將基因轉移進生殖細胞的方法
2023-12-08 19:45:36
專利名稱：將基因轉移進生殖細胞的方法
技術領域：
本發明涉及將基因轉移進生殖細胞的方法。更具體地說，本發明涉及將基因轉移進脊椎動物生殖細胞的方法以及用通過所述方法獲得的帶有轉移基因的生殖細胞產生轉基因動物的方法。本發明的方法可用於醫藥、藥理學和良種繁育等領域中。
產生轉基因動物的最常用的方法包括通過使用顯微操作器等將DNA直接注射入受精卵中，並將所述受精卵移植進代母(surrogatemother)，然後獲得長成的個體[Gordon,J.H．等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:7380-7384(1980)]。該方法要求極其精細的操作，包括處理離體的受精卵並將DNA注射入所述受精卵。因此，只有在熟練的研究人員實施該方法時，才預期獲得成功的結果。此外，由於所注射的DNA並非主動地整合入染色體中，因此獲得帶有外源基因的個體的效率低。
因此，有必要處理若干受精卵以確定地達到目的。這樣一種要求產生了一些問題，如繁重的操作以及為收集受精卵而購買動物的費用。在這些情況下，人們已經設計並測試了如下面所述的各種方法。
已經報導了為使外源基因有效地整合進染色體中，通過使用逆轉錄病毒載體將所述外源基因轉移進早期胚胎的嘗試[Bowen,R.A.等人，Molec.Reprod.Dev.,40:386-390(1995)]。
另外，已經報導了通過將一種鹼性多胺和一種質粒的混合物靜脈內注射入妊娠的雌性小鼠而將外源基因轉移進胎兒的嘗試[Terada等人，Nature Genetics,9:243-248(1995)]。
另一方面，已經嘗試了一種產生轉基因動物的方法。該方法基於這樣一個原理首先產生基因修飾的精子，然後用其產生受精卵。例如，已經報導了一種方法，在該方法中通過物理或化學處理破壞睪丸細胞，然後將基因修飾的精原細胞移植進生精小管[Brinster,R.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:11303-11307(1994)；Nature]Med.,2:693-696(1996)]。
此外，已經作出了以下努力。用磷酸鈣共沉澱帶有外源基因的環狀或線性質粒DNA。通過使用脂質體方法將所述沉澱物給予睪丸，以將所述外源基因轉移進睪丸幹細胞或精子[Tada等人，AnimalBiotechnol.,5:19-31(1994)；Takahashi等人，Nippon Chikusan Gakkai(日本動物科學協會)Abstract,2x-8(1996)]。
如Brinster等人和Bowen等人所述的方法主要目的在於以高效率獲得基因修飾的個體。然而，這些技術要求高水平的試驗技術，包括維持早期胚胎、用病毒轉移基因和將細胞移植進睪丸生精小管。這些技術還要求使得這些技術能夠進行的昂貴設備。因此，不可能用一般試驗設備實施這些技術。
如Tada等人、Takahashi等人和Terada等人所述的方法因為不要求如上所述的設備，所以是方便的。然而，在這些方法中，所給予的外源基因不是主動地整合進靶生殖細胞的染色體中。這導致所述基因傳遞給後代的可能性很小，儘管有可能瞬間觀察到所述基因的存在。換句話說，這些方法不適於獲得整合了具有生物功能的目的基因的生殖細胞，或獲得源自所述細胞的轉基因動物。發明目的本發明的一個目的是提供獲得整合了目的外源基因的生殖細胞以及帶有所述細胞的脊椎動物的便利方法。
本發明的另一個目的是提供利用所述生殖細胞或所述脊椎動物產生遺傳上新型的脊椎動物系的方法。
