siRNA及其在用於抑制ORAI1基因表達的方法和組合物中的應用與流程
2023-12-09 09:22:06 6
發明領域
本發明涉及這樣的領域：sirna產品及其在用於治療和/或預防眼病的方法和組合物中的用途，所述方法和組合物更具體地用於治療和/或預防諸如結膜炎和/或眼睛變態反應的眼病，所述眼病與高水平的orai1表達和或活性相關。
發明背景
rna幹擾(rnai)是存在於大多數真核細胞中的天然存在的轉錄後調控機制，其使用小雙鏈rna(dsrna)分子以指引依賴於同源性的基因沉默。fire和mello在蠕蟲線蟲(c.elegans)中的該發現{fire，1998}獲得了2006年的諾貝爾獎。在對其首次描述後不久，也顯示rnai發生在哺乳動物細胞中，不是通過長的dsrnas而是通過21個核苷酸長的雙鏈小幹擾rna(sirnas)進行{elbashir，2001}。
據信rna幹擾的過程是在進化上保守的細胞防禦機制，用於防止外源基因的表達，並且為不同門(phyla)和區系(flora)所共有，其中它被稱為轉錄後基因沉默。自從發現rnai機制，已經進行了大量研究，用於發現能夠選擇性地改變基因表達的新的化合物，其通過處理這樣的靶標而作為治療人類疾病的新途徑，所述靶標是利用涉及小分子或蛋白質的常規藥物方法「不能用藥」的。
根據現有知識，rnai的機制始於由稱為切酶(dicer)的rna酶iii樣蛋白質處理長的雙鏈rnas之時。蛋白質切酶通常包含n端rna解旋酶結構域，結合rna的所謂piwi/argonaute/zwille(paz)結構域，兩個rna酶iii結構域和雙鏈rna結合結構域(dsrbd){collins，2005}，並且它的活性導致長的雙鏈rnas被加工為21-24個核苷酸的雙鏈sirnas，該雙鏈sirnas具有2個鹼基的3'突出端和5'磷酸和3'羥基。所得的sirna雙鏈體然後結合到稱為rna誘導的沉默複合物(risc)的效應物複合物 中，其中在雙鏈sirna分子通過rna解旋酶活性的三磷酸腺苷(atp)依賴性解旋時{nykanen，2001}，sirna的反義或導引鏈指導risc識別並切割目標mrna序列{elbashir，2001}。導致mrna降解的risc的催化活性由核酸內切酶argonaute2(ago2)介導{liu，2004；song，2004}。ago2屬於高度保守的argonaute蛋白質家族。argonaute蛋白質是～100kda的高鹼性蛋白質，其包含兩個共同的結構域，即piwi和paz結構域{cerutti，2000}。piwi結構域對於與切酶的相互作用是關鍵的，並且包含負責切割mrnas的核酸酶活性{song，2004}。ago2使用sirna雙鏈體中的一條鏈作為指導去找到含互補序列的信使rnas並在相對於指導鏈的5'端的第10和第11個鹼基之間切割磷酸二酯骨架{elbashir，2001}。risc活化期間的一個重要步驟是由ago2切割正義或信使鏈，將此鏈從複合物中去除{rand，2005}。分析sirna指導鏈和piwi結構域之間相互作用的晶體學研究表明僅第2至第8個核苷酸構成指導risc識別目標mrna的「種子序列(seedsequence)」，並且此序列中單個核苷酸的錯匹配可以顯著影響所述分子的沉默能力{ma，2005；doench2004；lewis，2003}。一旦mrna已經被切割，由於片段中不受保護的rna末端的出現，mrna被細胞內的核酸酶進一步切割和降解，並且將不再被翻譯為蛋白質{orban，2005}，同時risc將再循環用於隨後的若干輪{hutvagner，2002}。這構成了導致特定mrna分子及相應的蛋白質的選擇性減少的催化過程。可能利用基因沉默的這種天然機制從而通過直接將sirna效應物遞送到細胞或組織中來調控任何所選的基因，在所述細胞或組織中它們將活化risc並且產生被靶向的mrna的有效且特異性的沉默。rnai已經用於生物醫學研究，諸如hiv、病毒性肝炎、心血管病和腦血管病、代謝病、神經變性病症和癌症的治療{angajisa等2010}。
已經發表了許多研究，其描述了為獲得最大有效性sirna應當具有的理想特徵，即，有關長度、結構、化學組成和序列。sirna設計的初始參數由tuschl及同事在wo02/44321中闡述，但是自此之後已經發表了許多後續研究、算法和/或改進。隨著機制詳細信息的出現，sirna選擇方法已經變得更加精細，除此之外，對現有和新的數據進一步分析可以提供關於進一步精細這些方法的另外的了解{waltonsp等2010}。備選地，一 些最近的研究報導了新型rnai-引發結構的設計與分析與經典的19+2sirna結構不同，並且其在突出端、長度或對稱性方面不符合經典sirna的關鍵特徵，這討論了rnai機制在哺乳動物細胞中的靈活性{changci等2011}。
此外，已經投入了大量努力來增強sirna的穩定性，原因在於，考慮到rna酶在生物流體中的普遍存在的性質，這被認為是基於sirna的治療的主要障礙之一。sirna分子的另一個固有的問題是其免疫原性，由此已發現sirnas誘導先天性免疫系統的非特異性的激活。非目標基因(mrnas)的敲減是sirna-介導的基因沉默的公知的副作用。其由於sirna與不同於目的靶標的mrnas之間的部分互補性引起，並且由與任一sirna鏈具有序列互補性的基因引起脫靶效應(otes)。用於穩定性增強和ote減少所遵循的主要策略之一是使用修飾的核苷酸，如2』-o-甲基核苷酸，2』-氨基核苷酸，或含有2』-o或4』-c亞甲基鍵的核苷酸。此外，已經描述了對連接相鄰的核苷酸的核糖核苷酸骨架的修飾，即，主要通過引入硫代磷酸酯修飾的核苷酸進行。似乎增強的穩定性和/或免疫原性降低通常與功效成反比{parrish,2000}，並且僅有特定數量的、位置和/或修飾的核苷酸的組合才能導致穩定的且無免疫原性的沉默化合物。由於這是基於sirna的治療的主要障礙，所以已經公開了不同的研究，其描述了表現出良好的結果的特定的修飾模式，這些的實例包括ep1527176,wo2008/050329,wo2008/104978或wo2009/044392，儘管在參考文獻中可以找到許多更多實例{sanghviys.2011；deleavey等2012}。
變應性疾病的特徵在於人免疫系統對食用、吸入肺中、注射或接觸到的外源蛋白質物質(「變應原」)的過度反應。變態反應(allergy)具有遺傳成分。如果父母親中僅有一方具有任意類型的變態反應，那麼，每個孩子將具有變態反應的機會是1/3。如果父母雙方都具有變態反應，那麼他們的孩子具有變態反應的可能性要大得多(7/10)。對於變態反應無法治癒；然而，可以用正確的預防和治療來管理它們。
全世界大約有30％的人患有變態反應症狀，並且他們中有40-80％具有眼部症狀{keyb.2001}。影響眼睛的變應性疾病或眼睛變態反應組成異質(heterogenic)疾病組，其具有非常廣譜的臨床表現。眼睛變態反應通常 在結膜(覆蓋眼睛的膜和眼瞼的內層)與變應原反應時發生。眼睛變態反應可以獨立發生或與其他變態反應症狀(諸如鼻炎或哮喘)聯合發生。
基本和臨床研究已經提供了對細胞、介質和眼睛變態反應中發生的免疫學事件的更好的理解。眼睛，特別是結膜，具有相對多數量的肥大細胞。當存在變應原時，它們可以以在這些肥大細胞表面上的fcεri受體結合免疫球蛋白ige，並且引發它們的激活和變態反應介質的釋放(稱為脫粒化(degranulation)的過程)。脫粒化將肥大細胞成分(包括組胺，前列腺素，類胰蛋白酶和白三烯)釋放到肥大細胞外的環境中。通過多種機制，這些成分產生眼睛變態反應的跡象和症狀。變應性炎症的肥大細胞的激活通常稱為眼睛變態反應的急性期反應或早期。急性期反應可以進展為晚期反應，其特徵在於將炎症細胞招募到變應性炎症部位，例如，作為進入結膜的嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞流入。
眼睛變態反應代表變態反應學家和眼科醫師遇到的最常見的病況之一。眼睛變態反應通常與下述症狀和跡象相關：結膜炎(conjunctivitis)，眼瞼炎(blepharitis)，瞼緣結膜炎(blepharoconjunctivitis)或角膜結膜炎(keratoconjunctivitis)。眼睛變紅，發癢，並且存在流淚和輕微的分泌物(slightdischarge)。嚴重的病例還可能表現為眼睛燒灼感、疼痛和畏光。
影響眼睛的變應性疾病包括輕微形式，諸如季節性變應性結膜炎(seasonalallergicconjunctivitis，sac)和常年性變應性結膜炎(perennialallergicconjunctivitis，pac)；以及更嚴重的表現，諸如春季角膜結膜炎(vernalkeratoconjunctivitis，vkc)；特應性角膜結膜炎(atopickeratoconjunctivitis，akc)和巨乳頭狀結膜炎(giantpapillaryconjunctivitis，gpc)。後者可以與諸如角膜損傷的併發症相關，並且可以引起視力喪失。sac和pac是常見的ige-肥大細胞介導的針對外源變應原的超敏性反應；而akc和vkc特徵在於涉及數種免疫細胞類型的慢性炎症。sac和pac變應原在抗原呈遞細胞(apcs)的幫助下引發th2-主導性免疫應答(th2-predominantimmuneresponse)，其誘導b細胞釋放ige。變態反應應答的激活通常涉及肥大細胞的浸潤和脫粒化。
sac是最常見的眼睛變應性疾病，通常由如空氣傳播的花粉、粉塵和動物毛屑引起。跡象和症狀通常在春季和夏季發生，並且通常在冬季月 份減輕。結膜發癢、發紅和腫脹是最特徵性的症狀，還有流淚、燒灼感和畏光。在大部分情形中，sac不嚴重。然而，由於其可以影響患者的生活質量，並且可能具有嚴重的社會經濟影響，其對於患者其可能是非常煩擾的{kario.和saarikm2010}。
pac是第二常見的眼睛變應性疾病，通常由動物和蟎蟲引起。症狀和跡象與sac在很大程度是相同的，不同在於患者變態反應的特定變應原和pac可以一年到頭地發生，暴露於常年性的變應原。pac影響所有年齡組，但是主要是兩種性別的年輕人和中年人。另外，pac通常與乾眼症候群聯繫在一起。
sac和pac是最常見形式的眼睛變態反應。估計值變化，但是據說這些類型的變態反應影響總人口的至少15-20％。sac和pac通常被漏診，並且因此未被治療。在sac和pac中，變應原誘導的ige局部釋放以ca2+依賴性機制促進肥大細胞的脫粒化。ige-激活的肥大細胞釋放預先形成的炎性介質，諸如組胺和白三烯4，它們是變應性反應的最先的介質。這些介質吸引浸潤到區域的嗜酸性粒細胞，擴大了變應性反應。
vkc是相對罕見的眼睛表面的慢性變應性炎症，其主要影響兒童和青少年。主要的症狀是發癢、發紅、腫脹、流淚和畏光。最有特徵性的跡象是上瞼板部結膜中的巨乳頭。
akc是眼睛表面和眼瞼的雙側慢性炎症疾病。最有特徵的跡象是眼瞼上的溼疹性損傷，其是發癢的。對於akc患者常見的是在幼小的年紀進行白內障手術{kario.和saarikm2010}。
gpc是以上瞼板部結膜的乳頭狀肥大為特徵的炎性疾病。gpc由惰性物質而不是變應原引起。當去除這些刺激性的刺激物時，結膜乳頭變化消退。在隱形眼鏡表面上的蛋白沉積可能變成變應性的，並且刺激ige產生{larosam.等2013}。
目前用於眼睛變態反應的治療包括非藥理學和藥理學策略。避免抗原是用於所有類型的眼睛變態反應的主要行為修正。人工淚液替代品提供屏障功能，並且幫助改善在結膜黏膜水平上的第一線防禦。當非藥理學策略不能提供充分的症狀緩解時，可以使用藥理學治療。
管理眼睛變態反應的主要依靠包括使用抗變態反應治療劑，諸如抗組 胺，雙重作用或聯合治療以及肥大細胞穩定劑。局部用的抗組胺(諸如依美斯汀(emedastine)和左卡巴斯汀(levocabastine))競爭性且可逆地阻斷組胺受體，並且緩解發癢和發紅，但是僅是短時間的。抗組胺不影響其他的促炎症介質，它們保持被抑制。有限的作用持續時間使得必須頻繁給藥，並且局部用抗組胺對眼睛可能是刺激性的，尤其是長期使用時。
