一種快速檢測副豬嗜血桿菌血清4型的方法與流程
2023-12-08 20:22:06
本發明涉及病原菌的快速檢測方法技術領域，尤其是涉及一種快速檢測副豬嗜血桿菌血清4型的方法。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(haemophilusparasuis,hps)是一種重要的豬呼吸道病原菌，目前已至少鑑定出15個血清型，不同血清型菌株之間存在高毒力、中等毒力和無毒力等顯著差異，鑑定hps血清型對該病的診斷和防治具有重要意義。hps血清4型是高毒力菌株，又是我國目前流行最多、分布範圍最廣的血清型之一。目前該菌常規血清型鑑定方法為細菌分離培養和鑑定的基礎上，通過瓊脂擴散試驗與hps所有血清型的陽性血清進行反應來判定血清型，通常需要3-5天的時間，費時費力，而且約有30％的hps分離菌株不能被準確鑑定出血清型，嚴重影響副豬嗜血桿菌病的快速診斷和檢測。
環介導等溫擴增技術(lamp，國際專利公開號wo00/28082)是2000年notomi等開發出的一種核酸擴增新技術，即針對靶基因的6個區域設計4條特異性引物(如需要還可以添加環引物對)，利用一種鏈置換dna聚合酶(bstdnapolymerase)在65℃左右恆溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴增反應，擴增結果可通過凝膠電泳進行檢測。用於lamp技術擴增的2對引物是針對靶基因序列的6個區段，因而具有比pcr更高的特異性，同時也具備不需要熱循環、擴增效率更高、不需要特殊儀器等優點。
副豬嗜血桿菌感染的流行病學研究主要利用血清學分型方法開展，即在hps分離培養和鑑定的基礎上，通過瓊脂擴散試驗與hps所有血清型的陽性血清進行反應來判定血清型，通常需要3-5天的時間，費時費力，而且約有30％的hps分離菌株不能被準確鑑定出血清型，嚴重影響副豬嗜血桿菌病的快速診斷和檢測。
技術實現要素：
本發明的技術目的是建立一種簡便、快速、高靈敏度、高特異性、高準確度的hps血清4型lamp檢測方法。
為快速準確地鑑定hps血清4型，本發明參考genbank發表的副豬嗜血桿菌sw124菌株的脂多糖合成蛋白(lipopolysaccharidebiosynthesisprotein，wcip4)基因序列(登錄號kc795356.1)，運用引物設計軟體primerexplorer4.0，在線進行lamp引物設計。按照引物設計原則，針對其6個特定區域設計4條引物：兩條外引物分別為上遊外引物(f3)和下遊外引物(b3)；兩條內引物分別為上遊內引物(fip)和下遊內引物(bip)，fip由f1的互補序列和正向序列f2構成，bip由b1的互補序列和正向序列b2構成，靶基因片段即為上遊外引物f3與下遊外引物b3之間的基因序列。依據primerexplorer4.0設計的引物，可獲得多個靶基因片段，然後運用blast進行序列比對，篩選出wcip4基因特異性高且高度保守的靶基因片段(如seqidno.5所示)。創新性發現，此wcip4基因特異性片段經lamp方法擴增，僅在恆溫條件下(62℃)反應60分鐘，即可將目的dna從幾個拷貝擴增到109個拷貝，通過電泳檢測擴增產物來判定結果。故而可作為一種運用lamp技術快速檢測hps血清4型方法的分子標記使用。
在此基礎上，本發明進一步提供一組環介導等溫擴增引物，其可特異性環介導等溫擴增所述的分子標記。根據一種優選的實施方式，所述引物組包括上遊外引物f3和下遊外引物b3，其核苷酸序列如seqidno.1-2所示；以及上遊內引物fip和下遊內引物bip，其核苷酸序列如seqidno.3-4所示。
更進一步，本發明提供一種快速檢測hps血清4型的方法，以待測樣品細胞基因組dna為模板，利用上述的特異性引物組進行環介導等溫擴增反應。所述待測樣品細胞基因組dna可以將待測樣品經常規細菌培養後提取細菌基因組dna。
所述的方法，還包括步驟：設置陰性對照模板和陽性對照模板，陰性對照模板為超純水，陽性對照模板為hps血清4型參考菌株hs79基因組dna；利用凝膠電泳對環介導等溫擴增產物進行檢測，電泳結果出現特徵性梯度狀電泳條帶判定為陽性，若無任何擴增產物則為陰性。
