一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒的製作方法

2023-12-09 09:27:31

專利名稱：一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及遺傳學，分子生物學，臨床醫學及預防醫學技術領域，具體地說，本發明涉及一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，通過聯合檢測多個核酸(DNA和RNA)分子標記，包括:APMI (+45)、FTO (rs9939609)、FTO (rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL (HindIII)、MC4R(rsl7782313)、PPAR y 2 (Pro 12AI a)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR (Trp64Arg)上基因多態性位點，來評估和篩選肥胖的遺傳易感性(susceptibility)。
背景技術：
肥胖已經成為全球日趨嚴重的「流行病」，已經成為全球性的重要健康問題。WHO指出，肥胖是一種疾病，它不僅僅是體型外貌問題，也是糖尿病、心血管疾病甚至腫瘤發病的獨立危險因素。肥胖者常伴有胰島素抵抗，並常與糖尿病、血脂異常、動脈粥樣硬化、高血壓等集結出現。因此，對肥胖症的早期預防與控制成為預防心腦血管疾病、腫瘤發生的重中之重。大量研究表明，環境因素和遺傳因素在肥胖的發生和發展中發揮重要的作用，遺傳因素增加了機體發生肥胖的危險性。肥胖風險的高低是遺傳基礎(內因)和暴露環境因素(生活習慣、生活方式、飲食特點和運動量等外因)相互作用的結果，決定某個個體是否易於患病，稱之為易患性(liability)。肥胖屬於多基因遺傳病，其發生並非是某個單一基因作用的結果，而是若干作用微小但有累積效應的致病基因決定某個個體患病的風險，稱之為易感性(susceptibility)。脂聯素是脂肪組織特異性分泌的一種膠原樣細胞因子。脂聯素由244個胺基酸組成，脂聯素在血漿中含量豐富。大量研究證實，血漿脂聯素水平與體重指數(BMI)、胰島素和甘油三脂(TG)水平呈 負相關。人脂聯素基因(Adiponectin gene或者APM1)定位於染色體3q27，大小為17kb，由3個外顯子和2個內含子組成。臨床研究表明，脂聯素基因多態性位點與肥胖有關。體脂量和肥胖症相關基因(fat-massand obesity-associated gene, FTO)位於染色體16ql2，屬於非血紅色加雙氧酶家族，編碼22酮戊二酸2依賴型核酸脫甲基酶。2007年，Frayling等率先報導了位於FTO基因第I內含子的rs9939609與成人和兒童肥胖具高度相關性，隨後在歐洲兒項獨立研究中，也分別報導了該基因多態性與高加索人群、西班牙人群BMI和肥胖的相關性。此後大量的研究證實，在中國漢族入中rs8050136、rs9939609多態性均與肥胖風險有密切的關聯性。大量實驗證實，G蛋白B3亞單位(G-protein 133 subunit,GNB3)基因第10外顯子多態位點C825T的單核苷酸多態性與肥胖存在相關性。研究還發現，GNB 3基因中第10個外顯子的825位，發生了胞嘧啶核苷酸(C)和胸腺核苷酸(T)的改變。該改變激活了一個隱蔽的剪切位點，選擇性地對外顯子9進行了剪切，造成外顯子9轉錄的mRNA核苷酸序列第498 620bp的缺失，引起其編碼的41個胺基酸的減少，導致GNB3結構少了一個WD螺旋區域，從而使B3亞單位的結構發生改變。p3亞單位結構的改變，增強了 G蛋白的活性，Gict2亞單位的表達量相應增加。由於Gict2分子的表達增加會導致脂肪細胞過度增生及細胞內脂質堆積，因此最終會引發肥胖的產生。脂蛋白脂酶基因(lipoprotein lipase, LPL)是脂肪分解過程的關鍵酶，可催化乳糜微粒CM與極低密度脂蛋白VLDL核心中的甘油三酯TG分解，向組織提供產能所需的游離脂肪酸，並促進各種脂蛋白之間的相互轉換，又稱為TG水解酶。臨床研究提示，LPL(HindIII)的單核苷酸多態性與肥胖有明顯的相關性。黑素皮質素受體-4(melanocortin_4receptor, MC4R)是下丘腦腹內側核分泌的一類肽類物質，為黑素皮質素受體家族5個亞型(MC1-5R)之一。在哺乳動物中，MC4R具有介導瘦素蛋白(Ieptin)的功能，是一個調節能量平衡與能量動態平衡的重要信號分子，可與其內源性配體黑素皮質素激素(melanocortin, MC)或刺鼠色蛋白(agouti protein,agouti蛋白)和agouti相關蛋白(agouti related protein, AGRP)相結合，從而在控制食慾和體重穩態中起關鍵作用。因此，MC4R在人類肥胖研究中作為重要的調節因子倍受關注。全基因組關聯分析發現，MC4R基因(rsl2970134)多態性與肥胖密切相關，參與控制食慾和增加能量消耗，進而調節體重。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferato-activated receptor,PPAR- Y )是由配體激活的核轉錄因子，屬II型核受體超家族成員。PPAR-Y2基因外顯子B的第12密碼子34位核苷酸C-G突變，導致第12位的脯氨酸替換為丙氨酸，即Prol2Ala是PPAR- Y 2最常見的多態位點。近年來研究顯示，PPAR- Y 2與脂肪細胞分化、肥胖、胰島素抵抗關係密切。