使用解充血藥(諸如羥甲唑啉(oxymetazoline)，四氫唑啉(tetrahydrozoline)和萘甲唑啉(naphazonline))聯合抗組胺的聯合治療作為血管收縮藥起作用，但是已知在滴注時是刺痛或燒灼的。其他不利事件包括瞳孔擴大和反彈的充血，使得這些聯合治療更適合短期緩解。另外，這些藥物不被推薦用於患有狹角性青光眼(narrow-angleglaucoma)的患者。肥大細胞穩定劑(諸如色甘酸鹽(cromoglycate)，洛度沙胺(lodoxamide)，奈多羅米(nedocromil))具有尚不清楚的作用機制。它們不緩解現有的症狀，並且僅可以基於預防基礎使用，以預防肥大細胞在後續暴露於變應原時脫粒化。它們需要一個裝載期(loadingperiod)，在該期間，它們必須在抗原暴露之前使用{larosam.等2013}。
當上文提及的抗變態反應藥物不允許對變應性炎症過程的充分控制時，使用抗炎症藥劑。皮質類固醇是用於眼睛變態反應的更嚴重的變型的最有效的藥劑之一{larosam.等2013}。然而，甾體藥物可能具有威脅患者的整體健康的副作用。長期施用皮質類固醇可能通過抑制腸鈣吸收和抑制骨形成而導致藥物誘導的骨質疏鬆症(osteoporosis)。由於這些藥物對身體代謝過程的影響，長期施用皮質類固醇的其他不利副作用包括高血壓(hypertension)，高血糖(hyperglycemia)，高脂血(hyperlipidemia)(增加水平的甘油三酯)和高膽固醇血症(hypercholesterolemia)(增加水平的膽固醇)。還已知某些皮質類固醇具有比該種類的其他化合物更大的升高眼內壓("iop")的潛力。例如，已知潑尼松龍(prednisolone)(其是一種非常有效的眼睛抗炎劑)具有比氟米龍(fluorometholone)(其具有中等眼睛抗炎活性)更大的升高iop的趨勢。還已知與皮質類固醇的局部眼科應用相關的iop升高的危險隨時間增加。換言之，這些藥劑的長期使用(即，長時間的)增加顯著的iop升高的危險。因此，皮質類固醇可能不適合用於長期的眼睛變態反應治療。另外，由於增加的發展白內障和青光眼的危 險，長期使用皮質類固醇是禁忌的{onosj，和abelsonmb，2005}。
變態反應的免疫療法可用於減少針對變應原的反應，但是其在變應性結膜炎中的作用還未得到證實。這種治療的主要目的是誘導針對特定變應原的臨床耐受性。該療法以遞增的劑量皮下施用，以保持低於臨床反應的閾值。認為舌下免疫療法(slit)是皮下變態反應免疫療法的備選方案，並且在舌下口服，但是使用slit的長期結果還沒有獲得。使用這種形式的療法的大部分試驗是用於變應性鼻炎(allergicrhinitis)。通常，針對變應原施用的免疫反應不能預測療法的功效，並且療法本身可以產生系統性反應，其發生率和嚴重性取決於施用的變應原的類型而不同{larosam.等2013}。
另外，大部分較新的眼科抗變態反應藥劑具有有限的作用持續時間，並且需要每天兩次給藥。由於具有更久的作用持續時間的局部用製劑可以每天滴注一次，因此，其將是有利的。因此，需要新的療法，所述療法可以在諸如功效和作用持續時間方面提供益處，同時提供與傳統眼科抗變態反應劑相似的安全模式。
已經指出基於rna幹擾的療法具有滿足變態反應治療中未滿足的需求的潛力{popescufd.2005}。已經證明，在用變應原致敏的小鼠中系統施用cd40sirna能夠通過抑制樹突細胞和b細胞功能並且產生調控t細胞而減輕鼻變態反應症狀{suzukim.等2009}。另外，通過使用cd40-沉默的和變應原刺激的(allergen-pulsed)樹突細胞還開發了用於變應性鼻炎的基於sirna的變應原特異性療法{suzukim等2010}。
細胞中細胞內游離鈣(ca2+)濃度的變化調節多種生物學細胞功能。ca2+信號通過內質網(er)的受控的ca2+釋放產生，內質網是細胞中主要的鈣儲庫。鈣從er的釋放激活質膜上儲庫-操縱的ca2+(soc)通道，引發胞外鈣流入細胞質的儲庫-操縱的ca2+進入(soce)。最近的研究強調了該ca2+進入機制在多種病理生理學過程(包括變態反應)中的重要性{bergmeierw等2013}。
soce響應erca2+池的消耗而激活。soce的激活誘導ca2+從胞外區室進入，並且這受儲庫-操縱的ca2+釋放-激活的ca2+(crac)通道介導{hothm.等1992}。
crac通道由稱為stim(間質相互作用分子)的鈣感應蛋白和命名為orai的孔形成亞基構成。哺乳動物細胞具有三個orai同種型：orai1，orai2和orai3；儘管orai2和orai3實現與orai1相同的作用，但是由這些蛋白產生的ca2+流比由orai1產生的小約兩倍至三倍{smythj.t.等2006}。
orai1是廣泛表達的33kda的質膜蛋白，具有4個跨膜結構域，該蛋白在鈣儲庫消耗時被鈣感應器間質相互作用分子1(stim1)激活，並且誘導胞外的鈣經由crac通道流入細胞質。orai1也稱為crac介質1，cracm1，orat1，跨膜蛋白142a，tmem142a，或crac通道蛋白1。orai1已被定義為crac通道的關鍵亞基{wangy.等2012}。
越來越多的證據證明，變應性反應中免疫細胞的短期和長期激活是由ca2+從胞外區室向免疫細胞的流動介導的。短期反應包括肥大細胞的脫粒化和效應溶細胞性t細胞的激活。事實上，缺少stim1或orai1的肥大細胞表現出相當大的脫粒化缺陷{vigm.等2008；babay.等2008}。長期反應包括對控制b和t細胞增殖和分化的基因表達的調控{parekha.b.等2005}。
還提示orai1在小鼠肥大細胞效應子功能中是至關重要的。來源於orai1-缺失小鼠的肥大細胞表現出非常不足的脫粒化，並且誘導ige介導的體內被動過敏性反應也依賴於orai1。{vigm,等2008}。
已經在變應性鼻炎中研究通過rnai敲減orai1。施用到ova-致敏的小鼠鼻孔中的編碼針對orai1的shrna(短髮夾rna)的重組慢病毒載體減輕變應性鼻炎症狀(打噴嚏次數和擦鼻子(nasalrubbings)次數){wang等2012}。鼻炎由因堵塞或充血導致的鼻刺激性或炎症產生。變應性鼻炎是與數種類型的免疫細胞的高反應性相關的上呼吸道變應性炎症{wang等2012}。然而，並不是所有的鼻炎病例都是由變態反應引起。鼻炎也由對化學暴露的反應而產生，包括吸菸、溫度變化、感染和其他因素。
另一個研究用sirna敲減orai1，以減少組胺介導的cox-2表達和nfkb激活，這表明orai-介導的nfkb激活是負責傳遞組胺信號的重要信號傳導途徑，所述組胺信號在變應性應答中引發炎性反應{huangwc等2011}。
因此，可能的是，眼睛變態反應中炎性反應中的一個重要部分由orai1激活介導。
存在關於涉及敲減orai1用來治療變態反應的sirna的專利文件。wo2010/099401(lelandstanfordjunioruniversity信託委員會)描述了調節細胞內crac通道活性的方法，其中crac通道與胺基酸殘基stim1結構域接觸，所述stim1結構域結合orai1並且打開crac通道。其中列出了可治療的病況：免疫系統的變態反應或超敏性，包括延遲類型的超敏性和哮喘。在說明書中，其表明，sirna可能用於破壞內源基因的表達，從而確定該內源基因是否具有調節stim與orai蛋白之間的相互作用的作用。
wo2007/121186(thequeen′smedicalcenter(女王醫學中心))描述了在人胚腎細胞(hek293)中sirna-介導的人cracm1(orai1)沉默。其還表明，通過與cracm1(orai1)蛋白相互作用或破壞cracm1(orai1)表達而調節crac通道活性的試劑可以用於調節變態反應。
wo2009/095719(isisinnovationlimited)描述了用於治療與肥大細胞激活相關的病症的方法、應用和產品，包括抑制cracm1(orai1)蛋白的藥劑(其可以是sirnas)和抑制肥大細胞的白三烯激活的藥劑的組合，用於治療變應性病症，特別是變應性鼻炎。
us2011/0112058(incozentherapeuticspvt.ltd.)描述了用於鑑定用於治療肺癌的候選藥劑的方法，所述藥劑優選地抑制cracm1/orai1。該文件還描述了使用sirna來調節crac/stim途徑。其還表明crac通道調節劑已被認為可用於治療、預防和/或減輕與鈣釋放-激活的鈣通道相關的疾病或病症，包括變應性鼻炎和變應性結膜炎。
us2012/0264231(hoganpatrick等)描述了用於鑑定用於治療與鈣信號傳導的失調相關的病況和疾病的試劑的方法和系統，所述試劑可以是sirna，其調節通過orai通道的鈣流和/或調節經過orai通道的胞內鈣，所述病況和疾病包括變應性鼻炎或變應性結膜炎。
眼睛變態反應中，炎性反應的一個重要部分由orai1調節，不僅是炎性反應的關鍵決定因素，而且其也與細胞增殖和細胞遷移相關。在視網膜色素上皮(rpe)細胞中通過sirna抑制orai1表明orai1參與表皮生 長因子(egf)-介導的細胞生長。該研究猜想orai1可能是旨在治療egf-相關的病症(諸如增生性玻璃體視網膜病變(proliferativevitreoretinopathy，pvr))的藥物的潛在治療靶標{yang等2013}。pvr是作為孔源性視網膜脫離(rhegmatogenousretinaldetachment)的併發症發展的一種疾病，在該過程中，來自玻璃體液的流體進入視網膜裂孔。還沒有充分理解形成視網膜裂孔或淚液的機制。流體在視網膜下間隙中的積聚和視網膜上玻璃體的牽引力導致孔源性視網膜脫離。在該過程中，視網膜細胞層與玻璃體細胞因子接觸，所述玻璃體細胞因子引發rpe增生的能力，並且遷移正在進行的上皮-間質轉換(emt)，發展遷移出來進入玻璃體的能力。在該過程中，失去rpe細胞層-神經視網膜粘附和rpe-ecm(胞外機制)粘附。在它們遷移時，rpe細胞放棄纖維膜，並且這些膜收縮且在視網膜上牽拉。所有這些最終導致在原發性視網膜脫離手術後的繼發性視網膜脫離。
發明概述
本發明提供用於減少orai1表達並且因此減輕眼睛變態反應中的眼睛炎症的改善的產品。相對於傳統抗變態反應治療劑和變態反應免疫治療藥，使用sirna產品治療眼睛變態反應的優點在於基於sirna的治療將具有持續更久的效果。該結果是由於這樣的事實導致的：一旦不再存在效應分子，則細胞將必須從頭合成新的受體；而傳統的治療將使得細胞膜上的受體水平不受影響。
在世界範圍內，眼睛變態反應似乎增多。特別是在工業化國家中，普遍認為環境汙染是變應性個體增加的敏感性的主要貢獻因素。除了惡化的排放汙染，研究還指出空氣傳播的變態反應原的全球增加。還有另一個考慮是較貧窮國家的居民不太可能為眼睛變態反應尋求治療，這是可能使不發達國家中報告的疾病發病率人為保持較低的因素。
美國哮喘和變態反應基金會(asthmaandallergyfoundationinamerica，aafa)指出美國每年的變態反應花費估計為將近145億美元。他們估計5000萬美國人患有所有類型的變態反應(5名美國人中有1人)，包括室內/室外、食品和藥物、膠乳、昆蟲、皮膚和眼睛變態反應。自從20世紀八十年代早期以來，美國變態反應流行性整體上增加，貫穿了所 有年齡、性別和種族。
儘管具有地理獨特性，但是來自全世界的醫師發現了他們用於選擇適當的治療療程的標準的共同基礎。按照來自數個國家的專家說法，這些標準包括功效、安全性和給藥的便利性以及對患者施用的舒適性。因此，隨著全世界抱怨各種眼睛變態反應症狀的患者人數的增加，發現最佳的治療每天都是更加複雜且更加有趣的。
附圖描述