所述環介導等溫擴增反應的反應體系包括：10×lampbufffer：2.5μl；10mmol/l的dntps：3.0μl；0.25mol/l的mgso4：0.2μl；5mol/l的betaine：0.5μl；10μmol/l的fip引物：2.0μl；10μmol/l的bip引物：2.0μl；10μmol/l的f3引物：0.5μl；10μmol/l的b3引物：0.5μl；8u/μl的bstdna聚合酶：0.7μl；模板dna：1.0μl；用滅菌超純水補足體系至25μl；
其中10×lampbufffer組成：200mmol/ltris-hcl，100mmol/lkcl，20mmol/lmgso4，100mmol/l(nh4)2so4，1.0％tritonx-100。
所述環介導等溫擴增反應的反應條件如下：95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然後62℃反應60min，最後80℃反應10min終止反應。
所述方法中使用的試劑優選製作為快速檢測hps血清4型的試劑盒，包括所述特異性引物組。
優選的包括：
10×lampbufffer：2.5μl；10mmol/l的dntps：3.0μl；0.25mol/l的mgso4：0.2μl；5mol/l的betaine：0.5μl；10μmol/l的fip引物：2.0μl；10μmol/l的bip引物：2.0μl；10μmol/l的f3引物：0.5μl；10μmol/l的b3引物：0.5μl；8u/μl的bstdna聚合酶：0.7μl；模板dna：1.0μl；使用時用滅菌超純水補足體系至25μl；
其中10×lampbufffer組成：200mmol/ltris-hcl，100mmol/lkcl，20mmol/lmgso4，100mmol/l(nh4)2so4，1.0％tritonx-100。
本發明通過提供一種hps血清4型的特異性基因片段及具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測樣品中是否存在hps血清4型特異性基因片段進而確定樣品是否為hps血清4型。本發明檢測試劑和檢測方法具有敏感性高(對hps血清4型基因組dna的檢測敏感度為1.0pg，對副豬嗜血桿菌血清4型菌液的檢測敏感度為1.6×102cfu/ml)、特異性強(僅檢測hps血清4型參考菌株和分離菌株為陽性，而對hps其它血清型參考和分離菌株、以及其它種屬的細菌檢測均為陰性)、方便快捷(整個檢測在3小時內完成，與現有的瓊脂擴散試驗檢測血清型相比省時2-3天)、不需要特殊儀器(在恆溫水浴鍋中就可反應)、適用範圍廣(適用於獸醫科研檢測實驗室、檢驗檢疫部門、養殖企業等)等優點，可解決hps血清4型的現場快速檢測和基層普及應用的難題。
附圖說明
圖1：lamp檢測hps不同血清型菌株的特異性結果，其中m：dl2000dnamarker；1-17孔所用模板對應的菌株與表3中的菌株序號一致，其中第5孔出現陽性條帶，為hps血清4型參考菌株hs79。
圖2：lamp檢測其它種屬細菌菌株的特異性結果，其中m：dl2000dnamarker；1-20孔所用模板對應的菌株與表4中的菌株序號一致，第20孔為hps血清4型參考菌株hs79作為陽性對照。
圖3：lamp檢測hps血清4型基因組dna的敏感性結果，其中m：dl2000dnamarker；模板dna的量分別標註於泳道上面，檢測結果顯示本發明的檢測限為1.0pg。
圖4：lamp檢測hps血清4型菌液的敏感性結果，其中m：dl2000dnamarker；泳道上面的標註為菌液的稀釋度，檢測結果顯示本發明的檢測限為4個菌，敏感性為0.16cfu/μl(1.6×102cfu/ml)。
圖5：lamp檢測臨床分離hps菌株結果，其中m：dl2000；1-21孔所用模板對應的菌株與表5中的菌株序號一致，結果顯示只有孔道1-14這14株hps血清4型菌株出現典型的梯狀條帶，其它血清型菌株均為陰性。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例1lamp引物的設計和合成
