA(5 μ g/ml)處理表達TLR3、TLR7、TLR8和對照載體的293細胞。顯示存在於RNA-730和RNA-1571中的修飾鹼基。(C)從大鼠肝、小鼠細胞系(TUBO)和人脾(整個)、人血小板線粒體RNA或從兩個不同的大腸桿菌來源獲得CpG0DN-2006 (5 μ g/ml)、LPS (I. O μ g/ml)和RNA分離物。293-hTLR9細胞用作對照。8小時後，利用ELISA測量上清液中的IL-8。顯示平均值土SEM。用星號指示含有hTLR3-靶向siRNA的細胞系。結果代表4個獨立實驗。圖8.由RNA轉染的DC進行的細胞因子產生顯示所有修飾阻斷產生細胞因子的DC的激活，雖然只有尿苷修飾阻斷血液來源的DC激活。用單獨的I .ipoicctin-K、I.ipoicctin i )-R-848 (I μ g/ml)或 RNA (5 μ g/ml)處理用 GM-CSF/1L-4 (A、C)或GM-CSF/IFN- a MDDCs⑶以及原代DCl和DC2⑶產生的MDDC，進行8至16小時。顯示了存在於RNA-1571中的經修飾的核苷。利用ELISA測量上清液中的TNF-a、IL_12(p70)和IFN- α。顯示了平均值土SEM。結果代表10個(Α和C)、4個⑶和6個⑶獨立實驗。Ε. RNA對DC的激活。用單獨的或與I μ g/ml poly(I) (C)或R_848(作為陽性對照)複合的Lipofectin (上圖框)或與指定的RNA複合的Lipofectin (5 μ g/ml ;下圖框)處理MDDC，進行20小時。顯示了存在於RNA-1886中的經修飾的核苷。通過流式細胞術測定CD83、CD80 和 HLA-DR 的表達。
圖9. RNA對DC的激活顯示所有核苷修飾抑制RNA介導的DC激活。利用單獨的I /ipoicctin^、I ,ipoicciini0-R-84S (I μ g/ml)或RNA-1571 (如所指定的修飾的)(5 μ g/ml)處理MDDC，進行20小時。(A)⑶83和HLA-DR染色。(B)上清液中的TNF- α水平和響應RNA的溫育的CD80和CD86的平均螢光。使培養基的體積增加至30倍以進行流式細胞術，如由星號指示的。數據代表4個獨立的實驗。圖10.轉錄包含不同量(0%、1%、10%、50%、90%、99%和100%的經修飾的核苷，相對於相應的未修飾的NTP)的加帽的RNA-1571，發現只有數個核苷的修飾導致DC的激活的抑制。Α.將所有轉錄物消化成單磷酸酯，利用反相HPLC進行分析以測定經修飾的核苷整合的相對量。顯示了在指定的(Ψ U)比率上獲得的代表性吸光度譜。記錄假尿苷(Ψ)、胞苷(C)、鳥苷(G)、尿苷(U)、7-甲基鳥苷("m7G")和腺苷("A")的3'-單磷酸酯的洗脫時間。(B)經RNA-1571的修飾的核苷的含量。基於轉錄反應中的修飾的NTP的相對量和RNA-1571的核苷組成(A :505，U :451，C :273，G 342)計算預期的RNA-1571中的m6A%、Ψ (假尿苷)％或m5C%。基於HPLC色譜圖的定量測定測量的經修飾的核苷含量的值。注意A :m6ATP、ΨΤΡ和m5CTP分別相對於ATP、UTP和CTP的值(％ )。B :m6A、Ψ和 m5C單磷酸酯相對於所有NMP的值。(C)利用],ipoibciini複合的加帽的RNA-1571 (5 μ g/ml)(含有指定量的m6A、Ψ或m5C)轉染MDDC。8小時後，測量上清液中的TNF-α。數據表示為TNF-α的相對抑制。顯示了 3個獨立實驗中獲得的平均值土SEM。圖11.由寡核糖核苷酸-轉染的DC產生的TNF- α表達顯示少至一種經修飾的核苷減少DC激活。(A)顯示了化學合成(0RN1-4) (SEQID NO 6~9)或體外轉錄(0RN5-6) (SEQID NO=IO-Il)的寡核糖核苷酸(ORN)的序列。突出顯示經修飾的核苷Um(2' -O-甲基尿苷)、m5C 和 Ψ 的位置。用單獨的Lipofectin i (培養基)、R-848 (I μ g/ml)或與 RNA (5 μ g/ml)複合的LiporeclnvX轉染人MDDC。其中要指出的是，用2. 5 μ g/ml環己醯亞胺(CHX)處理細胞。(B). 8小時溫育後，測量上清液中的TNF- α。(C)通過Northern印跡法分析細胞的RNA。顯示了 3個獨立實驗的代表性平均值土SEM。圖12. Α. Ψ-修飾的mRNA不刺激促炎性細胞因子的體內產生。利用ELISA分析血清樣品(注射後6小時)，所述樣品顯示3 μ g未修飾的mRNA與3 μ gW-修飾的mRNA相比較誘導更高水平的IFN- α (P < 0. 001)。由3 μ δΨ-修飾的mRNA誘導的IFN- α水平與當用未複合的lipofectin注射的動物時獲得的水平相似。值表示為平均值土s. em. (η = 3或5隻動物/組)。B.對於TNF- α觀察到類似結果。圖13.含有假尿苷(Ψ)的mRNA不激活PKR。Ψ :假尿苷。對照未修飾的RNA。m5C :具有m5C修飾的mRNA。圖14.增加的螢光素酶從兔網織紅細胞裂解物的含有假尿苷的mRNA的表達。Luc-Y :具有假尿苷修飾的mRNA ；Iuc-C :未修飾的RNA。通過將螢光素酶活性針對未修飾的螢光素酶RNA標準化來表示數據。圖15.增加的海腎螢光素酶從培養細胞的含有假尿苷的mRNA的表達。A. 293細胞。B.鼠原代、骨髓源性小鼠樹突細胞。海腎-Y:具有假尿苷修飾的mRNA;海腎-C:未修飾的RNA。用m5C、m6A和m5U修飾RAN，如所指示的。圖16.A. 3'和5'元件對Ψ-修飾的mRNA的翻譯效率的累加效應。用螢火蟲螢光素酶常規和Ψ-修飾的mRNA轉染293細胞，所述兩種mRNA具有Y帽(capLuc)、50nt_長的3'聚腺苷酸尾(TEVlucA50)、這兩個元件(分別地capTEVlucA50和Luc)中的兩個或任一個。4小時後裂解細胞，測量總裂解物的等分(1/20)的螢光素酶活性。B. Ψ-修飾的mRNA比未修飾的mRNA的更穩定。在轉染後在指定的時間上裂解用含有未修飾的或Ψ-經修飾的核苷的capTEVlucAn轉染的293細胞。測試等分(1/20)的裂解物的螢光素酶。標準誤差太小以至於不能用誤差棒顯現。C.與常規mRNA相比較使用Ψ-修飾的mRNA增強β -半乳糖苷酶的表達。用lipofectin-複合的編碼細菌β -半乳糖苷酶(IacZ)的mRNA (O. 25 μ g/孔)轉染接種在96孔平板中的293細胞。轉錄物具有帽和30nt-長(caplacZ)或 200nt_長(caplacZ-An)的3'多聚苷酸尾。轉染後24小時，測試使用常規U或Ψ核苷製備的構建體。固定細胞，並用X-gal染色。利用倒置顯微鏡(40和100倍的放大倍數)從代表性孔獲取圖像。圖17. A。在腦內注射經修飾的或未修飾的編碼mRNA後海腎的表達。以8個位置/動物注射大鼠腦皮層。一個半球用具有假尿苷修飾的加帽的海腎編碼RNA(capRenilla-Y)注射，而相應的半球用無核苷修飾的加帽的RNA(capRenilla-C)注射。顯示了來自2隻動物(6個注射位置)的數據。BG;更低的測定檢測水平。B.靜脈內-遞送的Ψ-修飾的mRNA 鼠)。在注射後2和4小時處死動物，測量在裂解緩衝液中勻漿的器官的等分(1/10)的螢光素酶活性。值代表整個器官中的螢光素酶活性。C. Ψ-修飾的mRNA在體內展示更大的穩定性和翻譯。將具有或不具有Ψ修飾的Lipofectin-複合的capTEVlucAn (O. 3 μ g/60 μ I/動物)靜脈內遞送至小鼠。在注射後1、4和24小時處死動物，處理1/2的它們的脾以進行螢光素酶測量(左圖框)並且另一半用於RNA分析(右圖框)。測量從一半脾製備的勻漿物的等分(1/5)的螢光素酶活性。標繪值代表整個脾的螢光素酶活性並且表示為平均值土 s. e.m. (n = 3或4/點)。D.氣管內注射mRNA後熒火蟲螢光素酶的表達。capTEVluc-Y :編碼加帽的熒火蟲螢光素酶的假尿苷修飾的RNA。CapTEVluc-C :不具有核苷修飾的加帽的RNA。圖18.蛋白質產量取決於小鼠中靜脈內遞送的mRNA的量。通過靜脈內注射以60 μ I/動物的體積將指定的量的lipofectin-複合的核酸,具有或不具有Ψ組分的capTEVlucAn mRNA和pCMVluc質粒DNA遞送入小鼠。分別在注射後6或24小時處死用mRNA或質粒DNA注射的動物，測量在裂解緩衝液中勻漿的它們的脾的等分(1/10)的螢光素酶活性。顯示來自每一隻動物的值，短水平線表示平均值；N.D.，不可檢測的。圖19。在編碼mRNA的氣管內遞送後螢火蟲螢光素酶的表達。將mRNA與lipofectin (或PEI，如指出的)複合，用0. 3 μ g具有或不具有Ψ修飾的螢火蟲螢光素酶編碼mRNA注射動物，然後3小時後處理動物。收穫肺，勻漿，測量裂解的器官的等分的螢光素酶活性。圖20. Ψ-修飾的mRNA在經肺遞送後不誘導炎性介質。在氣管內遞送編碼螢光素酶的未修飾的mRNA或Ψ修飾的mRNA後血清中TNF- α和IFN- α的誘導。在mRNA遞送後24小時通過ELISA測定TNF- α和IFN- α的血清水平。圖21顯示實施例35的結果將具有指定的修飾的螢火蟲或海腎螢光素酶編碼mRNA與lipofectin複合並且遞送至鼠樹突細胞(A)和HEK293T(B)細胞。用與具有指定的修飾(C)的TransIT複合的螢火蟲或海腎螢光素酶編碼mRNA轉染人DC。數據表示為與未修飾的mRNA相比較的倍數變化。圖22顯示實施例36的結果用於產生mRAN的T7聚合酶轉錄反應導致大量的正確尺寸的RNA，但也包含汙染物。這通過將RNA應用於反相HPLC柱(在變性條件下基於尺寸分離RNA)來顯現。將Ψ -修飾的TEV-螢光素酶-A51 RNA用於38%緩衝液B中的HPLC柱，將其經歷緩衝液B遞增至55%的線性梯度。特徵譜顯示小於預期的汙染物和大於預期的汙染物兩者。圖23顯示實施例37的結果(A)將具有指定的修飾以及利用或未利用HPLC純化的EPO編碼mRNA遞送至鼠DC，24小時後測量上清液的EPO水平。雖然m5C/W修飾的mRNA在HPLC純化之前具有最高翻譯水平，但Ψ-修飾的mRNA在HPLC純化後具有最高翻譯。(B)用利用或未利用HPLC純化的具有指定的修飾的海腎編碼mRNA轉染人DC。圖24顯示實施例38的結果(A)用利用或不利用HPLC純化的複合至具有指定的修飾的TransIT的RNA轉染人DC。24小時後測量IFN- α水平。HPLC純化增加未修飾的RNA的免疫原性，所述免疫原性依賴於序列，因為其它未修飾的RNA在HPL純化C後具有相 似的IFN-α水平或減少的水平。Ψ-修飾的RAN具有不可測量的IFN-α水平，與對照處理的DC相似。(B)使用斑點印跡，利用特異於dsRNA (J2)的單克隆抗體分析HPLC純化之前(-)和之後(P1+P2)的Ψ-修飾的RNA。RNA的純化除去dsRNA汙染。(C)編碼iPS因子的Ψ-修飾的RNA具有免疫原性，其通過RNA的HPLC純化除去。圖25 提供了 KLF4 (SEQ ID NO 12)和 LIN28 (SEQ ID NO 13)的 mRNA 編碼序列。圖26 提供了 cMYC (SEQ ID NO 14)和 NANOG (SEQ ID NO 15)的 mRNA 編碼序列。圖27 提供了 0CT4 (SEQ ID NO 16)和 S0X2 (SEQ ID NO 17)的 mRNA 編碼序列。圖28顯示編碼人重編程因子(KLF4、c-MYC, 0CT4和S0X2)的mRNA在原代人角質形成細胞中產生iPS細胞。圖28顯示用編碼4個重編程因子的mRNA轉染後第2天(A)的HEKn細胞的相差圖像以及所述mRNA轉染後第11天⑶和第20天(C)的iPS集落形成。圖像放大10倍。圖29 顯示編碼人重編程因子(KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4 和 S0X2)的 mRNA在人角質形成細胞中產生對於已知的iPS細胞標誌呈陽性的iPS細胞。圖29顯示源自HEKn細胞的集落的相差圖像(A、D和G)。㈧中顯示的相同iPS集落對於KLF4(B)和LIN28 (C)呈陽性。(D)中顯示的iPS集落呈SSEA4-陽性(E)和TRA-1-60-陽性(F)。(G)中顯示的iPS集落呈NANOG-陽性⑶。所有圖像放大20倍。圖30顯示用4個重編程mRNA(KLF4、c-MYC, 0CT4和S0X2)(不包括重編程因子NAN0G)轉染的HEKn細胞中3個iPS-相關信使的表達的增加。通過qPCR檢測到增加的信使的表達，將其針對GAPDH表達進行標準化。相對於原始細胞系中發現的水平描述每一個信使的表達水平。定義基於下面定義的術語理解和解釋本發明。如本文中所使用的涉及包含假尿苷或5-甲基胞苷殘基的單鏈完整mRNA的「大體上所有」意指在存在於樣品中的所有單鏈完整mRNA中，至少95%具有假尿苷或5-甲基胞
苷殘基。如本文中所使用的涉及包含假尿苷或5-甲基胞苷殘基的單鏈完整mRNA的「基本上所有」意指在存在於樣品中的所有單鏈完整mRNA中，至少99%具有假尿苷或5-甲基胞
苷殘基。如本文中所使用的「RNA汙染分子」為這樣的分子，其包含RNA殘基並且當轉染入細胞時可至少部分激活細胞的免疫系統(例如，通過激活RNA傳感器例如RNA依賴性蛋白激酶(PKR)、維甲酸誘導型基因-I (RIG-I)、Toll-樣受體分子(TLR) 3、TLR7、TLR8和寡腺苷酸合成酶(OAS)或可至少部分激活RNA幹擾(RNAi)反應(例如，包括對大雙鏈RNA分子或小雙鏈RNA分子(siRNA)的反應))的RNA。示例性RNA汙染分子包括但不限於僅編碼一部分重編程因子(例如，非全長iPS細胞誘導因子)的部分或非全長mRNA;大於編碼重編程因子(例如，iPS細胞誘導因子)的全長mRNA的單鏈mRNA，例如，不受理論束縛，通過「連綴IVT」或其它機制；雙鏈大或小mRNA分子；和未加帽的mRNA分子。如本文中所使用的，當RNA製劑中少於O. 5%的純化的總RNA由RNA汙染分子(或特別地引用的RNA汙染物)組成時，純化的RNA製劑「大體上不含」RNA汙染分子(或特別
地引用的RAN汙染物)。可通過HPLC或本領域中用於分離和定量RNA分子的其它方法測定非汙染mRNA分子和RNA汙染分子(或特定RNA汙染物)的量和相對量。如本文中所使用的，當純化的RNA製劑中少於I. O %的總RNA由RNA汙染分子(或特別引用的RNA汙染物)組成時，純化的RNA製劑「基本上不含」RNA汙染分子(或特別引用的RNA汙染物)。可通過HPLC或本領域中用於分離和定量RNA分子的其它方法測定非汙染mRNA分子和RNA汙染分子(或特別的RNA汙染物)的量和相對量。如本文中所使用的，當在純化的RNA製劑少於O. I %的總RNA由RNA汙染分子(或特別地引用的RNA汙染物)組成時，純化的RNA製劑「實際上不含」 RNA汙染分子(或特別的引用的RNA汙染物)。可利用HPLC或本領域中用於分離和定量RNA分子的其它方法測定非汙染mRNA分子和RNA汙染分子(或特定的RNA汙染物)的量和相對量。如本文中所使用的，當純化的RNA製劑中少於O. OI %的總RNA由RNA汙染分子(或特別引用的RNA汙染物)組成時，純化的RNA製劑「不含」RNA汙染分子(或特別引用的RNA汙染物)。可利用HPLC或本領域中用於分離和定量RNA分子的其它方法測定非汙染mRNA分子和RNA汙染分子(或特定的RNA汙染物)的量和相對量。除非另外指出，否則術語「包含」、「含有」、「具有」、「包括」和「包含」被解釋為「包括，但不限於」。除非另外指出，否則描述本發明的上下文中和特別地所附權利要求的上下文中術語「一個/ 一種(a)」、「一個/ 一種(an)」和「該(the) 」和類似的所指物被解釋為包括單數和複數形式。除非另外要求，否則任何和所有實例或示例性語言(「舉例」、「例如」、「諸如」)的使用僅意欲舉例說明本發明的方面或實施方案，並且不被解釋為限制其範圍。關於單詞「來源」的用途，例如用於「來源」於樣品、生物樣品、細胞、腫瘤等的RNA (包括mRNA)或多肽，其意指RNA或多肽存在於樣品、生物樣品、細胞、腫瘤等中，或可通過方法例如體外轉錄反應或RNA擴增反應使用樣品、生物樣品、細胞、腫瘤等中的RNA來製備，其中所述RNA或多肽由原始樣品、生物樣品、細胞、腫瘤等中的所有或部分RNA或多肽分子編碼或為其拷貝。例如，這類RNA可來自體外轉錄或RNA擴增反應(使用或未使用cDNA的克隆)而非直接獲自樣品、生物樣品、細胞、腫瘤等，只要用於體外轉錄或RNA擴增反應的原始RNA來自樣品、生物樣品、細胞、腫瘤等。術語「樣品」和「生物樣品」以它們最廣的意義使用並且包括獲自包含或可包含真核細胞的任何來源(包括生物和環境來源)的樣品或樣本。如本文中所使用的，術語「樣品」，當用於指獲自生物體的生物樣品時，包括體液(例如，血液或唾液)、糞便、生物活檢組織、拭子(例如，口腔拭子(buccal swab))、分離的細胞、滲出物等。生物體包括真菌、植物、植物、動物和人。然而，這些實例不被解釋為限制用於本發明的樣品或生物體的類型。此外，為了進行調查或研究，結果與本發明的方法或組合物的使用相關，在某些實施方案中，「樣品」或「生物樣品」包含固定的細胞、處理的細胞、細胞裂解物等。在某些實施方案，例如其中將mRNA遞送入來自患有已知疾病的生物體的細胞或展示疾病狀態或已知的病狀的細胞的方法的實施方案中，「樣品」或「生物樣品」還包括細菌或病毒。如本文中所使用的，術語「溫育」及其變型意指將反應物的一個或多個組分與另一個組分在使得期望的反應產物能夠形成的條件下接觸並且進行充足的時間。如本文中所使用的，「核苷」由共價地連接至戊糖(例如，核糖或2』 -脫氧核糖)的核酸鹼基(例如，典型的核酸鹼基鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C));或經修飾的核酸鹼基(例如，5-甲基胞嘧啶(m5C))組成，然而「核苷酸」或「單核苷酸」由在戊糖的羥基之一上被磷酸化的核苷組成。線性核酸分子據認為具有「5' 端」(5'末端)和「3'端」(3'末端)，因為除了加帽或腺苷醯化(例如，利用連接酶的腺苷醯化)外，單核苷酸以這樣的方式在一個方向上通過磷酸二酯鍵連接以產生寡核苷酸或多核苷酸，以便將一個單核苷酸糖部分的5'碳上的磷酸連接至其相鄰單核苷酸的糖部分的
碳上的氧。因此，線性單鏈寡核苷酸或多核苷酸的末端或線性雙鏈核酸(RNA或DNA)的一條鏈上的末端稱為「5'末端」(如果其5'磷酸未被連結或連接至單核苷酸糖部分的3'碳的氧的話)和稱為「3'末端」(如果其3'氧未被連接至連接於另一個單核苷酸的糖的5'磷酸的話)。如本文中所使用的末端核苷酸是在3'或5'端的末端位置上的核苷酸。為了實現指定的目標，被以本發明的任何方法引入真核細胞的mRNA的一個或多個核苷酸中的核酸鹼基、糖部分或核苷間(或核苷酸間)連接可包含經修飾的鹼基、糖部分或核苷間連接。例如，除了在本文中其它地方論述的用於進行本發明的方法的其它經修飾的核苷酸外，mRAN的一個或多個核苷酸還可具有經修飾的核苷酸鹼基，包括或由如下物質組成黃嘌呤；丙烯胺基-尿喃唳(allyamino-uracil);丙烯胺基-胸苷；次黃嘌呤；2_氨基腺嘌呤；5_丙炔基尿嘧啶；5_丙炔基胞嘧啶；4_硫尿嘧啶；6_硫鳥嘌呤；氮雜或脫氮尿嘧啶；氮雜或脫氮胸苷；氮雜或脫氮胞嘧啶；氮雜或脫氮腺嘌呤；或氮雜或脫氮鳥嘌呤；或利用生物素部分、地高辛部分、螢光或化學發光部分、淬滅部分或某些其它部分衍生以實現一個或多個特定的其它目的的核酸鹼基；和/或mRNA的一個或多個核苷酸可具有糖部位，例如但不限於2'-氟-2'-脫氧核糖或2' -O-甲基-核糖，其提供了針對某些核酸酶的抗性；或2'-氨基-2'-脫氧核糖或2'-疊氮基-2'-脫氧核糖，其可通過將它們與可見染料、螢光染料、紅外螢光染料或其它可檢測染料或具有親電、光反應性、炔基或其它反應性化學部分的化學藥品反應來進行標記。在本發明的某些實施方案中，mRNA的一個或多個核苷酸包含經修飾的核苷間連接例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯或二硒代磷酸酯連接(所述連接抗某些核酸酶)，包括用於進行RNA的共轉錄加帽的IVT反應的二核苷酸帽類似物(Grudzien-Nogalska等，2007)或聚腺苷酸尾(例如，通過在RNA的IVT過程中整合具有經修飾的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯或二硒代磷酸酯連接的核苷酸或，例如，通過使用聚腺苷酸聚合酶，經多腺苷酸化將包含經修飾的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯或二硒代磷酸酯連接的ATP摻入RNA上的聚腺苷酸尾)在內。本發明不限於被提供用以顯示可用於方法的特定目的實例的所列的經修飾的核酸鹼基、糖部分或核苷間連接。如本文中所使用的，「核酸」或「多核苷酸」或「寡核苷酸」為共價連接的核苷酸的序列，其中一個核苷酸的糖部分的3'位置被磷酸二酯鍵連接至緊接的核苷酸的糖部分的5'位置(S卩，3'至5'磷酸二酯鍵)，並且其中核苷酸以特定的順序連接；即核苷酸的線性順序。在某些實施方案中，核酸或多核苷酸或寡核苷酸由2'-脫氧核糖核苷酸(DNA)組成或包含2'-脫氧核糖核苷酸(DNA)。在某些實施方案中，寡核苷酸由核糖核苷酸(RNA)組成或包含所述核糖核苷酸。術語「分離的」或「純化的」，當結合多核苷酸或核酸使用時，如在「分離的RNA」或「純化的RNA」中，是指被鑑定的並且與至少一種通常在其來源中與其結合的汙染物分離的核酸。因此，分離的或純化的核酸(例如，DNA和RNA)以與其中其被天然發現的形式或設置不同的形式或設置存在，或以與將其經歷處理或純化法之前存在的形式或設置不同的形式或設置存在。