多細胞因子－抗體複合物的製作方法

2023-12-08 23:21:01

專利名稱：多細胞因子－抗體複合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及構建和表達多細胞因子蛋白複合物及其組合物的方法。更具體地講，本發明涉及由多種細胞因子和一種靶向組分組成的融合蛋白，以及使用所述融合蛋白治療如癌症和病毒感染的疾病的方法。
背景技術：
控制免疫系統的調節網絡依賴於稱為細胞因子的分泌性蛋白信號分子開啟和關閉免疫細胞的功能以及調節它們的增殖。這些反應一般涉及協調產生所需要的生物效應的多種細胞因子。某些細胞因子如白介素-2(IL-2)可以單獨誘導免疫細胞增殖，並可以激活其它的功能，包括次級細胞因子分泌。另一種細胞因子白介素-12(IL-12)[綜述Trinchieri，1994，Blood 844008-4027]可誘導某些免疫細胞增殖，並可以誘導另一種關鍵免疫調節物γ幹擾素(IFN-γ)。這種對IFN-γ的誘導是IL-12的主要活性，但是IL-12具有其它重要的獨立於IFN-γ的活性。因為IL-12本身是在感染性疾病的早期被誘導，所以認為IL-12是聯繫先天免疫系統和後天免疫系統的紐帶。
對小鼠和人類免疫細胞的許多體外研究說明了細胞因子組合在產生最適免疫應答中的重要性。例如，大多數T細胞不表達IL-12受體(IL-12R)，直到它們被促細胞分裂原激活或在高濃度IL-2下培養才表達該受體[Desai等(1992)，J.Immunol.1483125-3132]。一旦表達IL-12受體，則所述細胞對IL-12的反應性要強得多。而且，IL-12誘導IFN-γ轉錄，但此後不久IFN-γmRNA就被降解。在IL-2存在時，IFN-γmRNA是穩定的，使產生的IFN-γ量急劇增加[Chan等(1992)J.Immunol.14892-98]。在其他研究中，發現IL-3+IL-11或IL-3+青灰因子的細胞因子組合與IL-12一起對早期造血祖細胞的增殖具有協同作用[以上引用的Trinchieri，1994]。IL-4和GM-CSF組合對刺激樹突細胞特別有用(Palucka等J.Immunology 1604587-4595)。為了刺激細胞介導的免疫應答，還可使用IL-12與IL-18的組合，IL-18是最近公開的一種具有某些IL-12互補活性的Th1-促進型細胞因子(Hashimoto等J.Immunology 163583-589；Barbulescu等J.Immunology 1603642-3647)。另外，IL-2與IFN-γ在某些情況下產生協同作用[Palladino，M.A.，美國專利第5,082,658號]。
在許多協同作用研究中，發現每種細胞因子的相對水平非常重要。儘管在存在次優量IL-2時加入IL-12在誘導增殖、溶細胞活性和IFN-γ誘導方面產生協同作用，但發現其中一種細胞因子使用高劑量的IL-2和IL-12組合是拮抗性的[Perussia等，J.Immunol.1493495-3502(1992)；Mehrotra等，J.Immunol.1512444-2452(1993)]。IL-12和IL-7組合也存在相似的情況。
IL-12和其它細胞因子在小鼠中產生抗腫瘤反應的協同研究也顯示混合性各種結果。在某些模型中，在每種細胞因子的次優劑量和導致毒性增強的較高劑量觀察到協同作用，而在其它模型中，IL-12和IL-2組合顯示很小或沒有協同作用[參見例如Nastala等，J.Immunol.1531697-1706.(1994)]。這些結果可能反映出體內組合兩種潛在協同因子的固有困難，尤其是當需要保持兩種具有不同藥理特性(如不同的循環半衰期和生物分布)的因子的固定活性比時。
在體外細胞培養實驗中，可直接控制細胞因子水平，但許多因素可以影響體內細胞因子的相對生物分布和定位，因此影響它們的免疫刺激能力。這些因素中最重要的是半衰期。在單次快速注射後IL-2的循環半衰期約為10分鐘。與這些藥代動力學特性顯著不同的是，已經報導了IL-12在小鼠中的循環半衰期大於3小時[Wysocka等(1995)Eur.J.Immunol.25672]，而在人體內的循環半衰期為5-10小時[Lotze等(1996)Ann NY Acad Sci 795440-454]。
這種差異被認為是由於IL-2和GM-CSF都相對較小(15-25kD，而IL-12為75kD)，使得IL-2和GM-CSF可被腎過濾清除。分子量小於約50kD的蛋白可被腎過濾清除。幾乎所有的細胞因子都小於50kD，並存在相似快速的腎過濾清除。當需要用兩種這樣的被快速清除的小細胞因子治療時，僅共同給予所述細胞因子就可以了。然而，共同給予對於半衰期顯著不同的細胞因子並不是最優的。
難以系統給予細胞因子，因為它們具有有害的副作用。例如，高水平的α-幹擾素導致嚴重副作用，包括皮膚、神經、免疫和內分泌毒性。預期多細胞因子融合蛋白可能出現特別嚴重的副作用。
為減少系統給予細胞因子的副作用，一種策略是將一種細胞因子與第二種具有靶向能力的分子融合。其中Fc區位於另一種蛋白的N端的融合蛋白(稱為『免疫融合蛋白』或『Fc-X』融合蛋白，其中X為配體，如α-幹擾素)具有許多與眾不同的有利生物特性[Lo等，美國專利第5,726,044號和第5,541,087號；Lo等，Protein Engineering 11495]。具體來說，這樣的融合蛋白仍可以結合細胞表面上的相關Fc受體。然而，當所述配體結合細胞表面上的其受體時，Fc區的取向改變，介導抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)和補體結合的序列似乎被封閉。結果，Fc-X分子中的Fc區沒有有效介導ADCC或補體結合。N端細胞因子和C端Fc區的融合蛋白產生的細胞毒性作用是眾所周知的。例如，IL-2與Fc區的N端融合產生一種能夠結合具有IL-2受體的細胞、結合補體並因此溶解細胞的分子[Landolfi，N.F.(1993)，美國專利第5,349,053號]。相反，Fc-IL-2融合蛋白不具有這種特性。因此，預期Fc-X融合蛋白具有增加血清半衰期和肝中相對濃度的功效，而沒有ADCC和補體結合的有害副作用。
已經證明，許多不同的短血清半衰期蛋白可以Fc-X構型與Fc區融合，獲得的融合蛋白具有長得多的血清半衰期。然而，兩種不同Fc融合蛋白的血清半衰期一般不相同。因此，當需要傳遞兩種不同的X部分時，共同給予兩種不同的Fc-X蛋白一般不是最優的。
在某些情況下，較好的方法是通過將細胞因子融合至對細胞表面抗原具有特異性和親和性的抗體(或其衍生片段)(Gillies，美國專利第5,650,150號；Gillies等，Proc.Natl.Acad.Sci.891428)，或通過肽鍵以融合蛋白形式使蛋白抗原和刺激性細胞因子連接(Hazama等，Vaccine 11629)，將細胞因子的作用靶向細胞表面抗原。儘管抗體自身可增加融合細胞因子的半衰期，但在和相同抗體融合的不同細胞因子融合蛋白之間仍存在差異[參見例如Gillies等，BioconjugateChem.4230-235(1993)；Gillies等，J.Immunol.1606195-6203]，這種差異使得難以在靶位共同定位。如上所述，這可以導致細胞因子活性不平衡，降低所需要的協同作用。另外，使用兩種不同的融合蛋白需要分別測試每種融合蛋白的安全性和有效性分布，然後作為混合物進一步測試。
發明概述本發明提供兩種或多種不同細胞因子的複合物或融合物，它們可用於一般免疫治療以及靶向免疫治療。這些複合物或融合物可選地包括其它蛋白部分。所述複合物或融合物的一個特徵在於它們提供細胞因子組分固定活性比。
一般而言，本發明涉及含有至少兩種不同細胞因子的蛋白複合物。所述細胞因子可位於同一多肽鏈中，或者可通過共價鍵(如二硫鍵或化學交聯形成的鍵)連接。或者，所述細胞因子可為穩定的非共價鍵結合。在某些優選的實施方案中，所述蛋白複合物包含在哺乳動物中使所述複合物靶向特定部位的靶向部分，如抗體或抗體片段。
在一個優選的實施方案中，本發明提供將一種雙鏈細胞因子(如IL-12)的生物活性和第二種細胞因子的生物活性組合在一起的蛋白複合物。所述細胞因子互相之間可共價結合(例如融合)。所述細胞因子還可以通過其它部分結合。例如，含有第二種細胞因子的多肽鏈可包括特異性結合IL-12的結合部分，如IL-12抗體或IL-12受體。或者，所述結合部分可作用於結合IL-12的第二個部分。例如，如果編碼IL-12亞單位的多肽鏈還包括抗生物素蛋白，則含有第二種細胞因子的多肽可包括作為靶向部分的生物素蛋白。在一個優選的實施方案中，所述第二種細胞因子為IL-2。
本發明提供製備IL-12融合蛋白的方法，所述融合蛋白既保持IL-12活性，也保持第二種細胞因子的活性，所述融合蛋白在提供一種類似於IL-12自身的更長的單一藥代動力學特性的同時，延長第二種細胞因子的活性持續時間，並在注射入動物後保持兩種細胞因子的活性平衡。
在本發明的另一個實施方案中，所述融合蛋白包含異源二聚體形式的IL-12，其中IL-12的p35和p40亞單位通過二硫鍵連接，並在IL-12的p35或p40亞單位的N端或C端與第二種細胞因子共價結合，通式為IL-12-X或X-IL-12，其中X為第二種細胞因子。
在本發明的另一個實施方案中，所述融合蛋白包含與單鏈(sc)形式IL-12的N端或C端共價結合的第二種細胞因子，通式為scIL-12-X或X-scIL-12，其中所述單鏈形式的IL-12包含兩個通過柔性肽接頭連接的多肽亞單位。
在再一個實施方案中，兩種細胞因子進一步融合至一種能夠形成二聚體或多聚體結構的蛋白，融合部位在所述蛋白鏈的氨基端或羧基端。在該實施方案的一個優選形式中，IL-12與第二種細胞因子的一種融合蛋白形式進一步融合至能夠二聚體化的免疫球蛋白(Ig)鏈的一部分，如Fc區。進一步的實施方案包括在Ig鏈部分的任一端的至少一條IL-12多肽鏈和在另一端融合的第二種細胞因子的融合蛋白。
在另一個實施方案中，兩種或多種細胞因子與因為結合特異性受體具有靶向能力的蛋白融合。例如，Fc區能夠結合肝臟富有的Fc受體。Fc區與多種細胞因子的融合蛋白例證了二聚體和靶向的優勢，但在某些情況下可構建僅具有多聚化能力或靶向能力但二者不同時具備的多種細胞因子的融合蛋白。
在再一個實施方案中，包含多種細胞因子的融合蛋白進一步在氨基端或羧基端與具有多種靶向能力的分子類型中的一種分子融合，所述分子例如為抗體或具有或不具有支架結構的適體(aptamer)(Colas等Proc Natl Acad Sci USA.9514272-7)。一個具體的實施方案是多種細胞因子與能夠結合抗原的抗體的至少一部分(如完整抗體、單鏈抗體或單鏈Fv區)的融合蛋白。其它的實施方案包括在能夠結合抗原的至少一部分抗體鏈的任一端的至少一條IL-12多肽鏈與融合在另一端的第二種細胞因子的融合蛋白。
按照以上的描述，一般優選通過遺傳工程技術使組成蛋白通過共價鍵(如醯胺鍵或二硫鍵)連接，構建多細胞因子融合蛋白和多細胞因子-抗體融合蛋白。但是，也可使用化學交聯劑構建所述蛋白複合物。這樣的方法在蛋白質化學領域是成熟的方法。另一方面，有時通過將不同的細胞因子與配偶體蛋白融合形成穩定非共價複合物就足以製得蛋白複合物。例如，使用一種非共價異源二聚體支持蛋白第一種細胞因子融合至所述異源二聚體的一個亞單位，第二種細胞因子融合至所述異源二聚體的第二個亞單位，然後在合適的條件下混合兩種融合蛋白。例如，在同一細胞中表達編碼兩種亞單位-細胞因子融合蛋白的核酸。因此，可構建其中組成細胞因子直接或間接非共價連接的多細胞因子蛋白複合物。為達到本發明的目的，所述複合物必須在給予動物時保持足夠穩定並實現生物效應。
本發明還提供編碼包含兩種或多種細胞因子的融合蛋白的核酸，其中一種細胞因子優選為IL-12，而由所述核酸編碼的融合蛋白可選地包括其它蛋白部分。優選的實施方案包括編碼兩種或多種細胞因子與二聚體蛋白(如抗體鏈的Fc部分)的融合蛋白的核酸。另一組優選實施方案為編碼兩種或多種細胞因子與具有靶向能力的蛋白(如抗體)的融合蛋白的核酸。
本發明還提供構建兩種或多種細胞因子的融合蛋白的方法以及表達這樣的融合蛋白的方法。
本發明還提供治療疾病和其它病症的方法，其中治療包括兩種或多種蛋白活性的有效組合。在一個實施方案中，至少一種蛋白具有短血清半衰期(例如少於20分鐘)或僅具有中等血清半衰期(例如少於40分鐘)。通過遺傳工程或其它技術融合所述蛋白並給予人或動物。因此，兩種蛋白的活性為固定活性比，並且不需要按照兩種蛋白的不同給藥方案分別給予。另外，融合蛋白的血清半衰期一般更近似於血清半衰期較長的蛋白組分的血清半衰期，因此延長了血清半衰期較短蛋白的有效半衰期。
更具體地說，本發明提供免疫治療性治療可用一種雙鏈細胞因子(如IL-12)和第二種細胞因子聯合有效治療的疾病(如癌症或感染或其它疾病)的方法。在一個優選實施方案中，IL-12與IL-2或GM-CSF融合併給予動物或人。在其它優選的實施方案中，GM-CSF與IL-4融合併給予動物或人。在另一個優選實施方案中，IL-12與IL-18融合併給予動物或人。所述治療可與其它疾病治療聯合使用。另外，本發明提供針對多種抗原的免疫方法，所述方法可用於預防或治療各種疾病。
在這些方法的其它實施方案中，兩種不同的細胞因子與二聚體蛋白部分(如抗體的Fc區)融合併給予動物或人。在這些方法的一個優選形式中，細胞因子IL-12和第二種細胞因子與Fc區融合，所述第二種細胞因子更優選IL-2或GM-CSF。
在這些方法另外的其它實施方案中，兩種不同的細胞因子與完整抗體融合，並給予動物或人。在這些方法的一個優選形式中，細胞因子IL-12和第二種細胞因子與抗體部分融合，所述第二種細胞因子更優選IL-2或GM-CSF。本發明還公開了可用於治療疾病的抗體-細胞因子融合蛋白混合物。在一個實施方案中，使用抗體-IL-2融合蛋白與抗體-IL-12融合蛋白的混合物治療疾病。例如，治療癌症、病毒感染或細菌感染。
附圖簡述當同時閱讀以下說明書和附圖時，可更充分地理解本發明的前述目的和其它目的及其各種特徵。


圖1A圖示說明兩種細胞因子最簡單形式的融合蛋白一種細胞因子可選地通過接頭與第二種細胞因子融合。圖1B-1I顯示了其中第二種細胞因子(標記為『cyt』)可連接至異源二聚體細胞因子IL-12的各種方式。具體地說，第二種細胞因子可融合至p40的C端(圖1B)、p40的N端(圖1C)、p35的C端(圖1D)或p35的N端(圖1E)。另外，圖1顯示第二種細胞因子如何與單鏈型IL-12融合。具體而言，單鏈IL-12分子可為p35(N端)至p40，而第二種細胞因子在C端(圖1F)或N端(圖1G)。或者，單鏈IL-12分子可為p40(N端)至p35，而第二種細胞因子在C端(圖1H)或N端(圖1I)。
圖2A-2C圖示說明圖1描述的多細胞因子融合蛋白(框形)進一步如何與抗體的Fc區(圖中所示為鉸鏈區(H)、CH2結構域和CH3結構域(各種卵形))融合。具體而言，圖1中的8種分子中的任一種均可與Fc區的C端(圖2A)或N端(圖2B)融合。另外，第一種細胞因子和第二種細胞因子(分別為框形)互相之間不需要直接連接，而可以通過Fc部分連接(圖2C)。
圖3A-3G圖解顯示多細胞因子融合蛋白進一步與完整免疫球蛋白(如IgG)融合的亞類方式。重鏈V區顯示為卵形標記的VH，輕鏈V區顯示為卵形標記的VL，而恆定區為空白卵形。圖1例舉的多細胞因子融合蛋白可位於重鏈的C端(圖2A)、重鏈的N端(圖2B)、輕鏈的N端(圖2C)或輕鏈的C端(圖2D)。另外，有多種方式可將第一種和第二種細胞因子分別連接至重鏈和輕鏈的N端和C端；圖3E-3G顯示了其中的三種。