參考genbank發表的副豬嗜血桿菌sw124菌株的脂多糖合成蛋白(lipopolysaccharidebiosynthesisprotein，wcip4)基因序列(登錄號kc795356.1)，運用引物設計軟體primerexplorer4.0，在線進行lamp引物設計。按照引物設計原則，針對其6個特定區域設計4條引物：兩條外引物分別為上遊外引物(f3)和下遊外引物(b3)；兩條內引物分別為上遊內引物(fip)和下遊內引物(bip)，fip由f1的互補序列和正向序列f2構成，bip由b1的互補序列和正向序列b2構成，靶基因片段即為上遊外引物f3與下遊外引物b3之間的基因序列。依據primerexplorer4.0設計的引物，可獲得多個靶基因片段，然後運用blast進行序列比對，篩選出wcip4基因特異性高且高度保守的靶基因片段(如seqidno.5所示)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物名稱和序列見表1。
表1lamp所用引物名稱及序列
實施例2用作模板的hps細菌基因組dna提取
取分離培養的hps菌株，劃線培養於添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，於37℃溫箱中培養過夜。自培養平板上挑取單菌落接種於5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養基中，於37℃搖床中振搖培養過夜。取過夜培養的菌液1ml，離心後棄上清液，菌沉澱重懸於50μl超純水中，煮沸5min裂解細菌後，離心取上清液1.0μl用於lamp反應模板。
實施例3lamp反應體系的建立
lamp反應體系總量為25μl，反應組分見表2。
表2lamp反應體系的組分及添加量
lamp反應在pcr儀中進行，首先95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然後62℃反應60min，最後80℃反應10min終止反應。利用瓊脂糖凝膠電泳對lamp擴增產物進行檢測，電泳結果出現特徵性梯度狀電泳條帶判定為陽性，若無任何擴增產物則為陰性。
實施例4具體檢測方法的建立
(1)細菌培養。取擬鑑定血清型的hps分離菌株，接種於5ml添加終濃度100μg/ml煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的胰酶大豆肉湯(tsb)培養基中，於37℃搖床中振搖培養過夜。
(2)細菌基因組dna的提取。取過夜培養的菌液1ml，離心後棄上清液，菌沉澱重懸於50μl超純水中，煮沸5min裂解細菌後，離心取上清液1.0μl作為lamp反應模板。
(3)hps菌株的lamp檢測。按照表2中的lamp反應體系將除bstdna聚合酶外的其它組分加入0.2ml反應管中，放入pcr儀中，95℃變性5min，取出樣品冰浴，加入bstdna聚合酶，然後62℃反應60min，最後80℃反應10min終止反應。同時設置陰性對照和陽性對照。
(4)lamp擴增產物的電泳檢測。利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測：取9μllamp擴增產物加1μl10×上樣緩衝液混勻，以dl2000dnamarker作為相對分子量標準，用含核酸染色劑的1.5％瓊脂糖凝膠在100v電壓下電泳約30min，於凝膠成像系統中拍照分析結果。電泳圖片顯示lamp特徵性梯度狀條帶，則結果為陽性；如無任何條帶則結果為陰性。
實施例5特異性實驗
取甘油保存的hps不同血清型菌株，劃線培養於添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，於37℃溫箱中培養過夜。自培養平板上挑取單菌落接種於5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養基中，於37℃搖床中振搖培養過夜。針對用於鑑定lamp菌種間特異性試驗所用的其它種屬細菌菌株，同樣取適量甘油保存的相應菌株，劃線培養於tsa平板，於37℃溫箱中培養過夜。自培養平板上挑取單菌落接種於5mltsb培養基中，於37℃搖床中振搖培養過夜。