圖1:顯示選擇作為本發明的sirnas的靶序列的靶基因序列orai1的短片段。
圖2:顯示用於靶向本發明包括的orai1的本發明的sirna分子的寡核苷酸序列。該附圖中提供的seqidnos是指有義(5』->3』)鏈；典型地，sirnas作為dsrnas施用，因此將包括有義鏈及其互補反義鏈二者。seqidno.112-seqidno.222是分別靶向seqidno.1-seqidno.111的sirnas。通常，sirna包含有義鏈和反義鏈，並且還可以包含3』二核苷酸突出端(例如，dtdt)。然而，這不是必需的。
圖3:修飾的靶向orai1的sirnas。給出的seqidnos是指該修飾的orai1sirnas的有義(5』->3』)鏈。
圖4:在不同細胞系(人a204，鼠c2c12和鼠j744a,1)中轉染seqidno.112後的體外orai1表達水平。
圖5:在鼠c2c12細胞系中轉染靶向orai1的sirnas後的體外orai1表達水平。
圖6:在不同細胞系(人a204和鼠c2c12)中轉染seqidno.112後，不同細胞系的體外毒性水平。
圖7:在人a204細胞中轉染seqidno.112及其修飾的對應體seqidno.223，seqidno.224，seqidno.225，seqidno.226，seqidno.227，seqidno.228和seqidno.229後的體外人orai1表達水平。
圖8:在鼠c2c12細胞中轉染seqidno.112及其修飾的對應體seqidno.223，seqidno.224，seqidno.225，seqidno.226， seqidno.227，seqidno.228和seqidno.229後的體外鼠orai1表達水平。
圖9:顯示人細胞中seqidno.112(syl116011)和seqidno.227(syl116011v8)的劑量響應。用增加劑量(0.001-100nm)的seqidno.112(syl116011)和seqidno.227(syl116011v8)轉染人a204細胞並且定量sirna作用機制的％orai1基因表達結果。
圖10:顯示在鼠細胞中seqidno.112(syl116011)和seqidno.227(syl116011v8)的劑量響應。用增加劑量(0.001-100nm)的seqidno.112(syl116011)和seqidno.227(syl116011v8)轉染鼠c2c12細胞並且定量sirna作用機制的％orai1基因表達結果。
圖11:顯示人細胞中轉染seqidno.112(syl116011)和seqidno.227(syl116011v8)後的orai1及其旁系同源物(paralogues)orai2和orai3的表達。在人a204細胞中轉染seqidno.112和seqidno.227，並且定量sirna作用機制的％orai1、orai2和orai3基因表達結果。
圖12:顯示在鼠細胞中轉染seqidno.112(syl116011)和seqidno.227(syl116011v8)後的orai1及其旁系同源物orai2和orai3的表達。在鼠c2c12細胞中轉染seqidno.112和seqidno.227，並且定量sirna作用機制的％orai1、orai2和orai3基因表達結果。
圖13:顯示在人細胞中轉染seqidno.112(syl116011)後的推定的otes的表達。在人a204細胞中轉染seqidno.112，並且定量sirna作用機制的％orai1、msln和olfm12a基因表達結果。
圖14:顯示在大鼠細胞系中轉染seqidno.112(syl116011)後的orai1表達水平。在大鼠c6細胞中轉染seqidno.112，並且定量sirna作用機制的％orai1基因表達結果。
圖15:顯示在大鼠細胞系中轉染seqidno.112(syl116011)後的orai1表達水平。在大鼠jtc-19細胞中轉染seqidno.112，並且定量sirna作用機制的％orai1基因表達結果。
圖16:顯示在人、鼠和大鼠細胞中轉染seqidno.112(syl116011)、seqidno.233(syl116011v11)和seqidno.235 (syl116011v11)後的orai1基因表達水平。
圖17:體內測定的時間表。
圖18:在誘導眼睛變態反應後在不同時間，小鼠整個眼睛中的orai1mrna水平。na：沒有變態反應。
圖19:在豚草-花粉誘導的變態反應小鼠模型中的tlsp和tnfrsf9mrna水平。mrna水平表示為誘導變態反應之前觀察到的水平的百分數。
圖20:指示眼睛變態反應的眼睛臨床跡象。在誘導眼睛變態反應後1，3，6和24小時，觀察小鼠。通過以等級0-3分級下述參數來評估臨床跡象：結膜水腫和充血(conjunctivalchemosisandinjection)，充血(hyperemia)，眼瞼水腫(lidedema)，分泌物和流淚。數據表示為在pbs處理組誘導變態反應後1小時的臨床評分的百分數，並且表示pbs處理組8隻動物的平均值±s.e.m和seqidno.112(syl116011)處理組15隻動物的平均值±s.e.m。
圖21:在豚草-花粉誘導的變態反應小鼠模型中，響應不同劑量的seqidno.112(syl116011)的結膜水腫和流淚。在誘導眼睛變態反應後1，3，6和24小時觀察小鼠。a)結膜水腫和b)流淚以等級0-3評分。數據表示為在pbs處理組誘導變態反應後1小時的評分的百分數，並且表示pbs處理組8隻動物的平均值±s.e.m和seqidno.112(syl116011)處理組15隻動物的平均值±s.e.m。
圖22:在豚草-花粉誘導的變態反應小鼠模型中，瞼結膜和球結膜中的肥大細胞響應不同劑量的seqidno.112(syl116011)的浸潤。a)瞼結膜中的肥大細胞的浸潤表示為在處理後3小時在pbs處理的樣品中觀察到的肥大細胞的數目的百分數。b)球結膜中的肥大細胞的浸潤表示為在處理後3小時在pbs處理的樣品中觀察到的肥大細胞的數目的百分數。
圖23:在豚草-花粉誘導的變態反應小鼠模型中，瞼結膜和球結膜中的嗜酸性粒細胞響應不同劑量的seqidno.112(syl116011)的浸潤。a)瞼結膜中的嗜酸性粒細胞的浸潤表示為在處理後24小時在pbs處理的樣品中觀察到的肥大細胞的數目的百分數。b)球結膜中的嗜酸性粒細胞的浸潤表示為在處理後24小時在pbs處理的樣品中觀察到的嗜酸性粒細胞 的數目的百分數。
圖24:在豚草-花粉誘導的變態反應小鼠模型中，響應不同劑量的seqidno.112(syl116011)處理的tlsp和cd-137表達。a)tlsp的表達；b)cd-137(tnfrsf9)的表達。
圖25:在變應性攻擊後，在不同時間點觀察到的臨床跡象。通過向用pbs、seqidno.227(syl116011v8)或左卡巴斯汀(levocabastine)預處理的小鼠施用眼睛劑量的豚草花粉誘導變態反應。數據表示為每組10隻動物的平均值。
圖26:給藥後充血的變化-seqidno.112(syl116011)預防性相對於和賦形劑預防性。
圖27:給藥後斜視的變化-seqidno.112(syl116011)預防性相對於和賦形劑預防性。
圖28:給藥後眼瞼腫脹的變化-seqidno.112(syl116011)預防性相對於和賦形劑預防性。
圖29:給藥後分泌物的變化-seqidno.112(syl116011)預防性相對於和賦形劑預防性。
發明詳述
在第一方面，本發明涉及提供sirna分子，其作為藥物用於治療和/或預防以增加的orai1表達和/或活性為特徵的眼病，其中所述分子特異性靶向選自由seqidno.1-seqidno.111組成的組的序列，並且當引入到細胞中時減少orai1基因的表達。優選地，所述靶序列選自由seqidno.1–seqidno.14組成的組，更優選地，由seqidno.1–seqidno.8組成的組，並且甚至更優選地，所述靶序列包含seqidno.1或由seqidno.1組成。
例如，當sirna分子選擇性減少或抑制基因的表達時，該基因被本發明所述的sirna「靶向」。短語「選擇性減少或抑制」用在本文中包括影響一種基因(在這種情形中，是orai1)的表達的sirnas。備選地，當sirna(的一條鏈)在嚴格條件下與基因轉錄物(即，其mrna)雜交時，所述sirna靶向該基因。「在嚴格條件下」雜交意指在趨向於不利於雜交的 標準條件下，例如，高溫和/或低鹽含量下，與靶標mrna區域退火。適當的流程(包括0.1×ssc，68℃2小時)記述在maniatis,t.等，molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：實驗室手冊),coldspringharborlaboratory,1982，第387-389頁中。
除非另外指明，本文所引用的核酸序列以5』至3』方向書寫。術語「核酸」是指dna或rna或其修飾的形式，其包含在dna中存在的嘌呤或嘧啶鹼基(腺嘌呤「a」，胞嘧啶「c」，鳥嘌呤「g」，胸腺嘧啶「t」)或在rna中存在的嘌呤或嘧啶鹼基(腺嘌呤「a」，胞嘧啶「c」，鳥嘌呤「g」，尿嘧啶「u」)。例如，本文提供的幹擾rnas可以在3』端包含「t」鹼基，即使「t」鹼基在rna中不是天然存在的。在一些情形中，這些鹼基可以作為「dt」出現，以區分在核糖核苷酸鏈中存在的脫氧核糖核苷酸。
上文定義的靶序列記述為靶dna序列，用於定義在用於設計sirnas的目的的資料庫中的轉錄變體，而要用的特定的化合物將是按原樣定義的rna序列。
本領域專家可以通過公共資料庫訪問任意靶基因序列。例如，對應人orai1mrna的genbank登記號為nm_032790(geneid:84876)。對應小鼠orai1mrna的同源genbank登記號為nm_175423(geneid:109305)。此外，ensembl(mbl-ebi/wellcometrustsangerinstitute)具有下述orai1人和小鼠登記號：分別為ensg00000182500和ensmusg00000049686。人orai1mrna的公共轉錄物是enst00000330079和enst00000537188。
本發明鑑定的所述優選的靶標區域包含選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列或由選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列組成。
在一個優選的實施方案中，所述優選的靶標區域包含選自由seqidno.1–seqidno.14組成的組的至少一種序列或由選自由seqidno.1–seqidno.14組成的組的至少一種序列組成。
在另一個優選的實施方案中，所述優選的靶標區域包含選自由seqidno.1–seqidno.8組成的組的至少一種序列或由選自由seqidno.1–seqidno.8組成的組的至少一種序列組成。這些序列在下述物 種之間具有100％的同源性：智人(homosapiens)，小家鼠(musmusculus)，家犬(canislupusfamiliaris)和褐家鼠(rattusnorvegicus)。
在rnai領域中，當體外研究證明人sirna不能誘導動物模型基因的敲減時，合成替代化合物(動物活性的類似物)，從而分析該sirna在相關動物模型中的功效。該替代物針對人sirna的相同區域設計，由此兩種sirnas除少數核苷酸外具有相同的序列，這取決於人和兔靶基因之間的同源性。該方法已經廣泛用於開發其他的寡核苷酸，特別是用於毒物學研究{kornbrustd.等.2013}。
在一個更優選的實施方案中，所述優選的靶標區域包含seqidno.1(5』-tgatgagcctcaacgagca-3』)或由其組成。