1997 年 Fleury 等發現了解偶聯蛋白 2(uncoupling protein 2,UCP2)基因，並將其定位於人類染色體llql3，該基因編碼蛋白質的胺基酸序列與以往報導的UCPl蛋白具有59%的一致性。UCP2蛋白廣泛表達於人體各種組織，通過參與線粒體呼吸過程的解偶聯作用產熱，從而調節機體的能量消耗。大量臨床報導，UCP2 (Ala55Val)多態性與肥胖有密切相聯。研究發現，β 3-腎上腺能受體(β 3-adrenergic receptor, β 3-AR)對調節人體能量平衡發揮重要作用。i3 3-AR(Trp64Arg)基因變異可增加肥胖和糖尿病的易感性。

發明內容
基於循證醫學的基本原則，採用病例-對照研究和隊列研究相結合的方法，並將回顧性研究與前瞻性研究相結合，通過文獻檢索、證據評價、信息提取、H-W遺傳平衡檢驗、同質性檢驗、大樣本Meta分析等一系列嚴格的篩選和實驗驗證過程，綜合考慮和分析各個基因位點與肥胖的關聯度(0R值)、人群中基因型發生頻率、發病機理、信號通路等，最後確定8個肥胖相關的易感性基因，共計9個基因位點。本發明提供一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，通過聯合檢測多個核酸(DNA 和 RNA)分子標記，包括:APMI (+45)、FTO (rs9939609)、FTO (rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL(HindIII)、MC4R (rsl7782313)、PPAR- y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp64Arg)上基因多態性位點，來評估和篩選肥胖的遺傳易感性。該試劑盒的特徵是上述基因位點的特異性擴增引物對及DNA測序引物對包括:用於檢測APMI基因上+45基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；
用於檢測FTO基因上rs9939609基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測FTO基因上rs8050136多基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測GNB3基因上825C/T基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測LPL3基因上HidIII基因多態性位點的特異性弓丨物對及DNA測序引物對；用於檢測MC4R基因上rsl7782313基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序弓丨物對；用於檢測PPAR Y 2基因上Prol2Ala基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對； 用於檢測UCP2基因上Ala55Val基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；用於檢測β 3-AR基因上Trp64Arg基因多態性位點的特異性引物對及DNA測序引物對；PCR反應試劑組份(包括:緩衝液，MgCl2溶液，UdNTPs, dNTPs，特異性引物對，TaqDNA聚合酶，UNG酶，模板DNA，純水等)；PCR產物酶解試劑組份(包括:SAP酶，ExoL酶MIX，純水等)；DNA測序反應試劑組份(包括:EDTA，無水乙醇，70%預冷乙醇，去離子甲醯胺(H1-Di Formamide)，PCR 酶解產物，BigDye Mix, DNA 測序引物，純水等)。本試劑盒所述的特徵是APMI (+45)、FTO (rs9939609)、FTO (rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL (HindIII)、MC4R(rsl7782313)、PPAR y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp64Arg)上九個基因多態性位點同時進行聯合檢測。本試劑盒所述的特徵是九個特異性擴增引物對分別針對APMI (+45)、FT0(rs9939609)、FTO (rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL(HindIII)、MC4R(rsl7782313)、PPAR- y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp64Arg)上基因多態性位點，能特異性擴增出DNA片段。