利用promega公司的細菌全基因組dna提取試劑盒抽提細菌基因組dna，操作步驟簡述為：取2ml培養12～16h的菌液至1.5ml離心管；13,000rpm離心2min，棄淨上清，留取菌體沉澱；加入600μlnucleilysissolution，輕輕吹打至沉澱重懸；80℃培養5min，使菌體裂解，然後使其冷卻至室溫；加入3μlrnasesolution，顛倒2～5次，混勻；水浴37℃培養30min，並冷卻至室溫；加入200μlproteinprecipitationsolution，高速渦旋振蕩20s；將樣品在冰上放置5min；13,000rpm離心10min；將含有dna的上清液轉移至一個乾淨的的裝有600μl異丙醇的1.5ml離心管；輕輕顛倒混勻直至出現線狀dna；13,000rpm離心5min；輕輕倒出上清液，並用乾淨的吸水紙將管內殘液吸乾；加入600μl70％乙醇，輕輕顛倒幾次；13,000rpm離心2min，小心吸出乙醇；將離心管在空氣中晾10～15min，至乙醇完全蒸發；加入100μldnarehydrationsolution，65℃培養1h水化dna，並定期敲打離心管，也可在4℃過夜水化dna；將提取的dna保存於-20℃。提取的模板dna通過凝膠電泳和紫外分光光度計分析其質量和濃度。核酸濃度測定：用紫外分光光度計分別測定核酸在260nm和280nm處的紫外吸收值，以260nm和280nm處的紫外吸收值的比值計算純度，高質量dna的od260/280的值在1.8左右。細菌基因組dna完整性測定：取3μl提取的模板dna溶液電泳，選用的電泳膠為1.0％的瓊脂糖凝膠，在紫外投射儀下檢測dna的大小，根據其亮度和擴散管程度來判斷dna的完整性。
(1)lamp檢測hps不同血清型菌株的特異性
分別以表3中的17株副豬嗜血桿菌不同血清型的參考菌株基因組dna作為模板，利用lamp反應體系和程序進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定hps血清型特異性。檢測結果見表3和圖1，hps血清4型參考菌株hs79的孔內有明顯的階梯狀條帶，其它血清型孔內無條帶出現，表明本發明的lamp反應體系對hps不同血清型菌株具有高特異性。
(2)lamp檢測其它種屬細菌菌株的特異性
分別以表4中的19株其它種屬細菌菌株基因組dna作為模板，利用優化後的lamp反應體系和程序進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定lamp方法對其它種屬細菌的特異性。檢測結果見表4和圖2，hps血清4型參考菌株hs79的孔內有明顯的階梯狀條帶，其它種屬細菌菌株孔內無條帶出現，表明本發明的lamp反應體系對其它種屬細菌菌株具有高特異性。
表3lamp檢測hps不同血清型菌株的特異性
註：檢測結果中「-」為陰性；「+」為陽性。
表4lamp檢測其它種屬細菌菌株的特異性
註：檢測結果中「-」為陰性；「+」為陽性。
實施例6敏感性實驗
(1)lamp檢測hps血清4型基因組dna的敏感性
取甘油保存的hps血清4型參考菌株hs79，劃線培養於添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆瓊脂(tsa)平板上，於37℃溫箱中培養過夜。自培養平板上挑取單菌落接種於5ml添加終濃度100μg/mlnad的胰酶大豆肉湯(tsb)培養基中，於37℃搖床中振搖培養過夜。利用promega公司的細菌全基因組dna提取試劑盒抽提細菌基因組dna，操作步驟簡述為：取2ml培養12～16h的菌液至1.5ml離心管；13,000rpm離心2min，棄淨上清，留取菌體沉澱；加入600μlnucleilysissolution，輕輕吹打至沉澱重懸；80℃培養5min，使菌體裂解，然後使其冷卻至室溫；加入3μlrnasesolution，顛倒2～5次，混勻；水浴37℃培養30min，並冷卻至室溫；加入200μlproteinprecipitationsolution，高速渦旋振蕩20s；將樣品在冰上放置5min；13,000rpm離心10min；將含有dna的上清液轉移至一個乾淨的的裝有600μl異丙醇的1.5ml離心管；輕輕顛倒混勻直至出現線狀dna；13,000rpm離心5min；輕輕倒出上清液，並用乾淨的吸水紙將管內殘液吸乾；加入600μl70％乙醇，輕輕顛倒幾次；13,000rpm離心2min，小心吸出乙醇；將離心管在空氣中晾10～15min，至乙醇完全蒸發；加入100μldnarehydrationsolution，65℃培養1h水化dna，並定期敲打離心管，也可在4℃過夜水化dna；將提取的dna保存於-20℃。提取的模板dna通過凝膠電泳和紫外分光光度計分析其質量和濃度。核酸濃度測定：用紫外分光光度計分別測定核酸在260nm和280nm處的紫外吸收值，以260nm和280nm處的紫外吸收值的比值計算純度，高質量dna的od260/280的值在1.8左右。細菌基因組dna完整性測定：取3μl提取的模板dna溶液電泳，選用的電泳膠為1.0％的瓊脂糖凝膠，在紫外投射儀下檢測dna的大小，根據其亮度和擴散管程度來判斷dna的完整性。