因此，本發明各個方面所述的sirna優選地將包含雙鏈rna分子，其反義鏈將包含基本上與選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列互補的rna序列，並且其有義鏈將包含與所述反義鏈互補的rna序列，其中兩條鏈通過核苷酸之間的標準鹼基配對而雜交。更優選地，本發明各個方面所述的sirna優選地包含雙鏈rna分子，其反義鏈將包含基本上與選自由seqidno.1–seqidno.8組成(並且甚至更優選地由seqidno.1組成)的組的(序列)互補的rna序列。
在本發明的意思內，與靶標mrna序列「基本上互補」也可以理解為與所述靶序列「基本上相同」。如本領域普通技術人員已知的，「同一性」是通過匹配序列之間的核苷酸的順序和相同性所確定的核苷酸序列之間的序列相關性的程度。在一個實施方案中，與靶標mrna序列具有85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％互補性的sirna的反義鏈被認為是基本上互補的，並且可以用於本發明。互補性百分數描述在第一核酸分子中可以與第二核酸分子中一組連續的核苷酸在沃森-克裡克意義(watson-cricksense)上鹼基配對的連續的核苷酸的百分數。在一個優選的實施方案中，反義sirna鏈與靶標mrna序列100％互補，並且有義鏈與sirna雙鏈部分的反義鏈100％互補。sirna還可以包含未配對的突出端，例如，3』二核苷酸突出端，優選是dtdt。
在一個優選的實施方案中，本發明鑑定的所述眼病是眼睛變態反應和 /或眼睛結膜炎。更優選地，所述眼病選自季節性變應性結膜炎，常年性變應性結膜炎，春季角膜結膜炎，特應性角膜結膜炎，巨乳頭狀結膜炎，乾眼症候群和它們的組合。
如從現有技術中已知的，已經提議了多種不同的結構來實現rna幹擾。一般地，這些雙鏈分子在長度上約為19至約25個核苷酸，並且包括平端結構以及具有突出端的那些。已經記載突出端是有利的，並且可以存在於每條鏈的5』端或3』端，原因在於它們減少被rna酶的識別並且模擬切酶的天然底物。一些作者推薦在分子的兩個3』端包含突出端，而其他人認為一個突出端是足夠的。其他人已經描述了使用具有特定的修飾模式的平端結構(ep1527176，wo2005/062937，wo2008/104978，ep2322617，ep2348133，us2013/0130377，以及許多其他的)。
突出端可以由1-5個核苷酸構成；典型地，突出端由二核苷酸組成。本領域中所用的經典的分子包含19個核苷酸的雙鏈分子，其進一步包含3』二核苷酸突出端，優選地包含脫氧核苷酸，如tuschl的最初的研究所教導的(wo02/44321)。這些突出端被認為進一步增加對核酸酶(rna酶)降解的耐受性。後來，kim等2005記述了21-mer產物(含有二核苷酸突出端)是裝載到risc上所必需的。此外，bramsen等2009記述了向突出端引入可能的去穩定化修飾以進一步增加沉默效率。
由此，本發明的各個方面的一個優選實施方案是指包含至少一個突出端的靶向選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的sirna分子。更優選地，所述sirna分子靶向選自由seqidno.1–seqidno.8組成(甚至更優選地由seqidno.1組成)的組的至少一種序列。當本發明涉及靶向選自seqidno.1-seqidno.111的至少一種序列的sirna分子時，所述sirna將包含與靶標相等長度且互補的反義鏈和與反義鏈相等長度且互補的有義鏈。反義鏈和有義鏈可以進一步包含不與另一條鏈或靶標互補和/或在sirna的雙鏈部分不配對的另外的鹼基。例如，seqidno1是19個核苷酸的序列；sirna可以包含關於該序列同一性部分的19bp的雙鏈區和二核苷酸突出端。
本發明各個方面的一個優選實施方案是指靶向選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的sirna分子，其中所述雙 鏈sirna分子的每條鏈為約18至約28個或更多個(例如，約18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，或28個或更多個)核苷酸長。
本發明各個方面的另一個優選實施方案是指包含選自由seqidno.112–seqidno.229組成的組的核苷酸序列的18-28個核苷酸長或更長的sirna分子。更優選地，所述雙鏈sirna分子是至少19個核苷酸長，並且選自由seqidno.112–seqidno.229組成的組。
本發明的各個方面的另一個備選的實施方案提供平端分子。
此外，本發明的優選實施方案涉及包含或由靶向選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的19個核苷酸的雙鏈結構組成的sirna。更優選地，所述sirna包含或由靶向選自由seqidno.1–seqidno.8組成的組的至少一種序列的19個核苷酸的雙鏈結構組成，並且甚至更優選地由seqidno.1組成。
本發明的具體的實施方案涉及靶向選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的19個核苷酸的雙鏈平端sirna。更優選地，所述sirna靶向選自由seqidno.1–seqidno.8(並且甚至更優選地由seqidno.1組成)的組的至少一種序列。在另一個具體的實施方案中，該化合物包含或由選自由seqidno:112–seqidno.229組成的組的至少一種序列組成。在另一個優選實施方案中，該sirna的反義鏈與選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列至少80％、優選至少90％互補。
在一個優選的實施方案中，該化合物包含或由選自由seqidno.112–seqidno.119組成的組的至少一種序列組成。
在一個更優選的實施方案中，該化合物包含或由seqidno.112(5』-ugaugagccucaacgagca-3』)組成，其對應於我們命名為syl1160011的參比化合物的有義鏈。
此外，如稱為本領域背景的部分中所述，關於sirna分子的重要的問題是由於rna酶的普遍存在的性質導致其在生物流體中的不穩定性。由此，為增強化合物穩定性的目的，已經記述了對核苷酸的多種不同的化學修飾的應用。
sirna分子的另一種固有的問題是其免疫原性，由此已經發現 sirnas誘導先天性免疫系統的非特異性的激活，包括某些細胞因子的上調，例如，i型和/或ii型幹擾素以及il-12、il-6和/或tnf-α的產生。認為這些作用的起源是sirna對toll樣受體(如tlr7、tlr8和/或tlr3)的激活。
這些作用，即被rna酶識別和免疫原性，二者都已經被記述為是序列依賴性的。
通過減少對rna酶的敏感性而增強化合物穩定性的一些化學修飾還能夠減少後續應答的免疫識別的誘導。然而，在sirna中插入化學修飾的核苷酸還可能導致減少的沉默功效，如在前部分中所述，並且因此必須仔細考慮。
由此，在本發明的各個方面的優選的實施方案中，sirna進一步包含至少一個具有化學修飾的核苷酸。
增強穩定性並且減少免疫原性作用的優選的化學修飾包括2』-o-甲基核苷酸，2』-氟核苷酸，2』-氨基核苷酸，2』-脫氧核苷酸，或含有2』-o或4』-c亞甲基鍵的核苷酸。用於核酸外切酶保護的其他優選的化學修飾包括exoendolight(eel)：將有義鏈中的所有嘧啶修飾為2』-o-甲基殘基，並且修飾反義鏈中5』-ua-3』或5』-ca-3』基序中所有的嘧啶。另外，有義鏈的位置1也可以變成2』-o-甲基，防止有義鏈的5』-磷酸化，並且因此通過進一步使有義鏈失活而增加sirna的特異性。另外，有義鏈還可以包含在位置14的2』-o-修飾，原因在於在該位置的2』-o-me進一步使有義鏈失活，並且因此增加sirnas的特異性。另外，用於核酸外切酶保護的其他優選的化學修飾包括甲基-氟(mef)：在有義鏈上以2』-f起始(5』-端)和在反義鏈上以2』-o-me起始的交替2』-氟和2』-o-甲基修飾的外保護(exo-protection)。另外，有義鏈的位置1還可以變為2』-o-me，並且反義鏈的位置1變為2』-f(由於這可以有效地被5』-磷酸化)。此外，通過引入硫代磷酸酯修飾的核苷酸能夠修飾連接相鄰的核苷酸的核糖核苷酸骨架。在本發明的意思內的更優選的化學修飾涉及用脫氧胸腺嘧啶核苷(脫氧核糖核苷酸)替代尿嘧啶核糖核苷酸。在本發明的另一個優選的實施方案中，所述至少一個化學修飾的核苷酸是在sirna的有義鏈上、在反義鏈上或在兩條鏈上。
因此，在一個實施方案中，所述sirna包含或由選自由seqidno.223–seqidno.229組成的組的至少一種序列組成。
上述sirna分子可以使用本領域已知的方法以其天然結構遞送至細胞內部。例如，當研究體外基因沉默時，使用標準轉染試劑施用這些化合物。為了獲得體內效果，這些化合物可以裸露施用，或者使用遞送增強劑，如例如脂質體，與特定的結構部分綴合等進行施用，儘管本領域中已知多種不同的備選方案，並且取決於體內的所需要的靶向位點而不同地使用。
備選地，本發明各個方面的sirna分子可以由真核啟動子在細胞中表達。能夠表達sirna分子的重組載體可以被遞送至靶細胞中並且在靶細胞中永久存在。備選地，可以使用提供核酸分子的瞬時表達的載體。需要時，所述載體可以重複施用。一旦被表達，所述sirna分子與靶標mrna相互作用，並且產生rna幹擾反應。以這種方式產生的sirna分子通常稱為shrna(短髮夾rna)，原因在於其有義鏈和反義鏈通過小的核苷酸環連接在一起。表達sirna分子的載體的遞送可以是系統性的，諸如通過靜脈內或肌內施用，通過施用至來自受試者的外植體的靶細胞然後重新引入到所述受試者中，或者通過允許引入到所需要的靶細胞中的任何其他的方式。
本發明的另一方面涉及靶向選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的sirna在製備用於治療特徵在於增加的orai1表達和/或活性的眼病的方法中的藥物中的應用。更優選地，所述至少一種序列選自由seqidno.1–seqidno.8組成的組，並且甚至更優選地所述至少一種序列由seqidno.1組成。所述方法包括抑制患者中的orai1的表達。術語抑制用來表示表達或活性的下降或下調。優選地，所述眼病是眼睛變態反應和/或結膜炎。在一個實施方案中，所述眼病選自包括下述的組：季節性變應性結膜炎，常年性變應性結膜炎，春季角膜結膜炎，特應性角膜結膜炎，巨乳頭狀結膜炎，乾眼症候群以及它們的組合。
還提供治療以增加的orai1表達和/活性為特徵的眼病的方法。所述方法包括抑制患者中的orai1的表達。所述方法可以包括施用靶向選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的sirna。 更優選地，所述至少一種序列選自由seqidno.1–seqidno.8組成的組，並且甚至更優選地，所述至少一種序列由seqidno.1組成。
在一些國家中，慢性變應性結膜炎和乾眼症候群的組合是相當普遍的。增加的乾眼問題是由於常見的人工氣候、室內和室外汙染物和其他未知的原因導致。患有乾眼症候群的患者更傾向於患有眼睛變態反應，原因在於淚液膜是防止變應原與肥大細胞接觸的重要屏障。
預測使用針對orai1mrna的sirnas的治療性治療比小分子局部滴眼劑有益，其通過增加觀察到的作用的時間的長度，由此允許較不頻繁的給藥和更大的患者依從性。在諸如眼睛變態反應和/或結膜炎的情形中，包括但不限於春季角膜結膜炎、特應性角膜結膜炎和巨乳頭狀結膜炎，由於它們通常是慢性病症，這是特別重要的。