本發明的九個特異性引物可用常規的合成方法進行合成，這些引物本領域的技術人員可以輕易地進行設計、合成和使用等。本試劑盒所述的特徵是九個DNA測序引物對分別針對APMI (+45)、FT0(rs9939609)、FTO(rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL(HindIII)、MC4R(rsl7782313)、PPAR- y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp64Arg)上基因多態性位點，能特異性進行DNA片段的序列檢測。本發明的九個DNA測序引物對可用常規的合成方法進行合成，這些引物本領域的技術人員可以輕易地進行設計、合成和使用等。本試劑盒所述的特徵是所述試劑盒的組成與含量包括: (I) PCR反應試劑組份:單個PCR反應體系包括:10 X PCR緩衝液2.5 μ I，25mMMgCl2 溶液 2.5μ l，25mM UdNTPs 0.2 μ l,25mM dNTPs 0.2 μ 1，20 μ M 特異性引物對中的一對引物0.5 μ I，5U/ μ I混合酶(Taq DNA聚合酶與UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (50ng)，加純水至25μ1。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防汙染體系，經加熱可以選擇性地降解U-DNA,以防止PCR擴增產物的汙染。(2) PCR產物酶解試劑組份:2 μ I SAP酶+ExoL酶MIX。(3) DNA測序反應試劑組份:有兩部分組成:測序反應體系和測序產物純化。單個DNA測序反應體系包括:3 μ I PCR酶解產物，I μ I測序試劑(25% BigDye Mix)，I μ I DNA測序引物對(使用其中一個引物)，I μ I純水。測序產物純化包括:100mM EDTA 2 μ 1，16 μ I無水乙醇,70%預冷乙醇70μ 1X2,10μ I去離子甲醯胺(Hi_Di Formamide)等。上述三個組份的保存溫度為_20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發明，實施例僅用於說明目的，而不用於限制本發明範圍。下列實施例中未做詳細說明和具體描述的實驗條件和實驗方法，應為常規實驗條件和方法，或按廠家提供的操作步驟和方法進行。實施例本試劑盒的使用1、樣本基因組DNA的獲取:用清水漱口一到二次，去除口腔中的食物殘渣，並注意咽盡口腔中剩餘的清水。用棉籤刮取口腔黏膜脫落細胞並將其放入Eppendorf管的細胞固定液中，擰緊瓶蓋備用。2、DNA抽提及純化:用細胞裂解法提取中的DNA，懸浮於Iml生理鹽水中，2000 X g離心IOmin ;棄上清，每管加Iml生理鹽水重複洗滌一次，再2000 X g離心IOmin ;棄上清，每管加 400 μ I 細胞裂解緩衝液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8.0 ；0.1mol EDTA, PH 8.0 ；0.5%SDS)，放在50°C水浴中溫育30分鐘；然後冷卻至室溫，加等體積的酚一氯仿一異戊醇(體積比25: 24:1),混勻，5000Xg離心IOmin ;轉移上層水相到另一 Eppendorf管中，重複抽提一次；再轉移上層水相到另一 Eppendorf管中，加1/10體積的3M NaAc (pH5.2)，混勻;加入2.5倍體積的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉澱DNA 30分鐘；10000Xg離心15分鐘，棄上清；加Iml 70%冷乙醇清洗沉澱，10000 Xg離心分鐘，棄上清；37°C溫箱30分鐘烘乾；將DNA沉澱溶於20 μ I TE緩衝液中，加20 μ g/ml胰RNA酶I μ I，37°C溫浴30分鐘，置於-20°C保存。3、採用PCR方法擴增目標DNA片段:(I)本試劑盒的特點是使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防汙染體系，經加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴增產物的汙染。(2)本試劑盒的PCR反應試劑組份由PCR反應液體積21 μ 1、5U/ μ I混合酶(TaqDNA聚合酶與UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (約50ng)組成。PCR反應液包括:10 X PCR緩衝液 2.5 μ I，25mMMgCl2 溶液 2.5 μ I，25mM UdNTPs 0.2 μ I，25mM dNTPs 0.2 μ I。(3)PCR反應試劑組份準備:試劑開管前請完全解凍後充分混勻並短暫離心。建議在DNA提取結束後配製混合反應液，並立即加樣。如特殊情況，可將下述分裝好的混合反應液短期存於4°C,並在3小時內使用。(4)PCR反應試劑組份配製:按每個PCR反應液體積21 μ1、混合酶I μ 1，模板DNA3μ 1，乘以所需的反應管數，計算試劑的量，加於一個無菌離心管中，振蕩混勻。再用微量加樣器在每一 PCR反應管內加入25 μ I上述混勻的混合反應液。