例如，給定的DNA序列(例如，基因)與其它基因以及結構和功能蛋白一起 發現於宿主細胞染色體上，並且特定的RNA(例如，編碼特定蛋白的特定mRNA)作為與許多其它RNA和其它細胞組分的混合物發現於細胞中。分離或純化的多核苷酸或核酸可以以單鏈或雙鏈形式存在。「帽」或「帽核苷酸」意指在適當的反應條件下用作加帽酶系統的底物，從而被連接至包括初級RNA轉錄物的未加帽的RNA或具有V -二磷酸的RNA的V末端的核苷-5'-三磷酸。被這樣連接至RNA的核苷酸在本文中也稱為「帽核苷酸」。「帽核苷酸」是通過其5'末端連接至初級RNA轉錄物的5』末端的鳥嘌呤核苷酸。具有連接至其5'末端的帽核苷酸的RNA稱為「加帽的RNA」或「加帽的RNA轉錄物」或「加帽的轉錄物」。常見帽核苷為7-甲基鳥苷或N7-甲基鳥苷(有時稱為「標準帽」)，其具有稱為「m7G」的結構，在該情況下加帽的RNA或「m7G-加帽的RNA」具有稱為m7G (5' )ρρρ(5' (ρΝ)χ-0Η(3/ )或更簡單地稱為III7GpppN1 (PN)x或HI7G[5' ]ρρρ[5/ ]Ν的結構，其中HI7G代表7-甲基鳥苷帽核苷酸，PPP代表帽核苷的5'碳與初級RNA轉錄物的第一核苷酸之間的三磷酸橋，N1(PN)Χ-0Η(3/ )代表初級RNA轉錄物，其中N1為最5'-核苷酸，「P」代表磷酸基團，「G」代表鳥苷核苷，「m7」代表鳥嘌呤的7-位置上的甲基，「 [5'] 」表示「p」被連接至mRNA轉錄物(「N」)的帽核苷酸和第一核苷的核糖上的位置。除了該「標準帽」外，許多種其它天然存在和合成帽類似物在本領域是已知的。具有任何帽核苷酸的RNA稱為「加帽的RNA」。加帽的RNA可從生物樣品天然發生或其可通過用加帽酶系統(例如，牛痘加帽酶系統或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)加帽酶系統)對具有5'三憐酸基團的RNA或具有5' 二磷酸基團的RNA進行體外加帽來獲得。可選擇地，可通過使用本領域已知的方法(例如，使用 AMPLICAP T7 加帽試劑盒或 MES SAGEMAX T7 ARCA-CAPPED MES SAGE Transcription試劑盒，EPICENTRE或CellScript)體外轉錄(IVT)包含RNA聚合酶啟動子的DNA模板來獲得加帽的RNA，其中，除了 GTP外，IVT反應還包含二核苷酸帽類似物(例如，m7GpppG帽類似物或N7-甲基、2' -O-甲基-GpppG ARCA帽類似物或N7-甲基、3' -O-甲基-GpppGARCA帽類似物)。-三磷酸化初級mRNA轉錄物的體內加帽(或使用體外加帽酶系統)通過幾個酶促步驟發生(Higman 等，1992, Martin 等，1975, Myette 和 Niles 1996)。下列酶促反應參與真核mRNA的加帽⑴RNA三磷酸酶將mRNA的5 '-三磷酸切割成二磷酸，PPPN1(P)Nx-OH (3' ) — PPN1 (pN) X_0H (3' ) +Pi ;以及隨後⑵RNA鳥苷醯轉移酶催化GTP至mRNA的最5丨核苷酸(N1)的Y - 二磷酸的連接，PPN1(PN)x-OHC )+GTP —G(5' )ρρρ(5/ (ρΝ)χ-0Η(3/ )+PPi ;和最終，(3)鳥嘌呤-7-甲基轉移酶，使用S-腺苷-甲硫氨酸(AdoMet)作為輔因子，催化帽核苷酸中的鳥嘌呤的7-氮的甲基化， G (5 ' )ρρρ(5 ' (ρΝ) χ-0Η(3 ' )+AdoMet — m7G (5 ' )ppp(5 ' ) N1 (pN)X-0H(3/ )+AdoHyco因RNA三磷酸酶和RNA鳥苷醯轉移酶活性的作用而產生的RNA以及額外地被鳥嘌呤-7-甲基轉移酶酶促活性甲基化的RNA在本文中稱為「5'加帽的RNA」或「加帽的RNA」，本文中的「加帽酶系統」或更簡單地「加帽酶」意指一種或多種多肽的任何組合，所述多肽具有導致「加帽的RNA」的酶促活性。加帽酶系統，包括這類酶的克隆形式，已被鑑定並且從許多來源純化，並且在本領域是公知的(Baner jeel980, Higman等，1992, Higman等，1994,Myette 和 Niles 1996, Shuman 1995, Shuman 2001, Shuman 等，1980, Wang 等，1997)。可將具有5』磷酸的未加帽的RNA轉化為加帽的RNA的任何加帽酶可用於提供用於本發明的任何實施方案的加帽的RNA。在某些實施方案中，加帽酶系統是痘病毒加帽酶系統。在某些優選實施方案中，加帽酶系統是痘苗病毒加帽酶。在某些實施方案中，加帽酶系統是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)加帽酶。同樣地,鑑於來自一個來源的編碼RNA三磷酸酶、RNA鳥苷醯轉移酶和鳥嘌呤-7-甲基轉移酶的基因可互補來自另一個來源的一個或所有這類基因的缺陷的事實，加帽酶系統也可源於一個來源，或RNA三磷酸酶、RNA鳥苷醯轉移酶和/或鳥嘌呤-7-甲基轉移酶活性的一個或多個活性可包括來自不同來源的多肽。本發明的「修飾的帽核苷酸」意指其中糖、核酸鹼基或核苷間連接與相應的典型7-甲基鳥苷帽核苷酸相比較被化學修飾的帽核苷酸。修飾的帽核苷酸的實例包括帽核苷酸，所述帽核苷酸包含(i)經修飾的2'-或3』-脫氧鳥苷-5』-三磷酸(或鳥嘌呤2'-或3'-脫氧核糖核酸-5'-三磷酸)，其中脫氧核糖糖部分的2'-或3'-脫氧位置被包含氣基、置氣基、氣基、甲氧基、硫氫!基(或疏基)或甲硫基(或甲基疏基)的基團取代；或
(ii)經修飾的5』-三磷酸鳥苷，其中鳥嘌呤鹼基的O6氧被甲基化；或-脫氧鳥苷。為了清楚起見，在本文中應理解，「烷氧基-取代的脫氧鳥苷-5'-三磷酸」也可稱為「O-烷基-取代的5』 -三磷酸鳥苷」；例如，但不限於，2'-甲氧基-2'-脫氧鳥苷-5'-三磷酸(2'-甲氧基-2' -dGTP)和3,-甲氧基-3'-脫氧鳥苷-5'-三磷酸(3'-甲氧基-3' -dGTP)在本文中也可分別稱為W -O-甲基鳥苷-5'-三磷酸(2' -OMe-GTP)和
-O-甲基鳥苷-5'-三磷酸(3' -OMe-GTP)。在將經修飾的帽連接至未加帽的包括初級RNA轉錄物的RNA(或具有5' - 二磷酸的RNA))的Y -末端後，被連接至未加帽的包括初級RNA轉錄物的RNA (或具有5' - 二磷酸的RNA)的所述經修飾的帽核苷酸的部分可在本文中稱為「經修飾的帽核苷」(即，不提及其所連接的磷酸基團)，但有時其稱為「經修飾的帽核苷酸」。
「經修飾的核苷酸-加帽的RNA」是使用加帽酶系統合成和經修飾的帽核苷酸合成的加帽的RNA分子，其中在其5,端上的帽核苷酸包括經修飾的帽核苷酸，或在包含經修飾的二核苷酸帽類似物的體外轉錄物反應中共轉錄合成的加帽的RNA，其中二核苷酸帽類似物在帽核苷酸中包含化學修飾。在某些實施方案中，經修飾的二核苷酸帽類似物為抗抗 _ 反向帽類似物或 ARCA (Grudzien 等，2004, Jemielity 等，2003, Grudzien-Nogalska 等，2007，Peng 等，2002，Stepinski 等，2001)。「初級RNA」或「原代RNA轉錄物」意指由RNA聚合酶體外或體內合成的RNA分子並且該RNA分子在其最5'核苷酸的5'-碳上具有三磷酸。「RNA擴增反應」或「RNA擴增法」意指用於增加樣品中相應於一個或多個期望的RNA序列的RNA的量的方法。例如，在某些實施方案中，RNA擴增法包括(a)通過與期望的RNA分子退火的一個或多個引物的RNA-依賴性DNA聚合酶延伸合成與一個或多個期望的RNA分子互補的第一鏈cDNA ； (b)由第一鏈cDNA使用其中功能性RNA聚合酶啟動
子連接於其的方法合成雙鏈cDNA ;和(c)在轉錄條件下將雙鏈cDNA與結合所述啟動子的RNA聚合酶接觸，從而獲得相應於一個或多個期望的RNA分子的RNA。關於本發明的特定實施方案，除非另外指出，否則根據本發明的RNA擴增反應意指有義RNA擴增反應，意指合成有義RNA (例如，與mRNA或其它初級RNA轉錄物而非該序列的互補序列具有相同序列的RNA)的RNA擴增反應。包括在本定義內的本領域已知的有義RNA擴增反應包括但不限於，Ozawa 等(Ozawa 等，2006)和美國專利申請 No. 20090053775,20050153333,20030186237,20040197802和20040171041中描述的合成有義RNA的方法。美國專利申請No. 20090053775中描述的RNA擴增法是用於獲得來源於一個或多個細胞的擴增的RNA的優選方法，隨後將所述擴增的RNA用於產生用於本發明的方法的mRNA。「聚腺苷酸聚合酶」(「PAP」)意指在大多數真核生物、原核生物和真核生物病毒中發現的不依賴於模板的RNA聚合酶，所述聚合酶選擇性使用ATP將AMP殘基摻入RNA的3'-羥基化末端。由於已被研究的來自植物、動物、細菌和病毒的PAP酶(全都催化相同的總反應)(Edmonds 1990)在結構上高度保守(Gershon 2000)並且如果將PAP與識別AAUAAA多腺苷酸化信號的蛋白質分離，則缺乏對特定序列或RNA分子的尺寸的固有特異性(Wilusz和Shenk 1988)，因此可將來自任何來源種類的純化的野生型和重組型PAP酶用於本發明。在某些實施方案中，來自酵母菌屬(Saccharomyces)(例如,來自釀酒酵母)的PAP酶用於多腺苷酸化以產生包含一種或多種經修飾的mRNA或由所述mRNA組成的純化的RNA製劑，所述mRNA各自編碼重編程因子(例如，iPS細胞誘導因子)。在某些實施方案中，來自大腸桿菌的PAP酶用於多腺苷酸化以產生包含一種或多種經修飾的mRNA的純化的RNA製劑，所述mRNA各自編碼重編程因子(例如，iPS細胞誘導因子)。「重編程因子」意指當單獨地或與其它因子或條件組合地使用時，引起其中引入或表達重編程因子的細胞的分化狀態改變的蛋白質、多肽或其它生物分子。在本發明的方法的某些優選實施方案中，重編程因子為由被引入細胞，從而產生與其中引入mRNA的細胞相比較展示改變的分化狀態的細胞的mRNA編碼的蛋白質或多肽。在本發明的方法的某些優選實施方案中，重編程因子為轉錄因子。本發明的方法中使用的重編程因子的一個實施方案為「iPS細胞誘導因子」。「iPS細胞誘導因子」或「iPSC誘導因子」是當單獨或與其它重編程因子組合使用時導致iPS細胞從體細胞產生的蛋白質、多肽或其它生物分子。iPS細胞誘導因子的實例包括0CT4、S0X2、C-MYC, KLF4、NANOG和LIN28。iPS細胞誘導因子包括全長多肽序列或其生物活性片段。同樣地，編碼iPS細胞誘導因子的mRNA可編碼全長多肽或其生物活性片段。編碼示例性iPS誘導因子的序列的mRNA示於圖25 (KLF4和LIN28)、26 (cMYC和NAN0G)以及27(0CT4和S0X2)。在某些實施方案中，本發明使用這些圖中顯示的序列或相似序列，包括額外地包括、連接至這些mRNA序列的mRNA分子、展示5』和3』 UTR序列的任一個的寡核糖核苷酸、Kozak序列、IRES序列、帽核苷酸和/或聚腺苷酸序列(用於本文中描述的實驗)或通常在本領域中是已知的並且可通過將它們連接至這些蛋白質編碼mRNA序列來用於替代本文中使用的序列(為了最優化各mRNA分子在細胞中的翻譯和提高它們在細胞中的穩定性以實現本文中描述的方法)的序列。「分化」或「細胞分化」意指展示不太特化的分化狀態或細胞類型的細胞(例如，受精卵細胞、胚胎中的細胞或真核生物體中的細胞)籍以成為展示更加特化的分化狀態或細胞類型的細胞的天然發生的生物過程。科學家，包括生物學家、免疫學家和胚胎學家，使用 多種方法和標準，根據它們的「細胞類型」、「分化狀態」或「分化的狀態」來定義、描述或分類不同的細胞。一般地，根據其「細胞類型」、「分化狀態」或「分化的狀態」(基於一個或多個由該細胞展示的表型)來定義、描述或分類細胞，所述表型可包括形狀、生物化學或代謝活性或功能，某些生物分子在細胞中(例如，基於與特定生物分子的染色)或細胞上(例如，基於一種或多種與細胞表面上的特定生物分子反應的抗體的結合)的存在。例如，在某些實施方案中，使用細胞分選儀或螢光激活細胞分選(FACS)儀鑑定和分選不同細胞類型。「分化」或「細胞分化」還可對培養中的細胞發生。如本文中所使用的術語「重編程」意指響應於一種或多種重編程因子直接(例如，通過蛋白質或多肽重編程因子至細胞內的遞送)或間接(例如，通過包含一種或多種各自編碼重編程因子的mRNA分子的本發明的純化的RNA製劑的遞送)至細胞內的遞送而發生的分化或細胞分化和在有助於分化的條件(例如，培養基、溫度、氧和CO2水平、基質以及其它環境條件)下維持細胞。術語「重編程」，當在本文中使用時，無意表示或指分化的具體方向或途徑(例如，從不太特化的細胞類型至更特化的細胞類型)並且不排除以與通常在自然界中觀察到的不同的分化方向或途徑進行的過程。因此，在本發明的不同實施方案中，「重編程」意指和包括下列方面的任何方面和全部(I) 「去分化」，意指展示更加特化的分化狀態或細胞類型的細胞(例如，哺乳動物成纖維細胞、角質形成細胞、肌肉細胞或神經細胞)的細胞變成展示不太特化的分化狀態或細胞類型的細胞(例如，iPS細胞)的過程；(2) 「轉分化」，意指展示更加特化的分化狀態或細胞類型的細胞(例如，哺乳動物成纖維細胞、角質形成細胞或神經細胞)變成另一種更加特化的分化狀態或細胞類型的細胞(例如，從成纖維細胞或角質形成細胞至肌肉細胞)的過程；和(3) 「再分化」或「預期的分化」或「天然分化」，意指展示任何特定分化狀態或細胞類型的細胞變成另一種分化狀態或細胞類型的過程，如果細胞存在於其天然位置和環境中(例如，在胚胎或生物體中)，這預期可天然發生，無論所述過程在生物體中體內發生還是在培養中(例如，響應一種或多種重編程因子)發生。發明描述
本發明提供了重編程真核細胞(包括人或其它動物細胞)的分化狀態的組合物和方法，通過將細胞與包含一種或多種不同的各自編碼重編程因子(例如，iPS細胞誘導因子)的單鏈mRNA分子或由所述單鏈mRNA分子組成的純化的RNA製劑接觸。純化的單鏈mRNA分子優選包含至少一個經修飾的核苷(選自假尿苷(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5_甲基尿苷(m5U)、2' -O-甲基尿苷(Um或m2』 _°U)、2_硫尿苷(S2U)和N6-甲基腺苷(m6A))，其替代相應的未修飾的A、C、G或T典型核苷的相應未修飾的典型核苷的至少一部分(例如，包括大體上全部)。此外，優選純化單鏈mRNA分子以大體上不含可在細胞中激活不期望的反應、減少單鏈mRNA的表達和/或激活RNA傳感器的RNA汙染分子。在某些實施方案中，純化的RNA製劑大體上不為比全長單鏈mRNA分子更短或更長的、為雙鏈RNA和/或未加帽的RNA的RNA汙染分子。在某些優選實施方案中，本發明提供了用於重編程分化的真核細胞(包括人或其它動物體細胞)的組合物和方法，通過將細胞與包含一種或多種不同的各自編碼iPS細胞誘導因子的單鏈mRNA分子或由所述單鏈mRNA分子組成的純化的RNA製劑接觸。在某些實施方案中，純化的RNA製劑中使用的mRNA被純化以大體上、基本上或實際上除去所有汙染物，包括大體、基本上或實際上所有RNA汙染物。本發明不限於用於純化 mRNA的純化方法，並且本發明包括使用本領域已知的或將來開發的任何方法以純化mRNA和除去汙染物(包括RNA汙染物)，所述汙染物幹擾mRNA的期望的用途。例如，在優選實施方案中，mRNA的純化除去對細胞具有毒性(例如，通過誘導細胞中的先天性免疫反應，或在包含雙鏈RNA的RNA汙染物的情況下，通過例如經由siRNA或長RNAi分子誘導RNA幹擾(RNAi))的汙染物以及直接或間接減少細胞中mRNA翻譯的汙染物。在某些實施方案中，使用本文中包括實施例中描述的方法通過HPLC純化mRNA。在某些實施方案中，在聚合物樹脂使用包含C18衍生的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的基質純化mRNA，將三乙胺乙酸酯(TEAA)離子配對劑用於柱緩衝液中，同時使用乙腈梯度以洗脫mRNA並且以尺寸依賴性方式將其與RNA汙染物分離；在某些實施方案中，使用HPLC進行mRNA純化，但在某些其它實施方案中，將重力流動柱用於純化。在某些實施方案中，使用標題為由Douglas T. Gjerde,Lee Hoang,和 David Hornby 編著，Wiley-VCH, 2009 出版的標題為「RNA Purification andAnalysis」的書籍(通過引用併入本文)中描述的方法純化mRNA。在某些實施方案中，以非變性模式(例如，在低於約50°C的溫度，例如在環境溫度下)進行mRNA純化。在某些實施方案中，以部分變性模式(例如，在低於約50°C和72°C的溫度下)進行mRNA純化。在某些實施方案中，以部分變性模式(例如，在高於約72°C的溫度下)進行mRNA純化。當然，本領域技術人員將知道，變性溫度取決於待純化的mRNA的解鏈溫度(Tm)以及汙染所述mRNA的RNA,DNA或RNA/DNA雜交體的解鏈溫度。在某些其它實施方案中，如由Mellits KH等所描述的(Removal of double-stranded contaminants from RNA transcripts synthesis ofadenovirus VA RNAl from a T7 vector. Nucleic Acids Research 18 :5401_5406，1990，通過引用整體併入本文)純化mRNA。這些作者使用3步驟純化來除去可在本發明的實施方案中使用的汙染物。步驟I為7M尿素(變性條件)中進行的8%聚丙烯醯胺凝膠電泳。從凝膠片切取主RNA條帶，將其在非變性條件(無尿素)下經歷8%聚丙烯醯胺凝膠電泳，從凝膠片回收主條帶。使用乙醇-鹽緩衝液流動相在纖維素CF-II柱上進行進一步純化，其可將雙鏈RNA與單鏈RNA分開(Franklin RM. 1966. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55 :1504_1511 ；Barber R. 1966. Biochem. Biophys. Acta 114 422 ;和 Zelcer A 等，1982. J. Gen. Virol. 59 139-148，將所述全部文獻通過引用併入本文)，最終的純化步驟是纖維素層析。在某些其它實施方案中，使用羥基磷灰石(HAP)柱在非變性條件下或在更高溫度下(例如，如由PaysE. 1977. Biochem. J. 165 :237_245 ；Lewandowski LJ 等，1971. J. Virol. 8 :809_812 ；ClawsonGA 和 Smuckler EA. 1982. Cancer Research42 :3228_3231 ;和 / 或 Andrews-Pfannkoch C等，2010. Applied and Environmental Microbiology 76 :5039_5045 (將所述全部文獻通過引用併入本文)描述的)純化mRNA。在某些其它實施方案中，在非變性條件下利用弱陰離子交換液相色譜純化mRNA (例如，如由Easton LE等，2010. RNA 16 :647_653關於淨化體外轉錄反應所描述的，通過引用併入本文)。在某些實施方案中，使用任何上述方法或本領域已知或將來開發的另一種方法的組合純化mRNA。在另一個實施方案中，使用方法純化本發明的組合物和方法中使用的mRNA，所述方法包括用特異性作用(例如，消化)一種或多種汙染RNA或汙染核酸(例如，包括DNA)但不作用於(例如，不消化)期望的mRNA的酶處理mRNA。例如，在某些實施方案中，使用方法純化本發明的組合物和方法中使用的mRNA，所述方法包括用核糖核酸酶III (RNA酶III)(例如，大腸桿菌RNA酶III)處理mRNA，隨後從RNA酶II消化產物純化出mRNA。本文中的核糖核酸酶III (RNA酶III)意指將超過約12個鹼基對的雙鏈RNA降解成短雙鏈RNA片段的酶。在某些實施方案中，使用方法純化本發明的組合物和方法中使用的mRNA，所述方法包括用一種或多種特異性消化一種或多種汙染RNA或汙染核酸(例如，包括DNA)的其它酶處理mRNA。本發明提供了包含假尿苷或經修飾的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子、包含所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的基因治療載體、包括所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸的基因療法和基因轉錄沉默法、減少RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的免疫原性的方法以及合成所述RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸的方法。這些修飾的序列優選存在於本文中描述的純化的RNA製劑中。在一個實施方案中,本發明提供了包含假尿苷殘基的信使RNA。在另一個實施方案中，信使RNA編碼目標蛋白質。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了編碼目標蛋白質的RNA分子，所述RNA分子包含假尿苷殘基。在另一·個實施方案中，本發明提供了體外轉錄的包含假尿苷的RNA分子。在另一個實施方案中，本發明提供了體外轉錄的RNA分子，其包含經修飾的核苷。如本文中所提供的，本發明提供了用於合成體外轉錄的包含假尿苷和/或經修飾的核苷的RNA分子的方法。在另一個實施方案中，本發明提供了包含假尿苷殘基的信使RNA分子。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的體外轉錄的RNA分子由T7噬菌體RNA聚合酶合成。在另一個實施方案中，分子由SP6噬菌體RNA聚合酶合成。在另一個實施方案中，分子由T3噬菌體RNA聚合酶合成。在另一個實施方案中，分子由選自上述聚合酶的聚合酶合成。在另一個實施方案中，體外轉錄的RNA分子為寡核糖核苷酸。在另一個實施方案中，體外轉錄的RNA分子為多核糖核苷酸。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了體外合成的包含假尿苷或經修飾的核苷的寡核糖核苷酸，其中經修飾的核苷為m5C、m5U、m6A、s2U、W或2' -O-甲基-U。在另一個實施方案中，本發明提供了體外合成的包含假尿苷或經修飾的核苷的多核糖核苷酸，其中經修飾的核苷為m5C、m5U、m6A、s2U、Ψ 或 2' -O-甲基-U。在另一個實施方案中，體外合成的寡核糖核苷酸或多核苷酸為短髮夾(sh)RNA。在另一個實施方案中，體外合成的寡核糖核苷酸為小幹擾RNA (SiRNA)。在另一個實施方案中，體外合成的寡核糖核苷酸為本領域已知的任何其它類型的寡核糖核苷酸。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子還包括編碼功能性蛋白質的開放閱讀框架。在另一個實施方案中，RNA分子或寡核糖核苷酸分子發揮作用而不編碼功能性蛋白質(例如在轉錄沉默中)如RNzyme等。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子還包括聚腺苷酸尾。在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子不包括聚腺苷酸尾。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。