記得所述藥物的製備，可以將本發明各個方面的sirna配製為藥物組合物。優選地，所述sirnas的組合物和製劑可以局部施用至目的器官。在甚至更優選的實施方案中，它們可以配製用於局部施用至眼睛，優選地施用至眼睛的角膜表面。例如，應用至角膜表面可以以滴眼液、凝膠劑、洗液、乳膏或眼部插入物的形式進行。對眼睛的其他施用形式可以包括注射到眼睛中。
本發明各個方面的更優選的實施方案涉及前述段落中所述的特異性靶向選自由seqidno:1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的sirna，其用作用於治療以增加的orai1的表達和/或活性為特徵的眼病的藥物。更優選地，所述至少一種序列選自由seqidno.1–seqidno.8組成的組，並且甚至更優選地，所述至少一種序列由seqidno.1組成。如前文所述，其可以是包含或由靶向選自由seqidno:1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的19個核苷酸雙鏈結構組成的sirna。該sirna可以是平端的。優選地，所述sirna包含或由選自由seqidno.112–seqidno.229組成的組的至少一種序列組成。用於本發明所述的應用的其他的sirna包含或由來自由seqidno.223–seqidno.229組成的組的至少一種序列組成。
在本發明的上下文中，為了「特異性靶向」某種序列，本發明的sirna優選地包含至少相同的種子序列。因此，本發明所述的特異性靶向選自由 seqidno:1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的任意序列優選地在反義鏈的位置2-8是相同的。更優選地，所述至少一種序列選自由seqidno.1–seqidno.8組成的組，並且甚至更優選地，所述至少一種序列由seqidno.1組成。
儘管如上文所述，本發明各個方面的sirnas可以用於沉默眼部之外的組織中的orai1表達。由此，所述sirnas應該被相應地配製。
例如，sirna分子可以包含遞送載體(deliveryvehicle)，包括脂質體，用於施用給受試者。載體和稀釋劑及其鹽可以存在於藥用製劑中。核酸分子可以通過本領域技術人員已知的多種方法施用至細胞中，所述方法包括，但不限於，包封在脂質體中，通過離子電滲法，或通過結合在其他載體中，如生物可降解的聚合物、水凝膠、環糊精聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)和plca微球體、可生物降解的納米膠囊以及生物粘附性微球體，或通過蛋白質樣載體進行。在本發明的一個實施方案中，所述sirna分子可以通過細胞特異性sirna載體遞送，所述細胞特異性sirna載體組合了B型肝炎病毒的成分和脂質體。在另一個實施方案中，本發明的核酸分子還可以與聚乙烯亞胺及其衍生物一起配製或與聚乙烯亞胺及其衍生物複合，所述聚乙烯亞胺衍生物如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-n-乙醯半乳糖胺(pei-peg-gal)或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-n-乙醯半乳糖胺(pei-peg-三gal)衍生物。本發明的優選的組合物是水溶液，特別是鹽水溶液，如ph範圍在約7.0-約7.4、優選ph為7.2±0.5的磷酸緩衝鹽水(pbs)。
本發明的sirna分子可以與膜分解劑和/或陽離子脂質或輔助脂質分子複合。
可以用於本發明的遞送系統包括，例如，水性和非水性凝膠、乳膏、複合型乳劑、微乳劑、脂質體、油膏、水溶液和非水性溶液、洗液、氣溶膠、烴類基質和粉劑，並且可以包含賦形劑(excipients)，如增溶劑、滲透促進劑(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和胺基酸)、和親水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一個實施方案中，藥用載體是脂質體或透皮增強劑。
本發明的藥物製劑以適於施用(例如，系統或局部施用)至細胞或受試者中的形式存在，所述受試者包括，例如，人。適當的形式部分取決於 應用或進入途徑，例如，口服、經皮或通過注射的途徑。其他因素在本領域中是已知的，並且包括這樣的考慮，如毒性和防止所述組合物或製劑發揮其效果的形式。
本發明還包括製備的用於存儲或施用的組合物，其包含在藥用載體或稀釋劑中的藥物有效量的需要的化合物。用於治療用途的可接受的載體或稀釋劑在製藥領域中是公知的。例如，可以提供防腐劑、穩定劑、染料和調味劑。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對-羥基苯甲酸的酯。另外，還可以使用抗氧化劑和混懸劑。
藥物有效劑量是預防、抑制發生或治療(在某種程度上減輕症狀，優選地減輕所有的症狀)疾病狀態所需要的劑量。藥物有效劑量通常取決於疾病的類型、所用的組合物、施用的途徑、治療的哺乳動物的類型、所考慮的具體的哺乳動物的體格特徵、同時使用的藥物和醫學領域技術人員所認識到的其他因素。
治療有效量還可以指足以延緩或最小化與眼睛變態反應相關的眼部病症的發作的sirna的量。治療有效量還可以指在與眼睛變態反應相關的眼部病症的治療或管理中提供治療益處的治療劑的量。此外，關於本發明的sirna的治療有效量意指單獨的治療劑的量，或與其他治療劑組合的量，所述量在與眼睛變態反應相關的眼部病症的治療或管理中提供治療益處。與本發明的sirna的量聯繫使用，該術語可以包括改善整體治療、減少或避免不需要的作用或增強另一種治療劑的功效或與另一種治療劑協同作用的量。
在諸如眼睛變態反應的眼部病症的治療或管理中的治療益處是變態反應症狀的持續減少。鑑於sirna將減少orai1在細胞內的水平，當治療終止時，細胞必須重新合成新的蛋白。由此，基於sirna治療的療法將具有更持久的效果。這被認為是治療功效的顯著提高。
使用sirna的另外的益處是由其在系統循環中的存在所導致的副作用或急性毒性問題的最小的可能性，而這些通常與不同的基於滴眼液的治療相關。這是由於這樣的事實：當所述化合物進入血流中時，其將迅速地被存在於血液中rna酶降解。
另一方面，本文所述的製劑可以以在單劑量的小瓶中市售的事實意味 著可以避免向所述製劑中加入抗微生物防腐劑。防腐劑存在於現在的市場上的大部分製劑中。這些防腐劑在一些患者中產生不耐受性，使得其需要停止治療。當考慮到如同眼睛變態反應和/或結膜炎的病症(包括但不限於，春季角膜結膜炎，特應性角膜結膜炎和巨乳頭狀結膜炎)通常是慢性的，並且因此這樣進行治療時，這兩個問題是特別重要的。
一種優選的施用途徑是局部施用，直接滴到眼睛中，優選地使用滴眼液進行。如上文所述，預計使用針對orai1mrna的sirnas的治療性治療比小分子局部眼用滴劑有益，其增加所觀察到的效果的時間持久性，由此允許較不頻繁的給藥和更大的患者依從性。
然而，如前文所解釋的，還可以使用除了直接給藥到眼睛之外的給藥途徑。用於所述製劑的精確的劑量和給藥時間表也將取決於給藥途徑。技術人員應該理解，要用的精確的劑量和給藥時間表也取決於病症的嚴重性，並且應該按照執業者的判斷和每名患者的情形來決定。還理解用於任意具體的受試者的特定的劑量水平取決於多種因素，包括所用的具體的化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑和排洩率、藥物組合和治療中的特定疾病的嚴重性。
本發明的和本文所述的製劑或sirna可以以單位劑量製劑進行給藥，所述單位劑量製劑包含常規無毒藥用載體、輔藥和/或賦形劑。製劑可以以適於口服應用的形式存在，例如，作為片劑、藥片、錠劑、水性或油性混懸液、分散的粉劑或顆粒劑、乳液、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。旨在口服使用的組合物可以按照本領域已知的用於製備藥物組合物的任何方法進行製備，並且所述組合物可以包含一種或多種所述的增甜劑、調味劑、著色劑或防腐劑，以提供製藥學上別致且美味的製劑。片劑包含與適於製備片劑的無毒藥用賦形劑混合的活性成分。
例如，這些賦形劑可以是惰性稀釋劑；諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化劑和崩解劑，例如，玉米澱粉或海藻酸；結合劑，例如，澱粉、明膠或阿拉伯樹膠；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是無包衣的，或者其可以通過已知的技術進行包衣。在一些情形中，所述包衣可以通過已知的技術製成，以延緩在胃腸道中的崩解和吸收，並且由此提供在較長的時間期間內的持續作用。例如，可以使用時 間延遲物質，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用於口服使用的製劑也可以作為硬明膠膠囊存在，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或作為軟明膠膠囊存在，其中活性成分與水或油介質(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。
水性混懸液包含與適於製備水性混懸液的賦形劑混合的活性物質。所述賦形劑是混懸劑，例如，羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或潤溼劑可以是天然存在的磷脂(phosphatide)，例如，卵磷脂，或烯烴氧化物與脂肪酸的縮合產物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯，或環氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物，例如，十七乙烯氧基鯨蠟醇，或環氧乙烷與來源於脂肪酸與己糖醇的偏酯的縮合產物，如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環氧乙烷與來源於脂肪酸與己糖醇酐的偏酯的縮合產物，例如，聚乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。水性混懸液還可以包含一種或多種防腐劑，例如，乙基-或正丙基-對羥基苯甲酸酯，一種或多種著色劑，一種或多種調味劑，和一種或多種增甜劑，如蔗糖或糖精。
油性混懸液可以通過將活性成分混懸在植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)中或在礦物油(如液體石蠟)中而配製。油性混懸液可以包含增稠劑，例如，蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可以加入增甜劑和調味劑以提供可食用的口服製劑。這些組合物可以通過加入抗氧化劑如抗壞血酸進行保存。
適於通過加入水來製備水性混懸液的分散的粉劑和顆粒劑提供與分散劑或潤溼劑、混懸劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。適當的分散劑或潤溼劑或混懸劑例如上文已經提及的那些。也可以存在另外的賦形劑，例如，增甜劑、調味劑和著色劑。
本發明的藥物組合物還可以以水包油乳液的形式存在。油相可以是植物油或礦物油或這些的混合物。適當的乳化劑可以是天然存在的樹膠，例如，阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和來源於脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯，例如，失水山梨糖醇單油酸酯，和所述偏酯與環氧乙烷的縮合產物，例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸 酯。乳液還可以包含增甜劑和調味劑。