因此，本發明的第一個發明涉及將基因轉移進脊椎動物睪丸細胞的方法。該方法的特徵在於包括降低睪丸細胞的數目並將帶有外源基因的重組病毒接種進睪丸。可以使用化學方法、物理方法或生物學方法等降低睪丸細胞的數目。使用烷化劑的化學方法尤其是優選的。此外，所述重組病毒最好是在所述睪丸細胞的恢復期間接種到所述睪丸中。
能夠整合進染色體的重組病毒可以在本發明中用作重組病毒。最好使用重組逆轉錄病毒。
本發明的第二個發明涉及外源基因已經轉移進其睪丸細胞中的脊椎動物。所述脊椎動物的特徵在於所述外源基因是用第一個發明的方法轉移進去的。
本發明的第三個發明涉及帶有轉移外源基因的睪丸細胞。所述細胞的特徵在於它是由第二個發明的脊椎動物獲得的。
此外，本發明的第四個發明涉及帶有轉移外源基因的脊椎動物。所述脊椎動物的特徵在於它是通過使第二個發明的脊椎動物交配或使用第三個發明的睪丸細胞的人工受精而獲得的。發明詳述在本發明的將基因轉移進入睪丸細胞的方法中，使用重組病毒作為載體。在本發明中最好使用能夠將目的基因整合進靶細胞的染色體中的病毒載體。例如，可以使用的病毒載體包括但不限於逆轉錄病毒載體、人免疫缺陷病毒(HIV)載體、腺伴隨病毒載體。此外，本發明的病毒載體最好是複製缺陷型的，以便所述載體不重複無限制的感染。
在本發明的轉移基因的方法中，可以使用已知的複製缺陷型逆轉錄病毒載體。例如，可以使用的載體包括但不限於逆轉錄病毒載體，如MFG(ATCC No.68754)、α-SGC(ATCC No.68755)、pLRNL[Virology,171:331(1989)]和pBabe[Nucleic Acids Research,18:3587-3596(1990)]或由它們衍生的修飾載體。此外，所述載體可以作為含有病毒顆粒的病毒上清液製備，其中使用一種已知的包裝細胞系將所述載體包裝進所述病毒顆粒，其中所述包裝細胞系如PG13(ATCCCRL-10686)、PG13/LNc8(ATCC CRL-10685)、PM317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86(ATCC CRL9642)和GP+envAm-12(ATCCCRL9641)。
對於通過本發明的方法轉移進生殖細胞的外源基因是沒有限制的。可以使用任何需要轉移的基因。例如，可以轉移編碼一種酶或另一種蛋白的基因、編碼一種有功能的核酸分子的基因，其中所述有功能的核酸分子如反義核酸、核酶或誘餌(decoy)。對於所述基因的來源也沒有限制。所述基因可以是來自與所述基因要轉移進的生殖細胞的同一物種的生物的基因、得自異源生物的基因、化學合成的基因或它們的組合。此外，可以向所述基因加入調節元件，如適於調節所述基因表達的啟動子、終止子和增強子。在本發明中，所述基因是整合入上面提到的病毒載體中後使用。
本發明的轉移基因的方法包括接種一種重組病毒，其中所述重組病毒帶有要轉移進睪丸的外源基因。病毒接種的實施是，例如，通過在麻醉下用注射器注射入睪丸中，而不是通過如剖腹術等手術。
已知靶細胞數目與病毒顆粒數目(或病毒滴度)的比例是在病毒對細胞的感染中極大地影響感染效率的因素。例如，本發明人實施自然交配五周。在自然交配中，將50μl逆轉錄病毒(1×104cfu/ml)注射入十隻雄性小鼠，這些小鼠在每個睪丸中都含有摻入的外源基因。然後每周從周一到周五將它們與八周齡的正常雌性小鼠一一對應地養在一起。在五十隻雌性小鼠的總共534個後代中，通過PCR分析實施的轉基因檢測揭示沒有後代帶有所使用的外源基因。
為解決這樣一個問題，最好是以高滴度接種重組病毒。所述重組病毒的滴度取決於用於生產所述病毒的生產者細胞。在實踐上構建產生高滴度逆轉錄病毒載體的生產者細胞是不容易的。在本發明轉移基因的方法中，加入降低睪丸細胞數目的步驟已經解決了這個問題。
