一種檢測用生物標記物及應用的製作方法

2023-12-09 04:21:41 1

專利名稱：：一種檢測用生物標記物及應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬生物
技術領域：
，涉及一種胃癌生物標記物及其在胃癌診斷中的應用。
背景技術：
：胃癌是嚴重危害我國人民生命健康的重大疾病，其年齡標化發病率和死亡率均居我國常見惡性腫瘤年齡標化發病率和死亡率的第二位。由於絕大多數胃癌患者缺乏特異性臨床症狀，目前早期胃癌的診斷率較低，其病例僅佔胃癌手術病例的10-20%，就診的患者大多處於胃癌的中晚期，其五年生存率仍徘徊於20-30%。胃癌的發生是機體遺傳因素和外界環境因素相互作用、多基因參與、多步驟發生的過程。近年研究結果顯示，各分子事件之間存在以關鍵調控基因為重要節點的多中心調控網絡，這些重要節點通過各種信號傳導通路參與正常胃黏膜到胃癌這一複雜的演變過程。目前胃癌的臨床診斷主要依據組織學形態觀察結果，而未應用胃癌特徵性分子事件變化對上述病變進行分型和分級，因此上述病變的分型和分級具有較大的人為主觀性，且無法為患者提供個性化治療。而現有的腫瘤標記物如CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的陽性率約60%，但敏感性和特異性均不高，並與其他腫瘤存在交叉。因此，我們迫切需要了解胃癌發生發展的分子機制，尋找新的生物標記物和藥物靶標來早期診斷胃癌和有效治療胃癌。MicroRNA(miRNA)是一類長度約1925個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,廣泛存在於植物、線蟲、果蠅和哺乳動物等生物中，主要通過不完全互補的方式與編碼蛋白mRNA的3'-UTR區結合引起靶mRNA的降解、活性降低或翻譯受抑，從而在轉錄後水平對基因表達進行調控。研究表明miRNA幾乎在所有的生物學過程中發揮重要的調控作用，包括個體發育、細胞增殖、分化、代謝、凋亡和應激等。約50。/。的已知人類miRNA基因定位於和腫瘤相關的染色體區域，而不斷累積的研究成果也已充分證實miRNA的異常表達與腫瘤的發生、發展密切相關。最新的數據顯示腫瘤組織普遍具有特徵性的miRNA表達譜，即腫瘤細胞某幾種miRNA表達水平常與同一組織中的正常細胞存在顯著的差異，而特徵性的miRNA異常表達可望作為有效工具用於腫瘤的診斷、病理分級、臨床分期、預後和對治療的反應性等，顯示了良好的臨床應用前景。因此，開發一種可輔助胃癌診斷的miRNA作為生物標記物，具有廣泛的科研價值和臨床應用前景。
發明內容本發明的目的在於提供一種檢測用生物標記物，以檢測樣本中microRNA-375(miR-375)的表達量作為生物標記，以miR-375表達量小於等於0.2為臨界值。該生物標記物在胃癌組織中的表達量約為正常組織的四分之一。利用組織中miR-375的表達量作為生物標記，檢測胃癌的特異性達72.7%，敏感性達82.8%。本發明的另一個目的在於提供所述生物標記物在檢測胃癌組織中的應用。取氮凍存的組織1-3塊，使用mirVanamiRNAIsolation試劑盒(美國Ambion公司)提取總RNA，再使用miR-375特異的TaqmanMicroRNAAssays(美國AppliedBiosystems公司)試劑盒進行實時螢光定量PCR檢測；採用相對定量的方法，得到目標組織相對於參照組織miR-375的含量，參照組織為病理確診後的正常胃組織；以0.2為臨界值，miR-375表達量小於等於0.2的組織檢測認為是腫瘤組織，大於0.2的組織檢測認為是非腫瘤組織。本發明的有益效果在於1.提供的該生物標記物在胃癌組織中的表達量僅為正常組織的四分之一，該生物標記物的特異性72.7%,敏感性82.8%，具有敏感性和特異性高，操作方便等特點，有較高的診斷參考價值。2.有助於揭示腫瘤發生發展的分子生物學機制，為腫瘤的個體化靶向治療奠定基礎。圖1:手術胃癌組織中miR-375的相對定量。圖2:胃鏡組織中miR-375的相對定量。圖3:胃鏡組織中miR-375的相對定量(非腫瘤組vs.腫瘤組)。具體實施例方式本發明結合實施例和附圖作進一步的說明。實施例11、組織樣品的準備收集液氮凍存的胃癌手術切除樣本共34例，每例為腫瘤組織及癌旁非腫瘤組織各一塊，並收集液氮凍存的胃鏡樣本60例(29例胃癌組織和31例慢性淺表性胃炎組織)。