在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子還包含m7GpppG帽。在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子不包含m7GpppG帽。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子還包含不依賴於帽的翻譯增強子。在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子不包含不依賴於帽的翻譯增強子。在另一個實施方案中，不依賴於帽的翻譯增強子為不依賴於菸草蝕紋病毒(TEV)帽的翻譯增強子。在另一個實施方案中，不依賴於帽的翻譯增強子是本領域已知的任何其它不依賴於帽的翻譯增強子。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了基因療法載體，其包含體外合成的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包含假尿苷或經修飾的核苷。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子包含假尿苷。在另一個實施方案中，RNA分子或寡核糖核苷酸分子包含經修飾的核苷。在另一個實施方案中，RNA分子或寡核糖核苷酸分子為體外合成的RNA分子或寡核糖核苷酸。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。「假尿苷」在另一個實施方案中是指Hi1acp3W (I-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷。在另一個實施方案中，術語是指π^ψα-甲基假尿苷)。在另一個實施方案中，術語是指Ψπι(2' -O-甲基假尿苷。在另一個實施方案中，術語是指HI5D (5-甲基二氫尿苷)。在另一個實施方案中，術語是指πι3Ψ (3-甲基假尿苷)。在另一個實施方案中，術語是指未被進一步修飾的假尿苷部分。在另一個實施方案中，術語是指任何上述假尿苷的單磷酸酯、二磷酸脂或三磷酸酯。在另一個實施方案中，術語是指本領域已知的任何其它假尿苷。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子是治療性寡核糖核苷酸。在另一個實施方案中，本發明提供了將重組蛋白質遞送至受試者的方法，所述方法包括將受試者與本發明的RNA、寡核糖核苷酸、多核苷酸分子或基因治療性載體接觸，從而將重組蛋白質遞送至受試者。在另一個實施方案中，本發明提供了雙鏈RNA(dsRNA)分子，所述分子包含假尿苷或經修飾的核苷並且還包括siRNA或短髮夾RNA(shRNA)。在另一個實施方案中，dsRNA分子在長度上超過50個核苷酸。每一種可能性代表本發明的單獨的實施方案。在另一個實施方案中，假尿苷或經修飾的核苷在siRNA序列內。在另一個實施方案中，假尿苷或經修飾的核苷在siRNA序列之外。在另一個實施方案中，I個或更多個假尿苷和/或經修飾的核苷殘基存在於siRNA序列之內和之外。每一種可能性代表本發明的單獨的實施方案。在另一個實施方案中，siRNA或shRNA包含在dsRNA分子內。在另一個實施方案中，siRNA或shRNA包含在dsRNA分子的一個末端上。在另一個實施方案中，一個或多個siRNA或shRNA包含在dsRNA分子的一個末端上，然而另一個或多個包含在內部。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子(例如單鏈RNA(ssRNA)或dsRNA分子)的長度超過30個核苷酸。在另一個實施方案
中，RNA分子或寡核糖核苷酸的長度超過35個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少40個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少45個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少55個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少60個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少60個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少80個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少90個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少100個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少120個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少140個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少160個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少180個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少200個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少250個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少300個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少350個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少400個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少450個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少500個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少600個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少700個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少800個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少900個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少1000個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少1100個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少1200個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少1300個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少1400個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少1500個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少1600個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少1800個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少2000個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少2500個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少3000個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少4000個核苷酸。在另一個實施方案中，長度為至少5000個核苷酸。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的dsRNA分子通過體外轉錄來產生。在另一個實施方案中，體外轉錄的步驟使用T7噬菌體RNA聚合酶。在另一個實施方案中，體外轉錄使用SP6噬菌體RNA聚合酶。在另一個實施方案中，體外轉錄使用T3噬菌體RNA聚合酶。在另一個實施方案中，體外轉錄使用選自上述聚合酶的RNA聚合酶。在另一個實施方案中，體外轉錄使用本領域已知的任何其它RNA聚合酶。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，dsRNA分子通過被細胞酶加工以產生siRNA或shRNA。在另一個實施方案中，細胞酶是內切核酸酶。在另一個實施方案中，細胞酶為切丁酶(Dicer)。切丁酶為RNA酶III家族核酸酶，其通過產生決定這些基因沉默途徑的特異性的小RNA來起始 RNA 幹擾(RNAi)和相關現象(Bernstein E, Caudy AA 等，Role for a bidentateribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001 ；409 (6818)363-6)。在另一個實施方案中，細胞酶是本領域已知的能夠切割dsRNA分子的任何其它細胞酶。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，dsRNA分子包含兩個siRNA或shRNA。在另一個實施方案中，dsRNA分子包含3個siRNA或shRNA。在另一個實施方案中，dsRNA分子包含超過3個siRNA或shRNA。在另一個實施方案中，siRNA和/或shRNA通過細胞酶從dsRNA分子釋放。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。 在另一個實施方案中，本發明提供了給細胞施用siRNA或shRNA的方法，包括施用本發明的dsRNA分子，其中所述細胞加工dsRNA分子以產生siRNA或shRNA，從而給細胞施用 siRNA 或 shRNA。在另一個實施方案中，在本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子中被修飾的核苷為尿苷(U)。在另一個實施方案中，經修飾的核苷是胞苷(C)。在另一個實施方案中，經修飾的核苷是腺苷(A)。在另一個實施方案中，經修飾的核苷為鳥苷(G)。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，經修飾的核苷本發明的方法和組合物為m5C(5_甲基胞苷)。在另一個實施方案中，經修飾的核苷是5U(5-甲基尿苷)。在另一個實施方案中，經修飾的核苷為m6A(N6-甲基腺苷)。在另一個實施方案中，經修飾的核苷是S2U(2-硫尿苷)。在另一個實施方案中，經修飾的核苷為Ψ(假尿苷)。在另一個實施方案中，經修飾的核苷為Um (2; -O-甲基尿苷)。在其它實施方案中，經修飾的核苷為Hi1Aa-甲基腺苷)；m2A(2_甲基腺苷)；Am(2 , -O-甲基腺苷)；mS2mGA(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；iGA( -異戊烯腺苷)；mszi6A(2-甲基硫-N6異戊烯腺苷)；io6A(N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷)；mS2io6A(2-甲硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨醯氨甲醯腺苷)；t6A(N6-蘇氨醯氨甲醯腺苷)；ms2t6A (2-甲硫基-N6-蘇氨醯氨甲醯腺苷)；m6t6A (N6-甲基-N6-蘇氨醯氨甲醯腺苷)；hn6A(N6-羥基正纈氨醯氨甲醯腺苷)；ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羥基正纈氨醯氨甲醯腺苷)；Ar(p) (2/ -O-核糖基腺苷(磷酸))；1(肌苷)(I-甲基肌苷)^ImaA -O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2' _0_甲基胞苷)；S2C(2硫胞苷)；ac4C(N4-乙醯胞苷)；f5C(5-甲醯胞苷)；m5Cm(5，2^ _0_ 二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙醯基-2 ^ -O-甲基胞苷)；k2C(賴西丁)-Gd-甲基鳥苷)；m2G(N2-甲基鳥苷)；m7G(7-甲基鳥苷)；Gm(2' -O-甲基鳥苷)；m22G(N2，N2-二甲基鳥苷)！πΛΜΝ2，〗'_0_ 二甲基鳥苷)；m22Gm(N2，N2，2' -O-三甲基鳥苷)；Gr(p) (2/ -O-核糖基鳥苷(磷酸))；yW(懷丁苷)；o2yW(過氧懷丁苷)；OHyW(羥基懷丁苷)；0HyW*(修飾不足的羥基懷丁苷)；imG(Y核苷(wyosine)) ；mimG(甲基Y核苷)；Q(q核苷)；oQ(環氧Q核苷)；galQ(半乳糖基_q核苷)；manQ(甘露糖基q核苷)TreQc^-氰基-7-脫氮鳥苷)^reQ1 (7-氨基甲基-7-脫氮鳥苷)；G+(古嘌苷)；D (二氫尿苷)；m5Um(5A _0_ 二甲基尿苷)；S4U (4-硫尿苷)；m5s2U (5-甲基-2-硫尿苷)；s2Um(2-硫-2' -O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)；ho5U(5_羥基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-輕乙酸)；mcmo5U(尿苷5-輕乙酸甲酯)；chm5U(5_(羧基羥基甲基)尿苷))；mchm5U(5(羧羥基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羧基甲基尿苷)；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2 ' -O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2U(5_氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；mnmse2U(5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷)；ncm5U(5_氨甲醯甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨甲醯甲基-2' -O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷)；Cmnm5Um (5-羧甲基氨基甲基-2'-甲基尿苷)；cmnm5s2U (5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；Hi62A(N6，N6-二甲基腺苷)；Im(2' -O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4，2' -O-二甲基胞苷)；hm5C(5-輕基甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5_羧甲基尿苷)；m6Am(N6,2』 -O 二甲基腺苷)；m62Am(N6，N6，2' _0_ 三甲基腺苷)；m2』7G (N2，7-二甲基鳥苷)；m2』2』7G(N2，N2，7-三甲基鳥苷)；m3Um(3,2/ _0_二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氫尿苷)；f5Cm(5_甲醯基-2' -O甲基胞苷)WGmdd' -O-二甲基鳥苷)WAmdd' -O-二甲基腺苷)；Tm5U (5-牛磺酸甲基尿苷)；Tm5s2U(5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷))；imG_14 (4-脫甲基丫 苷)；imG2(異丫苷)或ac6A(N6-乙醯基腺苷)。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子包括2個或更多個上述修飾的組合。在另一個實施方案中，RNA分子或寡核糖核苷酸分子包括3個或更多個上述修飾的組合。在另一個實施方案中，RNA分子或寡核糖核苷酸分子包括超過3個上述修飾的組合。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物中的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子的O. 1%至100%的殘基被修飾(例如，存在假尿苷或經修飾的核苷鹼基)。在另一個實施方案中，0.1%的殘基被修飾。在另一個實施方案中，O. 2%的殘基被修飾。在另一個實施方案中，分數為O. 3 %。在另一個實施方案中，分數為0.4%。在另一個實施方案中，分數為0.5%。在另一個實施方案中，分數為0.6%。在另一個實施方案中，分數為0.8%。在另一個實施方案中，分數為I %。在另一個實施方案中，分數為1.5%。在另一個實施方案中，分數為2%。在另一個實施方案中，分數為2.5%。在另一個實施方案中，分數為3%。在另一個實施方案中，分數為4%。在另一個實施方案中，分數為5%。在另一個實施方案中，分數為6%。在另一個實施方案中，分數為8%。在另一個實施方案中，分數為10%。在另一個實施方案中，分數為12%。在另一個實施方案中，分數為14%。在另一個實施方案中，分數為16%。在另一個實施方案中，分數為18%。在另一個實施方案中，分數為20%。在另一個實施方案中，分數為25%。在另一個實施方案中，分數為30%。在另一個實施方案中，分數為35%。在另一個實施方案中，分數為40%。在另一個實施方案中，分數為45%。在另一個實施方案中，分數為50%。在另一個實施方案中，分數為60%。在另一個實施方案中，分數為70%。在另一個實施方案中，分數為80%。在另一個實施方案中，分數為90%。在另一個實施方案中，分數為100%。在另一個實施方案中，分數低於5%。在另一個實施方案中，分數低於3%。在另一個實施方案中，分數低於I %。在另一個實施方案中，分數低於2%。在另一個實施方案中，分數低於4%。在另一個實施方案中，分數低於6%。在另一個實施方案中，分數低於8%。在另一個實施方案中，分數低於10%。在另一個實施方案中，分數低於12%。在另一個實施方案中，分數低於15%。在另一個實施方案中，分數低於20%。在另一個實施方案中，分數低於30%。在另一個實施方案中，分數低於40%。在另一個實施方案中，分數低於50%。在另一個實施方案中，分數低於60%。在另一個實施方案中，分數低於70%。在另一個實施方案中，0.1%的給定的核苷酸(尿苷、胞苷、鳥苷或腺嘌呤)的殘基被修飾。在另一個實施方案中，核苷酸的分數為0.2%。在另一個實施方案中，分數為