如本文所用，睪丸細胞是指存在於睪丸中的生殖細胞。通過本發明的方法將基因轉移進睪丸細胞(包括例如，精原細胞、精母細胞、精子細胞和精子)。
作為降低睪丸細胞數目的方法，可以單獨或組合使用化學方法、物理方法或生物學方法。化學方法是指通過給予化學試劑而降低睪丸細胞數目的方法。例如，可以使用DNA合成抑制劑、RNA合成抑制劑、DNA聚合酶抑制劑、有絲分裂抑制劑、烷化劑、避孕藥等等。例如X-射線照射或γ-射線照射可以用作物理方法。此外，例如，涉及細胞增殖或複製的蛋白可以用於生物學方法。可以使用上面所述的各種方法中的任何一種來降低睪丸細胞的數目。在這些方法中，在本發明中降低睪丸細胞的數目最好使用不要求專門化設備或操作並且活性容易控制的化學方法。
通過化學方法降低睪丸細胞數目的方法包括，例如使用烷化劑的方法。可以在本發明的方法中使用的烷化劑包括，例如絲裂黴素C、氮芥-N-氧化物、TESPA、苯丙氨酸氮芥、卡巴醌、亞硝基脲衍生物、環磷醯胺、二甲磺酸丁酯等等。
本發明的轉移基因的方法包括降低睪丸細胞數目到某一程度，該程度允許細胞數目恢復到處理前的水平。如上所述的降低睪丸細胞數目的處理去除了睪丸中的成熟細胞。此後，剩餘的精原細胞開始活躍地分裂並增殖以在一段時間後恢復細胞數目到處理前的水平。可以通過檢查睪丸、鏡檢觀察睪丸的組織切片、使用FACS(螢光激活細胞分類術)分析細胞周期並在接受降低睪丸細胞數目的處理的動物個體上在時程內進行體內配對實驗，驗證這些事件。這些實驗詳細揭示了在降低睪丸細胞數目的處理和細胞數目由降低到恢復的時程之間的關係。
將含有外源基因的重組病毒接種到細胞數目已經如上所述降低的睪丸中，導致所述病毒對睪丸細胞的高效率感染。此外，隨著睪丸細胞數目的恢復，帶有轉移外源基因的精原細胞、精母細胞、精子細胞和精子在睪丸中積累。最好選擇剩餘細胞活躍增殖的恢復期以給予病毒。已知常常用作將基因轉移進細胞的載體的逆轉錄病毒優先感染分裂中的細胞。因此，恢復期為病毒感染提供了特別優選的環境。
高滴度重組病毒的感染可以進一步提高基因轉移的效率。例如，通過使用選定的能夠產生高滴度病毒的包裝細胞製備病毒上清液，可以獲得這樣的高滴度。或者，可以使用通過適當方法濃縮的病毒。例如，可以通過離心濃縮VSV-G載體的病毒顆粒，即一種所謂假型的逆轉錄病毒載體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:8033-8037(1994)]。
本發明提供了將外源基因轉移進脊椎動物生殖細胞的方便方法，該方法不涉及到手術或處理離體的生殖細胞。通過使用本發明可以獲得雄性脊椎動物個體，其攜帶的生殖細胞中帶有轉移的外源基因。此外，通過將所述得到的雄性脊椎動物個體與一雌性個體交配，可以獲得由帶有轉移基因的生殖細胞得到的受精卵，以及由所述受精卵發育的脊椎動物個體。可以使用除交配外的技術獲得受精卵。例如，可以使用人工受精產生受精卵，其中卵子在體外與從如上所述的雄性脊椎動物個體中收集的睪丸細胞(如精子)受精。將人工受精產生的受精卵移植到合適的代母中，可以將其發育成動物個體。
這樣獲得的動物個體中包含一種個體，這種個體在細胞中的僅僅一條染色體(雜合個體)上具有轉移的外源基因(即修飾的基因)。使用已知方法，如PCR分析或雜交方法，檢查基因組中是否含有所述外源基因，可以選出這樣的個體。從通過使雜合個體交配獲得的後代中選擇純合個體，即在兩條染色體上都帶有修飾基因的個體，可以獲得穩定地攜帶有轉移基因並顯示由該基因得到的表型的轉基因動物。