2、組織總RNA提取使用mirVanamiRNAIsolationKit(Catalog#1560,1561,Ambion)試劑盒，根據試劑盒所提供的操作步驟，提取上述34例胃癌手術切除樣本及60例胃鏡樣本的總RNA(每塊組織取50毫克)，分裝-80。C冰箱凍存，直至檢測。3、Real-timePCR檢測miR-375表達量使用hsa-miR-375TaqmanMicroRNAAssays(AppliedBiosystems,P/N:4373151)檢測組織樣本中miR-375的表達量，Real-timePCR在Real-TimePCRDetectionSystem(ABI7500)上進行。逆轉錄PCR使用10ng總RNA和蓮環樣引物(looperprimer),20Real-timePCR體系中包含1.33逆轉錄PCR產物，lO[iL2xTaqmanUniversalPCRMasterMix，NoAmpEraseUNG(P/N4369016，AppliedBiosystems),l|aLrealtimeprimer(20xTaqmanMicroRNAAssaysMix,P/N4373027)。反應在96孔板中進行，95°C,10分鐘，繼以4個循環的95。C，15秒60°C,1分鐘。使用mRNAU6(RNU6B，P/N:4373381;AppliedBiosystems)作為內參。MiRNA的相對定量使用2'A^t算法計算。手術腫瘤樣本以同患者鄰近非瘤樣本作為參照，胃鏡樣本以病理鑑定為正常的胃組織作為參照。所得相對定量(RelativeQuantitation,RQ)取logl0對數，以便於使用t-檢驗統計。結果顯示，在33例受檢手術樣本中，胃癌組織中miR-375的表達量在87.9%的樣本中較癌旁非瘤組織有明顯的降低，平均降低倍數為3.94，差異有顯著性(參見圖l，p<0.01)。而在胃鏡樣本中，腫瘤組miR-375的表達量較非腫瘤組亦有明顯的降低，腫瘤組和非腫瘤組miR-375的表達量的幾何平均數分別為0.07497和0.33977，平均下降倍數為4.53，具統計學差異(參見圖2，3，p0.2的共5例，0.2的共22例，<=0.2共9例。miR-375作為診斷指標的特異性為72.7%(24/33)，敏感性為82.8%(24/29)。具體檢測結果參見表l。表l:miR-375診斷實驗結果tableseeoriginaldocumentpage6權利要求1.一種檢測用生物標記物，其特徵在於以檢測樣本中microRNA-375的表達量作為生物標記，以miR-375表達量小於等於0.2為臨界值。2.根據權利要求1所述的一種檢測用生物標記物，其特徵在於通過以下步驟實現取氮凍存的組織l-3塊，使用mirVanaTMmiRNAIsolation試劑盒提取總RNA,再使用miR-375特異的TaqmanMicroRNAAssays試劑盒進行實時螢光定量PCR檢測；採用相對定量的方法，得到目標組織相對於參照組織miR-375的含量，參照組織為病理確診後的正常胃組織；以0.2為臨界值，miR-375表達量小於等於0.2的組織檢測認為是腫瘤組織，大於0.2的組織檢測認為是非腫瘤組織。3.根據權利要求2所述的一種檢測用生物標記物，其特徵在於所述實時螢光定量PCR體系中包含1.33逆轉錄PCR產物，反應在96孔板中進行，反應條件是95°C，10分鐘，繼以4個循環的95。C，15秒60。C，1分鐘。4.根據權利要求1所述的一種檢測用生物標記物在檢測組織中胃癌miR-375表達量中的應用。全文摘要本發明提供一種檢測用生物標記物，以檢測樣本中microRNA-375的表達量作為生物標記，以miR-375表達量小於等於0.2為臨界值，miR-375表達量小於等於0.2的認為是腫瘤組織，大於0.2的認為是非腫瘤組織。本發明提供的生物標記物檢測胃癌的特異性72.7％，敏感性82.8％，具有敏感性和特異性高，操作方便等特點，有較高的參考價值，可在檢測胃癌組織中應用。本發明有助於揭示腫瘤發生發展的分子生物學機制，為腫瘤的個體化靶向治療奠定基礎。文檔編號C12Q1/68GK101423869SQ20081016315公開日2009年5月6日申請日期2008年12月18日優先權日2008年12月18日發明者玲丁,周天華,姒健敏,陳淑潔申請人:浙江大學;杭州博通胃腸病診治技術有限公司