0.3%。在另一個實施方案中，分數為0.4%。在另一個實施方案中，分數為0.5%。在另一個實施方案中，分數為O. 6%。在另一個實施方案中，分數為0.8%。在另一個實施方案中，分數為1%。在另一個實施方案中，分數為I. 5%。在另一個實施方案中，分數為2%。在另一個實施方案中，分數為2. 5 %。在另一個實施方案中，分數為3%。在另一個實施方案中，分數為4%。在另一個實施方案中，分數為5%。在另一個實施方案中，分數為6%。在另一個實施方案中，分數為8%。在另一個實施方案中，分數為10%。在另一個實施方案中，分數為12%。在另一個實施方案中，分數為14%。在另一個實施方案中，分數為16%。在另 一個實施方案中，分數為18%。在另一個實施方案中，分數為20%。在另一個實施方案中，分數為25%。在另一個實施方案中，分數為30%。在另一個實施方案中，分數為35%。在另一個實施方案中，分數為40%。在另一個實施方案中，分數為45%。在另一個實施方案中，分數為50%。在另一個實施方案中，分數為60%。在另一個實施方案中，分數為70%。在另一個實施方案中，分數為80%。在另一個實施方案中，分數為90%。在另一個實施方案中，分數為100%。在另一個實施方案中，給定的核苷酸的分數低於8%。在另一個實施方案中，分數低於10%。在另一個實施方案中，分數低於5%。在另一個實施方案中，分數低於3%。在另一個實施方案中，分數低於1%。在另一個實施方案中，分數低於2%。在另一個實施方案中，分數低於4%。在另一個實施方案中，分數低於6%。在另一個實施方案中，分數低於12%。在另一個實施方案中，分數低於15%。在另一個實施方案中，分數低於20%。在另一個實施方案中，分數低於30%。在另一個實施方案中，分數低於40%。在另一個實施方案中，分數低於50%。在另一個實施方案中，分數低於60%。在另一個實施方案中，分數低於 70%。在另一個實施方案中，術語「核糖核苷酸」、「寡核糖核苷酸」和「多核糖核苷酸」是指至少2個鹼基-糖磷酸組合的串。在另一個實施方案中，術語包括含有其中糖部分為核糖的核苷酸的化合物。在另一個實施方案中，術語包括RNA和其中主鏈被被修飾的RNA衍生物。在另一個實施方案中，「核苷酸」是指核酸聚合物的單體單元。在另一個實施方案中，RNA可以以 tRNA (轉運 RNA)、snRNA (小核 RNA)、rRNA (核糖體 RNA)、mRNA (信使 RNA)、反義 RNA、小幹擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核酶的形式存在。已描述了 siRNA和miRNA的用途(Caudy AA等，Genes & Devel 16 :2491_96和其中引用的參考資料)。此外，RNA的這類形式可以是單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈的。在另一個實施方案中，術語還包括可包含其它類型的主鏈但相同鹼基的人工核酸。在另一個實施方案中，人工核酸為PNA (肽核酸)。PNA包含肽主鏈和核苷酸鹼基並且在另一個實施方案中能夠結合DNA和RNA分子。在另一個實施方案中，核苷酸為氧雜環丁烷修飾的。在另一個實施方案中，核苷酸通過用硫代磷酸酯鍵替代一個或多個磷酸二酯鍵來進行修飾。在另一個實施方案中，人工核酸可包含本領域已知的天然核酸的磷酸主鏈的任何其它變體。硫代磷酸酯核酸和PNA的使用對於本領域技術人員來說是已知的並且描述於例如，Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9 :353-57 和Raz NK等,Biochem Biophys Res ComMin. 297 :1075-84中。核酸的產生和使用對於本領域技術人員來說是已知的並且描述於例如Molecular Cloning (2001), Sambrook和Russell (編著)以及Methods in Enzymology Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003)Purchio和G. C. Fareed中。每一種核酸衍生物代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，術語「寡核苷酸」是指包含少於25個核苷酸(nt)的串。在另一個實施方案中，」寡核苷酸」是指少於24個核苷酸的串。在另一個實施方案中，」寡核苷酸」是指少於23個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「寡核苷酸」是指少於22個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「寡核苷酸」是指少於21個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「寡核苷酸」是指少於20個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「寡核苷酸」是指少於19個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「寡核苷酸」是指少於18個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「寡核苷酸」是指少於17個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「寡核苷酸」是指少於16個核苷酸的串。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。
在另一個實施方案中，術語「多核糖核苷酸」是指包含超過25個核苷酸(nt)的串。在另一個實施方案中，「多核糖核苷酸」是指包含超過26個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「多核糖核苷酸」是指包含超過28個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過30個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過32個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過35個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過40個核苷酸的串。在另一個實施方案中，術「術語」是指超過50個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過60個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過80個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過100個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過120個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過150個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過200個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過300個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過400個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過500個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過600個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過800個核苷酸。在另一個實施方案中，「術語」是指超過1000個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過1200個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過1400個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過1600個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過1800個核苷酸的串。在另一個實施方案中，「術語」是指超過2000個核苷酸的串。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了用於誘導哺乳動物細胞產生目標蛋白質的方法，包括將哺乳動物細胞與體外合成的編碼重組蛋白質的RNA分子、體外合成的包含假尿苷或經修飾的核苷的RNA分子接觸，從而誘導哺乳動物細胞產生目標蛋白質。在另一個實施方案中，目標蛋白質是重組蛋白質。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，「編碼」是指編碼目標蛋白質的RNA分子。在另一個實施方案中，RNA分子包含編碼目標蛋白質的開放閱讀框架。在另一個實施方案中，還編碼一種或多種其它蛋白質。在另一個實施方案中，目標蛋白質是唯一的編碼的蛋白質。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了誘導哺乳動物細胞產生重組蛋白質的方法，包括將哺乳動物細胞與體外合成的編碼重組蛋白質的RNA分子、體外合成的還包含假尿苷或經修飾的核苷的RNA分子接觸，從而誘導哺乳動物細胞產生重組蛋白質。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子在細胞中比具有相同序列的未修飾的RNA分子更有效地被翻譯。在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子展示增強的被靶細胞翻譯的能力。在另一個實施方案中，翻譯相對於其未修飾的對應物增強至約2倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至3倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至5倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至7倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至10倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至15倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至20倍。在另一個實施方案中,翻譯增強至50倍。在另一個實施方案中,翻譯增強至100倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至200倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至500倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至1000倍。在另一個實施方案中，翻譯增強至
2000倍。在另一個實施方案中，增強至10-1000倍。在另一個實施方案中，增強至10-100倍。在另一個實施方案中，增強至10-200倍。在另一個實施方案中，增強至10-300倍。在另一個實施方案中，增強至10-500倍。在另一個實施方案中，增強至20-1000倍。在另一個實施方案中，增強至30-1000倍。在另一個實施方案中，增強至50-1000倍。在另一個實施方案中，增強至100-1000倍。在另一個實施方案中，增強至200-1000倍。在另一個實施方案中，翻譯被增強至任何其它顯著量或量的範圍。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。測定翻譯效率的方法在本領域是公知的，包括例如測量編碼的報告蛋白(例如，螢光素酶或海腎[本文中的實施例]或綠色螢光蛋白[Wall AA,Phillips AM等，Effectivetranslation of the second cistron in two Drosophila dicistronic transcriptsis determined by the absence of in-frame AUG codons in the first cistron.J Biol Chem 2005 ；280(30) :27670-8])的活性或測量摻入翻譯的蛋白質的放射性標記(Ngosuwan J,ffang NM等，Roles of cytosolic Hsp70and Hsp40 molecular chaperones inpost-translational translocation of presecretory proteins into the endoplasmicreticulum. J Biol Chem 2003 ；278(9) :7034-42)。每一種方法代表本發明的單獨實施方案。在本文中提供的某些表達研究中，從複合至Lipofectin (Gibco BRL，Gaithersburg,MD，USA)和注射入小鼠的尾靜脈的RNA測量翻譯。在脾裂解物中，假尿苷_修飾的RNA比未修飾的RNA更加顯著有效地被翻譯(圖17B)。在本文中使用的條件下，本發明的基於轉染的方法的效率與轉染劑滲透入組織的能力相關，從而提供了為什麼作用在脾細胞中最顯著的解釋。脾臟血流是開放系統，血液內容物直接接觸紅髓和白髓組分，包括淋巴樣細胞。在另一個實驗中，在加帽的海腎編碼mRNA(0. 5和0. 05ng/y I)存在的情況下，使用重組人PKR及其底物eIF2a進行體外磷酸化測定。包含假尿苷(Ψ)的mRNA不激活PKR，如通過PKR的自身磷酸化和eIF2 a的磷酸化的不存在所檢測的，然而無核苷修飾的RNA和具有m5C修飾的mRNA激活PKR。已知磷酸化的eIF2 a阻斷mRNA翻譯的起始，從而在另一個實施方案中，磷酸化的不存在使得能夠增強包含假尿苷(Ψ)的mRNA翻譯。在另一個實施方案中，增強的翻譯存在於細胞中(相對於具有相同序列的未修飾的RNA分子在相同細胞中的翻譯；實施例13-14)。在另一個實施方案中，增強的翻譯存在於體外(例如在體外翻譯混合物或網織紅細胞裂解物中；實施例13-14)。在另一個實施方案中，增強的翻譯存在於體內(實施例13)。在各自情況下，增強的翻譯是相對於在相同的條件下具有相同序列的未修飾的RNA分子的。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子的免疫原性顯著低於具有相同序列的未修飾的體外合成的RNA分子。在另一個實施方案中，經修飾的RNA分子的免疫原性為其未修飾的對應物的1/2。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/3。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/5。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/7。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/10。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/15。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/20。在另一個實施方案中，免 疫原性減小至1/50。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/100倍。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/200倍。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/500。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/1000。在另一個實施方案中，免疫原性減小至1/2000。在另一個實施方案中，免疫原性減小至I/另一個倍數差異。在另一個實施方案中，「顯著更小的免疫原性」是指可檢測的免疫原性的減小。在另一個實施方案中，術語是指免疫原性的倍數減少(例如，上文例舉的倍數減少之一)。在另一個實施方案中，術語是指減少以便可施用有效量的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子而不觸發可檢測的免疫反應。在另一個實施方案中，術語是指減少以更可重複施用RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子而不引發足以可檢測地減少重組蛋白質的表達的免疫反應。在另一個實施方案中，減少是以便可重複施用RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子而不引發足以消除重組蛋白質的可檢測的表達的免疫反應。在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子的「有效量」是指足以產生療效的量。在另一個實施方案中，術語是指足以引發可檢測的量的重組蛋白質的表達的量。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。本文中證明了本發明的RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的減小的免疫原性(實施例4-11)。測定免疫原性的方法在本領域是公知的，包括例如測量細胞因子(例如IL-12、IFN-a , TNF- a、RANTES、ΜΙΡ-1 α 或 β、IL-6、IFN-β 或 IL-8 ;本文中的實施例)的分泌，測量DC激活標誌(例如⑶83、HLA-DR、⑶80和⑶86 ;本文中的實施例)的表達或測量用作適應性免疫應答的佐劑的能力。每一種方法代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，通過測定引發上述反應之一至與給定的量的未修飾的核苷酸相同的程度所需的經修飾的核苷酸量來測定經修飾的核苷酸及其未修飾的對應物的相對免疫原性。例如，如果需要多至兩倍的經修飾的核苷酸來引發相同的反應，那麼所述經修飾的核苷酸的免疫原性低至未修飾的核苷酸的I/2。在另一個實施方案中，通過測定響應於經修飾的核苷酸的施用而分泌的細胞因子(例如 IL-12、IFN-a、TNF-a、RANTES、MIP-I α 或 β、IL-6, IFN-β 或 IL-8)相對於相同量的未修飾的核苷酸的量來測定經修飾的核苷酸及其未修飾的對應物的相對免疫原性。例如，如果分泌多至一半的細胞因子，那麼所述經修飾的核苷酸的免疫原性低至未修飾的核苷酸的1/2。在另一個實施方案中，在於上述方法中計算免疫原性之前扣除刺激的本底水平。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法還包括在接觸步驟之前將RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子與轉染劑混合。在另一個實施方案中，本發明的方法還包括將RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子與轉染劑一起施用。在另一個實施方案中，轉染劑是陽離子性脂質試劑(實施例6)。在另一個實施方案中，轉染劑是基於脂質的轉染劑。在另一個實施方案中，轉染劑是基於蛋白質的轉染劑。在另一個實施方案中，轉染劑是基於聚乙烯亞胺的轉染劑。在另一個實施方案中，轉染劑是磷酸鈣。在另一個實施方案中，轉染劑是Lipofectin 或Lipofectamine ,,在另一個實施方案中，轉染劑是本領域已知的任何其它轉染劑。在另一個實施方案中，轉染劑形成脂質體。在另一個實施方案中，脂質體增加細胞內穩定性，增加攝取效率和提高生物活性。在另一個實施方案中，脂質體是由以與組成細胞膜的那些脂質相似的方式排列的脂質組成的中空球形小囊泡。在另一個實施方案中，它們具有用於捕獲水溶性化合物並且大小範圍為直徑O. 05至數微米的內部水性空間。在另一個實施方案中，脂質體可以以生物活性形式將RNA遞送至細胞。每一種類型的轉染劑代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明的方法的靶細胞為抗原呈遞細胞。在另一個實施方案中，細胞為動物細胞。在另一個實施方案中，細胞為樹突細胞(實施例14)。在另一個實施方案中，細胞為神經細胞。在另一個實施方案中，細胞為腦細胞(實施例16)。在另一個實施方案中，細胞為脾細胞。在另一個實施方案中，細胞為淋巴樣細胞。在另一個實施方案中，細胞為肺細胞(實施例16)。在另一個實施方案中，細胞為皮膚細胞。在另一個實施方案中，細胞為角質形成細胞。在另一個實施方案中，細胞為內皮細胞。在另一個實施方案中，細胞為星形膠質細胞、小神經膠質細胞或神經元(實施例16)。