糖漿和酏劑可以用增甜劑進行配製，所述增甜劑例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。所述製劑還可以包含緩和劑、防腐劑和調味劑和著色劑。本發明的和本文所述的藥物組合物或sirna可以以無菌注射用水性或油脂性混懸液的形式存在。
這種混懸液可以按照已知技術使用上文已經提及的那些適當的分散劑或潤溼劑和混懸劑來配製。
無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可用的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或混懸液，例如，作為在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的賦形劑和溶劑是水、ringer's溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發的油常用作溶劑或混懸介質。為了這一目的，可以使用任意溫和的不揮發的油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸，如油酸，也用於製備注射劑。
在優選的實施方案中，本發明的組合物配製在溶液中，優選地配製在緩衝的鹽水溶液中，如pbs，或在用於局部給藥到眼睛的凝膠中，如例如，以滴眼劑的形式。在此類實施方案中，所述製劑可以是陽離子乳液和/或包含生物聚合物，包括，但不限於，聚(丙交酯-共-乙交酯)，卡波普、透明質酸和聚丙烯酸。
本發明的核酸分子還可以以栓劑的形式給藥，例如，用於藥物的直腸給藥。這些組合物可以通過將藥物與適當的無刺激性賦形劑混合而製備，所述賦形劑在常溫是固體的但是在直腸溫度是液體的，並且因此在直腸中熔融以釋放藥物。此類物質包括可可脂和聚乙二醇。
本發明的核酸分子可以在無菌介質中腸胃外給藥。取決於所用的賦形劑和濃度，藥物可以混懸或溶解在賦形劑中。有利地，輔藥，如局部麻醉劑、防腐劑和緩衝劑，可以溶解在賦形劑中。
由此，本發明的進一步優選的實施方案涉及藥物組合物，其中所述組合物包含靶向選自由seqidno.1–seqidno.111組成的組的至少一種序列的至少一種sirna，如在前述段落中所述。更優選地，所述至少一種序列選自由seqidno.1–seqidno.8組成的組，並且甚至更優選地，所述至少一種序列由seqidno.1組成。
本發明的核酸分子還可以與其他治療性化合物組合施用給受試者，以增加整體治療效果。使用多種化合物來治療適應證可以增加有益的效果同時減少副作用的存在。
當用於本文時，術語「眼睛變態反應」是指由增加的orai1表達和/或活性引起的眼睛表面的變態反應病症。其也可以稱為變應性結膜炎。眼睛變態反應包括寬泛種類的病理病況，包括但不限於：季節性變應性結膜炎(sac)，常年性變應性結膜炎(pac)，春季角膜結膜炎(vkc)，特應性角膜結膜炎(akc)，和巨乳頭狀結膜炎(gpc)。
當用於本文時，術語「結膜炎」是指結膜的炎症。在印度，其可以稱為紅眼或馬德拉斯眼(madraseye)。其通常是由於感染(通常是病毒性的，但有時是細菌性的)或變態反應反應引起。
眼睛變態反應的「臨床症狀」包括，但不限於，眼睛發癢，眼睛發紅，眼瞼腫脹，結膜水腫，流淚和鼻炎，鼻塞，流鼻涕，鼻瘙癢和耳/顎瘙癢，和打噴嚏。優選地，本發明治療或預防至少兩種臨床症狀，更優選地至少三種，甚至更優選地多於四種症狀。
術語「患者」用在本文中是指動物，包括哺乳動物，優選人。
當用於本文時，術語「變態反應原」是指環境中能夠引起速髮型超敏反應(immediatehypersensitivity)(變態反應)的任何抗原性物質。已知的變態反應原的列表包括植物花粉、黴菌的孢子、動物毛屑、室內塵埃、食物、羽毛、染料、皂類、洗滌劑、化妝品、塑料和藥物。變態反應原可以通過吸入、吞入、接觸或注射進入體內。空氣傳播的變態反應原是足夠輕足以被氣流運送的變態反應原，例如，但不限於，花粉或孢子。
術語「變應性結膜炎」在本發明中應該理解為由變態反應反應引起的結膜的炎症。結膜是覆蓋眼睛的薄膜。當變態反應原刺激結膜時，眼睛中發生的常見症狀包括：發紅(主要是由於周圍小血管的舒張導致)，眼睛發癢，眼瞼水腫，增加的流淚，畏光，水樣分泌物，和異物感(帶有疼痛)。症狀通常在天氣溫暖乾燥時對患者加重，而涼爽的溫度和下雨傾向於緩和症狀。
術語「眼瞼炎」在本發明中應該理解為慢性眼瞼炎症。
術語「瞼緣結膜炎」在本發明中應該理解為兩種獨立的眼病的同時發 生：眼瞼炎和結膜炎。眼瞼炎影響外眼瞼，而結膜炎發生在結膜中。
術語「角膜結膜炎」在本發明中應該理解為角膜和結膜的炎症。
在下述非限制性實施例中將進一步描述本發明。
實施例
0.材料
·小鼠orai1探針:taqman基因表達測定mm00774349_m1。
·小鼠tlsp探針:taqman基因表達測定mm01157588_m1。
·小鼠tnfsr9探針:taqman基因表達測定mm00441899_m1。
·18s內源性對照:taqman基因表達測定。hs99999901_s1。
·multiscribe反轉錄酶50u/ml(appliedbiosystemsp/n4311235)。
·rna酶抑制劑20u/μl(appliedbiosystemsp/nn8080119)。
·taqman2x通用主混合物。
·非放射性細胞增殖測定試劑盒(promega，mannheim，德國)。
·人肥大細胞(hmc-1)。
·在dmso中的離子黴素(ionomycin)鈣鹽1mm(購自sigmalifescienceref#i3909-1ml)。
·annexin-v檢測試劑盒lifetechnologies(ref:v13241)。
1.體外分析
1.1在不同細胞系中轉染本發明的sirnas後的orai1表達水平
為了證明本發明的sirnas的沉默作用，在不同細胞系中轉染本發明選擇的sirnas之後，測量體外orai1表達水平。分別使用transittko和lipofectamine2000作為轉染劑，將人a204和鼠c2c12與j744a.1細胞轉染100nmseqidno.112(19bp的平端dsrna結構)。所有的轉染按照標準的供應商使用說明進行。在同一轉染中，使用雜亂的(scrambled)sirna序列作為幹擾特異性的對照。在轉染實驗後24、48和72小時收集細胞沉澱物，並且處理，以評估由於sirna作用機制導致的可能的mrna水平變化。rna水平通過實時pcr利用相對定量方法(即比較閾值2-δδct法)進行定量。(livak和schmittgen，2001)。所有的實時定 量pcr實驗一式三份進行，並且以三次獨立的實驗進行重複。計算平均值和標準偏差。如圖4所示，seqidno.112顯著地在a204和c2c12細胞中降低orai1mrna水平約70-80％，並且在j744a.1中降低orai1mrna水平40％。19bp的平端dsrna結構：seqidno.113，seqidno.115，seqidno.116，seqidno.117，seqidno.118和seqidno.119，也顯著降低orai1mrna表達水平約40-80％(圖5)。
1.2在轉染本發明的sirna後不同細胞系的細胞存活性
為了證明本發明的sirnas的細胞存活性，在不同細胞系中轉染本發明選擇的sirnas之後，測量體外毒性水平。分別使用transittko和lipofectamine2000作為轉染劑，將人a204和鼠c2c12與j744a.1細胞轉染100nmseqidno.112(19bp的平端dsrna結構)。所有的轉染按照標準的供應商使用說明進行。在同一轉染中，使用雜亂的sirna序列作為幹擾特異性的對照。在轉染實驗後24、48和72小時收集細胞沉澱物，並且處理，以評估由於sirna轉染導致的可能的細胞存活水平變化。細胞存活性使用購自promega的celltiter水性非放射性細胞增殖測定測量。該方法是基於活細胞(脫氫酶)將mts四唑化合物還原為甲產物的能力，其通過490nm的吸光度測量。計算平均值和標準偏差。如圖6所示，對於seqidno.112，沒有發現細胞存活水平的變化。因此，seqidno.112無毒，並且是安全的。
1.3在不同細胞系中轉染本發明未修飾的和化學修飾的sirna後的orai1表達水平
為了改善本發明的sirnas的穩定性並確保沒有免疫原性激活，向典型的seqidno.112序列(19bp的平端dsrna結構)中引入不同的sirna-優化的化學修飾；因此，獲得新的化學修飾的實體(seqidno.223，seqidno.224，seqidno.225，seqidno.226，seqidno.227，seqidno.228和seqidno.229)，並且轉染到人和鼠細胞中，以證明它們降低orai1mrna水平的能力。化學修飾詳細顯示在圖3中。分別使用transittko和lipofectamine2000作為轉染劑，將人a204和鼠 c2c12與j744a.1細胞轉染100nm的seqidno.112，seqidno.223，seqidno.224，seqidno.225，seqidno.226，seqidno.227，seqidno.228或seqidno.229(所有這些結構都對應19bp的平端dsrna結構)。所有的轉染按照標準的供應商使用說明進行。在同一轉染中，使用雜亂的sirna序列作為幹擾特異性的對照。在轉染實驗後24、48和72小時收集細胞沉澱物，並且處理，以評價由於sirna-處理導致的可能的mrna水平變化。rna水平通過實時pcr利用相對定量方法(即比較閾值2-δδct法)進行定量{livak和schmittgen，2001}。所有的實時定量pcr實驗一式三份進行，並且以三次獨立的實驗進行重複。計算平均值和標準偏差。如圖7和圖8所示，在人和鼠細胞系中，修飾的sirnas顯示出極好的功效，比得上seqidno.112。因此，化學修飾的產物seqidno.223，seqidno.224，seqidno.225，seqidno.226，seqidno.227，seqidno.228和seqidno.229降低orai1mrna水平50-80％。
1.4seqidno.112和seqidno.227在人和鼠細胞中的劑量響應
分別使用transittko和lipofectamine2000作為轉染劑，將人a204和鼠c2c12細胞轉染以增加劑量的seqidno.112(19bp的平端dsrna結構，syl116011)和seqidno.227(19bp的平端dsrna結構，syl116011v8)(0.001-100nm)。所有的轉染按照標準的供應商條件進行。在同一轉染中，使用雜亂的sirna序列作為幹擾的特異性對照。收集細胞沉澱物，並且處理，以評估由於sirna作用機制導致的可能的mrna水平變化。rna水平通過實時pcr利用相對定量方法(即比較閾值2-δδct法)進行定量。{livak和schmittgen，2001}。所有的實時定量pcr實驗一式三份進行，並且以三次獨立的實驗進行重複。計算平均值和sem。如圖9所示，在人細胞中，在0.5nm的劑量下觀察到orai1水平顯著降低。響應100nm劑量的seqidno.112和seqidno.227兩者，觀察到最大的作用。在濃度10-50nm之間，觀察到seqidno.112和seqidno.227的小差異。seqidno.227降低orai1mrna水平60-80％，而seqidno.112降低orai1mrna水平40-60％。在濃度0.05-0.001nm 之間沒有觀察到差異。使用這些數據，計算抑制性濃度50(ic50)值為：關於seqidno.227為1.98nm，關於seqidno.112為5.3nm。