圖4A-4C圖解顯示第一種細胞因子和第二種細胞因子如何與「單鏈」抗體融合，其中所述抗體的可變區輕鏈和可變區重鏈融合，並且所述蛋白以單一多肽表達，然後同源二聚體化。具體地說，多細胞因子融合蛋白可位於C端(圖4A)或N端(圖4B)。另外，第一種細胞因子和第二種細胞因子不需要直接連接，而可通過單鏈抗體部分連接(圖4C)。
圖5A-5C圖解顯示第一種細胞因子和第二種細胞因子如何與單鏈Fv區(由重鏈和輕鏈的可變區融合組成)融合。具體地說，第一種細胞因子-細胞因子融合蛋白可位於C端(圖5A)或N端(圖5B)。另外，第一種細胞因子和第二種細胞因子不需要直接連接，而可通過單鏈Fv部分連接(圖5C)。
圖6A和6B顯示在單獨細胞因子或融合蛋白作用下，IL-12和IL-2誘導人外周血單核細胞(PBMC)產生IFN-γ的協同作用。在圖6A中，在植物凝集素活化之前(方形)或之後(X形)用人IL-12處理細胞，或在植物凝集素活化之前(菱形)或之後(三角形)用IL-12-IL-2融合蛋白處理細胞。圖6B顯示其中細胞以1∶1摩爾比加入IL-12和IL-2的混合物(黑色菱形)、人Fc-IL-12-IL-2融合蛋白(灰色方塊)和人抗體-IL-12-IL-2融合蛋白(淺灰三角)處理的實驗。X軸表示IL-12的濃度(pg/ml)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在。y軸表示應用ELISA測定的IFN-γ濃度(ng/ml)。
圖7顯示了分別檢測融合蛋白活性並比較其與非融合IL-12分子活性的典型IL-12生物測定。所描述的是小鼠IL-12(空白圓圈)、小鼠IL-12與以1∶1摩爾比加入的IL-2的混合物(黑色方塊)、小鼠IL-2(空白三角形)和抗體-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白(黑色菱形)對人PBMC的3H-胸苷攝取的刺激作用。X軸表示單體細胞因子的濃度(pM)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在；y軸表示摻入氚化胸苷的cpm。
圖8顯示標準的IL-2生物活性測定。曲線圖顯示小鼠IL-2(圓圈)、抗體-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白(菱形)和小鼠IL-12(方塊)對小鼠CTLL細胞增殖的刺激作用。X軸表示單體細胞因子的濃度(pM)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在。在含各種量的細胞因子或融合蛋白的培養基中培養細胞48小時，然後使用MTT/MTS測定檢測活細胞數。y軸表示490nm吸光度的光密度(OD)單位。
圖9顯示了小鼠IL-12(空白圓圈)、小鼠IL-12與以1∶1摩爾比加入的IL-2的混合物(黑色圓圈)、小鼠Fc-單鏈IL-12-IL-2融合蛋白(黑色三角形)和融合小鼠IL-2的小鼠單鏈IL-12(黑色菱形)對人PBMC的3H-胸苷攝取的刺激作用。x軸表示單體細胞因子的濃度(pM)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在；y軸表示摻入氚化胸苷的cpm。
圖10顯示了小鼠IL-12(空白圓圈)、小鼠IL-12與以1∶1摩爾比加入的GM-CSF的混合物(黑色圓圈)、小鼠GM-CSF(黑色三角形)和小鼠Fc-小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白(X形)對人PBMC的3H-胸苷攝取的刺激作用。x軸表示單體細胞因子的濃度(pM)，無論其是以完整蛋白存在還是以融合蛋白存在；y軸表示摻入氚化胸苷的cpm。
圖11顯示抗體-細胞因子-細胞因子融合蛋白治療帶有皮下腫瘤的Balb/C小鼠的功效，所述皮下腫瘤由工程為表達人EpCAM(KS-1/4抗原)的CT26結腸癌細胞產生。黑色菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS對照的小鼠腫瘤平均體積。三角形表示用6μg KS-IL-12-IL-2治療的小鼠中的平均腫瘤體積。正方形表示用3.4μg KS-IL2和5.3μgKS-IL12治療的小鼠中的平均腫瘤體積。進行腫瘤內注射。x軸表示首次注射後經過的天數；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖12.顯示抗體-細胞因子-細胞因子融合蛋白治療帶有皮下腫瘤的SCID小鼠的功效，所述皮下腫瘤由工程為表達人EpCAM的CT26結腸癌細胞產生。菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS對照的小鼠中的平均腫瘤體積。三角形表示用6μg KS-IL-12-IL-2治療的小鼠中的平均腫瘤體積。正方形表示用3.4μg KS-IL2和5.3μg KS-IL12治療的小鼠中的平均腫瘤體積。進行腫瘤內注射。x軸表示首次注射後經過的天數；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖13顯示抗體-細胞因子和抗體-細胞因子-細胞因子融合蛋白治療帶有皮下腫瘤的小鼠的功效，所述皮下腫瘤由工程為表達人EpCAM的Lewis肺癌(LLC)細胞產生。菱形表示在第0、1、2、3和4天腫瘤內注射PBS對照的小鼠中的平均腫瘤體積。正方形表示在第0、1、2、3和4天腫瘤內注射20μg KS-IL2的小鼠中的平均腫瘤體積。三角形表示在第0、1、2、3和4天腫瘤內注射20μg KS-IL12的小鼠中的平均腫瘤體積。X形表示在第0、1、2、3和4天腫瘤內注射20μg KS-IL-12-IL-2的小鼠中的平均腫瘤體積。x軸表示首次注射後經過的天數；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖14顯示抗體-細胞因子-細胞因子融合蛋白對帶有皮下腫瘤的小鼠的治療功效，所述皮下腫瘤由工程為表達人EpCAM的Lewis肺癌細胞產生。菱形表示在第0、1、2、3和4天注射PBS對照的小鼠中的平均腫瘤體積。三角形表示用20μg KS-IL-12-IL-2治療的小鼠中的平均腫瘤體積。正方形表示用11.5μg KS-IL2和18μg KS-IL12治療的小鼠中的平均腫瘤體積。進行腫瘤內注射。x軸表示首次注射後經過的天數；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖15顯示抗體-細胞因子-細胞因子融合蛋白對帶有皮下腫瘤的小鼠的治療作用，所述皮下腫瘤由表達或不表達人EpCAM的Lewis肺癌細胞產生。黑色正方形表示帶有LLC-KSA衍生腫瘤的小鼠中的平均腫瘤體積。黑色菱形表示帶有LLC衍生腫瘤的小鼠中的平均腫瘤體積。在第0、1、2、3和4天用20μg KS-IL12-IL2治療小鼠。進行腫瘤內注射。x軸表示首次注射後經過的天數；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖16顯示抗體-細胞因子-細胞因子融合蛋白對帶有皮下腫瘤的小鼠的治療功效，所述皮下腫瘤由Lewis肺癌細胞產生。在第0天皮下注射約106細胞。菱形表示原初小鼠的平均腫瘤體積。正方形表示先前帶有Lewis肺癌細胞(工程為表達人EpCAM)產生的皮下腫瘤但已被KS-IL12-IL2治癒的小鼠中的平均腫瘤體積。x軸表示首次注射後經過的天數；y軸表示平均腫瘤體積(mm3)。
圖17A和17B顯示腫瘤細胞分泌的單一細胞因子蛋白或多細胞因子蛋白對該細胞在免疫系統正常的動物中形成腫瘤能力的作用。在圖17A中，比較4組小鼠皮下注射1×106LLC腫瘤細胞的C57BL/6小鼠(黑色菱形)；皮下注射5×106LLC腫瘤細胞的C57BL/6小鼠(白色菱形)；皮下注射1×106表達scIL-12的LLC腫瘤細胞的C57BL/6小鼠(黑色三角形)；以及皮下注射5×106表達scIL-12的LLC腫瘤細胞的C57BL/6小鼠(白色三角形)。圖17B比較了皮下注射1×106LLC腫瘤細胞的C57BL/6小鼠(黑色菱形)；皮下注射5×106LLC腫瘤細胞的C57BL/6小鼠(白色菱形)；皮下注射1×106表達scIL-12-IL-2的LLC腫瘤細胞的C57BL/6小鼠(X形)；以及皮下注射5×106表達scIL-12的LLC腫瘤細胞的C57BL/6小鼠(白色圓圈)。x軸表示注射所述腫瘤細胞後的天數。y軸表示腫瘤體積(mm3)。
圖18顯示腫瘤細胞分泌的單一細胞因子蛋白或多細胞因子蛋白對該細胞在免疫缺陷型動物中形成腫瘤能力的作用。該圖比較了皮下注射1×106LLC腫瘤細胞的SCID小鼠(黑色菱形)；皮下注射1×106表達scIL-12的LLC腫瘤細胞的SCD小鼠(黑色三角形)；以及皮下注射1×106表達scIL-12的LLC腫瘤細胞的SCID小鼠(白色圓圈)。x軸表示注射所述腫瘤細胞後的天數。y軸表示腫瘤體積(mm3)。
發明詳述本發明提供其中兩種或多種不同的細胞因子融合或複合的蛋白分子。所述蛋白複合物或融合蛋白可選地包括其它的蛋白部分，包括具有多聚體化和靶向能力的部分，例如抗體Fc區和包括抗原結合部位的抗體區。本發明還提供編碼多細胞因子融合蛋白的核酸。本發明還提供構建多細胞因子融合蛋白編碼核酸的方法、產生多細胞因子融合蛋白的方法以及使用多細胞因子融合蛋白治療疾病和病症的方法。
本文使用的「細胞因子」是指調節免疫系統細胞活性的分泌性蛋白或其活性片段或突變體。細胞因子的實例包括白介素、幹擾素、趨化因子、腫瘤壞死因子、免疫細胞前體的集落刺激因子等。
本文使用的「異源二聚體細胞因子」是指由兩種不同蛋白亞單位組成的細胞因子。IL-12是目前唯一已知的天然異源二聚體細胞因子。但是，可構建人工異源二聚體細胞因子。例如，IL-6和IL-6R可溶性片段可組合形成異源二聚體細胞因子，CNTF和CNTF-Rα同樣可以構建異源二聚體[Trinchieri(1994)Blood 844008]。
本文使用的「白介素-12」(IL-12)是指由p35和p40亞單位組成的兩個亞單位細胞因子，或p35和p40的活性單鏈融合物，或其種變異體、片段或衍生物。
本文使用的「白介素-2」(IL-2)是指任何哺乳動物IL-2，如人IL-2、小鼠IL-2或其活性種變異體或等位基因變異體、片段或衍生物。
本文使用的「GM-CSF」是指哺乳動物粒細胞/單核細胞-集落刺激因子細胞因子蛋白，如人GM-CSF、小鼠GM-CSF或其活性種變異體或等位基因變異體、片段或衍生物。
本文使用的「免疫球蛋白Fc區」是指免疫球蛋白重鏈恆定區的羧基端部分，或其類似物或部分。例如，IgG的免疫球蛋白Fc區可包含至少一部分鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域。在一個優選的實施方案中，Fc區包括至少一部分鉸鏈區和CH3結構域。在另一個優選的實施方案中，Fc區包括至少CH2結構域，更優選還包括至少一部分鉸鏈區。
本文使用的「肽接頭」是指用於將兩種蛋白(例如一個蛋白和一個Fc區)偶聯在一起的一個或多個肽。所述肽接頭經常是一系列胺基酸，例如主要為甘氨酸和/或絲氨酸。所述肽接頭最好是主要為甘氨酸和絲氨酸殘基的混合系列，約10-15個胺基酸長度。
本文使用的術語「多聚(的)」是指兩個或多個蛋白亞單位通過共價或非共價作用(例如二硫鍵連接)穩定結合。
本文使用的術語「二聚(的)」是指其中兩個蛋白亞單位通過共價或非共價作用穩定結合的特定多聚分子。一種穩定複合物是解離速率至少幾分鐘的複合物，使得所述複合物在體內使用時穩定足夠長時間，以到達靶組織並具有生物效應。Fc片段自身通常形成重鏈片段二聚體，所述重鏈片段包含一部分鉸鏈區、CH2結構域和/或CH3結構域。然而，已知許多蛋白配體結合其二聚體受體。如果細胞因子X天然二聚化，則Fc-X分子中的X部分高得多的程度上二聚化，因為二聚體化過程是濃度依賴性的。由Fc連接的兩種X部分的物理接近使二聚體化成為分子內過程，將平衡向有利於二聚體化的方向大幅移動，並增強了其與受體的結合。
本文使用的「載體」是指包含核苷酸序列的任何核酸，它能夠摻入到宿主細胞中並與宿主細胞基因組重組和整合入其中，或能夠作為附加體自主複製。這樣的載體包括線性核酸、質粒、噬菌粒、粘粒、RNA載體、病毒載體等。病毒載體的非限制性實例包括反轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。
本文使用的「基因表達」或「蛋白表達」是指DNA序列的轉錄、mRNA轉錄物的翻譯以及蛋白產物的分泌或可分離形式的蛋白產物的產生。
本文使用的「免疫細胞因子」是如美國專利第5,650,150號公開的包含抗體和細胞因子的融合蛋白。
本文使用的「前導序列」是這樣一種蛋白序列它通常在N端與第二種蛋白序列連接，並引導細胞分泌第二種蛋白序列。前導序列通常由第二種蛋白序列中切除，使所述蛋白成為成熟蛋白。術語「前導序列」一般與「信號序列」同義。
本文使用的「EpCAM」代表上皮細胞粘附分子(Cirulli等1401519-1534)，與「KSA」同義，是指單克隆抗體KS-1/4結合的抗原。EpCAM是一種在上皮細胞衍生的癌細胞上豐富表達的細胞表面蛋白。
本文使用的「KS-1/4」是指結合EpCAM的特定單克隆抗體。
本文使用的「KS-IL2」、「KS-IL12」和「KS-IL12-IL2」等是指分別由KS-1/4與IL-2、KS-1/4與IL-12以及KS-1/4與IL-12和IL-2二者組成的抗體-細胞因子融合蛋白。本文還使用類似名稱的融合蛋白構建物。因為細胞因子可能在幾個位置融合在抗體分子上，所以諸如「KS-IL12-IL2」的描述是指包含在任何可能的位置與IL-12和IL-2二者融合的KS-1/4的蛋白類型，除非另外明確說明。
本文使用的「14.18」是指結合腫瘤特異性抗原GD2的特定單克隆抗體。
在圖1-5中舉例說明了數個體現本發明的說明性蛋白構建物實施方案。圖2-5圖示的分子組成部分標記為1A-1I，是指圖1A-1I所示的融合蛋白，說明圖1的任何融合蛋白均可進一步融合至所示的其它蛋白。細胞因子以矩形表示，抗體恆定區以卵形表示，而重鏈可變區和輕鏈可變區以標記卵形表示。
本發明描述了包含兩種不同細胞因子和可選地包括另外的蛋白部分的蛋白複合物。同源二聚體細胞因子(例如α幹擾素、β幹擾素、γ幹擾素、IL-5、IL-8等)儘管含有多個亞單位，但仍然是單個細胞因子。同樣，異源二聚體細胞因子如IL-12儘管含有不同的亞單位，但也是單個細胞因子。而且，正常同源二聚體細胞因子的異源二聚體形式(如MCP-1/MCP-2異源二聚體)或正常同源二聚體細胞因子的兩種等位基因的異源二聚體(例如Zhang，J.Biol.Chem.26915918-24)，也是單一細胞因子。本發明的複合物包含兩種不同的細胞因子，其中每種細胞因子(例如IL-2和IL-12；IL-4和GM-CSF；MCP-1和eotaxin等)都能夠調節免疫系統細胞的活性。