在另一個實施方案中，細胞為肺泡細胞(實施例16)。在另一個實施方案中，細胞為表面肺泡細胞(實施例16)。在另一個實施方案中，細胞為肺泡巨噬細胞。在另一個實施方案中細胞為肺泡肺細胞。在另一個實施方案中，細胞為血管內皮細胞。在另一個實施方案中，細胞為間充質細胞。在另一·個實施方案中，細胞為上皮細胞。在另一個實施方案中，細胞為造血細胞。在另一個實施方案中，細胞為結腸上皮細胞。在另一個實施方案中，細胞為肺上皮細胞。在另一個實施方案中，細胞為骨髓細胞。在其它實施方案中，靶細胞為克勞迪厄斯細胞、漢森細胞、梅克爾細胞、穆勒膠質細胞(Muller cell)、潘氏細胞、浦肯野細胞、許旺細胞(Schwann cell)、支持細胞、嗜酸細胞(acidophil cell)、腺泡細胞、脂肪母細胞、脂肪細胞、棕色或白色α細胞、無長突細胞、β細胞、被囊細胞、牙骨質細胞、主細胞、成軟骨細胞、軟骨細胞、嗜鉻細胞、嫌色細胞、促腎上腺皮質激素細胞、S細胞(delta cell)、朗格漢斯細胞、濾泡樹突細胞、腸嗜鉻細胞、室管膜細胞、上皮細胞、基細胞、鱗狀細胞、內皮細胞、移行細胞、成紅血細胞、紅血球、成纖維細胞、纖維細胞、濾泡細胞、生殖細胞、配子、卵子、精子、卵母細胞、初級卵母細胞、次級卵母細胞、精子細胞、精母細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、生殖上皮、巨細胞、神經膠質細胞、成星形細胞(astroblast)、星形膠質細胞、成少突膠質細胞、少突膠質細胞、成膠質細胞、杯形細胞、促性腺激素細胞、顆粒細胞、成血細胞、毛細胞、成肝細胞(hepatoblast)、肝細胞、玻璃體細胞、間質細胞、'腎小球旁細胞(juxtaglomerular cell)、角質形成細胞、角膜細胞、神經膜細胞(lemmal cell)、白細胞、粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、淋巴母細胞、B淋巴母細胞、T淋巴母細胞、淋巴細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、誘導性T淋巴細胞、Thl T-淋巴細胞、Th2T-淋巴細胞、自然殺傷細胞、胸腺細胞、巨噬細胞、肝巨噬細胞、肺泡巨噬細胞、泡沫細胞、組織細胞、黃體細胞(luteal cell)、淋巴細胞幹細胞、淋巴樣細胞、淋巴系幹細胞、大神經膠質細胞(macroglial cell)、促乳激素細胞、肥大細胞、成神經管細胞、原巨核細胞、巨核細胞、黑色素母細胞(melanoblast)、黑色素細胞(melanocyte)、腎小球膜細胞、間皮細胞、晚幼粒細胞(metamyelocyte)、原單核細胞、單核細胞、頸粘液細胞、肌細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、髓細胞、髓樣細胞、髓樣幹細胞、成肌細胞、肌上皮細胞、肌成纖維細胞(myofibrobast)、成神經細胞、神經上皮細胞、神經元、成牙本質細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨細胞、泌酸細胞(oxyntic cell)、濾泡旁細胞、傍黃體細胞(paraluteal cell)、胃酶細胞(peptic cell)、周細胞、外周血單核細胞、嗜鉻細胞(phaeochromocyte)、指細胞、松果體細胞、垂體細胞、楽;細胞、血小板、足·細胞、原紅細胞、前單核細胞(promonocyte)、早幼粒細胞(promyeloblast)、早幼粒細胞(promyelocyte)、原紅細胞、網織紅細胞、視網膜色素上皮細胞、成視網膜細胞、小細胞、促生長激素細胞、幹細胞、支持細胞、端膠質細胞(teloglial cell)或產酶細胞。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。可通過應用本發明的方法來治療多種障礙，包括，除其它以外，單基因障礙、感染性疾病、獲得性障礙、癌症等。示例性單基因障礙包括腺苷脫氨酶缺乏症(ADAdeficiency)、囊性纖維化、家族性高膽固醇血症、血友病、慢性肉芽腫病、杜氏肌營養不良、範科尼貧血、鐮狀細胞性貧血、戈謝病、亨特氏症候群、X-連鎖SCID等。在另一個實施方案中，治療的障礙牽涉下文所列的蛋白質之一。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，由本發明的方法和組合物的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子編碼的重組蛋白質為外-核苷三磷酸二磷酸水解酶。在另一個實施方案中，重組蛋白質為紅細胞生成素(EPO)。在其它實施方案中，編碼的重組蛋白質為 ABCA4 ;ABCD3 ；ACADM ；AGL ；AGT ；ALDH4AI ；ALPL ；AMPDI ；AP0A2 ；AVSDI ；BRCD2 ；C1QA ；C1QB ；C1QG ；C8A ；C8B ；CACNAIS ；CCV ；CD3Z ；CDC2L1 ；CHML ；CHS1 ；CIAS1 ；CLCNKB ； CMDIA ；CMH2 ；CMM ; COLl IAl ；C0L8A2 ；C0L9A2 ；CPT2 ；CRB1 ；CSE ；CSF3R ；CTPA ；CTSK ；DBT ；DI01 ；DISC1 ；DPYD；EKV ；EN01 ；EN01P ；EPB41 ；EPHXI ；F13B ；F5 ；FCGR2A ；FCGR2B ；FCGR3A ；FCHL ；FH ；FM03 ；FM04 ；FUCAI ；FY ；GALE ；GBA ；GFND ；GJA8 ；GJB3 ；GLC3B ；HF1 ；HMGCL ；HPC1 ；HRD ；HRPT2 ；HSD3B2 ；HSPG2 ；KCNQ4 ；KCS ；KIF1B ；LAMB3 ；LAMC2 ；LGMDIB ；LMNA ；LOR ；MCKDI ；MCL1 ；MPZ ；MTHFR ；MTR ；MUTYH ；MY0C ；NB ；NCF2 ；NEM1 ；NPHS2 ；NPPA ；NRAS ；NTRKl ；0PTA2 ；PBX1 ；PCHC ；PGD ；PHA2A ；PHGDH ；PKLR ；PKP1 ；PLA2G2A ；PL0D ；PP0X ；PPT1 ；PRCC ；PRG4 ；PSEN2 ；PT0S1 ；REN ；RFX5 ；RHD ；RMD1 ；RPE65 ;SCCD ;SERPINC1 ；SJS1 ；SLC19A2 ；SLC2A1 ；SPG23 ； SPTAI ；TAL1 ；TNFSF6 ；TNNT2 ；TPM3 ；TSHB ；UMPK ；U0X ；UR0D ；USH2A ；VMGLOM ；VffS ；WS2B ；ABCB11 ；ABCG5；ABCG8 ；ACADL ；ACP1 ；AGXT；AHHR ；ALMSI ；ALPP；ALS2 ；AP0B ；BDE ；BDMR；BJS ；BMPR2 ；CHRNAI ；CMCffTD ；CNGA3 ；C0L3A1 ；C0L4A3 ；C0L4A4 K0L6A3 ；CPSI ；CRYGA ；CRYGEPI ；CYPIBI ；CYP27A1 ；DBI ；DES；DYSF ；EDAR ；EFEMPI ；EIF2AK3 ；ERCC3 ；FSHR ；GINGF ；:6T3CdA3: ZTdAOi CTlOXOi Ν9Π3: νΖΠ03: CaNOVOi VdXi TdMXi TOSXi CCWIHXi TOWX
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TSC2 ;VE>I ;WT3 ;ABR ;ACACA ;ACADVL ;ACE ;ALDH3A2 ;APOH ;ASPA ;AXIN2 ;BCL5 ;BHD ;BLMH ;BRCAlOACD ;CCA1oczsoHRNBlOHRNEOMTIA00匚 00RD5OTNS ;EPX ;ERBB2 ;G6PC ;GAA ;GALK1 ;GCGR ;GFAP ;GH1 ;GH2 ;GP1BA ;GPSC ;GUCY2D ;ITGA2B ;ITGB3 ;ITGB4 ;KRT10 ;KRT12 ;KRT13 ;KRT14 ;KRT14L1 ;KRT14L2 ;KRT14L3 ;KRT16 ;KRT16L1 ;KRT16L2 ;KRT17 ;KRT9 ;MAPT ;MDB ;MDCR ;MGI ;MHS2 ;MKS1 ;MPo;MYo15A ;NAGLU ;NAPB ;NF1 ;NME1 ;P4HB ;PAFAH1B1 ;PECAM1 ;PEX12 ;PHB ;PMP22 ;PRKAR1A ;PRKCA ;PRKWNK4 ;PRP8 ;PRPF8 ;PTLAH ;RARA ;RCV1 ;RMSA1 ;RP17 ;RSS ;SCN4A ;SERPINF2 ;SGCA ;SGSH ;SHBG ;SLC2A4 ;SLC4A1 ;SLC6A4 ;SMCR ;SOST ;S0X9 ;SSTR2 ;SYM1 ;SYNSI ;TCF2 ;THRA ;TIP2 ;TOC ;T0P2A ;TP53 ;TRIM37 >TP00B1 ^olOORDII0YB5σοο;5P§ Upms ;LAMA3 ;LCFS2 ;MADH4sAFDlSC2R ;MCLSYP2 ;NPC1 ;SPPK ;TGFBRE ;TGIF ;TTR ;AD2 ;AMH>P0C2>POE ;ATHS ;BAX ; BCKDHA ;BCL3 ;BFICo3OACNAIAoco0EACAM5OOMP ;CRX ;DBA ;DDU ;DFNA4 ;DLL3 ;DM1 ;DMWD;E11S;ELA2 ;EPOR ;ERCC2 ;ETFB ;EXT3 ;EYCLI ;FTL;FUT1 ;FUT2 ;FUT6 ;
39GAMT ;GCDH ；GPI ;(；USM ；HB1 ；HCL1 ；HHC2 ；HHC3 ；ICAM3 ；INSR ;JAK3 ；KLK3 ；LDLR ；LHB ；LIG1 ；L0H19CR1 ；LYL1 ；MAN2B1 ；MC0LN1 ；MDRV ；MLLTI ；N0TCH3 ；NPHSI ；0FC3 ；0PA3 ；PEPD ；PRPF31 ；PRTN3 ；PRX ；PSG1 ；PVR ；RYR1 ；SLC5A5 ；SLC7A9；STKll ；TBXA2R ；TGFBI ；TNNI3 ；TYROBP ；ADA ；AHCY ；AVP ;CDAN2 ；CDPDI ；CHEDI ；CHED2 ；CHRNA4 ；CST3 ；EDN3 ；EEGVI ；FTLLI ；GDF5 ；GNAS ；GSS ；HNF4A JAGl ；KCNQ2 ；MKKS ；NBIAl ；PCK1 ；PI3 ；PPCD ；PPGB ；PRNP ；THBD ；T0P1 ；AIRE ；APP ；CBS ；C0L6A1 ；C0L6A2 ；CSTB；DCR ；DSCR1 ；FPDMM ；HLCS ；HPE1 ；ITGB2 ；KCNEI ；KN0 ；PRSS7 ；RUNXI ；S0D1 ；TAM ；ADSL；ARSA；BCR ；CECR ；CHEK2 ；C0MT ；CRYBB2 ；CSF2RB ；CTHM ；CYP2D6 ；CYP2D7P1 ；DGCR ；DIA1 ；EWSR1 ；GGT1 ；MGCR ；MN1 ；NAGA ；NE2 ；0GS2 ；PDGFB ；PPARA ；PRODH ；SC02 ；SCZD4 ；SERPIND1 ；SLC5AI ；S0XI0 ；TCN2 ；TIMP3 ；TST ；VCF ；ABCD1 ；ACTL1 ；ADFN ；AGMX2 ；AHDS ；AIC ；AIED ；AIH3 ；ALAS2 ；AMCD ；AMELX ；ANOPI ；AR ；ARAF1 ；ARSC2 ；ARSE ；ARTS ；ARX ；ASAT ；ASSP5 ；ATP7A ；ATRX ；AVPR2 ；BFLS ；BGN ；BTK ；BZX ；C1HR ；CACNAIF ；CALB3 ；CBBM ；CCT ;CDR1 ；CFNS ；CGF1 ；CHM ；CHR39C ；CIDX ；CLA2 ；CLCN5 ；CLS ；CMTX2 ；CMTX3 ；CND ；CODl ；C0D2 ；C0L4A5 ；C0L4A6 ；CPX ；CVD1 ；CYBB ；DCX ；DFN2 ；DFN4 ；DFN6 ；DH0F ；DIAPH2 ；DKC1 ；DMD ；DSS ；DYT3 ；EBM ；EBP ；ED1 ；ELK1 ；EMD ；EVR2 ；F8 ；F9 ；FCP1 ；FDPSL5 ;FO)l ；FGS1 ；FMR1 ；FMR2 ；G6PD ；GABRA3 ；GATAI ；GDI1 ；GDXY ；GJB1 ；GK ；GLA ；GPC3 ；GRPR ；GTD ；GUST ；HMS1 ；HPRTl ；HPT；HTC2 ；HTR2C ；HYR ；IDS ；IHG1 ；IL2RG ；INDX ；IP1 ；IP2；JMS ；KAL1 ；KFSD ；LICAM ；LAMP2 ；MAA ；MAFD2 ；MA0A ；MA0B ；MCF2 ；MCS ；MEAX ；MECP2 ；MF4 ；MGCI ；MIC5 ；MID1 ；MLLT7 ；MLS ；MRSD ；MRX14 ；MRX1 ；MRX20 ；MRX2 ；MRX3 ；MRX40 ；MRXA ；MSD ；MTMI ；MYCL2 ；MYPI ；NDP ；NHS ；NPHLI ；NROBI ；NSX ；NYSI ；NYX ；0AI ；0ASD ；0CRL ；0DTI ；0FD1 ；0PA2 ；0PD1 ；0PEM ；OPNlLff ；0PN1MW ；0TC；P3 ；PDHAI ；PDR ；PFC ；PFKFBI ；PGK1 ；PGK1P1 ；PGS ；PHEX ；PHKAI ；PHKA2 ；PHP ；PIGA ；PLP1 ；P0F1 ；P0LA ；P0U3F4 ；PPMX ；PRD ；PRPSI ；PRPS2 ；PRS ；RCCP2 ；RENBP ；RENSl ；RP2 ；RP6 ；RPGR ；RPS4X ；RPS6KA3 ；RS1 ；S11 ；SDYS ；SEDL ；SERPINA7 ；SH2D IA ；SHFM2 ；SLC25A5 ；SMAX2 ；SRPX ；SRS ；STS ；SYN1 ；SYP ；TAF1 ；TAZ ；TBX22 ；TDD ；TFE3 ；THAS ；THC ；TIMM8A ；TIMP1 ；TKCR ；TNFSF5 ；UBE1 ；UBE2A ；WAS ；WSN ；WTS ；WWS ；XIC ；XIST ；XK ；XM ；XS ；ZFX ；ZIC3 ；ZNF261 ；ZNF41 ；ZNF6 ；AMELY ；ASSP6 ；AZFI ；AZF2；DAZ ；GCY ；RPS4Y ；SMCY ；SRY ；ZFY ；ABAT ；AEZ ；AFA ；AFD1 ；ASAH1 ；ASD1 ；ASMT ；CCAT ；CECR9 ；CEPA ；CLA3 ；CLN4 ；CSF2RA ；CTSI ；DF ；DIH1 ；DWS；DYT2；DYT4 ；EBR3 ；ECT ；EEF1A1L14 ；EYCL2 ；FANCB ；GCSH ；GCSL ；GIP ；GTS ；HHG ；HMI ；H0AC ；H0KPP2 ；HRPTI ；HSD3B3 ；HTC1 ；HV1S ；ICHQ ；ICR1 ；ICR5 ；IL3RA ；KAL2 ；KMS ；KRT18 ；KSS；LCAT；LH0N;LMM ;MANBB ；MCPH2 ；MEB ；MELAS ；MIC2 ；MPFD；MS ；MSS ；MTATP6 ；MTC0I ；MTC03 ；MTCYB ；MTND1 ；MTND2 ；MTND4 ；MTND5 ；MTND6 ；MTRNR1 ；MTRNR2 ；MTTE ；MTTG ；MTTI ；MTTK ；MTTL1 ；MTTL2 ；MTTN ；MTTP ；MTTS1 ；NAMSD ;0CD1 ;0PD2 ；PCK2 ；PCLD ；PCOSl ；PFKM ；PKD3 ； PRCAI ；PR01 ； PROP I ；RBS ； RFXAP ；RP ；SHOX ；SLC25A6 ；SPG5B ；STO ；SUOX ；THM ;或111)。每一種重組蛋白質代表本發明的單獨實施方案。 在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的貧血症的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼紅細胞生成素的RNA分子接觸，從而治療受試者的貧血症。在另一個實施方案中，體外合成的RNA分子還包含假尿苷或經修飾的核苷。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，細胞為皮下組織細胞。在另一個實施方案中，細胞為肺細胞。在另一個實施方案中，細胞為成纖維細胞。在另一個實施方案中，細胞為淋巴細胞。在另一個實施方案中，細胞為平滑肌細胞。在另一個實施方案中，細胞為本領域已知的任何其它類型的細胞。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的血管痙攣的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼可誘導的一氧化氮合酶(iNOS)的RNA分子接觸，從而治療受試者的血管痙攣。在另一個實施方案中，本發明提供了用於提高受試者的細胞的存活率的方法，包括將細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼熱激蛋白的RNA分子接觸，從而提高受試者的細胞的存活率。在另一個實施方案中，其存活率得到提高的細胞為局部缺血的細胞。在另一個實施方案中，細胞未局部缺血。在另一個實施方案中，已將細胞暴露於局部缺血環境。在另一個實施方案中，已將細胞暴露於環境應激。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了用於在進行擴大血管的方法後降低血管的再 狹窄的發病率的方法，包括將血管的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼熱激蛋白的RNA分子接觸，從而降低受試者的再狹窄的發病率。在另一個實施方案中，方法是血管成形術。在另一個實施方案中，方法是本領域已知的擴大血管的任何其它方法。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了用於增加毛髮從受試者的頭皮的毛囊生長的方法，包括將頭皮的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼端粒酶或免疫抑制蛋白的RNA分子接觸，從而增加毛髮從毛囊生長。在另一個實施方案中，免疫抑制蛋白為α-促黑色素細胞激素(α-MSH)。在另一個實施方案中，免疫抑制蛋白為轉化生長因子-β I (TGF-β I)。在另一個實施方案中，免疫抑制蛋白為胰島素樣生長因子-I (IGF-I)。在另一個實施方案中，免疫抑制蛋白為本領域已知的任何其它免疫抑制蛋白。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了在細胞中誘導具有抗氧化劑活性的酶的表達，包括將細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼所述酶的RNA分子接觸，從而在細胞中誘導具有抗氧化劑活性的酶的表達。在一個實施方案中，酶是過氧化氫酶。在另一個實施方案中，酶是穀胱甘肽過氧化酶。在另一個實施方案中，酶是磷脂過氧化氫穀胱甘肽過氧化物酶。在另一個實施方案中，酶是超氧化物歧化酶-I。在另一個實施方案中，酶是超氧化物歧化酶_2。在另一個實施方案中，酶是本領域內已知的具有抗氧化活性的任何其它酶。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的囊性纖維化的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼囊性纖維化跨膜傳導調節劑(CFTR)的RNA分子接觸，從而治療治療受試者的囊性纖維化。在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的X連鎖丙種球蛋白缺乏血症的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼Bruton』 s酪氨酸激酶的RNA分子接觸，從而治療X連鎖丙種球蛋白缺乏血症。在另一個實施方案中，本發明提供了用於治療受試者的腺苷脫氨酶嚴重聯合免疫缺陷症(AM SCID)的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼ADA的RNA分子接觸，從而治療ADA SCID。在另一個實施方案中，本發明提供了用於減輕皮膚的免疫反應和改善皮膚病狀的方法，包括將受試者的細胞與體外合成的RNA分子、體外合成的編碼外-核苷三磷酸二磷酸水解酶的RNA分子接觸，從而減輕皮膚的免疫反應和改善皮膚病狀。在另一個實施方案中，本發明的RNA分子或核糖核苷酸分子被封裝在納米顆粒中。用於納米顆粒包裝的方法在本領域是公知的，並且描述於例如Bose S，等(Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type 3 Infection ofHuman Lung Epithelial Cells.J. Virol. 78 :8146. 