本發明可以應用於除人類以外的任何動物物種。例如，它可以應用於經常用於研究的嚙齒類動物(如小鼠、大鼠等)以及家畜和家禽(例如家牛(domestic cattle)如奶牛和肉牛、馬、豬、鳥如雞等)。使用本發明的方法，可以容易並且低成本地產生可用作實驗動物的轉基因動物或作為家畜具有極佳表型的轉基因動物。
目的外源基因通過本發明的方法轉移進其睪丸細胞中的雄性脊椎動物個體，產生所述基因已整合到染色體中的精子。因此，預期所述方法可用作例如，為產生有價值的牛犢或馬駒而產生種公牛或種公馬的方法。可以通過使所述雄性動物交配而產生帶有所述基因的後代。
圖2顯示了給予了二甲磺酸丁酯的雄性小鼠的生殖力。圖中的妊娠率代表妊娠雌性小鼠的比例。圖中A、B和C分別代表對照小鼠、給予20或30mg/kg二甲磺酸丁酯的小鼠的結果。
圖3描繪了包含在質粒pGL2中要整合進被感染細胞的染色體的vGL2病毒基因的一個區。在圖中，LTR代表來自莫洛尼鼠類白血病毒的LTR(長末端重複)，SD代表剪接供體位點，ψ代表包裝信號，CMV代表來自巨細胞病毒的早期增強子-啟動子，GFP代表綠螢光蛋白基因，SA代表剪接受體位點，Neo代表新黴素磷酸轉移酶基因，SV40ori代表來自SV40的複製起點，而pBR322ori代表了來自pBR322的複製起點。
圖4顯示了對來自接種了vGL2病毒的小鼠的睪丸細胞中GFP-表達的FACS分析的結果。
圖5顯示了對從接種了vGL2病毒的小鼠的附睪收集的精子中GFP-表達的FACS分析的結果。
實施例1腹腔內給予二甲磺酸丁酯在鼠睪丸細胞中引起的變化(1)對睪丸重量的影響將5、10、20或40mg/kg二甲磺酸丁酯(1,4-丁二醇二甲磺酸酯，Wako Pure Chemical Industries)腹腔內給予四周齡的MCH(ICR)雄性小鼠(Clea Japan)。稱量給藥後1、2、3、4和5周從小鼠取出的睪丸的重量，並與從給予鹽水的對照小鼠中取出的睪丸的重量比較。
結果，如表1所示，觀察到給予20或40mg/kg二甲磺酸丁酯的小鼠重量減少。此外，觀察到給予20mg/kg二甲磺酸丁酯的小鼠在給予後五周恢復重量的趨勢。
表1給予二甲磺酸丁酯對小鼠睪丸重量的影響
(2)對體重的影響將10、20、30或40mg/kg二甲磺酸丁酯腹腔內給予四周齡的MCH(ICR)雄性小鼠。給藥後七周才測量體重的變化，並與給予鹽水的對照小鼠的體重比較。給藥組的每個組和對照組都使用每組五隻小鼠。
結果，如表2所示，在測試的量的範圍內給予二甲磺酸丁酯完全不影響小鼠的體重。此外，沒有觀察到小鼠有外觀上的變化。
表2給予二甲磺酸丁酯對小鼠體重的影響
表示為每組五隻小鼠的平均體重±標準差(克)。N.D.未測定。
(3)對睪丸和附睪的組織切片的顯微鏡觀察的結果將20、30或40mg/kg二甲磺酸丁酯腹腔內給予四周齡的MCH(ICR)雄性小鼠。給藥後十周，由從小鼠取出的睪丸和附睪製備組織切片。用HE染色(蘇木精-伊紅染色)處理這些切片，然後鏡檢觀察。將所述組織和/或細胞的狀態與給予鹽水的對照小鼠的狀態相比較。給藥組的每個組和對照組都使用每組五隻小鼠。
結果，如表3所示，在給予20mg/kg或30mg/kg二甲磺酸丁酯的組中，小鼠的睪丸和附睪都恢復到與對照小鼠的睪丸和附睪近乎相同的狀態。
表3給予二甲磺酸丁酯的小鼠的睪丸和附睪的組織切片的顯微鏡觀察的結果
評價是基於從每組五隻小鼠的睪丸和附睪的組織切片的鏡檢觀察的結果。