如圖10所示，在鼠c2c12細胞中，以2.5nm的劑量也觀察到顯著的orai1水平降低。響應50nm劑量的seqidno.112和seqidno.227，觀察到最大作用。在濃度5-100nm之間，觀察到seqidno.112和seqidno.227的小差異。seqidno.112和seqidno.227都降低orai1mrna水平70-80％。在濃度0.1-0.001nm之間沒有觀察到差異。使用這些數據，計算抑制性濃度50(ic50)值為：關於seqidno.227為1.98nm，關於seqidno.112為1.25nm。
1.5在轉染seqidno.112和seqidno.227後，orai1及其旁系同源物orai2和orai3的表達
為了證明本發明的sirnas的特異沉默作用，在不同細胞系中轉染本發明選擇的sirnas之後，測量體外orai1、orai2和orai3表達水平。我們分析seqidno.112和seqidno.227對orai通道家族的受體的作用，從而分析其對與orai1通道結構和功能相關的蛋白的作用。在用seqidno.112和seqidno.227處理後，評估人a204和c2c12鼠細胞中的orai1、orai2和orai3mrna水平。分別使用transittko和lipofectamine2000作為轉染劑，將人a204和鼠c2c12細胞轉染100nmseqidno112和seqidno227。所有的轉染按照標準的供應商條件進行。在同一轉染中，使用雜亂的sirna序列作為幹擾的特異性對照。在轉染實驗後24、48和72小時收集細胞沉澱物，並且處理，以評估由於sirna作用機制導致的可能的mrna水平變化。圖11和圖12顯示，seqidno.112和seqidno.227能夠選擇性地降低orai1mrna的水平，在人細胞中約70-80％，而不顯著影響orai2或orai3的mrna水平(圖11)，並且在鼠細胞中為60-70％(圖12)。
1.6在人細胞中轉染seqidno.112(syl116011)後，推定的otes的表達。
為了證明本發明的sirnas關於非預期的靶標的特異性沉默作用，在 人細胞系中確定seqidno.112的推定的在計算機晶片上的脫靶效應(insilicooff-targetseffects(otes))。在人細胞系中轉染本發明選擇的sirnas之後，測量msln和olfm12a表達水平。我們分析了seqidno.112對msln和olfm12a基因表達的作用。在使用transittko作為轉染劑，用100nmofseqidno.112處理後，評估人a204細胞中的msln和olfm12amrna水平。所有的轉染按照標準的供應商條件進行，並且具有陽性和陰性對照。在同一轉染中，使用雜亂的sirna序列作為幹擾的特異性對照。在轉染實驗後24、48和72小時收集細胞沉澱物，並且處理，以評價seqidno.112的作用機制導致的推定的otesmrna水平可能的變化。圖13顯示seqidno.112不降低推定的otes的水平。
1.7在大鼠細胞系中轉染seqidno.112後的orai1表達水平
為了證明seqidno.112的沉默作用，在不同細胞系中轉染本發明選擇的sirnas之後，測量體外orai1表達水平。分別使用transitit2020和lipofectamine2000作為轉染劑，將大鼠jtc-19和c6細胞轉染以100nm的seqidno.112。所有的轉染按照標準的供應商條件進行，具有陰性對照。在同一轉染中，使用雜亂的sirna序列作為幹擾的特異性對照。在轉染實驗後24、48和72小時收集細胞沉澱物，並且處理，以評估由於sirna作用機制導致的可能的mrna水平變化。rna水平通過實時pcr利用相對定量方法(即比較閾值2-δδct法)進行定量{livak和schmittgen，2001}。所有的實時定量pcr實驗一式三份進行，並且以三次獨立的實驗進行重複。計算平均值和sem。如圖14和圖15所示，seqidno.112顯著降低orai1mrna水平，在jtc-19細胞中降低約70％，並且在c6細胞中降低40-70％。對於seqidno.112，在72小時，在jtc-19細胞中，orai1mrna水平沒有完全恢復，但是在c6細胞中恢復(圖14和圖15)。
1.8在轉染seqidno.112(syl116011)、seqidno.233(syl116011v11)和seqidno.235(syl116011v11)後，orai1的基因表達水平。
分別使用transittko、lipofectamine2000和mirusit2020作為轉染劑，將人a204、鼠c2c12和jtc-19大鼠細胞轉染100nm的seqidno.112(19bp的平端dsrna結構，syl116011)和seqidno.233(19bp的平端dsrna結構，syl116011v11)以及seqidno.235(19bp的平端dsrna結構，syl116011v12)。所有的轉染按照標準的供應商條件進行。在同一轉染中，使用雜亂的sirna序列作為幹擾的特異性對照。收集細胞沉澱物，並且處理，以評價由於sirna作用機制導致的可能的mrna水平變化。rna水平通過實時pcr利用相對定量方法(即比較閾值2-δδct法)進行定量{livak和schmittgen，2001}。如圖16所示，在人、鼠和大鼠細胞中觀察到orai1水平大量降低。對於seqidno.112(syl116011)、seqidno.233(syl116011v11)和seqidno.235(syl116011v11)，在人細胞中，orai1mrna水平降低70-80％。在鼠細胞中，對於seqidno.112(syl116011)、seqidno.233(syl116011v11)和seqidno.235(syl116011v11)，orai1mrna水平降低50％，而在大鼠細胞中，對於seqidno.112(syl116011)，降低50％，對於seqidno.233(syl116011v11)和seqidno.235(syl116011v11)分別降低95％和99％。
2.體內分析
2.1在豚草花粉誘導的眼睛變態反應小鼠模型中分析seqidno.112(syl116011)和seqidno.227(syl116011v8)的體內功效。
本研究的目的是分析本發明設計來沉默orai1的表達的sirnas[具體是seqidno.112(19bp的平端dsrna結構，syl116011)和seqidno.227(19bp的平端dsrna結構，syl116011v8)]減輕豚草花粉誘導的眼睛變態反應小鼠模型中與眼睛變態反應相關的症狀的功效。
豚草是葵花家族菊科(asteraceae)豚草屬(ambrosia)的開花植物。豚草花粉是高度變應性的，通常認為是世界上所有空氣傳播的花粉的最大的氣源性變態反應原和花粉熱(hayfever)的主要原因。國家環境健康科學研究所(nationalinstituteofenvironmentalhealthscience，niehs)表明，豚草和其他的雜草，諸如皺葉酸模(curlydock)，藜(lambsquarters)， 豬草(pigweed)，車前屬(plantain)，酢漿草屬(sheepsorrel)和蒿屬(sagebrush)，是世界上最豐富的花粉變態反應原製造者中的一些。該花粉通常用於研究變應性結膜炎的動物模型{bacsia等2005}。
本分析的目的是確定通過眼部滴注本發明的化合物(seqidno.112(syl116011)和seqidno.227(syl116011v8))下調orai1是否減輕小鼠中由豚草花粉誘導的眼睛變態反應引起的症狀。
我們已經分析了orai1是否在小鼠眼睛中表達，以及其表達是否響應豚草花粉誘導的眼睛變態反應被上調。我們還已經評估了使用局部施用的seqidno.112(syl116011)或seqidno.227(syl116011v8)沉默orai1表達對上文提及的小鼠模型中的變應性反應的作用。為了這一目的，已經分析了下述參數：
·響應變態反應誘導的臨床跡象：變應性結膜炎的典型眼部跡象包括發癢、眼瞼腫脹、結膜腫脹(結膜水腫)和粘液沉積。與眼睛變態反應相關的粘液是量多的、粘稠的，甚至是粘性的。結膜的變化通常引起球結膜呈現「玻璃樣」外觀，並且瞼結膜的顏色比紅色更粉色，通常具有乳白色外觀。
·局部肥大細胞的數目：在變應性刺激後數分鐘，結膜肥大細胞脫粒化；炎性介質的釋放吸引更多的從結膜深層遷移的肥大細胞。
·嗜酸性粒細胞的局部浸潤：在變態反應原暴露後數小時，發生炎性細胞向結膜的浸潤，並且作為針對變態反應原的後期反應的一部分。儘管一些不同類型的細胞遷移到結膜，主要類型還是嗜酸性粒細胞。
·變態反應相關的分子生物標記的表達變化：
○胸腺間質淋巴細胞生成素(tlsp)是上皮來源的細胞因子，其通過與其特異性的受體tlspr結合而激活樹突細胞。tlsp與tlspr的結合誘導th2-型炎性反應。tlsp主要由上皮細胞產生，但是也可以由肥大細胞產生，並且已經發現在變應性炎症部位被上調{zhengx.等2010}。
○腫瘤壞死因子受體超家族，成員9(tnfrsf9)或cd-137是記憶t細胞的共同刺激劑。該共同刺激劑在激活的t細胞、nk細胞和樹突細胞(dc)中表達，而已經在成熟的dv、激活的巨噬細胞和激活的b細胞上檢測到其配體cd137l。cd-137共同刺激t細胞激活和增殖，增強激活的 t細胞的存活並且抑制cd4+t輔助細胞。在變應性炎症中，已經表明，其介導il-4依賴性th2應答，並且在具有ige介導的變應性反應的患者的嗜酸性粒細胞中被上調。
a.方法
a.1測試系統表徵
表1.測試系統表徵
本發明的sirnas的另一個優點是，在不同動物序列之間，seqidno.1–seqidno.8對應orai1基因的高度保守區域。事實上，這些序列在人和小鼠之間是相同的，這使得該動物模型特別適合用於眼睛變態反應的研究。
a.2變態反應的誘導
通過在第1天腹膜內注射，用50μg豚草(rw)花粉在0.25ml明礬中的混合物免疫動物而誘導變應性結膜炎。在施用之前立即製備免疫溶液，並且在所有時刻避光。免疫後十天，將1.25mgrw花粉局部滴注到每隻眼 睛中。施用以5μl/眼睛的劑量體積進行。該方法由本領域專家已知的標準的已有的公開的流程修改而成，並且在評估sirnas的功效之前進行了驗證{magonem.t.等1998}。
a.3測試項目施用
從第6天開始，在5天的期間內，每天一次將測試項目通過局部眼睛途徑應用到動物的兩隻眼睛(圖4)。一個獨立組的動物施用賦形劑(pbs)並作為對照。施用以5μl/眼睛的劑量體積進行。
a.4臨床觀察和樣品收集
從第一次施用直到處死，每天監測動物的一般健康狀態。在滴注局部眼睛花粉之前，以及在花粉滴注後不同時間點直到24小時，檢查小鼠的臨床超敏跡象。結膜水腫和充血、眼瞼腫脹、分泌物和流淚按等級0-3分級。由對實驗條件不知情的實驗觀察者進行臨床評分。在變態反應攻擊後3或24小時處死動物。在處死之前，採集血液樣品，以評估血漿中ige，il-13；il-10和mcp-1的存在。在處死後，分離眼睛、脾和頸淋巴結，並且處理用於組織學，保存用於後續rna或者處理用於分析結膜中上文提及的細胞因子的水平。
a.5組織學
將摘除的眼睛浸沒在10％甲醛(1/20體積)中24小時，然後用0,1m磷酸緩衝液洗滌幾次去除甲醛，並且在該緩衝液中保持幾乎24小時。通過將樣品在濃度遞增的乙醇中溫育，而將樣品脫水，然後包埋在組織處理器(leicatp1020，cat.no-070437101，leicamicrosystems，nussloch，germany)的低熔點石蠟中。將樣品在切片機中切割，以獲得2μm的切片，然後用甲苯胺欄染色以計數肥大細胞數目或者用蘇木精-曙紅染色以評估嗜酸性粒細胞浸潤。
a.6rna分離和反轉錄