2004) ；Dong Y 等，Poly(d,1-lactide-co-glycolide)/montmoriIIonite nanoparticles for oral delivery ofanticancer drugs. Biomaterials 26 :6068.2005) ；Lobenberg R.等(Improved bodydistribution of 14C_labelled AZT bound to nanoparticles in rats determinedby radioluminography. J Drug Target 5:171.1998) ；Sakuma SR 等(Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilic polymeric chains in thegastrointestinal tract. Int J Pharm 177 :161.1999) ；Virovic L 等，Novel deliverymethods for treatment of viral hepatitis an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005);和 Zimmermann E 等，Electrolyte-and pH-stabilities of aqueous solidlipid nanoparticle (SLN) dispersions in artificial gastrointestinal media. Eur JPharm Biopharm 52 :203. 2001)中。每一種方法代表本發明的單獨實施方案。本發明的化合物的劑量範圍的不同實施方案可用於本發明的方法。在一個實施方案中，劑量範圍為I-IOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為2-10 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為3-10 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為5-10 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為2-20 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為3-20 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為5-20 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為IOIOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為3-40 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為5-40 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為IOIOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為20-40 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為5-50 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為IO-SOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為20-50 μ g/天。在一個實施方案中，劑量為I-IOOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為2-100 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為3-100 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為S-IOOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為IO-IOOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為20-100 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為AO-IOOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為60-100 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為0. Iyg/天。在另一個實施方案中，劑量為0.2 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為OJyg/天。在另一個實施方案中，劑量為OAyg/天。在另一個實施方案中，劑量為I U g/天。在另一個實施方案中，劑量為2mg/天。在另一個實施方案中，劑量為3 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為5 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為IOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為Myg/天。在另一個實施方案中，劑量為20 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為30 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為
天。在另一個實施方案中，劑量為60 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為80 μ g/天。在另一個實施方案中，劑量為IOOyg/天。在另一個實施方案中，劑量為10 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為20 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為30 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為40 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為60 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為SOyg/劑。在另一個實施方案中，劑量為IOOyg/劑。在另一個實施方案中，劑量為150 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為200μ8/劑。在另一個實施方案中，劑量為300 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為AOOyg/劑。在另一個實施方案中，劑量為600 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為SOOyg/劑。在另一個實施方案中，劑量為IOOOyg/劑。在另一個實施方案中，劑量為1.5mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為2mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為3mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為5mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為IOmg/劑。在另一個實施方案中，劑量為15mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為20mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為30mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為50mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為80mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為IOOmg/劑。
在另一個實施方案中，劑量為IOIOyg/劑。在另一個實施方案中，劑量為20-30 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為20-40 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為30-60 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為40-80 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為SO-IOOyg/劑。在另一個實施方案中，劑量為50-150 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為100-200 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為200-300 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為300-400 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為400-600 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為500-8001^/劑。在另一個實施方案中，劑量為SOO-IOOOyg/劑。在另一個實施方案中，劑量為1000-1500 μ g/劑。在另一個實施方案中，劑量為1500-20001^/劑。在另一個實施方案中，劑量為2-3mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為2-5mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為2-10mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為2-20mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為2-30mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為2-50mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為2-80mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為2-100mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為3-10mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為3-20mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為3-30mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為3-50mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為3-80mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為3-100mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為5-10mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為5-20mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為5-30mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為5-50mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為5-80mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為5-100mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為10-20mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為10-30mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為10-50mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為10-80mg/劑。在另一個實施方案中，劑量為IO-IOOmg/ 劑。在另一個實施方案中，劑量為日劑量。在另一個實施方案中，劑量為周劑量。在另一個實施方案中，劑量為月劑量。在另一個實施方案中，劑量為年劑量。在另一個實施方案中，劑量為一系列確定數量的劑量之一。在另一個實施方案中，劑量為一次劑量。如下文中描述的，在另一個實施方案中，本發明的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子的有利方面為它們效力越大，使得能夠使用越小的劑量。
在另一個實施方案中，本發明提供了用於產生重組蛋白的方法，包括將體外翻譯裝置與體外合成的寡核糖核苷酸、體外合成的包含假尿苷或經修飾的核苷的寡核苷酸接觸，從而產生重組蛋白質。在另一個實施方案中，本發明提供了用於產生重組蛋白的方法，包括將體外翻譯裝置與本發明的體外組轉錄的RNA分子、體外轉錄的包含假尿苷或經修飾的核苷的RNA分子接觸，從而產生重組蛋白質。在另一個實施方案中，本發明提供了體外轉錄裝置，包括未修飾的核苷酸、包含假尿苷或經修飾的核苷的核苷酸和聚合酶。在另一個實施方案中，本發明提供了體外轉錄試劑盒，包括未修飾的核苷酸、包含假尿苷或經修飾的核苷的核苷酸和聚合酶。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，體外翻譯裝置包括網織紅細胞裂解物。在另一個實施方案中，網織紅細胞裂解物是兔網織紅細胞裂解物。在另一個實施方案中，本發明提供了減小寡核糖核苷酸分子或RNA分子的免疫原性的方法，所述方法包括用包含經修飾的核苷或假尿苷的經修飾的核苷酸替代寡核糖核苷酸分子或RNA分子的核苷酸的步驟，從而減小寡核糖核苷酸分子或RNA分子的免疫原性。在另一個實施方案中，本發明提供了減小包含多核苷酸分子或RNA分子的基因治療載體的免疫原性的方法，所述方法包括用包含經修飾的核苷或假尿苷的經修飾的核苷酸替代多核苷酸分子或RNA分子的核苷酸的步驟，從而減小基因治療載體的免疫原性。在另一個實施方案中，本發明提供了增強從寡核糖核苷酸分子或RNA分子的體外翻譯的方法，所述方法包括用包含經修飾的核苷或假尿苷的經修飾的核苷酸替代寡核苷酸分子或RNA分子的核苷酸的步驟，從而增強從寡核糖核苷酸分子或RNA分子的體外翻譯。在另一個實施方案中，本發明提供了增強從包含多核苷酸分子或RNA分子的基因治療載體的體內翻譯的方法，所述方法包括用包含經修飾的核苷或假尿苷的經修飾的核苷酸替代多核苷酸分子或RNA分子的核苷酸的步驟，從而增強從基因治療載體的體內翻譯。在另一個實施方案中，本發明提供了利用包含多核苷酸分子或RNA分子的基因治·療載體增加重組蛋白質的遞送的效率的方法，所述方法包括用包含經修飾的核苷或假尿苷的經修飾的核苷酸替代多核苷酸分子或RNA分子的核苷酸的步驟，從而增加通過基因治療載體遞送重組蛋白質的效率。在另一個實施方案中，本發明提供了增強包含多核苷酸分子或RNA分子的基因治療載體的體內穩定性的方法，所述方法包括用包含經修飾的核苷或假尿苷的經修飾的核苷酸替代多核苷酸分子或RNA分子的核苷酸的步驟，從而增加基因治療載體的體內穩定性。在另一個實施方案中，本發明提供了合成包含假尿苷核苷的體外轉錄的RNA分子的方法，所述方法包括將分離的聚合酶與未修飾的核苷酸和經修飾的核苷酸的混合物接觸(實施例5和10)。在另一個實施方案中，本發明的體外轉錄法利用來自動物細胞的提取物。在另一個實施方案中，提取物來自網織紅細胞或具有類似的體外轉錄效率的細胞。在另一個實施方案中，提取物來自本領域已知的任何其它類型的細胞。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，可在本發明的任何方法中使用本發明的任何RNA分子或寡核糖核苷酸分子。在另一個實施方案中，本發明提供了增強對抗原的免疫反應的方法，包括將抗原與線粒體(mt) RNA組合施用(實施例4和8)。在另一個實施方案中，本發明提供了降低RNA分子刺激樹突細胞(DC)的能力的方法，包括利用本發明的方法(例如，參見實施例)修飾RNA分子的核苷。在另一個實施方案中，DC為DCl細胞。在另一個實施方案中，DC為DC2細胞。在另一個實施方案中，DC為DCl細胞或DC2細胞亞型。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了降低RNA分子刺激由TLR3介導的信號轉導的能力的方法，包括利用本發明的方法修飾RNA分子的核苷。在另一個實施方案中，本發明提
供了降低RNA分子刺激由TLR7介導的信號轉導的能力的方法，包括利用本發明的方法修飾RNA分子的核苷。在另一個實施方案中，本發明提供了降低RNA分子刺激由TLR8介導的信號轉導的能力的方法，包括利用本發明的方法修飾RNA分子的核苷。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子中的所有核苷間或核苷酸間連接都為磷酸二酯鍵。在另一個實施方案中，核苷酸間連接主要為磷酸二酯。在另一個實施方案中，大多數核苷酸間連接為硫代磷酸酯。在另一個實施方案中，大多數核苷酸間連接為磷酸二酯。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，作為磷酸二酯的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子中的核苷酸間連接的百分比高於50%。在另一個實施方案中，百分比高於10%。在另一個實施方案中，百分比高於15%。在另一個實施方案中，百分比高於20%。在另一個實施方案中，百分比高於25%。在另一個實施方案中，百分比高於30%。在另一個實施方案中，百分比高於35%。在另一個實施方案中，百分比高於40%。在另一個實施方案中，百分比高於45%。在另一個實施方案中，百分比高於55%。在另一個實施方案中，百分比高於60%。在另一個實施方案中，百分比高於65%。在另一個實施方案中，百分比高於70%。在另一個實施方案中，百分比高於75%。在另一個實施方案中，百分比高於80% .在另一個實施方案中，百分比高於85%。在另一個實施方案中，百分比高於90%。在另一個實施方案中，百分比聞於95 % ο在另一個實施方案中，本發明的方法包括增加RNA分子中的經修飾的核苷的數目、百分比或頻率以減小免疫原性或增加翻譯效率。如本文中所提供的(例如，參見實施例)，在另一個實施方案中，RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子中的經修飾的殘基的數目決定本發明中觀察到的效應的量級。在另一個實施方案中，本發明提供了用於將重組蛋白質引入受試者的細胞的方法，包括將受試者與體外轉錄的編碼重組蛋白的RNA分子、體外轉錄的還包含假尿苷或另一種經修飾的核苷的RNA分子接觸，從而將重組蛋白質引入受試者的細胞。在另一個實施方案中，本發明提供了用於減少響應於受試者的基因治療載體的TNF-α產量的方法，包括對載體進行工程改造以包含假尿苷或經修飾的核苷鹼基的步驟，從而減少響應於受試者的基因治療載體的TNF-α產量。在另一個實施方案中，本發明提供了用於減少響應於受試者的基因治療載體的IL-12產量的方法，包括對載體進行工程改造以包含假尿苷或經修飾的核苷鹼基的步驟，從而減少響應於受試者的基因治療載體的IL-12產量。在另一個實施方案中，本發明提供了減小基因治療載體的免疫原性的方法，包括將經修飾的核苷引入所述基因治療載體，從而減小基因治療載體的免疫原性。如本文中所提供的，本發明的發現顯示原代DC具有額外的RNA信號轉導實體，其識別m5C-和m6A-修飾的RNA並且其信號轉導被U殘基的修飾抑制。在另一個實施方案中,本發明的RNA、寡核糖核苷酸和多核苷酸分子的有利方面是RNA不整合至基因組中(與基於DNA的載體相反)。在另一個實施方案中，有利方面是RNA的翻譯，從而編碼的產物的出現是瞬時的。在另一個實施方案中，有利方面是從mRNA產生的蛋白質的量可通過遞送更多或更少的RNA來調節。在另一個實施方案中，有利方面是純化的假尿苷或其它修飾的RNA、寡核糖核苷酸或多核苷酸分子的重複遞送不誘導免疫反應，然而未修飾的RNA的重複遞送可誘導通過RNA傳感器的信號轉導途徑。·