(4)腹腔內給予二甲磺酸丁酯的睪丸細胞群體的FACS分析將20或30mg/kg二甲磺酸丁酯或鹽水(對照組)腹腔內給予四周齡的MCH(ICR)雄性小鼠(每組六隻小鼠)。給予後1、2、3、4、5和6周，從每組的一隻小鼠中取出一對睪丸。然後按照下面方法處理睪丸細胞。首先，除去睪丸的膜後，向裡面加入膠原酶Ⅰ(Gibco)至1mg/ml的終濃度，於37℃處理15分鐘。洗滌混合物，然後用1ml0.25％胰蛋白酶/EDTA(Gibco)分散細胞團。在通過過濾除去100微米或更大的細胞團後，用1％低聚甲醛然後用70％乙醇固定細胞。用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)洗滌細胞，懸浮於PBS中，用2mg/mlRNase A(Sigma)處理，然後用0.05mg/ml碘化丙錠(Sigma)進行DNA染色。正好在FACS分析之前用30-微米篩除去細胞團。使用FACSVantage(BectonDickinson)在488nm的激發波長和564-606nm的發射波長分析細胞內的DNA含量。
FACS分析可以用於測定下列細胞的數目。G2期和M期的精原細胞以及初級精母細胞，它們的DNA含量為4n；G1期的精原細胞以及次級精母細胞，它們的DNA含量為2n；精子細胞和精子，它們的DNA含量為n；以及凋亡的細胞，它們的DNA含量少於前者。由分析數據確定的值顯示於表4。給予20mg/kg二甲磺酸丁酯1、3和5周後由小鼠獲得的睪丸細胞的FACS數據顯示於
圖1作為代表。
圖1顯示給藥後三周在大多數睪丸細胞中觀察到細胞凋亡，儘管具有2n的細胞的比例在給藥後五周增加了。此外，表4所示結果揭示了以下現象。給予二甲磺酸丁酯後約四周觀察到睪丸中有最小的總細胞數。其後開始了細胞的再生。在細胞再生的過程中，具有2n的細胞的數目首先增加。
表4腹腔內給予二甲磺酸丁酯後小鼠中睪丸細胞類型的變化
結果表示為兩隻小鼠的各自細胞數目的平均值。n精子細胞和/或精子。2n:G1期的精原細胞和/或次級精母細胞。4n:G2期和M期的精原細胞和/或初級精母細胞。
(5)由腹腔內給予二甲磺酸丁酯引起的雄性小鼠中生殖力的降低以及恢復期的確定腹腔內給予四周齡的MCH(ICR)雄性小鼠(每組六隻小鼠)20或30mg/kg二甲磺酸丁酯。使小鼠自然交配。給藥後從第一周到第十周，每周五天(從周一到周五)進行自然交配。讓它們與雌性小鼠交配，並且每周更換雌性小鼠。確定雌性小鼠的妊娠率，並將給予了二甲磺酸丁酯的雄性小鼠的生殖力與給予鹽水的對照組的生殖力相比較。
結果，如圖2所示，腹腔內給予20mg/kg或30mg/kg二甲磺酸丁酯的組觀察到了生殖力的降低(給予二甲磺酸丁酯後4-7周)以及它的恢復(給予二甲磺酸丁酯後8周)。已知在小鼠中精原細胞轉變為精母細胞、形成精子細胞並最後成為成熟的精子大約需要3-6周。在如實施例1-(3)和(4)所述的組織切片的鏡檢觀察結果中，以及使用FACS對睪丸細胞群體的變化的分析結果中，在給予二甲磺酸丁酯後五周或更遲觀察到給藥後睪丸細胞的恢復。在三周後觀察到雄性小鼠生殖力的恢復的事實與由精原細胞形成成熟的精子所需的時間十分符合。
實施例2將外源基因轉移入鼠睪丸細胞中以及它的表達(1)重組逆轉錄病毒的構建質粒pGreen Latern-l(Life Technologies Oriental)包含一個編碼綠螢光蛋白(GFP)的基因。在該基因中，密碼子針對人類優化，並且N端65位上編碼的胺基酸絲氨酸被蘇氨酸取代(S65T)。用SspⅠ(TakaraShuzo)消化該質粒，並應用1％瓊脂糖凝膠電泳。回收對應於約1.9kb的DNA片段。另一方面，用BamHⅠ(Takara Shuzo)消化質粒pZIP-NeoSV(X)I[Cell,37:1053-1062(1984)]。用DNA平端化試劑盒(TakaraShuzo)平端化該末端，然後用鹼性磷酸酶(Takara Shuzo)脫磷酸化。將得到的質粒DNA與上面提到的約1.9kb的DNA片段混合併連接，然後將混合物引入大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)。檢測所得轉化體載有的質粒，選出僅含有一個分子的約1.9kb片段的一個質粒。這樣獲得的質粒被命名為質粒pGL2。由該質粒獲得的病毒顆粒能夠感染細胞並將GFP基因整合進所感染的細胞的染色體。圖3顯示了質粒pGL2中含有的要整合進所感染細胞的染色體的逆轉錄病毒基因的區域。