圖1A描述了本發明的優選實施方案在融合蛋白10中，第一種細胞因子12的C端可選地通過連接區(未顯示)融合至第二種細胞因子14的N端。在本發明的某些實施方案中，本發明的蛋白複合物包含至少兩種血清半衰期顯著不同的細胞因子。例如，使用小蛋白和大蛋白通常導致融合蛋白具有較大蛋白的循環半衰期特徵。因此，在需要IL-12和第二種細胞因子的聯合作用的情況下，優選將兩種細胞因子表達為以下通式的融合蛋白IL-12-X或X-IL-12，其中X為第二種細胞因子。觀察到兩種特別的優勢。首先，更快被清除的細胞因子的血清半衰期延長。第二，兩種細胞因子的血清半衰期互相之間變得非常相似。
諸如IL-12的雙鏈細胞因子可在其任一條鏈的N端或C端與另一個細胞因子融合。在一個實施方案中，第二種細胞因子融合在IL-12的p35或p40亞單位的N端或C端(圖1B-1E)。在圖1B的融合蛋白16中，第一種細胞因子12的N端融合至IL-12亞單位p40 18的C端。亞單位p40 18通過共價鍵22與IL-12亞單位p35 20連接。在圖1C的融合蛋白24中，p40亞單位18的N端融合至第一種細胞因子12的C端，並通過共價鍵22與p35亞單位20連接。圖1D描述了其中第一種細胞因子12的N端融合至p35亞單位20的C端的融合蛋白26，p35亞單位20通過共價鍵22與p40亞單位18連接。在圖1E中，融合蛋白28包括p35亞單位20，其N端融合第一種細胞因子12的C端，並通過共價鍵22與p40亞單位18連接。
在第二個實施方案中，IL-12亞單位可融合形成單鏈蛋白scIL-12，處於N端部位的或者為p35亞單位或者為p40亞單位；第二種細胞因子可結合至產生的scIL-12的N端或C端(圖1F-1I)。因此，在圖1F描述的一個優選實施方案中，融合蛋白30包含單鏈IL-12，其中p40亞單位18的N端可選地通過肽接頭融合至p35亞單位20的C端。在該實施方案中，細胞因子12的N端融合至p40亞單位18的C端。在圖1G顯示的實施方案中，p35亞單位20的N端可選地通過肽接頭融合至細胞因子12的C端。圖1H和1I顯示了包含另一種單鏈型IL-12的融合蛋白34和36，其中p35亞單位的N端可選地通過肽接頭融合至p40亞單位的C端。在圖1H顯示的融合蛋白34中，細胞因子12的N端融合至p35亞單位的C端。在圖1I顯示的融合蛋白36中，p40亞單位18的N端融合至細胞因子12的C端。在一個高度優選的實施方案中，IL-12融合至IL-2。
在實施例中進一步描述了這些分子的製備。
將異源多聚體分子如IL-12或抗體表達為其中不相同的亞單位通過短胺基酸接頭連接的單鏈分子通常是很方便的[Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.855879；Lieschke等(1997)Nat Biotechnol.1535；Lieschke；G.J.和Mulligan；R.C.，美國專利第5,891,680號]。構建基因融合物，然後可以在包含單一重組DNA構建物的細胞中表達需要的蛋白。這樣的單鏈型異源多聚體細胞因子可進一步融合至第二種細胞因子，這仍然允許由單一重組DNA構建物表達具有需要活性的融合蛋白。在實施例中描述了所述分子的表達。
本發明還描述了包含IL-4和GM-CSF的融合蛋白。該組合在功能性刺激樹突細胞提呈抗原方面特別有用。另一種有用的融合蛋白包含IL-12和IL-18。這些細胞因子都促進Th1應答，但互補活性稍有不同。
本發明還描述了其中多種不同的融合細胞因子進一步融合至能夠形成多聚體(如同源二聚體或異源二聚體)的蛋白的融合蛋白。這種分子的優勢在於二聚體化可增強一種或多種細胞因子的效力。在某些情況下，二聚化對效力的增強可能因為細胞因子結合其二聚體受體。在一個實施方案中，多種細胞因子融合至抗體分子的一部分，如Fc區(圖2)。在另一個實施方案中，IL-12和第二種細胞因子融合至同源二聚化蛋白部分。在一個優選的實施方案中，所述第二種細胞因子為IL-2或GM-CSF。所述融合蛋白可以各種方式產生，反映幾種不同蛋白部分由融合蛋白的N端至C端的所有不同排序。例如當IL-12和第二種細胞因子融合至Fc區時，兩種細胞因子都可以任何順序融合至Fc區的N端或C端，或者一種細胞因子可融合在N端，而另一種細胞因子融合在C端。
在圖2描述了一些這樣的排列。例如，在圖2A所示的實施方案中，本發明的融合蛋白44融合至含有鉸鏈區38、CH2區40和CH3區42的Fc區的C端。融合蛋白44可具有各種結構，包括例如圖1A-1I中描述的融合蛋白10、16、24、26、28、30、32、34或36的結構。如果融合蛋白44如同融合蛋白16、24、26和28一樣具有一個以上的N端和C端，則Fc區可融合至融合蛋白44的任一個N端。如圖2B所示，融合蛋白44可融合至Fc區的N端。在圖2C所示的實施方案中，第一種細胞因子12可融合至Fc區的N端，而第二種細胞因子14可融合至Fc區的C端。結構設想要著重指出的是，細胞因子作為一類蛋白質，在大小和一般摺疊特性上是相似的。因此，本文公開的具體實施例描述了如何構建細胞因子蛋白家族的多細胞因子融合蛋白。例如，許多細胞因子屬於稱為「四螺旋束」的蛋白摺疊類型。四螺旋束蛋白包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、生長激素、睫狀神經營養因子(CNTF)、苗條蛋白、促紅細胞生成素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素5(IL-5)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、IL-2、IL-4、白介素3(IL-3)、IL-10、β幹擾素、α幹擾素和密切相關的τ幹擾素以及γ幹擾素(IFN-γ)。
除了IL-5和IFN-γ以外，所有這些蛋白都摺疊為具有四個大致平行的α螺旋和兩個交叉連接的單體。在除了IL-5和IFN-γ以外的每種情況下，N端和C端都在所述蛋白的同一面。因為IL-5和IFN-γ以外的四螺旋束蛋白都具有相同的摺疊模式，本文描述的用於IL-2、IL-4和GM-CSF的方法也適用於其它四螺旋束蛋白和其它的摺疊為單體的細胞因子小蛋白。
趨化因子是一類特殊的細胞因子，人們認為其形成胞外梯度和介導特定類型免疫細胞的趨化性。例如，MCP-1是單核細胞、巨噬細胞和活化T細胞的化學引誘物；eotaxin是嗜酸性粒細胞的化學引誘物；而IL-8是嗜中性粒細胞的化學引誘物。趨化因子除了其化學引誘物功能以外，同其它細胞因子一樣，也能夠誘導特定基因在特定的靶細胞中表達。例如，認為MCP-1在血管平滑肌細胞中誘導組織因子表達(Schecter等，J Biol Chem.27228568-73)。
本發明公開了其中一種或多種細胞因子為趨化因子的細胞因子-細胞因子融合蛋白和抗體-細胞因子-細胞因子融合蛋白。本發明還公開了具有三種或三種以上的細胞因子的蛋白構建物，其中一種或多種細胞因子為趨化因子。例如，趨化因子IP-10、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、巨噬細胞趨化蛋白、eotaxin、淋巴趨化因子(lymphotactin)、BLC可融合至有或沒有其它部分(如抗體部分)的第二種細胞因子。
例如人基因組編碼至少50個趨化因子。已知的趨化因子一般具有相似的三維單體結構和蛋白摺疊模式。因此，本文公開的一般類型的蛋白構建物和構建策略可適用於各種已知的趨化因子和迄今尚未發現的趨化因子。
趨化因子具有一種獨特的含三個β鏈和一個α螺旋的摺疊模式。在某些但不是所有情況下，趨化因子摺疊為單體，然後在摺疊後二聚化。對於所有的趨化因子，單體亞單位的摺疊模式相同，整體結構極其相似。例如，IL-8、血小板因子4、黑素瘤生長刺激因子(MGSA)、巨噬細胞炎性蛋白、MIP、RANTES(受激活作用調節的正常T細胞表達和分泌的蛋白)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1、MCAF)、Eotaxin、單核細胞趨化蛋白-3(MCP-3)、fractalkine趨化因子結構域、嗜中性白細胞活化肽-2(NAP-2)、基質細胞衍生因子-1(SDF-1)、巨噬細胞炎性蛋白-2、趨化因子hcc-2(巨噬細胞炎性蛋白-5)、Groβ、細胞因子誘導性嗜中性白細胞化學引誘物和CINC/Gro的三維結構已通過X射線晶體學和/或NMR方法測定；所有這些結構都顯示相同的摺疊和廣泛的相似。因為趨化因子具有相同的摺疊模式，所以本文描述的用於淋巴趨化因子的方法也適用於其它趨化因子蛋白。
趨化因子的自由N端對其功能通常很重要。因此，在某些實施方案中可優選構建其中第二種細胞因子、抗體部分或其它蛋白部分與趨化因子C端融合的融合蛋白。為了構建含有兩種活性趨化因子的蛋白複合物，例如將兩種不同趨化因子融合至抗體重鏈和輕鏈的N端是有效的。某些趨化因子如IL-8在生理條件下為二聚體。對於某些用途，有效的作法是共表達多細胞因子抗體融合蛋白(如IL-8-抗體-細胞因子融合蛋白)以及未融合的IL-8部分或具有不與抗體部分相互作用的不同融合配偶體的IL-8部分。因此，不同的IL-8部分可異源二聚化而沒有在所有的IL-8部分都融合至抗體鏈時可能導致的空間約束或多聚化。然後可根據大小或根據與抗體結合蛋白(如葡萄球菌A蛋白)的結合分離需要的多細胞因子融合蛋白。
對於含有趨化因子的多細胞因子融合蛋白，一個優選的實施方案為所述融合蛋白還包含定位功能，如結合抗原的抗體部分。儘管希望不受理論的束縛，但是一般認為趨化因子在體內的廣泛分布將失去作用或導致細胞對所述趨化因子全面脫敏。另外，認為趨化因子的化學引誘物功能僅可以在所述趨化因子存在濃度差時才能表現出來。
一個優選的實施方案是淋巴因子-抗體-IL-2融合蛋白。另一個優選的實施方案是其中趨化因子和第二種細胞因子都促進Th1應答的融合蛋白。例如，含有IP-10和IL-12的融合蛋白是一個高度優選的單獨的Fc區或作為完整抗體組成部分的Fc區，可以賦予多細胞因子融合蛋白幾種特性，這些特性可能是有利的或是不利的，取決於具體的用途。這些特性包括二聚體化、延長血清半衰期、結合補體的能力、介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)的能力以及與Fc受體結合。如果血清半衰期延長是主要需要的特徵，並且Fc區的免疫特性是不重要或不需要的，則優選使用缺乏一種或多種免疫特性的Fc區天然變異體或突變體。例如，如果需要均等或延長兩種或多種血清半衰期短的細胞因子的血清半衰期，則優選構建含有人IgG2或IgG4的Fc區的多細胞因子融合蛋白，所述人IgG2或IgG4的Fc區各自對Fc受體的親和力降低或消失，或者優選使用在Fc受體結合位點具有突變的Fc區。實際上，已經表明某些細胞因子與抗體的融合蛋白增加了所述融合蛋白對Fc受體的親和性，導致其在動物體內的清除速率更快。使用對Fc受體親和力降低的Fc區極大改善這些分子的血清半衰期(Gillies等Cancer Res.592159-2166)。在某些情況下並取決於所使用的細胞因子，結合Fc受體的Fc區導致多細胞因子融合蛋白內化和一種或多種細胞因子部分的降解。靶向本發明還描述了其中兩種或多種細胞因子連接到能夠將所述細胞因子定位到特定靶分子、細胞或機體部位的蛋白的融合蛋白。優選的具有定位能力的分子為抗體或含有抗原結合可變區的抗體部分。然而，可以使用其它定位分子或其結構域，諸如特異性配體或受體、天然存在的結合蛋白、結合特定底物的酶、經選擇特定結合或定位能力的人工製備肽、具有產生靶向能力的特殊物理-化學特性的肽、因為與另一個靶向分子結合而具有靶向能力的蛋白或其它類型的蛋白。在融合兩種細胞因子至靶向分子的情況下，優選的第一種細胞因子為IL-12。當使用IL-12時，優選的第二種細胞因子為IL-2或GM-CSF。
在使用抗體的情況下，存在無數可將兩種或多種細胞因子融合的方式，因為存在若干可能的連接部位。例如，IgG抗體由兩個重鏈和兩個輕鏈組成。兩種細胞因子可互相融合，然後融合至重鏈或輕鏈中任一條鏈的N端或C端。或者，每種細胞因子可分別融合至所述抗體分子上的一個N端或C端。
圖3描述了一部分可將兩種細胞因子融合至抗體分子的方法。例如，參照圖3A，本發明的融合蛋白44可融合至免疫球蛋白重鏈46的C端，而免疫球蛋白重鏈46與免疫球蛋白輕鏈48相連。如圖2所示，融合蛋白44可具有許許多多的結構，包括例如圖1A-1I中描述的融合蛋白10、16、24、26、28、30、32、34或36的結構。如圖3B所示，融合蛋白44可融合至與免疫球蛋白輕鏈48相連的免疫球蛋白重鏈46的N端。在圖3C和3D顯示的實施方案中，融合蛋白44融合至與免疫球蛋白重鏈46相連的免疫球蛋白輕鏈48的N端(圖3C)或C端(圖3D)。如圖3E和3F所示，第一種細胞因子12可融合至免疫球蛋白輕鏈48，而免疫球蛋白輕鏈48與融合第二種細胞因子14的免疫球蛋白重鏈46相連。細胞因子12和14可融合至免疫球蛋白鏈的N端(圖3E)或C端(圖3F)。或者，如圖3G所示，第一種細胞因子12可融合至免疫球蛋白輕鏈48的N端，而第二種細胞因子14融合至免疫球蛋白重鏈46的C端。與單鏈抗體融合將抗體表達為單鏈抗體有時是非常適合的。本發明還提供其中兩種或多種細胞因子融合至單鏈抗體的融合蛋白。其優勢是在表達特別用於基因治療的需要的融合蛋白時減少了使用的DNA構建物數。具體地說，如果所述細胞因子為單鏈分子，則其與單鏈抗體的融合將允許所述融合蛋白以單一蛋白鍊表達。
如圖4A-4C所示，在某些實施方案中，細胞因子可融合至單鏈抗體的N端、C端或兩端。例如，如圖4A所示，融合蛋白44可融合至具有輕鏈可變區52和重鏈可變區54的單鏈抗體50的C端。如圖4B所示，融合蛋白44也可融合至單鏈抗體50的N端。在圖4C顯示的實施方案中，第一種細胞因子12融合至單鏈抗體50的N端，而第二種細胞因子融合至單鏈抗體50的C端。
一個優選的實施方案包含IL-12和第二種細胞因子與單鏈抗體的融合蛋白。一個更優選的實施方案包含作為第二種細胞因子的IL-2或GM-CSF。
抗體的恆定區具有介導各種效應子功能的潛能。例如，IgG1介導補體結合、ADCC和與Fc受體的結合。所述細胞因子融合的位置可改變抗體恆定區的效應子功能，這在需要調節這些效應子功能時是有用的。
在某些情況下，可能需要構建兩種或多種細胞因子與具有抗體靶向區但不具有恆定區的部分的融合蛋白。這樣的融合蛋白小於完整抗體與兩種或多種細胞因子的融合蛋白，這可能在某些用途上具有優勢。另外，這樣的融合蛋白缺少完整抗體的一種或多種效應子功能，但仍保留抗體的靶向能力。
因此本發明的特徵在於其中兩種或多種細胞因子融合至單鏈Fv區的融合蛋白。如圖5A-5C描述的實施方案所示，兩種細胞因子可融合至Fv區的N端或C端，或者一端融合一種細胞因子。例如，如圖5A所示，本發明的融合蛋白44可融合至含有免疫球蛋白輕鏈可變區52和免疫球蛋白重鏈可變區54的單鏈Fv區的C端。融合蛋白44還可以融合至示於圖5B的Fv區的N端。如圖5C所示，第一種細胞因子12可融合至Fv區的N端，而第二種細胞因子14可融合至Fv區的C端。作為多細胞因子異源二聚體載體的抗體在某些情況下，需要構建兩種或多種細胞因子的融合蛋白，其中對於兩種所述細胞因子而言，所述蛋白的同一末端是其活性必須的。例如，兩種不同的細胞因子的天然存在的N端對每種細胞因子的活性都可能是必不可少的。不可能構建其中兩種細胞因子部分都有活性的單一多肽鏈融合蛋白。