在另一個實施方案中，有利方面是不存在免疫原性，從而使得能夠重複遞送而不產生炎症細胞因子。在另一個實施方案中，RNA的穩定性通過環化(從而減少外切核酸酶的降解)來增加。在另一個實施方案中，本發明提供了治療患有包括抗自身RNA分子的免疫反應的疾病的受試者的方法，包括給受試者施用TLR-3分子的拮抗劑,從而治療患有疾病的受試者，所述受試者包括抗自身RNA分子的免疫反應。在另一個實施方案中，本發明提供了治療患有包括抗自身RNA分子的免疫反應的疾病的受試者的方法，包括給受試者施用TLR-7分子的拮抗劑,從而治療患有包括抗自身RNA分子的免疫反應的疾病的受試者。在另一個實施方案中，本發明提供了治療患有包括抗自身RNA分子的免疫反應的疾病的受試者的方法，包括給受試者施用TLR-8分子的拮抗劑,從而治療患有包括抗自身RNA分子的免疫反應的疾病的受試者。在另一個實施方案中，包括抗自身RNA分子的免疫反應的疾病為自身免疫疾病。在另一個實施方案中，疾病為全身性紅斑狼瘡(SLE)。在另一個實施方案中，疾病為本領域已知的另一種疾病，所述疾病包括抗自身RNA分子的免疫反應。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本發明提供了包括進行本發明的方法中使用的試劑的試劑盒。在另一個實施方案中，本發明提供了包括本發明的組合物、工具或儀器的試劑盒。在另一個實施方案中，本發明提供了用於測量或研究由TLR-3、TLR-7和TLR-8受體介導的信號轉導的試劑盒，如實施例7中舉例說明的。在另一個實施方案中，本發明的治療方案是治療性的。在另一個實施方案中，方案是預防性的。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。在一個實施方案中，短語「接觸細胞」或「接觸群體」是指暴露的方法，其可以是直接的或間接的。在一個方法中，這樣的接觸包括通過本領域公知的任何方法例如顯微注射進行的細胞的直接注射。在另一個實施方案中，至細胞的提供是間接的，例如通過在包圍細胞的培養基中提供，或給受試者施用，或通過本領域已知的任何途徑的提供。在另一個實施方案中，術語「接觸」意指將本發明的分子引入接受治療的受試者，並且使分子在體內與細胞接觸。每一種可能性代表本發明的單獨實施方案。用於定量網織紅細胞頻率和測量EPO生物活性的方法在本領域是公知的，並且描述於例如 Ramos, AS 等(Biological evaluation of recombinant 人 erythropoietin inpharmaceutical products. Braz J Med Biol Res 36 :1561)中。每一種方法代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，可通過本領域技術人員已知的任何方法例如胃腸外、癌旁(paracancerally)、透黏膜(transmucosalIy)、經皮、肌內、靜脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內、顱內、陰道內或瘤內施用本發明的組合物。在本發明的方法和組合物的另一個實施方案中，口服施用組合物，從而以適合用於口服施用的方式(即作為固體或液體製劑)配製組合物。適當的固體口服製劑包括片劑、膠囊、丸劑、粒劑、小丸(pellet)等。適當的液體口服製劑包括溶液、混懸液、分散液、乳液、油等。在本發明的另一個實施方案中，將活性成分配製在膠囊中。根據該實施方案，本發明的組合物，除了活性化合物和惰性載體或稀釋劑外，還包含硬明膠化膠囊。 在其它實施方案中，通過靜脈內、動脈內或肌內注射液體製劑來施用藥物組合物。適當的液體製劑包括溶液、混懸液、分散液、乳液、油等。在另一個實施方案中，靜脈內施用藥物組合物，由此以適合用於靜脈內施用的形式配製。在另一個實施方案中，動脈內施用藥物組合物，由此以適合於動脈內施用的形式配製。在另一個實施方案中，肌內施用藥物組合物，由此以適合於肌內施用的形式配製。在另一個實施方案中，將藥物組合物局部施用至身體表面，由此以適合於局部施用的形式配製。適合的局部製劑包括凝膠劑、軟膏劑、乳膏劑、洗劑、滴劑等。為了進行局部施用，製備組合物或它們的生理上可耐受的衍生物，以生理上可接受的稀釋劑(具有或不具有藥用載體)中的溶液、混懸液或乳液施用。在另一個實施方案中，以栓劑例如直腸栓劑或尿道栓劑的形式施用組合物。在另一個實施方案中，通過皮下植入小丸施用藥物組合物。在另一個實施方案中，小丸在一段時間內提供受控的試劑釋放。在另一個實施方案中，將活性化合物於小囊泡例如脂質體中進行遞送(參見Langer, Science 249:1527-1533(1990) ；Treat 等，in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein 和 Fidler (編)，Liss, New York,pp. 353-365 (1989) ;Lopez_Berestein,如上，pp. 317-327 ;通常參見如上)。如本文中所使用的「藥學上可接受的載體或稀釋劑」對於本領域技術人員來說是公知的。在不同的實施方案中，載體或稀釋劑可以是用於固體配製的固體載體或稀釋劑、用於液體配製的液體載體或稀釋劑或其混合物。在另一個實施方案中，固體載體/稀釋劑包括但不限於樹膠、澱粉(例如玉蜀黍澱粉、預膠化澱粉)、糖(例如，乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖)、纖維質材料(例如微晶纖維素)、丙烯酸酯(例如聚丙烯酸甲酯)、碳酸鈣、氧化鎂、滑石或其混合物。在其它實施方案中，用於液體製劑的藥學上可接受的載體可以是水性或非水性溶液、混懸液、乳液或油。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有機酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液性、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。油的實例為石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、向日葵油和魚肝油。
胃腸外媒介物(用於皮下、靜脈內、動脈內或肌內注射)包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖(Ringer' s dextrose)、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏溶液和不揮髮油。靜脈內媒介物包括液體和營養補充劑(nutrient replenisher)、電解質補充劑例如基於林格氏葡萄糖的那些補充劑等。實例是無菌液體(含或不含表面活性劑或其它藥學上可接受的佐劑)，例如水和油。一般地，水、鹽水、葡萄糖水溶液和相關糖溶液以及二醇類例如丙二醇或聚乙二醇是優選的液體載體，特別是對於可注射溶液。油的實例是石油、動物、植物或合成來源的那些油，例如，花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、向日葵油和魚肝油。在另一個實施方案中，組合物還包含粘合劑(例如阿拉伯膠、玉蜀黍澱粉、明膠、卡波姆、乙基纖維素、瓜爾膠、羥丙基纖維素、羥基羥丙甲基纖維素、聚維酮)、崩解劑(例如，玉蜀黍澱粉、馬鈴薯澱粉、海藻酸、二氧化矽、交聯羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、瓜爾膠、澱粉羥乙酸鈉)、不同PH和離子強度的緩衝劑(例如，Tris-HCI、醋酸鹽、磷酸鹽)、阻止吸附至表面的添加劑例如白蛋白或明膠、去垢劑(例如，Tween 20>Tween 80>Pluronic F68、膽汁酸鹽)、蛋白酶抑制劑、表面活性劑(例如十二烷基硫酸鈉)、滲透促進劑、增溶劑(例如，甘油、聚乙二醇)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉、丁基化羥基茴香醚)、穩定劑(例如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素)、增粘劑(例如，卡波姆、二氧化矽膠體、乙基纖維素、瓜爾膠)、甜味劑(例如，阿司帕坦、檸檬酸)、防腐劑(例如，硫柳汞、苯甲醇、對羥苯甲酸酯)、滑潤劑(例如硬脂酸、硬脂酸鎂、聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉)、助流劑(例如二氧化矽膠體)、增塑劑(例如鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三乙酯)、乳化劑(例如，卡波姆、羥丙基纖維素、十二烷基硫酸鈉)、聚合物包衣(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)、包衣劑和成膜劑(例如乙基纖維素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐劑。上述賦形劑各自代表本發明的單獨實施方案。在另一個實施方案中，本文中提供的藥物組合物是控制釋放組合物，即其中化合物在施用後一段時間內釋放的組合物。控制釋放或持續釋放組合物包括親脂貯庫(例如脂肪酸、石臘、油)中的製劑。在另一個實施方案中，組合物為即釋(immediate-release)組合物，即其中全部化合物在施用後立即釋放的組合。在另一個實施方案中，通過共價連接水溶性聚合物例如聚乙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸來修飾本發明的分子。已知經修飾的化合物在靜脈內注射後在血液中展示比相應的未修飾的化合物顯著更長的半衰期(Abuchowski等，1981 ；Newmark等，1982 ;和Katre等，1987)。在另一個實施方案中，這類修飾也增加化合物在水溶液中的溶解度，消除聚集，增強化合物的生理和·化學穩定性，以及極大地減小化合物的免疫原性和反應性。因此，可通過以比未修飾的化合物更低的頻率或更小的劑量施用這類聚合物-化合物加成物來獲得期望的體內生物活性。在另一個實施方案中，將活性化合物以經中和的藥學上可接受的鹽形式配製到組合物中。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(例如，與多肽或抗體分子的游離氨基形成的)，其可用無機酸例如鹽酸或磷酸或這樣的有機酸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等來形成。由游離羧基形成的鹽還可由無機鹼例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及這樣的有機鹼如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等產生。每一種上述添加劑、賦形劑、製劑和施用方法代表本發明的單獨實施方案。實施例除非另外指出，否則在下面提供的實施例中使用下列實驗方案。實施例1-3的材料和方法細朐培養。將新生兒人包皮成纖維細胞1079細胞(Cat#CRL_2097，ATCC,Manassas, VA)和人MR90細胞(Cat#CCL_186，ATCC)培養在補充有10%熱滅活胎牛血清(FBS, Hyclone Laboratories, Logan, UT)、2mM Glutamax (Invitrogen)、0· ImM β-疏基乙醇(Sigma, St. Louis, MO)和青黴素/鏈黴素的(Invitrogen)的高級MEM培養基(Invitrogen，Carlsbad, CA)中。將所有細胞在37°C和5% CO2下生長。在某些實驗中，將使用本文中描述的方法誘導的人iPS細胞在用O. 1%的在DMEM/F12培養基中的明膠(MiIlipore, Phillipsburg, NJ)預包被的10-cm平板上的被福射的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF) (R&DSystems, Minneapolis, MN)上維持，所述DMEM/F12培養基補充有20%敲除血清替代者(KnockOut serum replacer) >0. ImM L-穀氨酸胺(全都來自 Invitrogen)、0· ImM β-巰基乙醇(Sigma)和100ng/ml鹼性成纖維生長因子(Invitrogen)。在某些實驗中，將使用本文中描述的方法誘導的人iPS細胞維持在如先前所述收集的MEF-條件化培養基中(Xu 等，2001)。裁體的構建。從cDNA 克降(ODen Biosystems, Huntsville, AL)PCR 擴增 KLF4、LIN28、NANOG和0CT4的開放閱讀框架(ORF)的cDNA，將其在T7RNA聚合酶啟動子的下遊克隆入質粒載體(Mackie 1988, Studier 和 Moffatt 1986)(例如，不同的 pBluescript ,Agilent, La Jolla, CA 或 pGEMTM, Promega, Madison, WI，載體)並且對其進行測序。從cDNA 克隆(Invitrogen) PCR 擴增 S0X2 的 0RF，通過 RT-PCR 從 HeLa 細胞總 RNA 分離 c_MYC的0RF。也將S0X2和c-MYC ORF都在T7RNA聚合酶啟動子的下遊克隆入質粒載體並且對其進行測序。可將包含人(KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4和S0X2)的開放閱讀框架的替代質粒載體克隆入pBluescriptII。這些pBluescriptII載體可通過將上述開放閱讀框架連接入在描述的5』與3』光滑爪蟾β-球蛋白非翻譯區之間的EC0RV(CMyC)或EcoRV/SpeI (KLF4、LIN28、NANOG, 0CT4 和 S0X2)位點來構建(Krieg 和 Melton 1984)。mRNA的產牛。用BamHI線性化含T7 RNA聚合酶啟動子的質粒構建體(pT7_KLF4、PT7-LIN28、pT7-c-MYC、pT7_0CT4、pT7_S0X2 或 pT7_XBg_KLF4、pT7_XBg_LIN28、pT7-XBg-c-MYC、pT7-XBg-0CT4 和 pT7_XBg_S0X2)，並且用 Xba I 線性化 pT7_NAN0G 和pT7-XBg-NAN0G。將 mSCRIPT mRNA 產生系統(EPICENTRE 或 CellScript，Madison，WI，USA)用於產生具有5』帽I結構和3』聚腺苷酸尾(例如，具有約150個腺苷酸殘基)的mRNA，除用假尿苷-5』 -三磷酸(TRILINK，San Diego, CA)在體外轉錄反應中替代T7RNA聚合酶中的尿苷-5』 -三磷酸外。mRNA的產牛和分析。在某#實驗的實施方案中，利用HPLC純化mRNA，收集柱級分，如「實施例35-38的材料和方法」中所述和/或如圖22-24中描述和顯示的分析mRNA級分的純度和免疫原性。在某些實驗的實施方案中，將包含編碼一種或多種重編程因子的mRNA或由所述mRNA組成的純化的RNA製劑(所述製劑展示幾乎無或無免疫原性)用於將人體細胞重編程為iPS細胞的實驗。在MEF上重編稈人體細胞。將1079成纖維細胞以I X IO5個細胞/孔塗鋪在用0.I %明膠(Millipore)預包被的6孔培養皿上並且生長過夜。使用TransIT mRNA轉染劑(MirusBio，Madison，WI)，用等量的每一種重編程因子 mRNA (KLF4、LIN28、c-MYC、NAN0G、0CT4和S0X2)轉染1079成纖維細胞。進行總共3次轉染，每隔一天進行一次轉染，在第一次和第二次轉染後第二天改變培養基。在第三次轉染後第二天，用胰蛋白酶處理細胞，將3. 3 X IO5個細胞於1079培養基中塗鋪在前一天用7. 5 X IO5個MEF接種的O. I %明膠預包被的10-cm平板上。將轉染的1079成纖維細胞塗鋪在MEF上後第二天，將培養基改變成iPS細胞培養基。每天改變iPS細胞培養基。將轉染的細胞塗鋪在MEF上後8天，使用MEF-條件化培養基。如選前所述(Xu等，2001)收集MEF條件化培養基。每天使用倒置顯微鏡篩選板上存在的具有iPS形態學的集落。還使用用於在MEF上重編程1079和MR90成纖維細胞的替代方案。將MEF以
1.25 X IO5個細胞/孔塗鋪在O. I %明膠預包被的6孔培養皿並且在完全成纖維細胞培養基中溫育過夜。將1079或MR90成纖維細胞以3 X IO4個細胞/孔塗鋪在前一天用MEF接種 的6孔培養皿上，於37°C /5% CO2下生長過夜。隨後將mScript試劑盒用於從下列用於這類每日轉染的載體(ρΤ7-Χ β g-KLF4、ρΤ7-Χ β g_LIN28、ρΤ7_Χ β g-c-MYC、ρΤ7_Χ β g-NANOG、ρΤ7-Χ β g-0CT4和ρΤ7-Χ β g-S0X2)產生帽I/多腺苷酸化mRNA。將所有6種重編程mRNA稀釋至IOOng/ μ I的每一種mRNA。使用下列轉換係數(將0CT4設置在I並且將所有其它mRNA乘以這些轉換係數以獲得每一種mRNA混合物的等克分子濃度)一起添加等克分子濃度的每一種 mRNA ο KLF = I. 32、LIN28 = O. 58, c-MYC = I. 26, NANOG = O. 85、0CT4 = I 和S0X2 = 0.88。為了獲得等克分子濃度的每一種因子，可一起加入132 μ I的KLF4、58y I的 LIN28、126 μ I 的 c_MYC、85 μ I 的 NAN0G、100 μ I 和 0CT4 和 88 μ I 的 S0X2mRNA (各自在IOOng/ μ I)。用於轉染的600 μ g總劑量意指使用IOOng (使用上述克分子濃度換算)的6種重編程mRNA中的每一種。將Trans-IT mRNA轉染劑用於轉染這些mRNA劑量。對於所有轉染，將mRNA混合物添加至250 μ I的不具有添加劑的DMEM/F12培養基或不具有添加劑的高級MEM培養基。將5 μ I的mRNA加強劑和5 μ I的TransIT轉染劑添加至每一個管中，在室溫下溫育2分鐘，然後將轉染混合物添加至2. 5ml的含有10% FBS+100ng/ml hFGFb的高級MEM培養基或含有100ng/ml hFGFb的iPS培養基。每天重複轉染，進行10_16天。在每一次轉染後4小時改變培養基。在某些實驗中，用胰蛋白酶處理細胞，在初次轉染後5-8天將其塗鋪在新的MEF平板上。將1079細胞分成6份或12份，將每一份塗鋪在新的MEF平板上，同時將頂R90細胞分成3份或6份，將每一份塗鋪在新的MEF平板上。在MEF-條件化培養基中重編稈人體細胞。將1079或MR90成纖維細胞以3 X IO5個細胞/IOcm用0. 1%明膠(Millipore)預包被的培養皿上，生長過夜。使用TransIT mRNA轉染劑(MirusBio，Madison, WI)，用等量的重編程因子 mRNA (KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG,0CT4和S0X2)轉染1079或IMR90成纖維細胞。對於每一次轉染，每10-cm培養皿使用6 μ g、18 μ g 或 36 μ g 的每一種重編程 mRNA (KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4 和 S0X2)。進行總共3次轉染，每隔一天進行一次轉染，在第一次和第二次的每一次轉染後第二天改變培養基。在MEF條件化培養中進行所有轉染。在第三次轉染後第二天，用胰蛋白酶處理細胞，將3X IO5個細胞塗鋪在用0. 1%明膠(Millipore)預包被的10-cm培養皿上。將細胞在MEF條件化培養基中生長進行實驗的持續時間。也如先前部分中所描述的進行類似的日mRNA轉染，唯一的差別是不將MEF用作飼養層，僅使用MEF條件化培養基。免疫螢光。用PBS洗滌1079細胞或1079-源性iPS細胞平板，在室溫下將其在4%在PBS中的多聚甲醛中固定30分鐘。隨後用PBS洗滌iPS細胞3次，每次5分鐘，然後用PBS+0. 1% Triton X-100洗滌3次。隨後在室溫下在封閉緩衝液(PBS+0. 1% Triton,2% FBS和1% BSA)中封閉iPS細胞I小時。隨後用以I : 500稀釋於封閉緩衝液中的一抗(小鼠抗-人 0CT4 Cat# sc-5279, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、(兔抗-人 NANOG Cat #3580、兔抗-人 KLF4 Cat#4038、小鼠抗-人 LIN28 Cat#5930、兔抗-人 c-MYC Cat#5605、兔抗-人 S0X2 Cat# 3579 和小鼠抗 i-TRA-1-60，全部來自 CellSignaling Technology, Beverly, MA)在室溫下溫育細胞 2 小時。於 PBS+0. I % TritonX-100中洗滌5次後，用以I : 1000稀釋於封閉緩衝液中的抗-兔Alexa Fluor 488抗體(Cat # 4412, Cell Signaling Technology)、抗-小鼠 FITC 二抗(Cat# F5262, Sigma)或抗-小鼠 Alexa Fluor 555 (Cat# 4409, Cell Signaling Technology)溫育 iPS 細胞 2 小時。使用NIS-elements軟體(Nikon)在具有2-兆象素單色數位相機(Nikon)的NikonTS100F倒置顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)上獲取圖像。 實施例I本實施例描述了確定利用編碼KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4和S0X2的mRNA的轉染是否導致每一種各自的蛋白質產物在新生兒胎兒包皮1079成纖維細胞中表達和正確的亞細胞定位的測試。利用假尿苷_5』 -三磷酸替代尿苷_5』 -三磷酸來製備用於實驗的mRNA (Kariko等，2008)。6孔培養皿的每一個孔用4 μ g的每一種mRNA轉染1079成纖維細胞，轉染後24小時進行免疫螢光分析。內源KLF4、LIN28、NAN0G、0CT4和S0X2的蛋白水平通過未轉染的1079細胞中的免疫螢光(圖I :B、F、N、R、V)未能檢測到。c_MYC的內源水平在未轉染的1079細胞中相對較高(圖1J)。利用編碼轉錄因子KLF4、c-MYC, NANOG,0CT4和S0X2的mRNA的轉染在mRNA轉染後24小時都導致每一種蛋白質的主要細胞核定位(primarily nuclear localization)(圖 I :D、L、P、T、X)。細胞質 mRNA 結合蛋白 LIN28 被定位至細胞質(圖I :H)。實施例2由於已顯示高效mRNA轉染和正確的重編程蛋白質亞細胞定位，因此本實施例描述了用於從體細胞成纖維細胞產生iPS細胞的方案的開發。將等量(按重量計)的KLF4、LIN28、c-MYC、NANOG, 0CT4和S0X2mRNA轉染入1079成纖維細胞3次(每隔一天一次)。在第三次轉染後第二天，將細胞塗鋪在被輻射的MEF飼養細胞上並且在iPS細胞培養基中生長。將1079成纖維細胞塗鋪至被輻射的MEF上後6天，兩個假定的iPS細胞集落開始出現在用3 μ g的每一種重編程因子mRNA(KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4和S0X2)轉染的10-cm平板上。使集落生長直至最後一次轉染後12天，然後將它們固定以用於免疫螢光分析。內細胞團(inner cell mass)-特異性標誌NANOG通常用於測定iPS細胞集落是否為真實iPS集落(Gonzalez等,2009, Huangfu等,2008)。基於關於mRNA的穩定性和表達的持續時間的先前報導(Kariko等，2008)，從12天前轉染的mRNA產生的NANOG表達可忽略不計。NANOG的染色顯示這兩種iPS細胞集落都呈NANOG陽性(圖2B、圖D，和未顯示的)。不為iPS細胞集落的部分的周圍成纖維細胞呈NANOG陰性，這表明它們未被重編程為iPS細胞。