(2)vGL2病毒上清液的製備由質粒pGL2得到的病毒被命名為vGL2病毒。通過使用BOSC23作為包裝細胞系，製備含有該病毒的上清液[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:8392-8396(1993)]。簡短地說，在10-cm直徑的明膠包被的細胞培養皿(Iwaki Glass)中，在10ml含有10％胎牛血清(FCS,DainipponPharmaceutical)、50單位/ml青黴素和50μg/ml鏈黴素(均來自Gibco)的Dulbecco’s改良Eagle’s培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM,Iwaki Glass)中(所有在下文的方法中使用的DMEM都含有50單位/ml青黴素和50μg/ml鏈黴素)，將1×107BOSC23細胞培養過夜。將上述培養基更換為10ml新鮮培養基後，使用50μg質粒pGL2通過磷酸鈣共沉澱法進行轉染。8小時後將培養基更換為10ml新鮮培養基，24小時後更換為5ml新鮮培養基。再繼續培養24小時，然後收集培養物上清液。將收集到的培養物上清液通過0.45-微米濾器(Millipore)過濾，製備vGL2病毒上清貯液，在-80℃保存待用。
(3)病毒上清液滴度的估計按照標準方法[J.Virol.,62:1120-1124(1988)]，使用NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)測定上清液的滴度。簡短地說，在6孔組織培養板(Iwaki Glass)上，在含有10％小牛血清(CS,Gibco)的DMEM中，將每孔2,000NIH/3T3細胞培養過夜。然後每孔加入病毒上清的連續稀釋液，並加入溴化己二甲銨(polybrene,Aldrich)至7.5μg/ml的終濃度。於37℃溫育24小時後，將培養基更換為含有終濃度為0.75mg/ml的G418(Gibco)以及10％CS的DMEM，然後繼續培養。10-12天後用結晶紫染色G418抗性的集落並計數。通過用病毒上清液的稀釋度乘以每孔集落的數目，計算1ml上清液中含有的感染顆粒的數目(cfu/ml)，即病毒上清液的滴度。根據該滴度確定在下文的試驗中使用的病毒上清液的量。
(4)將外源GFP基因轉移進鼠睪丸細胞腹腔內給予四周齡的MCH(ICR)雄性小鼠(每組4隻小鼠)30mg/ml二甲磺酸丁酯。在接種病毒之前將小鼠如下分為四組。一組在給藥後14、17和20天三次接種病毒(組1)；一組在給藥後21、24和27天三次接種病毒(組2)；一組在給藥後28、31和34天三次接種病毒(組3)；一組在給藥後35、38和41天三次接種病毒(組4)。實施病毒接種的方法為在每個睪丸中接種50μl的一種vGL2病毒上清(1×104cfu/ml)。在最後一次病毒接種之後的4、11、18和25天，從每組的一隻小鼠中取出一對睪丸。對來自睪丸的睪丸細胞製備物通過PCR分析和GFP基因產物的FACS分析，來檢測細胞中的GFP基因。