使用rneasyrna提取試劑盒(invitrogen，ca，usa)從完整的眼睛、 脾或淋巴結中分離總rna。使用high-capacitycdnaarchive試劑盒(appliedbiosystems，inc.，fostercity，ca，usa)，按照供應商的使用說明和it-b-0003-01，將4μg的總rna反轉錄。
a.7qpcr
使用steponeplus檢測系統(appliedbiosystems)進行qpcr。在下述條件下：95℃10min，然後是40個循環：95℃15s和60℃1min，使用taqman2x通用主混合物擴增500納克的每種樣品。所有的qpcr擴增一式三份進行，並且以至少兩次獨立的實驗重複進行，總是包括反轉錄對照和無模板對照。使用相對定量的δδct法通過qpcr分析orai1、tlsp和tnfrsf9mrna水平，其中使用18s基因作為內標{livakk.j.和schmittgent.d.，2001}。
a.8分析血漿和結膜中的ige，il-13；il-10和mcp-1
使用下述試劑盒並按照供應商的使用說明，評估小鼠血漿和結膜中下述細胞因子的量：ige，il-13，il-10和mcp-1。
b.結果
b.1小鼠眼中的orai1表達和響應眼睛變態反應的誘導。
在如方法部分所述誘導變態反應後的不同時間點評估小鼠眼睛中的orai1表達。圖17顯示orai1存在於眼睛中，並且其表達響應變應性攻擊快速上調。在施用豚草花粉後3-6小時觀察到orai1mrna水平增加兩倍。攻擊後24小時，orai1水平約是基底水平的350％。
b.2評估響應眼睛變態反應的變態反應生物標記的表達。
在通過對預先致敏的小鼠滴注豚草花粉誘導眼睛變態反應後的不同時間點，研究tlsp和tnfrsf9的mrna水平。在攻擊後3小時觀察到tlsp和tnfrsf9二者的顯著誘導。誘導後24小時，tnfrsf9mrna水平接近基線水平，而tlsp的mrna水平仍然是基底水平的約1.5倍高(圖18)。
b.3seqidno.112(syl116011)在眼睛變態反應小鼠模型中的功效。
如方法部分所述，對三組動物腹膜內(ip)注射一定劑量的吸附在明礬上的豚草花粉。ip注射後五天，一組(a，n＝8)在五天的期間每天接受pbs的眼部滴注，第二組(b，n＝15)在相同的時間期間內接受劑量為150μg/眼睛/天(低劑量)的seqidno.112(syl116011)，而第三組在5天內接受劑量為375μg/眼睛/天(高劑量)的seqidno.112(syl116011)。在眼部滴注花粉後1，3，6和24小時，檢查動物與眼睛變態反應相關的症狀。如在圖20中所示，使用任一劑量的seqidno.112(syl116011)治療顯著降低變態反應速髮型臨床跡象。臨床跡象的進一步分析表明，兩種劑量的seqidno.112(syl116011)對所研究的兩個參數都具有特別的作用：結膜水腫(結膜的腫脹)和流淚(圖21)。
在誘導眼睛變態反應後3小時，評估瞼結膜和球結膜中的肥大細胞浸潤。以375μg/眼睛/天的劑量施用的seqidno.112(syl116011)引起浸潤到瞼結膜和球結膜兩者中的肥大細胞數目的顯著降低(圖22)。
在攻擊後24小時，評估結膜中的嗜酸性粒細胞浸潤。同樣地，在結膜的兩個區域中都觀察到響應高劑量的seqidno.112(syl116011)的浸潤的嗜酸性粒細胞的顯著降低，以及在球結膜中，觀察到響應低劑量的浸潤的嗜酸性粒細胞的顯著降低(圖23)。
完整眼睛中變態反應生物標記tlsp的分析表明該標記響應seqidno.112(syl116011)的劑量依賴性的減少。在變應性攻擊後3小時，cd-137(tnfrsf9)的表達還響應seqidno.112(syl116011)顯著降低。如圖11所示，該變態反應標記在變態反應誘導後3小時被顯著誘導(圖24)。
b.4seqidno.227(syl116011v8)在眼睛變態反應小鼠模型中的功效
此外，進行另一項體內實驗，其中三組動物腹膜內(ip)注射一定劑量的吸附在明膠上的豚草花粉，如在方法部分中所述。ip注射後五天，一組(a，n＝10)在五天的期間每天接受pbs的眼部滴注，第二組(b，n＝10)在相同的時間期間內接受劑量為450μg/眼睛/天的本發明的另一種化合物(seqidno.227(syl116011v8))，而第三組在5天內接受2μl0.5mg/ml的左卡巴斯汀。左卡巴斯汀是目前銷售用於治療眼睛變態反應的第二代 h1受體拮抗劑。在眼部滴注花粉後0.5，1，3，6和24小時，檢查動物與眼睛變態反應相關的症狀。如圖25所示，用seqidno.227(syl116011v8)處理顯著降低臨床變態反應跡象；臨床跡象的減少大於響應左卡巴斯汀觀察到的減少。臨床跡象的進一步分析表明，當與pbs處理的動物相比較時，seqidno.227(syl116011v8)改善所有研究的參數。因此，證明該化合物是眼睛變態反應的有效治療性治療。
2.2在實驗變應性結膜炎鼠模型中評價seqidno.112(syl116011)的體內作用。
本研究的目的是評價本發明設計來沉默orai1表達的sirnas減輕鼠模型匯中與變應性結膜炎相關的變應性症狀(如充血，斜視，分泌物和眼瞼腫脹)的作用。
本研究的目的是評價通過眼部滴注seqidno.112(19bp的平端dsrna結構，syl116011)下調orai1是否減輕變應性結膜炎鼠模型中的變應性症狀(充血，斜視，分泌物和眼瞼腫脹)。關於陽性對照，使用常用的藥物，即，抗變態反應的(0.1％奧洛他定(olopatadine))是作為滴眼劑施用的抗組胺/肥大細胞穩定劑雙重作用劑。阻斷組胺的作用，並且防止肥大細胞釋放引起變態反應症狀的化學物質。局部施用pbs(賦形劑)用作陰性對照。
a.方法
在本研究中，在第0天，用與氫氧化鋁混合的短豚草致敏雌性balb/c小鼠。在第18天，在局部處理之前，用在平衡鹽溶液(bss)中的短豚草局部致敏小鼠，以去除認為對攻擊不響應的小鼠。不響應的是與基線相比不具有至少2個單位的充血變化的小鼠。由於響應者的數目少，在第21天將小鼠再次致敏。在第24天，重複第18天的步驟，以鑑定響應者。選擇48隻小鼠用於本研究，並且隨機分成6組，每組8隻。預防性治療組在第25-27天接受它們各自的局部藥物(第2，3和5組每天一次；第6組每天四次)。在第28-31天，將小鼠每天用豚草局部攻擊兩次，同時接受它們各自的藥物(除組每天接受三次劑量外，所有組每天一次)。 在第一次、第四次、第六次和第八次攻擊後，用評價來評估動物的充血、斜視、分泌物和眼瞼腫脹。
a.1動物
將小鼠籠養在具有直接接觸的墊子的聚碳酸酯籠子中籠子符合動物福利法(animalwelfareact)和實驗室動物護理和應用指導(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)中所述的標準。對於動物推薦的生活空間符合phs政策和awa。動物籠中的廢物或墊子按照保持動物乾燥清潔所需經常更換。
給動物隨意餵飼新鮮、可口和充分營養的食物。隨意提供清潔、可以飲用且沒有汙染的水。設定環境控制以保持溫度為22±4℃(68±5of)，相對溼度為50±20％。保持12小時光/暗循環。在基線評價之前，將動物在到達後在設施中適應至少5天。在整個研究中不需要獸醫工作人員。
a.2變態反應原致敏
·途徑：皮下，兩個後小腿。
·頻率：對於所有組，在第0天和第21天。
·步驟：對於每次致敏，接受srw的動物接受50μl在0.65mg氫氧化鋁中的100μg豚草。
a.3給藥
如所述，對所有組施用seqidno.112(syl116011)的局部治療劑、作為陽性對照的或賦形劑對照。使用校準的微量移液器，對小鼠角膜局部給藥，每隻眼睛3μl治療用滴劑。在預防性治療日過程中(第25-27天)，每天在約9am，12pm，2pm和5pm對動物給藥四次。所有時間為±60分鐘，並且將準確的給藥時刻記錄在研究活頁本上。第2，3，5和6組動物在約1pm±60分鐘接受它們的局部劑量。在攻擊的日子(第28-31天)，在攻擊的日子的約9am，1pm和4pm，小鼠每天給予三次；然而，給藥的時間是±90分鐘。所有其他組在約1pm給藥。同樣地，將準確的給藥時刻記錄在研究活頁本上。
a.4變態反應原攻擊
·途徑：眼睛應用，兩隻眼睛。
·頻率：在第18天，進行篩選srw攻擊，以鑑定響應者。在基線、在srw攻擊之前評價小鼠。然後，在攻擊後18±1分鐘，再次評價動物。由於缺少響應者，所以延緩研究。在第21天進行第二次致敏，並且在第24天重複篩選srw攻擊。在第25-27天，第2，3，5和6組開始它們各自的預防性治療。在第28-31天，在第一次每日劑量後和第三次每日劑量後約30分鐘進行bid攻擊。在第28-31天，在第28天的第一次局部劑量後和在第29-31天的第三次局部劑量後，在局部劑量後30分鐘評價動物，然後在評價後攻擊～3分鐘，並且在攻擊後(1，4，6和8次局部攻擊後)18分鐘再次評價。
·步驟：小鼠用每隻眼睛中局部劑量為150μgsrw(3μl50mg/ml)混懸液(在3μl平衡鹽溶液(bss)中)攻擊。在第24天，基於小鼠從基線充血的變化，將動物隨機化。
a.5組織採集
將動物處死，並且在確認動物死亡後，取出右眼和周圍的附件，並且在davidson’s固定劑中保存24小時。固定24小時後，將組織轉移到70％乙醇中長期保存。將眼睛石蠟包埋，和對每隻眼睛製備1個h&e，1個tblue，和1個未染色的載玻片。
a.6統計學方法
使用bonferroni事後檢驗的雙向anova分析數據，以比較各組間臨床跡象的差異。
b.結果
關於充血、斜視、眼瞼腫脹和分泌物的數據為n＝8隻眼睛的平均值±sem。在1，4，6和8次攻擊時，由同一名不知情的觀察者評價小鼠，所述攻擊分別發生在第28，29，30和31個研究日。對於充血、斜視和分 泌物，以0-4級嚴重性評價動物(0是正常的，4是最嚴重的)。對於眼瞼腫脹，以0-2等級將小鼠分級。對於每個終點，在給藥後30分鐘(僅對)或恰好在那一天攻擊前的基線(對於所有其他組)評價動物。所有組通過bonferroni事後檢驗的雙向anova進行分析，並且用星號標記相對於賦形劑的任意統計學顯著性。
b.1給藥後充血的變化-seqidno.112(syl116011)預防性相對於和賦形劑預防性。
數據為每組n＝8隻眼睛的平均值±sem。在第28天第一次攻擊後，表現出統計學較低的響應(p<0.01)。預防劑量的seqidno.112(syl116011)表現出與具有的相似的趨勢，但是沒有觀察到統計學顯著性(見圖26)。
b.2給藥後斜視的變化-seqidno.112(syl116011)預防性相對於和賦形劑預防性。
數據是每組n＝8隻眼睛的平均值±sem(見圖27)。沒有觀察到統計學顯著性。
b.3給藥後眼瞼腫脹的變化-seqidno.112(syl116011)預防性相對於和賦形劑預防性。
數據是每組n＝8隻眼睛的平均值±sem(見圖28)。沒有觀察到統計學顯著性。
b.4給藥後分泌物的變化-seqidno.112(syl116011)預防性相對於和賦形劑預防性。
數據是每組n＝8隻眼睛的平均值±sem(見圖29)。沒有觀察到統計學顯著性。
c.結論
在研究結尾時，似乎seqidno.112(syl116011)預防性符合相同的 減輕充血、眼瞼腫脹和分泌物的趨勢(見圖26-29)，然而，當通過bonferroni事後檢驗的雙向anova分析這些數據時，其不是統計學顯著的，這是由於本研究所用的較低的n。
值得注意的是，當評價本發明設計來沉默orai1表達的seqidno.112(syl116011)的作用時，結果表明seqidno.112(syl116011)組中的劑量-響應的趨勢與用治療的組的趨勢相似，是目前市售的已知的抗變態反應藥物，在兩種情形中都減輕了鼠模型中與變應性結膜炎相關的變應性症狀。預計使用更高的n，數據的分析將變為統計學顯著的。
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