在使用相同方案進行的隨後實驗中，用相同重編程mRNA轉染1079成纖維細胞和人IMR90成纖維細胞。早至將轉染的細胞塗鋪在被輻射的MEF後4天檢測到多個集落。當將6 μ g的每一種mRNA(KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4和S0X2)在6孔培養皿中用於轉染時，後來在塗鋪在10-cm平板中的MEF上後在兩個細胞系中都檢測到3個假定的iPS細胞集落(圖3)。除了分析這些克隆的NANOG、TRA-1-60的表達外，還將完全重編程的iPS細胞的更嚴格的標誌(Chan等，2009)用於免疫螢光分析。從1079成纖維細胞(圖3A-F)和IMR90成纖維細胞(圖3G-I)產生的iPS集落對於NANOG和TRA-1-60都呈陽性，表明這些克隆為完全重編程的III型iPS細胞集落。該方案(包括編碼所有6種重編程因子的mRNA的3次轉染和隨後將其塗鋪至MEF飼養細胞上)產生相似的重編程效率(3-6個iPS集落/I X IO6個輸入細胞)，如先前通過方案(包括通過表達質粒的轉染來遞送相同的重編程因子)所報導的(Aoi等，2008)。實施例3本實施例描述了使用mRNA提高重編程分化細胞的效率的努力。在一個方法中，使
用如下方案，所述方案包括在MEF條件化培養基中而非在成纖維細胞培養基中用編碼6種重編程因子的mRNA轉染1079或MR90成纖維細胞轉染3次(每隔一天一次)，隨後在MEF條件化培養基中生長經處理的1079成纖維細胞而非在處理後將它們塗鋪在MEF飼養層上。在使用的最高轉染劑量(36 μ g的每一種重編程因子Λθ-cm培養皿)上，在最終轉染後3天檢測到208個iPS細胞集落(圖A-F)。有趣地，在3天的時間點上在用6或18 μ g的每一種重編程因子轉染的培養皿中未檢測到iPS細胞集落，這表明高於18 μ g的劑量在這些條件下對於在MEF-條件化培養基中在3天內形成iPS細胞集落是非常重要的。IMR90細胞顯示甚至更多數目的iPS細胞集落，在最終轉染後8天，在用3個6- μ g劑量的6種重編程因子mRNA的每一種轉染的平板中具有約200個集落，以及在用18- μ g或36- μ g劑量的6種重編程mRNA的每一種轉染3次的MR90細胞(圖4G-I)中具有超過1000個集落。在1079細胞中在最終轉染後3天可看到集落，然而在IMR90細胞中在最終轉染後6-7天才可看到集落。因此，來源於1079細胞的更成熟的集落與MR90集落相比較更大和更密集並且在明視野圖像中更暗(圖4)。用36 μ g的每一種重編程mRNA轉染3次的1079平板上的所有集落在最終mRNA轉染後8天對於NANOG和TRA-1-60都呈陽性(圖5A-I)。所有更成熟的IMR90 iPS集落對於NANOG和TRA-1-60也呈陽性(圖5J-0)，但因它們與更成熟的1079集落相比較不太密集的細胞性質而對於兩個標誌顯示不太強的染色(圖5A-I)。本方案(包括在EF條件化培養基中將mRNA遞送入1079或MR90細胞)具有200至超過1000多個集落/3 X IO5個輸入細胞的重編程效率。誘導iPS細胞的該方案比公開的方案(包括在成纖維細胞培養基中用編碼這6種相同重編程因子的DNA質粒轉染成纖維細胞)更快並且效率高出其幾乎2-3個數據級(Aoi等，2008)。然而，基於公開的數據重編程因子至1079新生兒成纖維細胞的慢病毒遞送導致約57個iPS細胞集落/6 X IO5個輸入細胞(Aoi等，2008)，本方案的效率為公開的方案(包括利用慢病毒遞送重編程因子)的7至40倍。本方案也比公開的方法快得多。實施例4天然存在的RNA分子展示差異的激活樹突細胞的能力材料及實驗方法質粒和試劑
分別從ATCC(Manassas, VA)和 InvivoGen(San Diego, CA)獲得質粒PT7T3D-MART-1 和 pUN0_hTLR3。 pTEVluc 獲自 Dr Daniel Gallie(UC Riverside),其包含pT7-TEV(菸草蝕紋病毒基因組RNA的前導序列)_螢光素酶-A50，並且描述於 Gallie, DR 等，1995.The tobacco etch viral 5 ' leader and poly(A)tail arefunctionally synergistic regulators of translation. Gene 165 :233)中。通過用BamHI和NotI消化除去螢火蟲螢光素酶編碼序列、進行末端充填,然後再連接從p21uc產生pSVren(Grentzmann G,Ingram JA等,A dual-luciferase reporter system for studyingrecoding signals. RNA 1998 ；4 (4) :479-86)。通過將編碼與人TLR3(nt 703-722，登錄號NM_003265)具有20_nt長的同源物的 shRNA 的合成 ODN 插入質粒 pSilencer4. 1-CMV-neo (Ambion, Austin, TX)來構建人TLR3-特異性siRNA，pTLR3-sh。通過首先將hTLR3_特異性PCR引物(nt 80-2887 ;登錄號NM_003265)克隆入 pCRII-TOPO (Invitrogen，Carlsbad, CA)，然後用 Nhe I-Hind III 切割釋放，將其亞克隆入pcDNA3. I (Invitrogen)的相應位點來獲得pCMV_hTLR3。LPS (大腸桿菌055 B5)獲自 Sigma Chemical Co, St. Louis, MO。CpG 0DN2006 和 R-848 獲自 InvivoGen0
細胞和細胞培養將人胚胎腎293細胞(ATCC)在補充有穀氨醯胺(Invitrogen)和10 %FCS (Hyclone, Ogden,UT)的DMEM(完全培養基)中進行繁殖。在本文中的所有情況下，「293細胞」是指人胚胎腎(HEK) 293細胞。通過用pUN0-hTLR3轉化293細胞來產生293_hTLR3細胞。將細胞系293-hTLR7、293-hTLR8和293-hTLR9 (InvivoGen)生長在補充有殺稻瘟菌素(10 μ G/ml) (Invivogen)的完全培養基中。如所描述的(Kariko等,2004, mRNA is anendogenous ligand for Toll-like receptor 3. J Biol Chem 279 :12542-12550)培養細胞系 293-ELAM-Iuc 和 TLR7-293 (M. Lamphier, Eisai Research Institute, Andover MA)和TLR3-293細胞。用pTLR3-sh穩定地轉染細胞系293、293_hTLR7和293_hTLR8，利用6-418(400 μ g/ml) (Invitrogen)進行選擇。篩選抗新黴素集落，只有不表達TLR3,確定為缺乏對poly (I) (C)的IL-8分泌loin反應的那些集落才被用於進一步的研究。白細胞單採術(Leukopheresis)樣品通過IRB-批准的方案獲自未感染HIV的志願者。鼠DC的產生通過從6-8周齡的C57BL/6小鼠的脛骨和股骨收集骨髓細胞，然後裂解紅細胞來產生鼠 DC。將細胞於 2ml DMEM+10% FCS 和 20ng/ml muGM-CSF(R&D Systems)中以 IO6 個細胞/孔接種在6孔平板中。在第3天，添加2ml具有muGM-CSF的新鮮培養基。在第6天，收集2ml培養基/孔，將細胞沉澱，重懸浮於具有muGM-CSF的新鮮培養基中。在培養的第7天，收穫、洗滌muDC。天然RNA使用分級分離裂解法(線粒體分離試劑盒；Pierce, Rockford, IL)從獲自University of Pennsylvania Blood Bank 的血小板分離線粒體。利用 Master IiIasIerJv(BioRad，Hercules，CA)從293細胞、未分級分離的293細胞、大鼠肝、小鼠細胞系TUBO和大腸桿菌的DH5 α株系未純化的線粒體、細胞質和細胞核級分分離RNA。牛tRNA、小麥tRNA、酵母tRNA、大腸桿菌tRNA、來自小鼠心臟的聚腺苷酸+mRNA和poly (I) : (C)購自Sigma，來自人脾和大腸桿菌RNA的總RNA購自Ambion。化學合成寡核糖核苷酸-5'- 一磷酸(Dharmacon, Lafayette, CO)。在Benzonase核酸酶( υ/5μ I的RNA(1微克/微升(μ g/ μ I))進行I小時)(Novagen, Madison, WI)存在的情況下溫育等分的RNA樣品。用鹼性磷酸酶(New EnglandBiolabs)消化RNA-730的等分。通過變性瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳分析RNA樣品以確保質量。使用Limulus Amebocyte Lysate凝膠凝固測定法對RNA製劑中的LPS的測定呈陰性，靈敏度為 3 皮克 / 毫升(pg/ml) (University of Pennsylvania, Core Facility)。HPLC 分析通過HPLC分離和顯現一磷酸核苷。為了釋放游離核苷3'-—磷酸，用O. IU的10 μ I 50mM NaOAc 和 2mM EDTA 緩衝液(pH 4. 5)中的 RNA 酶 T2 (Invitrogen)降解 5 μ g的RNA等分,進行過夜，隨後使用Waters Symmetry C18柱(Waters, Milford, MA)將樣品注射到Agilent 1100 HPLC中。在60分鐘內以ImL/分鐘的流速運行100%緩衝液A(30mMKH2PO4 和 IOmM 憐酸四乙銨[PicA reagent, Waters], pH 6. 0)至 30%緩衝液 B (乙臆)的 梯度。在254nm上使用光電二極體陣列檢測核核苷酸。通過保留時間和光譜驗證身份。樹突細胞測定用R-848、I,ipofectiTi⑩或Lipofec如⑩-RNA處理96孔平板中的樹突細胞(大約
I.I XlO5個細胞/孔)1小時，然後改變培養基。在8小時(除非另外指出)結束時，收穫細胞以進行RNA分離或流式細胞術，同時將收集的培養基經歷細胞因子ELISA。利用夾心ELISA測量上清液中的 IL-12 (p70) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)、IFN-α、TNF-α 和 IL-8 (Biosource International, Camarillo, CA)的水平。以一式三份或一式四份進行培養，以一式兩份進行測量。Northern 印跡分析在如上所述處理後8小時溫育後，從MDDC分離RNA。應注意，在刺激前30分鐘和貫穿整個溫育期間用2. 5 μ g/ml環己醯亞胺(Sigma)處理細胞。處理RNA樣品，如所描述的(Kariko等，2004，ibid)使用來源於獲自ATCC的質粒(分別地pE4和pHcGAP)的人TNF- α和GAPDH探針在Northern印跡上分析所述樣品。為了測定不同細胞RNA亞型的免疫刺激潛能，從不同的亞細胞組分-即細胞質、細胞核和線粒體分離RNA。將這些RNA級分以及總RNA、tRNA和聚腺苷酸尾選擇的mRNA (全部來自哺乳動物來源)與i.ipoi'cchni複合並且被添加至MDDC。然而哺乳動物的總RNA、細胞核RNA和細胞質RNA都刺激MDDC，如通過可檢測的TNF-α分泌證明的，TNF-α水平遠低於通過體外合成的mRNA誘導的水平(圖6)。此外，哺乳動物tRNA不誘導任何可檢測水平的TNF-α，然而線粒體(mt)RNA誘導比其它哺乳動物RNA亞型多得多的TNF-α。細菌總RNA也是MDDC的強有力激活劑；相比之下，細菌tRNA僅誘導低水平的TNF-α。來自其它來源(酵母、小麥胚、牛)的tRNA是非刺激性的。當測試來自其它哺乳動物來源的RNA時觀察到相似結果。當用Benzonase (其切割ssRNA和dsRNA)消化RNA樣品時，MDDC中的RNA信號轉導被消除，從而驗證了 TNF-α分泌歸因於製劑中的RNA。測試的RNA類型的激活潛能與核苷酸修飾的程度呈反相關。在本實施例中描述的實驗中對於兩種類型的產生細胞因子的DC獲得相似的結果。這些發現證明RNA的免疫原性受核苷修飾的程度影響，更大程度的修飾傾向於減小免疫原性。實施例5具有經修飾的核苷的RNA分子的體外合成材料和實驗方法體外轉錄的RNA通過使用體外轉錄測定法(MessageMachine和MegaScript試劑盒；Ambion),如所描述的(Kariko 等，1998, Phosphate-enhanced transfection of cationiclipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta 1369,320-334)利用T7RNA聚合酶(RNAP)產生下列長RNA(注意模板的名稱示於括號中；RNA名稱中的數字指定長度)RNA-1866 (Nde I-線性化pTEVluc)編碼螢火蟲螢光素酶和50nt_長的聚腺苷酸尾。RNA-1571(Ssp I-線性化pSVren)編碼海腎螢光素酶。RNA-730 (Hind III-線性化PT7T3D-MART-1)編碼人黑色瘤抗原 MART-I。RNA_713(EcoR I-線性化 pTIT3D_MART_l)相應於MART-I的反義序列，RNA497 (Bgl II-線性化pCMV_hTLR3)編碼hTLR3的部分5'片段。RNA分子的序列如下·
權利要求
1.一種用於將展示第一分化狀態或表型的人或動物細胞重編程為展示第二分化狀態或表型的細胞的方法，包括將包含編碼至少一種重編程因子的經修飾的mRNA分子的純化的RNA製劑引入展示第一分化狀態的細胞，以及在其中所述細胞展示第二分化狀態的條件下培養所述細胞。
2.權利要求I所述的方法，其中所述經修飾的mRNA分子包含至少一種經修飾的核苷替代至少一部分相應的未修飾的典型核苷，所述經修飾的核苷選自假尿苷(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5_甲基尿苷(m5U)、2' -O-甲基尿苷(Um或m2』_°U)、2_硫尿苷(S2U)和N6-甲基腺苷(m6A)。
3.權利要求2所述的方法，其中存在所述至少一種經修飾的核苷替代大體上所有相應的未修飾的典型核苷。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述純化的RNA製劑 i)包含至少一種編碼iPS細胞誘導因子的單鏈mRNA，其中大體上所有所述第一單鏈mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，和 )大體上不含能夠激活所述體細胞中的RNA傳感器的RNA汙染分子。
5.權利要求4所述的方法，其中所述RNA汙染分子選自僅編碼一部分所述重編程因子的部分mRNA、比全長mRNA短的RNA分子、比全長mRNA長的RNA分子、雙鏈mRNA分子和未加帽的mRNA分子。
6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中展示第二分化狀態的所述細胞為iPS細胞或去分化細胞。
7.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中展示第二分化狀態的所述細胞為iPS細胞或轉分化細胞。
8.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中展示第二分化狀態的所述重編程細胞為再分化細胞。
9.權利要求1-8中任一項所述的方法，其中編碼至少一種重編程因子的所述經修飾的mRNA 分子選自 KLF4、LIN28、c_MYC、NANOG, 0CT4 和 S0X2。
10.權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述方法還包括將展示第一分化狀態或表型的所述細胞與至少一種生長因子和/或細胞因子接觸。
11.權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述經修飾的mRNA中的所有尿苷核苷被假尿苷核苷替代。
12.權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述經修飾的mRNA中的所有胞苷核苷被5-甲基胞苷核苷替代。
13.權利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述純化的RNA製劑不含一定量的RNA汙染分子，所述一定量的RNA汙染分子將在展示第一分化狀態的所述細胞中激活免疫反應以阻止展示第二分化狀態的所述細胞在培養中存活至少10天。
14.權利要求1-13中任一項所述的方法，其中展示第二分化狀態的所述細胞能夠形成細胞系。
15.權利要求14所述的方法，其中所述去分化細胞表達NANOG和TRA-1-60。
16.一種包含純化的RNA製劑的組合物，其中所述純化的RNA製劑 i)包含編碼至少一種重編程因子的單鏈mRNA分子，其中所述單鏈mRNA分子包含至少一個選自假尿苷(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5_甲基尿苷(m5U)、2' -O-甲基尿苷(Um或m2』_°U)、2-硫尿苷(S2U)和N6-甲基腺苷(m6A)的核苷，和 )大體上不含能夠激活人或動物細胞中的RNA傳感器的RNA汙染分子。
17.權利要求16所述的組合物，其中所述純化的RNA製劑包含編碼選自KLF4、LIN28、c-MYC, NANOG, 0CT4和S0X2的至少一種重編程因子的單鏈mRNA分子。
18.一種用於誘導細胞產生MYC蛋白的方法，包括將細胞與體外合成的編碼MYC基因的mRNA接觸，其中所述體外合成的mRNA包含至少一個假尿苷殘基和/或至少一個5-甲基胞苷殘基，從而誘導哺乳動物細胞產生所述MYC蛋白。
全文摘要
本發明提供了使用包含編碼iPS細胞誘導因子的單鏈mRNA的純化的RNA製劑重編程體細胞的組合物和方法。純化的RNA製劑優選大體上不含RNA汙染分子，所述RNA汙染分子i)可激活體細胞的免疫反應，ii)減少體細胞中單鏈mRNA的表達，和/或iii)激活體細胞中的RNA傳感器。在某些實施方案中，純化的RNA製劑大體上不含部分mRNA、雙鏈RNA、未加帽的RNA分子和/或單鏈連綴mRNA。
文檔編號C12N5/071GK102947450SQ201080063294
公開日2013年2月27日 申請日期2010年12月7日 優先權日2009年12月7日
發明者凱塔林·卡裡科, 德魯·韋斯曼, 加裡·達爾, 安東尼·珀森, 朱迪思·邁斯, 傑羅姆·詹德裡薩克 申請人:賓夕法尼亞州大學信託人