以濃度為100ng/μl的hps血清4型參考菌株hs79基因組dna為初始模板，分別以超純水進行系列稀釋，每個梯度各取1μl加入反應管中，反應體系中細菌基因組dna的量分別為100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、5pg、2.5pg、1.0pg、0.1pg、0.05pg、0.01pg、0.001pg，以超純水作為陰性對照，擴增後通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定敏感性結果。結果如圖3所示，從第7泳道至第14泳道均出現lamp反應典型的階梯狀電泳條帶，而且隨著模板dna濃度的增加，條帶亮度逐漸增強。結果表明，本發明建立的lamp方法最低限度能檢測到1.0pg的hps血清4型參考菌株hs79基因組dna，且隨著模板dna濃度的增加，lamp擴增產物量也隨之增多。
(2)lamp檢測hps血清4型菌液的敏感性
取甘油保存的hps血清4型參考菌株hs79，劃線培養於添加終濃度100μg/mlnad的tsa平板上，於37℃溫箱中培養過夜。自培養平板上挑取單菌落接種於5ml添加終濃度100μg/mlnad的tsb培養基中，於37℃搖床中振搖培養過夜。經分光光度計測得菌液濃度od600為0.6，將菌液用超純水倍比稀釋至10-11，從10-6、10-7和10-8管中各取出100μl分別塗在tsa平板上，過夜培養後計算細菌的菌落數。同時從每個稀釋度管中取出1μl作為模板dna進行lamp擴增，擴增後通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定敏感性結果。結果如圖4所示，從第9泳道至第13泳道均有典型的梯狀條帶，最低限度至少能檢測到10-5。平板計數結果顯示在10-7培養基中是80cfu/ml、10-6培養基中是400cfu/ml，倍比計算得到10-5約4000cfu/ml，模板取量為1μl，所以該lamp反應檢測的最低含菌量為4個菌，即靈敏性為0.16cfu/μl(1.6×102cfu/ml)。
實施例7lamp檢測臨床分離hps菌株
取表5中的21株hps臨床分離株(已利用瓊脂擴散試驗鑑定血清型)，分別過夜培養後取菌液1ml，離心後棄上清液，菌沉澱重懸於50μl超純水中，煮沸5min裂解細菌後，離心取上清液1.0μl用於lamp反應用模板dna。以優化後的lamp反應體系及程序進行擴增，核酸電泳觀察lamp擴增結果。lamp檢測結果如圖5所示，在所有hps分離菌株中，只有14株血清4型菌株出現典型的梯狀條帶，其它血清型菌株均為陰性反應，提示本發明建立的lamp檢測方法可用於臨床hps分離株血清4型的檢測和鑑定。
表5lamp檢測臨床分離hps不同血清型菌株的結果
註：檢測結果中「-」為陰性；「+」為陽性。
序列表
北京市農林科學院
一種快速檢測副豬嗜血桿菌血清4型的方法
p1710133
5
patentinversion3.5
1
19
dna
人工序列
1
agagtttctttttcgagaa19
2
20
dna
人工序列
2
ataaatcttcaggatgagaa20
3
52
dna
人工序列
3
cagctctagaaaccaaataactacacttcttaattcccctttttatggattc52
4
58
dna
人工序列
4
gtggaaagattgtatcatgtacataaaaagacctttgatactagattgaatagcaaga58
5
224
dna
wcip4基因片段
5
agagtttctttttcgagaaaatataaaaattcttaattcccctttttatggattcttttt60
atatcgaacgtgtagttatttggtttctagagctgttgtggaaagattgtatcatgtaca120
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