抗體為由重鏈和輕鏈組成、通過二硫鍵共價連接的異源二聚體蛋白。如果需要構建具有兩種細胞因子部分(都需要完整的非融合N端)的多細胞因子融合蛋白，最好將所述兩種細胞因子分別融合至抗體重鏈和輕鏈的N端(圖3E)。同樣地，如果需要構建具有兩種細胞因子部分(都需要完整的非融合C端)的多細胞因子融合蛋白，最好將所述兩種細胞因子分別融合至抗體重鏈和輕鏈的C端(圖3F)。如果所述抗體僅用作以此方式連接兩種細胞因子的載體，則突變或去除所述抗體的那些具有其它免疫功能相關特性的部分可能有用。例如，可優選使用Fab區作為載體，因為Fab區保留了抗體的異源二聚體特徵但缺少Fc區的功能特徵。使用其中抗原結合部位無功能的抗體或抗體片段也可能有用。
多種細胞因子與抗體的融合蛋白兼有多種本發明的新特徵。在抗體-多細胞因子融合蛋白中，所述細胞因子的血清半衰期均等或延長；兩種細胞因子的活性局限於靶，並避免了由於系統給予多種協同作用的細胞因子而產生的特別毒性作用；各細胞因子有效二聚化或多聚化；所述細胞因子不需要直接融合但可以融合至抗體分子重鏈和輕鏈上的不同部位。
在設計含有多種細胞因子和一種抗體的融合蛋白時，存在許多可通過常規實驗方法區分的選擇和構型。結構性生物學設想也是有用的。例如，許多細胞因子屬於叫做4螺旋束的一類。這些結構由4個α螺旋組成，並且N端和C端在同一鄰近位置。一般而言，細胞因子在N端和C端周圍的一面不用於結合細胞因子受體，所以任一端都可用於和抗體或第二種細胞因子融合。然而，有時由於空間原因難以直接將4螺旋束細胞因子的N端和C端融合至不同的部分。因此，當需要將兩種不同的4螺旋束細胞因子融合至抗體時，有效作法是將每種細胞因子融合至所述抗體上的不同部位。或者，如果必須構建Ig鏈-細胞因子-細胞因子形式的多肽鏈，則可使用一種或多種柔性接頭克服空間問題。
還可能使用其它分泌性異源二聚體分子代替抗體來攜帶多種細胞因子。例如，可使用包括前列腺特異性抗原和與其複合的蛋白酶抑制劑的複合物、IgA重鏈和J鏈、TGF-β家族成員及其蝦紅素樣結合配偶體或IL-12。核酸本發明的特徵還在於能夠表達上述每種類型蛋白的核酸。這些核酸包括含兩種或多種細胞因子的融合蛋白的編碼核酸、含兩種或多種細胞因子以及二聚體化結構域(如Fc區)的融合蛋白的編碼核酸、含兩種或多種融合至抗體的細胞因子的融合蛋白的編碼核酸以及含兩種或多種融合至Fc區的細胞因子的融合蛋白的編碼核酸。優選形式的核酸為可在細菌和哺乳動物細胞中表達融合蛋白的DNA載體。對於含多條多肽鏈的融合蛋白，可使用一個以上的編碼核酸。或者，可將兩種或多種融合蛋白編碼序列置於單一核酸分子上。實施例描述了編碼多細胞因子的特徵核酸的具體形式。
本發明的核酸特別用於表達多細胞因子融合蛋白，或用於產生這些蛋白或用於基因治療目的。
在實施例中描述了合成本發明有用實施方案的方法，以及用於測試其藥理學活性的測定。
本發明還提供藥用組合物及其用於治療和預防各種疾病(包括但不限於治療各種感染和癌症)的方法，以及針對各種疾病的疫苗接種。
多細胞因子融合蛋白可用於治療細菌、寄生物、真菌或病毒感染，或者用於治療癌症。例如，已知IL-12在許多類型的感染中具有保護作用，所述感染包括但不限於細菌單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)感染；寄生物鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、碩大利什曼原蟲(Leishmania major)和曼氏裂體吸蟲(Schistosomamansoni)感染；真菌白色念珠菌(Candida albicans)感染；以及病毒脈絡叢腦膜炎病毒和巨細胞病毒感染。因為細胞因子一般聯合起作用，故使用含兩種或多種已知協同起作用的細胞因子常常是有用的。例如，因為IL-2增強IL-12的作用，所以在治療細菌、寄生物、真菌和病毒感染性疾病時組合這些細胞因子是有用的。
治療感染性疾病的一個優選方法是使用進一步融合至靶向劑的多細胞因子融合蛋白，所述靶向劑將所述多種細胞因子靶向感染部位。以下描述各種靶向策略。
可使用固體、半固體或液體劑型的本發明藥用組合物，例如丸劑、膠囊劑、粉末劑、液體製劑、懸浮劑等，優選適用於準確劑量給予的單位劑型。所述組合物包括常規藥用載體或賦形劑，以及另外可包括其它醫療藥物、藥用劑、載體、佐劑等。這樣的賦形劑可包括其它蛋白，例如人血清白蛋白或血漿蛋白。製備所述劑型的實際方法是已知的，或者是對本領域技術人員而言顯而易見的。要給予的組合物或製劑在任何情況下都含有一定量的活性組分，其量可有效在受治療患者體內實現治療作用。
關於所述組合物的給予，可通過任何已接受的給予模式，以使所給予的藥物具有所述活性。這些給藥方法包括口服、胃腸外或局部給予以及其它的系統形式，注射是優選的給予方法。
當然，給予活性化合物的量取決於要治療的患者、病患的嚴重程度、給予方式和主治醫師的判斷。
如上所述，已經研究了細胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、IL-4和其它一些細胞因子在治療癌症方面的作用。在某些情況下，使用多細胞因子融合蛋白治療癌症是有利的，原因是給予較簡單、增加了一種組成細胞因子的血清半衰期和/或良好調節兩種細胞因子的相對活性。
治療癌症的一個優選方法是將細胞因子靶向特定的器官和組織，因此可集中細胞因子的功效，並可避免系統分布的副作用。例如，期望多種細胞因子和Fc區的融合蛋白集中於肝臟，這對於治療局限於肝臟的癌症有利。一個更優選的方法是使用進一步融合至靶向劑(如抗體)的多細胞因子融合蛋白。具體地說，抗體KS-1/4和14.18針對腫瘤特異性抗原(Varki NM等，Cancer Res44681-7；Gillies等，Journal of Immunological Methods 125191；美國專利第4,975,369號和第5,650,150號)。當使用抗體-多細胞因子融合蛋白時，常常需要分析腫瘤類型和選擇針對可能存在於所述類型腫瘤上的抗原的抗體。例如，可通過FACS分析、蛋白質印跡、檢測腫瘤DNA或僅鑑定腫瘤細胞類型，特徵鑑定腫瘤。這樣的腫瘤表徵方法是腫瘤表徵領域技術人員(如腫瘤學家和腫瘤生物學家)眾所周知的。還可通過多種其它方法靶向多細胞因子融合蛋白，如與特異性配體或受體部分融合、與具有預先選定的結合活性的肽適體融合、與具有定位特性的小分子化學結合等等。這些靶向方法還可用於治療其它疾病，如感染。通過基因療法治療癌症和其它細胞疾病本發明的核酸可用作治療癌症和其它需要將免疫系統靶向特殊細胞類型的疾病的基因治療藥物。例如，由人或動物中取出癌細胞，將一種或多種編碼多細胞因子融合蛋白的核酸轉染入癌細胞中，然後將癌細胞再導入人或動物體內。或者可將DNA引入到癌細胞原位。人或動物隨後建立起針對癌細胞的免疫應答，這可治癒或緩解癌症。可通過眾多技術中的任一種，將偶合至在哺乳動物細胞中促進表達的合適調節元件的多細胞因子基因融合物轉染入癌細胞中，所述方法包括磷酸鈣法、「基因槍」法、腺病毒載體轉染方法、陽離子脂質體轉染方法、反轉錄病毒載體轉染方法或任何其它有效的轉染方法。所述核酸可編碼進一步融合至其它部分的多細胞因子融合蛋白。
採用表達一種以上融合細胞因子的融合蛋白的核酸進行的抗癌基因治療可與其它癌症治療組合進行，如可增強融合細胞因子蛋白的免疫刺激特性的治療。例如，本發明的核酸還可以表達其它蛋白部分，這些蛋白部分可幫助激發針對癌細胞表達抗原的免疫應答，或者可以與其它表達所述蛋白部分的核酸共轉染。具體地說，表達B7共刺激表面蛋白的核酸可共轉染入癌細胞中[Robinson等，美國專利第5,738,852號]。用表達多細胞因子融合蛋白的核酸轉染癌細胞還可以與採用針對癌細胞的抗體或免疫細胞因子的治療同時進行[Lode等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.952475]。用表達多細胞因子融合蛋白的核酸轉染癌細胞還可以與採用血管發生阻斷劑的治療同時進行[Lode等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.91591]。
採用其它免疫刺激物和/或血管發生阻斷劑的治療也可以與採用多細胞因子融合蛋白的系統治療組合進行。與其它的免疫刺激物或血管發生阻斷劑共同治療的優勢在於這些治療與DNA損傷劑和細胞周期阻斷劑不同，它們不殺死可能由於所述多細胞因子融合蛋白的刺激而正在分裂的免疫細胞。
所述基因療法的一個優選實施方案是將一種或多種編碼IL-12和第二種細胞因子的核酸引入到癌細胞中，然後再將所述癌細胞引入到人或動物中。第二種細胞因子優選為IL-2或GM-CSF。
本發明提供新型疫苗組合物和輔助疫苗的方法，該方法使用兩種或多種已經融合的細胞因子作為佐劑，用來在接種宿主哺乳動物中產生一種抗某些病原體的保護性細胞介導免疫應答。例如，如果需要Th1型免疫應答，則可以融合多種Th1促進型細胞因子，並將獲得的融合蛋白與抗原一起給予動物。
具體地說，可融合IL-12和IL-2，並與抗原一同給予。或者，可將IL-12和IL-2進一步融合至抗原性蛋白自身，並用於刺激免疫應答。在此情況下，本發明涉及依賴於宿主的細胞介導免疫的疫苗，即激發細胞毒性T淋巴細胞和活化吞噬細胞，以提供抗特定病原體感染的保護。特別有用的是用含IL-12、IL-2和所述抗原的融合蛋白進行疫苗接種，因為這種組合產生針對所述抗原的Th1應答。在人類使用的常規佐劑，如明礬，常常用於誘導Th2應答。
如果需要Th2型免疫應答，則可使用Th2促進型細胞因子的融合組合物。例如，可融合IL-4和IL-10以形成單一分子，獲得的融合蛋白用作佐劑。具體地說，如果需要在動物中募集樹突細胞，則可將IL-4和GM-CSF的融合組合物與促進結合抗原提呈細胞的Fc區進一步融合，或者與能夠將所述融合細胞因子導向靶組織(如腫瘤)的抗體進一步融合。
本發明還提供新型治療組合物和用來提供與某些治療組合物的協同作用的輔助方法，所述治療組合物包括所謂的『癌症疫苗』，可以包括存在於癌細胞上的選定抗原。例如，可通過合適的途徑，將含兩種或多種融合細胞因子的蛋白連同適當處理的癌細胞一起直接給予。
實施例實施例1構建能夠表達細胞因子-細胞因子融合蛋白的基因融合物為製備有眾多細胞因子的多功能蛋白，合成IL-12 p40和IL-2基因融合物以及IL-12 p40和GM-CSF基因融合物。另外，將成熟小鼠p35的編碼序列(SEQ ID NO1)融合至允許高水平表達和有效分泌的啟動子序列和前導序列。小鼠p40-IL-2和p40-GM-CSF的編碼序列分別示於SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。還構建了人p40-IL-2融合蛋白(SEQ ID NO4)。使用先前公開的表達質粒(Lo等，ProteinEngineering 11495-500；Lo等，美國專利第5,726,087號)，構建小鼠IgG2a Fc區與小鼠p35的融合物(SEQ ID NO5)以及人p35與人IgG1 Fc區的融合物(SEQ ID NO6)。
Gillies等人描述了成熟小鼠和人p35與KS-1/4抗體重鏈C端的融合蛋白(J.Immunology1606195-6203)。以相似的方式構建了成熟小鼠和人p35與14.18抗體重鏈C端的融合蛋白(PCT國際公開號WO99/29732)。
本文討論的融合p40與IL-2以及融合p40與GM-CSF的策略類型一般可應用於兩種或多細胞因子的融合蛋白。具體地說，大多數N端部分的編碼序列包含用於分泌的信號序列，而C端部分不需要信號序列。在某些情況下，可將短肽接頭編碼序列(優選10-15個胺基酸長，富含甘氨酸和絲氨酸)置於兩種細胞因子的編碼序列之間。涉及製備所有所述類型的融合蛋白的DNA操作都在本領域的技術水平範圍內。
例如，以下描述了構建小鼠IL-12 p40亞單位與小鼠IL-2的融合蛋白的細節。通過PCR由伴刀豆球蛋白A(Concavalin A)活化的小鼠脾細胞(每ml培養基5μg伴刀豆球蛋白A，活化3天)克隆小鼠IL-12p40亞單位的全長cDNA。正向引物序列為AA GCT AGC ACC ATGTGT CCT CAG AAG CTA ACC(SEQ ID NO7)，其中NheI位點GCTAGC(SEQ ID NO7的殘基3-8)位於翻譯起始密碼子ATG的上遊，而反向引物序列為CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCAGGG(SEQ ID NO8)，其中XhoI位點CTCGAG(SEQ ID NO8的殘基1-6)緊接著位於翻譯終止密碼子TAG(反密碼子為CTA)的下遊。驗證序列後，將含有mu-p40 cDNA及其天然前導序列的NheI-XhoI片段連接至XbaI-XhoI消化的表達載體pdCs[Lo等(1998)ProteinEngineering 11495-500]。限制位點NheI和XbaI具有匹配粘性末端，而NheI位點用於克隆mu-p40，因為mu-p40具有內部XbaI位點。
為了構建mu-p40-muIL-2編碼DNA，使用寡核苷酸接頭經由PstI位點(C TGC AG)連接mu-p40 DNA與含有成熟小鼠IL-2 cDNA的SmaI-XhoI片段。在所述融合蛋白連接處的DNA序列為C TGC AGGGTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC(SEQ ID NO9)，其中CTGC AG(SEQ ID NO9的殘基1-6)為PstI位點，C CCG GG(SEQ IDNO9的殘基15-20)為SmaI位點，TCC是小鼠p40的C端胺基酸殘基，而GCA是成熟小鼠IL-2的N端殘基。
通過用muGMCSF cDNA在SmaI位點置換muIL2 cDNA，由編碼以上的單鏈muIL12-muIL2的DNA構建物獲得單鏈muIL12-muGMCSF編碼DNA。在單鏈muIL2和muGMCSF連接處的DNA序列為C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA AAA GCA(SEQ IDNO10)，其中C TGC AG(SEQ ID NO10的殘基1-6)為PstI位點，C CCG GG(SEQ ID NO10的殘基17-22)為SmaI位點，TCC是小鼠p40的C端胺基酸殘基，而GCA是成熟小鼠GMCSF的N端殘基。實施例2表達IL-12融合蛋白如下表達IL-12-IL-2融合蛋白。將不同組合的編碼p40融合蛋白的單個載體和編碼含p35的蛋白的載體共轉染入人293表皮癌細胞，以瞬時表達融合蛋白。使用製備型試劑盒(Wiazrd，Promega Inc.)純化DNA，乙醇沉澱以滅菌，並在無菌水中重懸浮。