(5) PCR反應試劑組份加樣:在上述分裝好的裝有混合反應液的PCR反應管中分別加入模板DNA和陰性對照各3 μ I。S卩:單個PCR反應體系組分，見表1:
表I單個PCR反應試劑組份
權利要求
1.本發明提供了一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是包括以下步驟: 獲得受檢者的體液，毛髮，血液或細胞組織等樣本； 提取樣本中的核酸(DNA和RNA)； 通過聯合檢測多個核酸(DNA和RNA)分子標記的方法獲得受檢者的遺傳信息； 對相關的生物信息進行數據處理與統計分析，從而評估該受檢者的肥胖易感性。
2.根據權利要求1所述的一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是聯合檢測多個核酸(DNA 和 RNA)分子標記，包括:APMI (+45)、FTO (rs9939609)、FTO (rs8050136)、GNB3 (825C/T)、LPL (HindIII)、MC4R(rsl7782313)、PPAR y 2 (Prol2Ala)、UCP2 (Ala55Val)、β 3-AR(Trp/Arg)。
3.根據權利要求1所述的一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述核酸(DNA和RNA)分子標記的檢測方法，包括: 各種DNA測序的方法； 各種螢光定量PCR方法； 各種生物晶片檢測方法； 通過各種突光標記與雜交技術檢測核酸(DNA和RNA)分子標記的方法。
4.根據權利要求1所述的一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述核酸(DNA和RNA)分子標記，包括: 單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)；拷貝數多態性(copy number polymorphism, CNP)；微衛星 DNA (short tandem repeat, STR)； 限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)； 隨機擴增多態性 DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)； 特定序列位點(sequence-tagged site, STS)； 擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)。
5.根據權利要求1所述的一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述九個核酸(DNA和RNA)分子標記的特異性擴增引物對及DNA測序引物對。
6.據權利要求1所述試劑盒，其特徵是使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防汙染體系，經加熱可以選擇性地降解U-DNA，以防止PCR擴增產物的汙染，確保實驗結果的可靠性。
7.根據權利要求1所述的一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述試劑盒的組成與含量，包括:(I) PCR反應試劑組份；(2) PCR產物酶解試劑組份；(3) DNA測序反應試劑組份。
8.根據權利要求1所述的一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述試劑盒的可應用於受檢者個體肥胖的遺傳風險評估，有利於專家和受檢者根據基因分型的結果，進行個性化的健康管理及幹預指導。
9.根據權利要求1所述的一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是所述試劑盒的可應用於已經患肥胖人群的檢測，有利於專家和受檢者根據基因分型的結果實現個性化治療和個性化保健。
全文摘要
本發明提供了一種肥胖基因易感性和預警檢測試劑盒，其特徵是聯合檢測多個核酸(DNA和RNA)分子標記，包括APMI(+45)、FTO(rs9939609)、FTO(rs8050136)、GNB3(825C/T)、LPL(HindIII)、MC4R(rs17782313)、PPARγ2(Pro12Ala)、UCP2(Ala55Val)、β3-AR(Trp/Arg)。該試劑盒包括上述多態性位點的特異性擴增引物對及DNA測序引物對，以及PCR反應試劑組份，PCR產物酶解試劑組份，DNA測序反應試劑組份。通過本發明的試劑盒檢測，並對相關的基因信息進行數據處理與統計分析，可以評估受檢者的肥胖易感性。
文檔編號C12Q1/68GK103074415SQ201210128350
公開日2013年5月1日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者肖自力, 崔春黎, 紀燕燕 申請人:上海金防生物科技有限公司