為了表達生物活性IL-12融合蛋白異源二聚體，通過共轉染人293表皮癌細胞瞬時表達不同組合的編碼融合形式亞單位和非融合形式亞單位的單個載體。使用製備型試劑盒(Wiazrd，Promega Inc.)純化DNA，乙醇沉澱以滅菌，並在無菌水中重懸浮。使用10μg DNA/ml(當共轉染兩個質粒時質粒DNA各5μg)通過標準方法製備磷酸鈣沉澱，按0.5ml/板加入到在60mm平板中培養的約70％融合的293培養物中(Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis編著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。16小時後，去除含所述沉澱的培養基，代之以新鮮培養基。3天後，取出上清液，通過ELISA分析產生的轉染基因表達、生物測定IL-12活性或者對放射性標記蛋白進行免疫沉澱和SDS凝膠分析。為了標記，在培養第2天使用無甲硫氨酸的培養基代替所述生長培養基，並加入35S-甲硫氨酸(100μCi/ml)。再溫育16小時後，收穫所述培養基，通過離心澄清(在臺式微型離心機中以13,000rpm離心5分鐘)並與A蛋白瓊脂糖珠(每ml培養上清液10μl珠量)溫育。於室溫1小時後，通過重複的離心和在含1％Nonidet-P40(NP-40)的PBS緩衝液中重懸浮清洗所述瓊脂糖珠。將最終的沉澱在含SDS的凝膠緩衝液中重懸浮，並煮沸2分鐘。離心去除瓊脂糖珠後將上清液分為兩等份。向1個樣品中加入還原劑(5％2-巰基乙醇)，將兩個樣品都煮沸5分鐘，然後上SDS聚丙烯醯胺凝膠。電泳後將所述凝膠對X射線膠片曝光(放射自顯影)。
使用以下的表達質粒劑進行轉染mu.p35+mu.p40-IL-2、KS-1/4-mu.p35+mu.p40、KS-1/4-mu.p35+mu.p40-IL-2、14.18-mu.p35+mu.p40-IL-2、hu.Fc-.p35+hu.p40-IL-2、KS-1/4-hu.p35+hu.p40-IL-2和14.18-hu.p35+hu.p40-IL-2，其中「mu」是指小鼠蛋白，而「hu」是指人蛋白。
當用35S-甲硫氨酸代謝標記細胞並用還原性SDS凝膠電泳和放射自顯影檢測分泌性蛋白時，在每種情況下都觀察到高水平表達。根據組成蛋白的分子量預測的還原性融合蛋白的分子量如下IL-12p35，35kD；IL-12p40，40kD；IL-12，16kD；Fc，32kD；Ig重鏈，55kD；以及Ig輕鏈，28kD。觀測到的蛋白遷移約為預測的分子量。
還分離了表達多細胞因子融合蛋白的穩定轉染細胞系。在異源二聚體構建物情況下，編碼IL-12 p40-IL-2或IL-12 p40-GM-CSF融合蛋白的表達載體如早前對單獨的IL-12 p40亞單位所述(Gillies等J.Immunol.1606195-62030)。按照所述(Gillies等J.Immunol.1606195-62030)用編碼IL-12 p35亞單位、Fc-p35融合蛋白或抗體-p35融合蛋白的表達載體第二次轉染表達p40融合蛋白的轉染細胞系。
收集表達人Fc-IL-12-IL-2(即表達KS-p35和p40-IL-2)的穩定轉染細胞系的上清液，按照生產商的方法(Repligen，Needham，MA)通過與A蛋白瓊脂糖結合併從其上洗脫，純化產物。通過ELISA測定純化蛋白中的IL-12和IL-2含量。結果顯示各種細胞因子含量在質量上相差約4倍，與IL-12和IL-2的分子量相差4倍有關。同樣地，通過ELISA測定表達人KS-IL-12-IL-2的轉染細胞產物的IL-12和IL-2水平得到相似的IL-12和IL-2值。因此，在ELISA精度範圍內，檢測值表示IL-12和IL-2以約1∶1摩爾比產生。用Fc或完整抗體製備的IL-12-GM-CSF融合蛋白獲得相同的結果。實施例3融合蛋白在IFN-γ誘導測定中的協同活性使用人類志願者的靜止或促有絲分裂原活化的人外周血單核細胞(PBMC)以IFN-γ誘導測定檢測IL-12-IL-2融合蛋白的生物活性(圖6)。通過ELISA檢測IFN-γ產生。
由健康志願者獲得人外周血單核細胞(PBMC)，通過Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度離心(1700rpm，20分鐘)純化。用無血清培養基(SF-RPMI)將含PBMC的「血沉棕黃」層稀釋至50ml體積，於1000rpm.離心5分鐘收集。梯度離心後，在有或沒有植物凝集素(PHA；10μg/ml)的情況下，在含10％胎牛血清的細胞培養基(RPMI-10)中以5×106細胞/ml的密度重懸浮細胞，並在溼潤的CO2培養箱中於37℃培養3天。離心收集細胞，用等體積的SF-RPMI清洗三次，並在新鮮RPMI-10中重懸浮(1×106細胞/ml)。將等份溶液(100μl)分散入多個96孔平板的各孔中，每孔的最終細胞數為105個。在新鮮培養基中連續稀釋培養基測試樣品，並加入到所述96孔平板的各孔中。對照孔加入IL-12(圖6A)或市售IL-2和IL-12的等摩爾混合物(圖6B；細胞因子購自RD Systems)。在CO2溫育箱中於37℃溫育所述平板48小時，此時取出等份溶液(20μl)按照生產商的說明(Endogen，Inc.，Woburn，MA USA)通過ELISA分析IFN-γ濃度。
在圖6A中，比較人IL-12-IL-2融合蛋白和單獨的IL-12的活性。結果表明單獨的IL-12誘導中等水平的IFN-γ，而IL-12-IL-2融合蛋白強烈誘導IFN-γ合成。因為還已知IL-2不足以合成IFN-γ，所以這些結果表明IL-12和IL-2部分不但在所述融合蛋白中都有功能，而且還協同起作用。
再者，比較了Fc-IL-12-IL-2融合蛋白、KS-IL-12-IL-2融合蛋白和由1∶1摩爾比的IL-12和IL-2組成的混合物在誘導IFN-γ能力方面的活性。圖6B的結果表明，Fc-IL-12-IL-2融合蛋白和KS-IL-12-IL-2融合蛋白與IL-12和IL-2等摩爾混合物具有大約相同的活性。當使用小鼠形式的IL-2和IL-12構建融合蛋白時，獲得了相同的結果，其中所述小鼠形式的IL-2和IL-12通過在實施例1描述的用於構建人類形式的IL-2和IL-12的方式構建。實施例4IL-12-IL-2融合蛋白的IL-2和IL-12生物活性以增殖型測定比較了融合蛋白中的IL-2和IL-12活性與單獨的細胞因子的活性。以典型的IL-12增殖測定測試了小鼠抗體14.18-IL-12-IL-2分子的活性。由志願者獲得人PBMC，將其與5μg/ml植物凝集素-P培養3天，用Hank’s HBSS清洗，按照標準方法以105細胞/孔平板接種入微量培養板(Gately，M.K.，Chizzonite，R.和Presky，D.H.Current Protocols in Immunology6.16.1-6.16.15頁)。在各種測試蛋白存在下溫育細胞48小時，並在測定放射性摻入水平之前10小時加入0.3μCi3H-胸苷。IL-12和IL-12與IL-2的等摩爾混合物以劑量依賴方式刺激3H-胸苷摻入細胞，14.18-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激3H-胸苷摻入方面差不多等效。IL-2僅在較高摩爾濃度刺激3H-胸苷摻入，表明所觀察到的14.18-IL-12-IL-2融合蛋白刺激的3H-胸苷摻入主要是由於其IL-12活性。結果示於圖7。
另外，按照標準方法(Davis，L.S.，Lipsky，P.E.和Bottomly，K.Current Protocols in Molecular Immunology6.3.1-6.3.7頁)以不同的細胞增殖測定測試IL-2部分的生物活性。小鼠CTLL-2細胞系增殖依賴於IL-2。CTLL-2細胞系還可以在IL-4作用下增殖，但對IL-12沒反應。將處於活躍對數生長期的CTLL-2細胞在缺少IL-2的培養基中清洗2次，並在各種量的市售小鼠IL-2、小鼠14.18-IL-12-IL-2融合蛋白或市售小鼠IL-12存在下以約1×104細胞/孔接種在微量滴定板上，培養48小時。在培養結束時，使用MTT/MTS測定定量活細胞數。圖8顯示了一個其中IL-2、IL-12或14.18-IL-12-IL-2融合蛋白水平變化的實驗。結果顯示小鼠IL-2和小鼠14.18-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激細胞增殖方面差不多等效，而小鼠IL-12量增加沒有對細胞增殖產生可檢測的刺激作用。該結果表明14.18-IL-12-IL-2融合蛋白刺激CTLL-2細胞增殖是緣於IL-2部分而不是IL-12部分。實施例5構建和表達具有和沒有抗體部分的單鏈和多鏈IL-12-IL-2融合蛋白如下構建單鏈小鼠IL-12-IL-2融合蛋白。通過與實施例1中構建人p40-IL-2融合蛋白使用方法類似的方法構建p40-IL-2編碼序列融合蛋白。為連接編碼IL-12的p35和p40亞單位的DNA和產生單一編碼序列，合成在5′末端具有XhoI位點和在3′末端具有BamHI位點的接頭編碼DNA。修飾成熟p40-IL-2編碼序列的5′末端，以引入限制性位點，然後連接至所述接頭的3′末端。修飾小鼠p35編碼序列的3′末端，以產生限制性位點，並連接至所述接頭的XhoI位點。利用p40中適宜的限制性位點組合編碼實施例1中所述的單鏈muIL12和mu-p40-muIL2的cDNA，獲得編碼單鏈muIL12-muIL2的第三個DNA構建物。這些步驟使用不同載體進行，並根據需要分離DNA片段。獲得的小鼠p35-接頭-p40-IL-2編碼區序列為SEQ ID NO11。
與此同時，通過相應的方法構建對應的單鏈小鼠IL-12編碼序列。該編碼序列為SEQ ID NO12。
另外，我們還構建了編碼融合至p35-接頭-p40-IL-2N端的小鼠IgG2a Fc區的DNA序列。該編碼序列為SEQ ID NO13。
用編碼小鼠單鏈Fc-IL-12-IL-2和Fc-IL-12蛋白的表達質粒轉染培養的293細胞。如實施例2所述測定融合蛋白的表達。通過與A蛋白瓊脂糖凝膠結合純化Fc融合蛋白，並觀測到Fc-IL-12-IL-2和Fc-IL-12高水平表達。根據SDS凝膠遷移的表觀分子量Fc-IL-12-IL-2，123kD；和Fc-IL-12，107kD推斷，合成了完整蛋白。
實施例1中描述的KS-scIL12-IL2融合蛋白是一種四聚體，具有兩種不同多肽鏈KS-1/4輕鏈和KS-1/4重鏈及在C端的scIL 12-IL2部分。為研究抗體分子上的哪些位點適於結合細胞因子部分，構建了其中KS-1/4抗體、IL-12和IL-2部分的構型與實施例1中的KS-IL12-IL-2構型不同的第二種融合蛋白。該第二種蛋白為四聚體，由兩種不同的多肽組成。一種多肽由KS-1/4抗體的輕鏈組成。另一種多肽包括融合至KS1/4抗體重鏈成熟N端的單鏈muIL12，後面是在重鏈羧基端的小鼠IL-2。
通過PCR由伴刀豆球蛋白A活化的小鼠脾細胞(每ml培養基5μg伴刀豆球蛋白A，活化3天)克隆編碼小鼠IL-12p35亞單位的cDNA。正向引物序列為AAGCTT GCTAGCAGC ATG TGT CAA TCA CGCTAC(SEQ.ID NO14)，其中HindIII位點AAGCTT(SEQ ID NO14的殘基1-6)位於翻譯起始密碼子ATG的上遊，而反向引物序列為CTCGAG CTT TCA GGC GGA GCT CAG ATA GCC(SEQ ID NO15)，其中XhoI位點CTCGAG(SEQ ID NO15的殘基1-6)位於翻譯終止密碼子TGA(反密碼子為TCA)的下遊。
編碼單鏈IL-12的DNA包括連接寡核苷酸的mup35 DNA，其後為mup40 DNA，其中所述寡核苷酸編碼富含甘氨酸和絲氨酸殘基的接頭。獲得的構建物在寡核苷酸連接處具有以下序列Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerG AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCCAla(SEQ ID NO17)GCC ATG(SEQ ID NO16)其中G AGC TC(SEQ ID NO16的殘基1-6)為SacI限制位點，恰好位於小鼠p35翻譯終止密碼子上遊，GCG編碼小鼠p35的C端胺基酸殘基，GGA TCC(SEQ ID NO16的殘基50-55)是為了有利於連接而引入的BamHI限制性位點，而ATG編碼成熟mu-p40的N端殘基。
編碼單鏈muIL12-KS重鏈-muGMCSF的DNA在mup40和KS重鏈的成熟N端連接處的序列如下Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyC TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGAGly Gly Ser Leu Ser (SEQ ID NO19)GGG GGC TCC TTA AGC CAG (SEQ ID NO18)其中C TGC AG(SEQ ID NO18的殘基1-6)為PstI位點，恰好位於小鼠p40翻譯終止密碼子上遊，TCC編碼小鼠p40的C端胺基酸殘基，而CAG編碼成熟KS重鏈的N端殘基。然後將獲得的編碼單鏈muIL 12-KS重鏈-muIL2的DNA與KS輕鏈共表達。
為進一步研究抗體分子的哪個末端可用於產生融合連接以及為了研究許多截然不同的多肽怎樣可以裝配入一個多細胞因子融合蛋白中，表達含KS-1/4、IL-12和IL-2的第三種蛋白，即IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2，並測試其活性。該融合蛋白為六聚體，並含有三種不同多肽。一種多肽由小鼠p35與KS1/4抗體輕鏈融合組成。第二種多肽由融合至人IL-2的KS1/4抗體重鏈組成[Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891428]，而第三種多肽為小鼠p40。在表達時，兩條輕鏈和兩條重鏈以二硫鍵鍵合，形成四聚體抗體-細胞因子結構。另外，輕鏈N端的p35還與p40以二硫鍵結合。
編碼mup35-KS輕鏈的DNA在連接處的序列如下Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerG AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCCLeu Ser (SEQ ID NO21)TTA AGC GAG (SEQ ID NO20)其中G AGC TC(SEQ ID NO20的殘基1-6)為SacI限制性位點，恰好位於小鼠p35翻譯終止密碼子上遊，GCG編碼小鼠p35的C端胺基酸殘基，GGA TCC(SEQ ID NO20的殘基50-55)是為有利於連接而引入的BamHI限制性位點，而GAG編碼輕鏈的N端胺基酸殘基。
為表達此六聚體融合蛋白，通過用含新黴素抗性基因的表達載體轉染並用G418選擇，獲得表達小鼠p40的細胞系。然後用含輕鏈和重鏈轉錄單元以及允許用氨甲蝶呤選擇的二氫葉酸還原酶選擇標記的表達載體轉染表達小鼠p40的細胞系[Gillies等(1998)J.Immunol.1606195]。實施例6小鼠單鏈IL-12-IL-2融合蛋白活性使用在實施例4中使用的相同方法測試通過瞬時表達產生的小鼠單鏈IL-12-IL-2的活性。首先通過ELISA測定細胞培養上清液中每種細胞因子的量，並用於建立劑量-反應曲線。所述活性與用上述Fc和抗體IL-12-IL-2融合蛋白發現的活性密切相關。
具體而言，以實施例4描述的人PBMC細胞增殖測定測試小鼠單鏈(sc)IL-12-IL-2和小鼠Fc-scIL-12-IL-2分子的IL-12活性。IL-12和IL-12與IL-2的等摩爾混合物以劑量依賴方式刺激3H-胸苷摻入細胞中。以每摩爾為基準，scIL-12-IL-2和Fc-scIL-12-IL-2融合蛋白在刺激3H-胸苷摻入方面與IL-12大致等效(圖9)。如實施例4所述，IL-2僅在非常高摩爾濃度刺激3H-胸苷摻入，表明所觀察到的scIL-12-IL-2融合蛋白刺激的3H-胸苷摻入主要是由於其IL-12活性。
另外，在細胞型測定中測試scIL-12-IL-2融合蛋白的IL-2部分的生物活性，發現其與市售IL-2以每摩爾為基準在所述測定的精度範圍內大致相同。如實施例4所述，在CTLL-2細胞增殖測定中測試IL-2部分的生物活性。結果表明，小鼠IL-2、小鼠scIL-12-IL-2和小鼠Fc-IL-12-IL-2融合蛋白在刺激增殖的能力上大致相等，小鼠IL-12對CTLL-2細胞增殖不產生可檢測的刺激作用。這些結果表明scIL-12-IL-2融合蛋白對CTLL-2細胞增殖的刺激作用緣於IL-2部分而不是IL-12部分。
還在細胞型測定中測試了實施例5描述的Fc-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2蛋白的IL-12活性和IL-2活性。使用PBMC細胞增殖/氚化胸苷摻入測定，Fc-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2蛋白都顯示出有效的IL-12活性。同樣地，使用CTLL-2細胞增殖測定，Fc-IL12-IL2、IL12-KS-IL2和IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2蛋白都顯示出有效的IL-2活性。另外，在ELISA中IL12-KS-IL2和IL12-KS(輕鏈)+KS(重鏈)-IL2蛋白都緊密結合EpCAM抗原，即使重鏈和輕鏈V區分別融合至其它蛋白的N端。實施例7小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白的活性在細胞增殖測定中測試小鼠Fc-IL-12-GM-CSF的IL-12活性(圖10)。由三個志願者獲得人PBMC，將其與5μg/ml植物凝集素-P培養3天，用Hank’s HBSS清洗，按照標準方法以105細胞/孔接種入微量滴定板(Gately，M.K.，Chizzonite，R.和Presky，D.H.CurrentProtocols in Immunology6.16.1-6.16.15頁)。在各種測試蛋白存在下溫育細胞48小時，並在測定放射性摻入水平之前10小時加入0.3μCi3H-胸苷。IL-12和IL-12與GM-CSF的等摩爾混合物以劑量依賴方式刺激3H-胸苷摻入細胞，而14.18-IL-12-GM-CSF融合蛋白在刺激3H-胸苷摻入方面差不多等效。GM-CSF在測試濃度不刺激3H-胸苷摻入，表明所觀察到的14.18-IL-12-GM-CSF融合蛋白刺激的3H-胸苷摻入主要是由於其IL-12活性。
另外，在細胞型測定中測試了各種IL-12-Gm-CSF融合蛋白的GM-CSF部分的生物活性。發現GM-CSF部分有活性，每摩爾的活性與市售GM-CSF在相同的常規範圍內。例如，在不同的細胞增殖測定中按照分子免疫學領域熟練技術人員已知的方法(Cooper，S.C.和Broxmeyer，H.E.，Current Protocols in Molecular Immunology6.4.1-6.4.20頁)測試GM-CSF部分的生物活性。小鼠32D(GM)細胞系增殖依賴於GM-CSF；該細胞系由Cooper和Broxmeyer描述的原始32D細胞系改變獲得，對GM-CSF特別敏感(Faas等，Eur.J.Immunol.231201-14)。32D(GM)細胞系對IL-12無應答。將處於活躍對數生長期的32D(GM)細胞在沒有GM-CSF的培養基中清洗兩次，並在各種量的市售小鼠GM-CSF或小鼠IL-12-GM-CSF融合蛋白存在下以約5×103細胞/孔接種在微量滴定板各孔中，培養48小時。在測定放射性摻入水平之前16小時加入0.3μCi3H-胸苷。隨著IL-12-GM-CSF融合蛋白水平增加，3H-胸苷摻入呈劑量反應性增加，表明IL-12-GM-CSF融合蛋白的GM-CSF部分有活性。而且，以1摩爾為基準計算，所述融合蛋白的GM-CSF生物活性與市售小鼠GM-CSF相當。實施例8用多細胞因子融合蛋白治療免疫功能良好(immune-proficient)的哺乳動物的結腸癌為測試多細胞因子-抗體融合蛋白是否可用於治療免疫系統完好的哺乳動物的結腸癌，進行了以下實驗。CT26是得自Balb/C小鼠的結腸癌細胞系。通過標準的遺傳工程技術工程該細胞系，使其表達人上皮細胞粘附分子(EpCAM)，EpCAM是KS-1/4抗體識別的抗原；這些細胞被稱為CT26/KSA細胞。
用2×106CT26/KSA細胞皮下接種Balb/C小鼠。當腫瘤體積達到約100-200mm3時，隨機將小鼠分為三組，每組9隻，供進一步研究用。從第0天開始用PBS、約3.4μg KS-IL2與約5.3μg KS-IL12的混合物或約6μg KS-IL2-IL12治療腫瘤小鼠。這些劑量用來將相等數量IL-12和IL-2分子傳遞給每組小鼠。對小鼠進行腫瘤內注射，每天一次，共5天。用測徑器檢測腫瘤大小。
一個這樣的實驗的結果示於圖11。在該實驗中，KS-IL12-IL2極為顯著地抑制腫瘤生長。KS-IL12和KS-IL2的混合物也明顯抑制腫瘤生長，但不如KS-IL12-IL2徹底。在KS-IL12-IL2治療的小鼠組中，9隻小鼠中的6隻腫瘤表觀治癒這6隻小鼠直至所述實驗終止時的第93天仍存活；而且這些小鼠中的腫瘤萎縮和消失，從第39天至第93天不能檢測到皮下腫瘤。另3隻小鼠的腫瘤生長延遲，腫瘤體積僅在第87天後超過4,000mm3。
在KS-IL12和KS-IL2混合物治療的小鼠中，2隻小鼠的皮下腫瘤表觀治癒，直至實驗結束時仍存活。餘下的7隻小鼠的腫瘤沒有消失，最終生長至體積為1,000mm3(1隻小鼠)或大於4,000mm3(6隻小鼠)。
KS-IL12-IL2比KS-IL12和KS-IL2的等摩爾混合物更有效的事實令人驚奇。該實驗中的給予劑量為每劑約19pmol融合蛋白，相當於約9×1012個分子。在治療開始時，每個腫瘤的體積約160mm3，相當於約1.6億個細胞。每個細胞表達約106個EpCAM分子，由此KS抗體可能結合的EpCAM抗原分子約1.6×1014個。因此，當混合KS-IL12和KS-IL2並注射入帶有所述腫瘤的小鼠中時，這兩種免疫細胞因子融合蛋白互相之間不大可能競爭抗原結合部位。因此，對於KS-IL12和KS-IL2混合物和KS-IL12-IL2而言，在腫瘤部位的IL12和IL2有效劑量應當至少一樣高。實施例9.用多細胞因子融合蛋白治療免疫缺陷哺乳動物中的結腸癌許多形式的癌症治療具有殺傷分裂細胞的作用，包括免疫系統細胞。因此，癌症患者常常發生免疫抑制。為了了解多細胞因子融合蛋白是否可用於治療免疫系統受抑制的哺乳動物，用KS-IL12-IL2、KS-IL12和KS-IL2的混合物或PBS治療帶有CT26/KSA腫瘤的SCID小鼠。SCID小鼠的B細胞和T細胞均存在缺陷，依賴於具抗感染能力的先天免疫系統分支如NK細胞。
如實施例8所述製備攜帶皮下CT26/KSA腫瘤的小鼠。用與實施例8相同的給藥劑量和方案通過腫瘤內注射治療三組各8隻攜帶約100-200mm3腫瘤的小鼠。結果示於圖12。在該實驗中，KS-IL12-IL2融合蛋白與KS-IL12和KS-IL2的混合物差不多等效第25天時每組8隻小鼠中的5隻被治癒。然而，在未治癒的小鼠中，6個腫瘤中的5個開始以未治療小鼠的腫瘤特徵性速率生長，有效延遲約14-21天。這與實施例8中的免疫良好小鼠的腫瘤大不相同即使在用KS-IL12-IL2治療未完全消除腫瘤時，實驗開始後約60天後腫瘤才開始侵蝕性生長。
這些實驗證明，多細胞因子抗體融合蛋白可用於治療免疫抑制動物癌症。實施例10.通過腫瘤內注射多細胞因子融合蛋白治療肺癌與單獨免疫細胞因子治療比較為了解多細胞因子融合蛋白和具有單一細胞因子部分的免疫細胞因子抗肺細胞衍生癌症的有效性，進行了以下實驗。
Lewis肺癌(LLC)是在C57BL/6小鼠中產生的一種侵襲性腫瘤。通過標準遺傳工程技術構建表達人EpCAM蛋白的LLC細胞系；此細胞系稱為LLC/KSA。
如實施例8所述製備攜帶皮下LLC/KSA腫瘤的C57BL/6小鼠(用KML核對細胞序號#)。通過腫瘤內注射治療四組各5隻攜帶約100-200mm3腫瘤的小鼠5天。用PBS、約20μg KS-IL12、約20μg KS-IL12或約20μg KS-IL12-IL2注射小鼠。
結果示於圖13。在此實驗中，KS-IL12-IL2融合蛋白遠比KS-IL12或KS-IL2有效。在用KS-IL12-IL2融合蛋白治療的所有小鼠中，腫瘤至第27天全部消失。在第74天，對這些小鼠進行實施例14所述的肺轉移測定；在幹預期或第二個實驗期間，原來的皮下腫瘤沒有再出現。相反，KS-IL2或KS-IL12治療使腫瘤外觀有一定縮小以及腫瘤生長明顯延遲，但腫瘤最終還是生長。比較此實驗和前述實驗的結果表明，對於某些疾病和給予方式，用具有不同細胞因子部分的免疫細胞因子混合物治療優於用單一類型的免疫細胞因子治療。實施例12.通過腫瘤內注射多細胞因子融合蛋白治療肺癌與免疫細胞因子混合物治療比較為了解多細胞因子融合蛋白和具有不同細胞因子部分的免疫細胞因子混合物對肺細胞性癌症的有效性，進行以下實驗。
如實施例11所述製備攜帶皮下LLC/KSA腫瘤的C57BL/6小鼠。通過腫瘤內注射治療三組各7隻攜帶約100-200mm3腫瘤的小鼠5天。用PBS、約18μg KS-IL12和約11.5μg KS-IL12的混合物或約20μgKS-IL12-IL2注射小鼠。
結果示於圖14。在此實驗中，KS-IL12-IL2融合蛋白遠比KS-IL12和KS-IL2的混合物有效。在用KS-IL12-IL2融合蛋白治療的所有小鼠中，腫瘤至第27天為止全部消失。相反，用KS-IL12和KS-IL2的混合物治療使腫瘤表觀有一定縮小以及腫瘤生長明顯延遲，但此治療組的所有腫瘤最終再發生生長。實施例13.多細胞因子抗體融合蛋白的抗原依賴性抗腫瘤活性為了解多細胞因子-抗體融合蛋白治療腫瘤的有效性是否依賴於腫瘤特異性表達的所述抗體識別抗原，進行以下實驗。
如實施例11所述製備攜帶皮下LLC/KSA腫瘤的一組7隻C57BL/6小鼠和攜帶親代LLC細胞系衍生腫瘤的第二組9隻小鼠。通過腫瘤內注射治療這兩組攜帶約100-200mm3腫瘤的小鼠5天。用約20μgKS-IL12-IL2注射小鼠。
結果示於圖15。在此實驗中，攜帶LLC/KSA腫瘤的所有小鼠的腫瘤都完全治癒。相反，LLC腫瘤小鼠只有2隻治癒，其餘的LLC腫瘤小鼠的腫瘤體積都曾有短時縮小，但腫瘤體積最終增大。
這些結果表明，對EpCAM表面抗原的識別促進了KS-IL12-IL2粘附於LLC/KSA腫瘤細胞表面，增強了產生的免疫應答。也觀察到對LLC-衍生腫瘤的一定抗腫瘤作用；儘管不希望受理論束縛，但是仍然認為在此實驗中的KS-IL12-IL2抗腫瘤作用是由於以下事實所述融合蛋白直接注射入腫瘤並因此瞬時局限於腫瘤。實施例14.產生抗腫瘤細胞類型的免疫記憶發生轉移是癌症治療中的主要問題。為測試多細胞因子抗體融合蛋白治療是否可形成抗腫瘤細胞類型的長久免疫記憶，以及是否可預防形成轉移，進行了以下實驗。
實施例11中的5隻C57BL/6小鼠用KS-IL12-IL2進行了治療，並且其皮下腫瘤已表觀治癒。如實施例14所述，從治療開始計的第74天，這5隻小鼠靜脈內注射106LLC/KSA細胞。作為對照，還對8隻C57BL/6小鼠靜脈內注射106LLC/KSA細胞。
在第28天，處死小鼠，檢查肺部轉移。8隻對照小鼠的肺部轉移佔70％-100％，肺表面覆蓋平均為85％。這些小鼠的平均肺重量為0.86克。相比之下，在5隻預治療小鼠的肺表面未發現轉移，平均肺重量為0.28克，與正常小鼠的肺重量相當。這些結果表明，對原腫瘤細胞的治療產生了對所述腫瘤細胞的長久免疫記憶；該記憶防止所述腫瘤細胞類型形成轉移。
表X.「腫瘤消退」小鼠對LLC-KSA肺轉移的保護作用在先治療 轉移記分 肺重量(g)無 4，4，4，4，4，4，3，30.88+/-0.27KS-IL12/IL2 0，0，0，0，0 0.27+/-0.03無腫瘤對照組的平均肺重量為0.2克。轉移記分是基於融合腫瘤轉移結節的表面範圍百分率，其中0＝無轉移；1＝1-25％範圍；2＝25-50％範圍；3＝50-75％範圍；而4＝75-100％範圍。
測試免疫記憶形成的第二個實驗使用實施例12的7隻小鼠中的6隻，這6隻小鼠已經注射了LLC/KSA腫瘤細胞，產生了皮下腫瘤並且已經使這些腫瘤消失。在實施例12的治療開始後62天，對6隻預治療小鼠和10隻原初未治療的C57BL/6對照小鼠皮下注射106LLC細胞。這些細胞不表達人KS抗原EpCAM。
在所述原初小鼠中，注射的LLC細胞形成的腫瘤在所有小鼠中快速生長。相比之下，預治療小鼠腫瘤的生長要慢得多，而在1隻小鼠中未檢測到皮下腫瘤。結果示於圖16。因為人KS抗原EpCAM不在LLC細胞上表達，所以針對LLC細胞的免疫應答是基於這些細胞表達的其它抗原。實施例15.作為疫苗的多細胞因子融合蛋白多細胞因子融合蛋白當融合至抗原蛋白時可用作疫苗。疫苗部分由N端至C段的具體順序或者所述融合蛋白是單一多肽鏈還是寡聚物，可根據構建表達質粒的方便性而有所變化。可通過各種途徑如靜脈內、皮下、腹膜內等給予所述蛋白。同樣地，給予的劑量和頻率一般需要經驗性確定，這是人類疫苗的標準操作，是疫苗開發領域的技術人員眾所周知的。
例如，給予小鼠抗原-IL-12-細胞因子形式的融合蛋白，其中所述融合蛋白中的細胞因子為與IL-12不同的第二種細胞因子。對照小鼠給予相同量的抗原-細胞因子、抗原-IL-12或單獨的抗原。在給予所述抗原融合蛋白期間和/或以後的各個時間通過眼眶後取血收集血樣，然後製備血漿並分析抗所述抗原的抗體存在情況。發現產生了抗所述抗原的抗體。而且，針對所述抗原的免疫應答性質為Th1型應答特徵性的。與某些對照免疫相比，所述抗體應答更強，產生的抗體類型不同。
更具體地說，將人源化抗體-小鼠IL-12-IL-2融合蛋白的PBS緩衝液靜脈注射入Balb/c小鼠中(5μg/天×5)。對照小鼠接受相同量的相同抗體，但所述抗體未附著IL-12-IL-2。兩種注射溶液都不含有任何其它類型的佐劑。在第10天，通過眼眶後取血將血樣收集到微量離心管中，並通過收集含檸檬酸鈉的塑料管中的血樣，接著在Eppendorf臺式微量離心機中全速離心製備血漿。用人源化抗體蛋白包被ELISA板(96孔)，所述人源化抗體蛋白含有人恆定區，並用於捕獲免疫應答中產生的任何小鼠抗體。洗去未結合物質之後，用偶合辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠Fc抗體(Jackson ImmunoResearch)檢測結合的小鼠抗體。任何結合抗體都可能涉及人恆定區或可變區，而人源化抗體和所述融合蛋白共有這二者。
對沒有融合IL-12-IL-2的人源化抗體幾乎沒有反應性。另一方面，所述融合蛋白在沒有外源佐劑的情況下誘導強抗體應答，儘管靜脈內給予途徑和皮下或腹膜內給予相比對於誘導這種應答是非常不宜的。為典型的IL-12增強型應答的IgG2a同種型抗體見於抗體-IL-12-IL-2注射組，但不見於人源化抗體注射組。
通過注射融合蛋白(諸如上述融合蛋白)的PBS溶液或其它生物相容性緩衝溶液或已知的佐劑(如弗氏不完全佐劑或完全佐劑)，測試由各種途徑給予的抗原-IL-12多細胞因子融合蛋白的免疫原性。例如，可每兩周給予單次或多次的皮下、皮內或腹膜內注射。或者，所述融合蛋白首先可通過皮下注射給予，然後通過腹膜內注射給予。弗氏佐劑由於刺激注射部位而不能用於人類用途。其它佐劑如氫氧化鋁沉澱(Alum)被批准用於人類用途並可用於本發明。基於鯊烯和脂質的新型有機化學佐劑也可由於皮膚注射。實施例16.用多細胞因子融合蛋白進行基因治療通過基因療法傳遞多細胞因子融合蛋白的抗癌活性也已經被證明可用於治療肺癌。使用前述病毒載體系統穩定轉染Lewis肺癌細胞(pLNCX-scIL-12-IL-2DNA或pLNCX-scIL-12 DNA轉染入PA317包裝細胞系)。這些構建物編碼其中p35和p40已通過接頭連接起來的單鏈型IL-12。使用含G418的培養基體外選擇克隆，並通過ELISA(RD Systems)鑑定穩定表達約50-60ng/ml IL-12的克隆。
將大約1×106和大約5×106的表達scIL-12或scIL-12-IL-2的LLC細胞皮下注射入C57BL/6小鼠以及SCID小鼠。作為對照，將2×106LLC細胞注射入C57BL/6小鼠以及SCID小鼠。表達IL-12的LLC細胞形成的腫瘤的生長速率與沒有被工程為表達細胞因子的LLC細胞產生的腫瘤大致相同。然而，在C57BL/6小鼠以及在SCID小鼠中，表達scIL-12-IL-2的LLC細胞或者不形成皮下腫瘤，或者形成隨後縮小消失的腫瘤(圖17和18)。實施例17.構建含IL-4和GM-CSF的多細胞因子融合蛋白細胞因子IL-4和GM-CSF當聯合使用時是有效的樹突細胞激活物。如下構建含IL-4和GM-CSF活性的多細胞因子-抗體融合蛋白。將GM-CSF的編碼序列按照讀框融合至位於前導序列之後的KS-1/4抗體重鏈編碼序列的3′末端。另外，用接頭將IL-4的編碼序列(包括前導序列)按照讀框融合至成熟KS-1/4抗體輕鏈編碼序列的5′末端。
具體而言，為構建小鼠IL-4和KS-1/4抗體輕鏈的融合蛋白編碼DNA，使用正向引物序列TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAGC(SEQ ID NO22)通過PCR修飾小鼠IL-4 cDNA，其中XbaI位點TCTAGA(SEQ ID NO22的殘基1-6)位於翻譯起始密碼子ATG的上遊，而反向引物序列為C GGA TCC CGA GTA ATC CAT TTG CATGAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G(SEQ ID NO23)，它含有的BamHI位點GGA TCC(SEQ ID NO23的殘基2-7)緊接著編碼小鼠IL-4的C端胺基酸殘基的TCG密碼子(反密碼子為CGA)的3′。克隆PCR片段並驗證序列後，將含有小鼠IL-4 cDNA的XbaI-BamHI片段連接至編碼富含甘氨酸和絲氨酸殘基的柔性肽接頭的BamHI-AflII寡核苷酸雙鏈體。AflII末端又連接至人工放置於成熟KS-1/4輕鏈N端之前的AflII位點。在兩次連接產生的連接處的DNA和蛋白序列如下。DNA TCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA蛋白 (Ser)Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGGG GGC TCC TTA AGC GAG (SEQ ID NO24)Gly Gly ser Leu Ser (Glu) (SEQ ID NO25)在該DNA序列中，GGATCC(SEQ ID NO24的殘基4-9)和CTTAAG(SEQ ID NO24的殘基48-53)分別為用於再構建的兩個限制性位點BamHI和AflII；TCG編碼小鼠IL-4的C端絲氨酸殘基；GAG編碼KS-1/4輕鏈的成熟N端；而在DNA序列之下顯示了富含GlySer的肽接頭的胺基酸序列。使用前面實施例描述的技術和其它分子生物學標準技術，將包括強啟動子的用於高水平表達的輔助序列適當地置於兩種融合多肽編碼DNA節段的周圍。
將編碼IL4-KS(輕鏈)和KS(重鏈)-GM-CSF的融合蛋白的DNA序列轉染入NS/0細胞，高水平表達相應的多肽。SDS-PAGE在還原條件下顯示約80kD的分散帶(對應於重鏈-GM-CSF多肽)和約50kD的多條帶(對應於IL-輕鏈融合蛋白)。出現分散帶和多條帶分別是由於IL-4和GM-CSF的可變糖基化。
將所述亞單位裝配入其結構對應於圖3G通式結構的二硫鍵結合的四聚體蛋白。該蛋白具有KS-1/4抗原結合活性、通過其Fc區結合Staph A蛋白的能力以及IL-4和GM-CSF的細胞因子活性。通過IL-4依賴性刺激CTLL-2細胞的氚化胸苷摻入檢測IL-4活性。通過GM-CSF依賴性刺激32(D)GM細胞的氚化胸苷摻入檢測GM-CSF活性。以1摩爾為基準，KS-IL4-GMCSF的IL-4活性和GM-CSF活性與純化的IL-4和GM-CSF相似。
如下構建沒有結合抗體序列的細胞因子IL-4和GM-CSF的融合蛋白。通過PCR由小鼠脾細胞RNA克隆小鼠IL-4。正向引物序列為TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C(SEQ ID NO26)，其中XbaI位點TCTAGA(SEQ ID NO26的殘基1-6)位於翻譯起始密碼子ATG的上遊，而反向引物序列為CGA TAT CCC GGA CGAGTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G(SEQ ID NO27)，其中EcoRV位點GAT ATC(SEQ ID NO27的殘基2-7)緊接著編碼小鼠IL-4C端胺基酸殘基的TCG密碼子(反密碼子為CGA)的3′。驗證序列後，將含有muIL-4 cDNA與其天然前導序列的XbaI-EcoRV片段連接至含muGM-CSF cDNA的SmaI-XhoI片段，在muIL-4和muGM-CSF融合的連接處產生以下序列ATG GATTAC TCG TCC GGG ATG GGA AAA GCA CCC GCC CGC(SEQ IDNO28)，其中muIL-4的C端序列和muGM-CSF的N端序列為粗體，而G ATG GG(SEQ ID NO28的殘基17-22)是將EcoRV平端連接至SmaI平端產生的序列。然後將獲得的編碼muIL4-muGMCSF的DNA克隆入表達載體。通過SDS-PAGE分析所表達的蛋白，發現跑出一條表觀分子量為45-50kD的分散帶。以1摩爾為基準，IL4-GMCSF的IL-4活性和GM-CSF活性與純化的IL-4和GM-CSF相似。實施例18.構建淋巴趨化因子-KS-IL2編碼DNA和表達淋巴趨化因子-KS-IL2蛋白趨化因子是一類獨特的被認為形成梯度和介導免疫細胞趨化性的細胞因子。另外，同其它細胞因子一樣，趨化因子也能夠誘導特定基因在靶細胞中表達。趨化因子的一個特徵在於自由N端往往是其活性必需的，這可能對構建融合蛋白的途徑構成限制。
構建一種細胞因子-抗體-細胞因子融合蛋白，包含細胞因子淋巴趨化因子(為一種趨化因子)、抗體KS-1/4和細胞因子IL-2。該融合蛋白為四聚體，並含有兩種不同多肽。一種多肽包括融合至KS-1/4抗體重鏈N端的小鼠淋巴趨化因子，其後為位於C端的IL-2。先前已經描述了KS-1/4重鏈與在C端的IL-2的融合蛋白-「KS-IL2重鏈」[Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891428]。另一種多肽由KS1/4抗體輕鏈組成。
Kelner和Zlotnik公開了小鼠淋巴趨化因子的完全編碼序列(Science 2661395)。為構建小鼠淋巴趨化因子與KS-IL2重鏈的融合蛋白的編碼DNA，使用正向引物TCTAGAGCCACC ATGAGA CTT CTC CTC CTG AC(SEQ ID NO29)通過PCR修飾小鼠淋巴趨化因子cDNA，其中XbaI位點TCTAGA(SEQ ID NO29的殘基1-6)位於翻譯起始密碼子ATG的上遊，而反向引物序列為GGATCC CCC AGT CAG GGT TAC TGC TG(SEQ ID NO30)，其BamHI位點GGA TCC(SEQ ID NO30的殘基1-6)緊接著編碼小鼠淋巴趨化因子的C端胺基酸殘基的GGG密碼子(反密碼子為CCC)的3′。克隆PCR片段並驗證序列後，將含有小鼠淋巴趨化因子cDNA的XbaI-BamHI片段連接至編碼富含甘氨酸和絲氨酸殘基的柔性肽接頭的BamHI-AflII寡核苷酸雙鏈體。AflII末端又連接至人工放置於KS-IL2重鏈成熟N端之前的AflII位點。在兩次連接產生的連接處的DNA序列如下
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser LeuCCC GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA GGG GGC TCC TTASer(SEQ ID NO32)AGC CAG(SEQ ID NO31)其中GGATCC(SEQ ID NO31的殘基4-9)和CTTAAG(SEQ ID NO31的殘基48-53)分別為用於再構建的兩個限制性位點BamHI和AflII；CCC編碼小鼠淋巴趨化因子的C端胺基酸殘基；CAG編碼KS-IL2重鏈的成熟N端；而在DNA序列之上顯示了富含GlySer的肽接頭的胺基酸序列。然後將小鼠淋巴趨化因子-KS-IL2重鏈的編碼DNA克隆入表達載體，再與KS1/4輕鏈共表達。
使用T細胞以Boyden室遷移測定(Boyden chamber migrationassay)測試表達的淋巴趨化因子-KS-IL2融合蛋白的淋巴趨化因子活性(Leonard等，Current Protocols in Immunology 6.12.3頁)。或者，使用NK細胞。或者，用在G蛋白偶聯受體活化作用下的標準細胞鈣流量測定觀測淋巴趨化因子活性(Maghazachi等，FASEB J.；11765-74)。另外，測試了淋巴趨化因子-KS-IL2融合蛋白，發現其在結合EpCAM的能力測定中有活性，並且在IL-2活性測定(如CTLL-2細胞增殖測定)中也有活性。
文獻引用本文以上提及的所有出版物都通過引用整體結合到本申請中。
等同實施方案可在不背離本發明精神或基本特徵的情況下以其它具體形式實施本發明。因此認為前述的實施方案是在所有方面進行闡述，而不是限制本文描述的本發明。因此，本發明的範圍由所附而不是由以上描述限定，所以權利要求書包括權利要求書等同含義和範圍內的所有變化。
說明書的核苷酸和胺基酸序列表序列表110Gillies，StephenLo，Kin Ming120多細胞因子蛋白複合物130LEX-010PC14014115060/147，9241511999-08-0916032170PatentIn Ver.2.02101211582212DNA213小家鼠(Mus musculus)220223人工序列的描述成熟蛋白的小鼠p35編碼序列4001agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct ga58221022111472212DNA213人工序列220223人工序列的描述小鼠p40-IL-2融合蛋白編碼序列4002atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020gatccccggg taaagcaccc acttcaagct ctacagcgga agcacagcag cagcagcagc 1080agcagcagca gcagcagcag cacctggagc agctgttgat ggacctacag gagctcctga 1140gcaggatgga gaattacagg aacctgaaac tccccaggat gctcaccttc aaattttact 1200tgcccaagca ggccacagaa ttgaaagatc ttcagtgcct agaagatgaa cttggacctc 1260tgcggcatgt tctggatttg actcaaagca aaagctttca attggaagat gctgagaatt 1320tcatcagcaa tatcagagta actgttgtaa aactaaaggg ctctgacaac acatttgagt 1380gccaattcga tgatgagtca gcaactgtgg tggactttct gaggagatgg atagccttct 1440gtcaaagcat catctcaaca agccctcaat aa 147221032111409212DNA213人工序列220223人工序列的描述小鼠p40-GM-CSF融合蛋白編碼序列4003atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020gatccccggg aaaagcaccc gcccgctcac ccataattgt tacccggcct tggaagcatg 1080tagaggccat caaagaagcc ctaaacctcc tggatgacat gcctgtcacg ttgaatgaag 1140aggtagaagt cgtctctaac gagttctcct tcaagaagct aacatgtgtg cagacccgcc 1200tgaagatatt cgagcagggt ctacggggca atttcaccaa actcaagggc gccttgaaca 1260tgacagccag ctactaccag acatactgcc ccccaactcc ggaaacggac tgtgaaacac 1320aagttaccac ctatgcggat ttcatagaca gccttaaaac ctttctgact gatatcccct 1380ttgaatgcaa aaaaccaagc caaaaatga 140921042111389212DNA213人工序列220223人工序列的描述人p40-IL-2融合蛋白編碼序列4004atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960gaatgggcat ctgtgccctg cagtgcacct acttcaagtt ctacaaagaa aacacagcta 1020caactggagc atttactgct ggatttacag atgattttga atggaattaa taattacaag 1080aatcccaaac tcaccaggat gctcacattt aagttttaca tgcccaagaa ggccacagaa 1140ctgaaacatc ttcagtgtct agaagaagaa ctcaaacctc tggaggaagt gctaaattta 1200gctcaaagca aaaactttca cttaagaccc agggacttaa tcagcaatat caacgtaata 1260gttctggaac taaagggatc tgaaacaaca ttcatgtgtg aatatgctga tgagacagca 1320accattgtag aatttctgaa cagatggatt accttttgtc aaagcatcat ctcaacacta 1380acttgataa 138921052111278212DNA213人工序列220223人工序列的描述小鼠Fc-p35融合蛋白編碼序列4005gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg 300agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 360accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca 420gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 480gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat 660caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ccgggtaggg tcattccagt ctctggacct 720gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 780gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag 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tctgcatact tcttcatgct ttcagaattc gggcagtgac tattgacaga 1260gtgacgagct atctgaatgc ttcctaa 1287210721132212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建小鼠p40-IL-2融合蛋白的正向引物220221其它特徵222(12)..(14)223翻譯起始密碼子4007aagctagcac catgtgtcct cagaagctaa cc 32210821127212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於構建小鼠p40-IL-2融合蛋白的反向引物220221其它特徵222互補物(complement)((7)..(9))223翻譯終止密碼子4008ctcgagctag gatcggaccc tgcaggg 27210921131212DNA213人工序列220223人工序列的描述小鼠p40-IL-2融合蛋白連接處的DNA序列220221其它特徵222(14)..(16)223編碼小鼠p40的C端胺基酸殘基220221其它特徵222(26)..(28)223編碼成熟小鼠IL-2的N端胺基酸殘基4009ctgcagggtc cgatccccgg gtaaagcacc c 312101021128212DNA213人工序列220223人工序列的描述在單鏈小鼠IL12和GMCSF連接處的DNA序列220221其它特徵222(14)..(16)223編碼小鼠p40的C端胺基酸殘基220221其它特徵222(26)..(28)223編碼成熟小鼠GMCSF的N端胺基酸殘基40010ctgcagggtc cga tccccgg gaaaagca 28210112112013212DNA213人工序列220223人工序列的描述小鼠p35-接頭-p40-IL-2融合蛋白編碼序列40011agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa 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cagatgacat ggtgaagacg 780gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc 840acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 900agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 960aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260tatctgagct ccgcgtcgag cgggggcagc gggggcggag gcagcggcgg gggcggatcc 1320gccatgtggg tgctggagaa agacgtttat gttgtagagg tggactggac tcccgatgcc 1380cctggagaaa cagtgaacct cacctgtgac acgcctgaag aagatgacat cacctggacc 1440tcagaccaga gacatggagt cataggctct ggaaagaccc tgaccatcac tgtcaaagag 1500tttctagatg ctggccagta cacctgccac aaaggaggcg agactctgag ccactcacat 1560ctgctgctcc acaagaagga aaatggaatt tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa 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152101821173212DNA213人工序列220223人工序列的描述在小鼠p40和KS重鏈成熟N端之間連接處的編碼序列220221其它特徵222(14)..(16)223編碼小鼠p40的C端胺基酸殘基220221其它特徵222(71)..(73)223編碼成熟KS重鏈的N端殘基40018ctgcagggtc cgatccccgg gatccggagg ttcagggggc ggaggtagcg gcggaggggg 60ctccttaagc cag732101921118212蛋白213人工序列220223人工序列的描述在小鼠p40和KS重鏈成熟N端之間連接處的蛋白序列40019Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15Leu Ser2102021164212DNA213人工序列220223人工序列的描述在小鼠p35和KS輕鏈之間連接處的編碼序列220221其它特徵222(8)..(10)223編碼小鼠p35的C端胺基酸殘基220221其它特徵222(62)..(64)223編碼輕鏈的N端胺基酸殘基40020gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccttaag 60cgag 642102121117212蛋白213人工序列220223人工序列的描述在小鼠p35和KS輕鏈連接處的蛋白序列40021Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu1 5 10 15Ser2102221127212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於PCR擴增小鼠IL-4的正向引物220221其它特徵222(9)..(11)223翻譯起始密碼子40022tctagaccat gggtctcaac ccccagc 272102321147212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於PCR擴增小鼠IL-4的反向引物220221其它特徵222互補物((8)..(10))223編碼小鼠IL-4的C端胺基酸殘基40023cggatcccga gtaatccatt tgcatgatgc tctttaggct 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權利要求
1.一種多功能融合蛋白，它包含限定為免疫球蛋白區段(Ig)、第一種細胞因子(C1)和第二種不同的細胞因子(C2)的多肽鏈。
2.權利要求1的融合蛋白，其中所述Ig、所述C1和所述C2從N端至C端的方向排列產生由選自以下的組成式定義的融合蛋白(i)Ig—C1—C2；(ii)C1—Ig—C2；和(iii)C1—C2—Ig，其中破折號表示多肽鍵或多肽接頭。
3.權利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2包括IL-2、IL-4或GM-CSF。
4.權利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2包括異源二聚體細胞因子亞單位。
5.權利要求1的融合蛋白，其中所述C1為趨化因子。
6.權利要求4的融合蛋白，其中所述亞單位包括IL-12的p35亞單位或IL-12的p40亞單位。
7.權利要求1的融合蛋白，其中所述C1或所述C2為人細胞因子。
8.權利要求1的融合蛋白，其中所述Ig包括免疫球蛋白重鏈可變區結構域(VH)。
9.權利要求1或8的融合蛋白，其中所述Ig包括免疫球蛋白重鏈恆定區。
10.權利要求9的融合蛋白，其中所述恆定區包含鉸鏈區結構域、CH2結構域和CH3結構域。
11.權利要求10的融合蛋白，其中所述恆定區還含有CH1結構域。
12.權利要求9的融合蛋白，其中所述VH對癌症特異性抗原或病毒抗原具有免疫反應性。
13.權利要求1的融合蛋白，其中所述C1和所述C2當以所述融合蛋白連接時在體內具有相似的循環半衰期。
14.權利要求1的融合蛋白，其中所述Ig、所述C1和所述C2在相同條件下都具有活性。
15.一種多功能蛋白複合物，它包含第一條多肽鏈和第二條多肽鏈，其中所述第一條多肽鏈限定為免疫球蛋白區段和第一種細胞因子的第一部分，所述第二條多肽鏈限定為第二種細胞因子和第一種細胞因子的第二部分。
16.權利要求15的多功能蛋白複合物，其中所述第一條多肽鏈與所述第二條多肽鏈共價連接。
17.權利要求15的多功能蛋白複合物，其中所述第一種細胞因子為二聚體細胞因子。
18.權利要求15的多功能蛋白複合物，其中所述第一種細胞因子為IL-12。
19.權利要求15的多功能蛋白複合物，其中所述第二種細胞因子為IL-2。
20.一種多功能蛋白複合物，它至少包含第一種融合蛋白它包含與至少一部分免疫球蛋白輕鏈融合的第一種細胞因子，以及第二種融合蛋白它包含與至少一部分免疫球蛋白重鏈融合的第二種不同的細胞因子。
21.權利要求20的蛋白複合物，其中所述第一種融合蛋白與所述第二種融合蛋白共價結合。
22.權利要求21的蛋白複合物，其中所述免疫球蛋白輕鏈部分以二硫鍵與所述免疫球蛋白重鏈部分結合。
23.權利要求20的蛋白複合物，其中所述第一種細胞因子的N端與所述免疫球蛋白輕鏈的C端融合。
24.權利要求20的蛋白複合物，其中所述第二種細胞因子的N端與所述免疫球蛋白重鏈的C端融合。
25.權利要求20的蛋白複合物，其中所述第一種細胞因子為IL-12。
26.權利要求20的蛋白複合物，其中所述第二種細胞因子為IL-12。
27.一種多功能融合蛋白，它包含限定為第一種細胞因子(C1)和第二種不同的細胞因子(C2)的多肽鏈，其中所述C2單獨具有的體內循環半衰期比單獨的C1高約2倍，但當所述C1以所述融合蛋白與所述C2連接時，所述融合蛋白中的所述C1的體內循環半衰期與所述C2大致相同。
28.權利要求27的融合蛋白，其中所述C1為IL-2或GM-CSF。
29.權利要求27的融合蛋白，其中所述C2為IL-4、IL-12或其亞單位。
30.權利要求27的融合蛋白，其中所述C1的C末端與所述C2的N末端連接。
31.權利要求27的融合蛋白，其中所述C2的C末端與所述C1的N末端連接。
32.權利要求30或31的融合蛋白，其中所述C末端通過多肽接頭與所述N末端連接。
33.權利要求32的融合蛋白，它還含有免疫球蛋白區段(Ig)。
34.權利要求33的融合蛋白，其中所述Ig含有免疫球蛋白重鏈可變區結構域(VH)。
35.權利要求33的融合蛋白，其中所述Ig含有免疫球蛋白重鏈恆定區。
36.權利要求35的融合蛋白，其中所述恆定區包含鉸鏈區結構域、CH2結構域和CH3結構域。
37.權利要求36的融合蛋白，其中所述重鏈恆定區還含有CH1結構域。
38.權利要求27的融合蛋白，其中所述單獨的C2的體內循環半衰期比C1的體內循環半衰期至少高約4倍。
39.權利要求38的融合蛋白，其中所述C2的循環半衰期比C1的體內循環半衰期至少高約8倍。
40.一種核酸，它編碼權利要求1、15、20或27的融合蛋白。
41.一種細胞，它包含權利要求40的核酸。
42.一種製備融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含第一種細胞因子(C1)、第二種不同的細胞因子(C2)和能夠靶向哺乳動物預先選定部位的靶向部分，所述方法包括以下步驟(a)在宿主細胞中表達編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含所述C1、所述C2和在給予哺乳動物時能夠將所述融合蛋白靶向預先選定部位的靶向部分；和(b)收穫所述融合蛋白。
43.一種將第一種細胞因子(C1)和第二種不同的細胞因子(C2)靶向哺乳動物預先選定部位的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物一種多功能融合蛋白，該融合蛋白包含C1、C2和能夠將所述融合蛋白靶向哺乳動物預先選定部位的免疫球蛋白區段(Ig)。
44.權利要求42或43的方法，其中所述Ig包含與布局在哺乳動物預先選定部位的抗原具有免疫反應性的免疫球蛋白重鏈可變區結構域。
45.權利要求44的方法，其中所述抗原為癌症特異性抗原或病毒抗原。
46.權利要求42或43的方法，其中所述Ig包含能夠結合布局在哺乳動物預先選定部位的免疫球蛋白Fc受體的免疫球蛋白重鏈恆定區。
47.權利要求42或43的方法，其中所述Ig、所述C1和所述C2在所述融合蛋白給予所述哺乳動物時均有活性。
48.權利要求42或43的方法，其中所述哺乳動物為人。
49.權利要求42或43的方法，其中所述C1為IL-12或其亞單位。
56.權利要求49的方法，其中所述C2選自IL-2和GM-CSF。
57.一種治療哺乳動物疾病的方法，該方法包括給予所述哺乳動物權利要求1、15、20或27的蛋白。
58.一種治療哺乳動物疾病的方法，該方法包括給予所述哺乳動物權利要求40的核酸。
59.一種治療哺乳動物疾病的方法，該方法包括給予所述哺乳動物權利要求41的細胞。
全文摘要
本發明涉及包括至少兩種不同細胞因子分子的蛋白複合物和融合蛋白。所述蛋白複合物和融合蛋白還可以包括諸如免疫球蛋白區段的靶向部分。本發明還公開了使用所述蛋白複合物和融合蛋白的方法。
文檔編號A61K48/00GK1382158SQ00813726
公開日2002年11月27日 申請日期2000年8月9日 優先權日1999年8月9日
發明者S·D·吉利斯, 勞健明 申請人:利思進藥品公司