(5)鼠睪丸細胞中GFP基因表達的FACS分析從實施例2-(4)中的一隻小鼠收集一對睪丸並除去睪丸的膜。然後使用勻漿器將睪丸勻漿。在勻漿物中加入1ml0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液以解離細胞團。用30微米的篩除去剩餘的細胞團，製備睪丸細胞製備物。對這樣獲得的睪丸細胞製備物進行FACS分析，檢測GFP基因的表達。該分析使用FACS Vantage，在488nm的激發波長和515-545nm的發射波長下測定來自GFP的螢光。
獲得了由病毒接種25天後從組(3)得到的睪丸細胞製備物的分析結果。同時，獲得了由同樣周齡但在給予二甲磺酸丁酯後未接種病毒的小鼠的睪丸細胞製備物的結果(作為對照分析)。圖4顯示了這些結果。對於接受了病毒接種的製備物，存在一個代表來自GFP的螢光的區域，而在對照中沒有觀察到這個區域(在圖中水平軸上標出的GFP相對螢光密度上，該區域範圍為從30到100)。這證實了轉移的GFP基因在睪丸細胞中的表達。
(6)轉移進鼠睪丸細胞的GFP基因的檢測由幾個睪丸細胞製備物製備染色體DNA，其中所述睪丸細胞製備物是由在實施例2-(5)中製備的製備物中選出。將來自所述睪丸細胞製備物的約1×106細胞懸浮於700μlDNA提取液(10mMTris-HCl(pH8.0),100mMNaCl,10mMEDTA,39mMDTT和2％SDS)中。在懸浮液中加入35μl蛋白酶K(10mg/ml,Merck)。將混合物在37℃溫育過夜後，在混合物中加入2μl核糖核酸酶A(20mg/ml,Sigma)，然後在37℃下繼續溫育兩小時。通過酚-氯仿提取終止反應；進行乙醇沉澱以回收DNA，然後將DNA溶解於100μlTE緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0),1mMEDTA)以獲得染色體DNA溶液。
使用PCR分析證實因用vGL2病毒感染細胞導致GFP基因整合進染色體。製備PCR反應混合物，所述混合物中含有所述染色體DNA溶液以及根據GFP基因序列合成的寡核苷酸GFP-13和GFP-16R(序列表的SEQ ID NO:1和2分別顯示了寡核苷酸GFP-13和GFP-16R的鹼基序列)。使所述混合物進行反應94℃1分鐘，然後30個循環的94℃30秒-63℃30秒-72℃30秒。PCR使用TakaRa Taq(TakaraShuzo)並使用附帶的反應緩衝液製備反應混合物。同時，使用從用vGL2病毒感染的NIH/3T3細胞相似製備的染色體DNA溶液作為陽性對照，使用從同樣周齡但在給予二甲磺酸丁酯後未接種病毒的小鼠獲得的睪丸細胞製備物作為陰性對照。
結果，如表5所示，在下列染色體DNA觀察到了來自GFP基因的234-bp DNA片段的擴增從最後一次病毒接種18天後由組2獲得的睪丸細胞製備的染色體DNA；從最後一次病毒接種4和25天後由組3獲得的睪丸細胞製備的染色體DNA；從最後一次病毒接種4和18天後由組4獲得的睪丸細胞製備的染色體DNA。
這些結果顯示，外源基因即GFP基因，在給予二甲磺酸丁酯後4-5或5-6周接種病毒的組中以高效率整合入染色體中。因此揭示在給予二甲磺酸丁酯後約五周進行幾次病毒接種是重要的。這個階段對應於實施例1中所述的初步試驗中所說明的減少的睪丸細胞的恢復期。
實施例2-(4)到(6)的結果表明，為將目的基因體內整合進睪丸細胞的染色體，下面幾點是重要的。將目的基因引入能夠整合的載體。然後在睪丸細胞從藥物損傷恢復的時期內接種它。
表5通過PCR分析檢測GFP基因
+擴增了一個234-bp片段。-沒有擴增234-bp片段。
實施例3將GFP基因轉移進鼠附睪精子細胞以及它的表達(1)將GFP基因轉移進鼠附睪精子細胞腹腔內給予十六隻四周齡的MCH(ICR)雄性小鼠30mg/kg二甲磺酸丁酯。給藥後28、31和34天在每個睪丸中接種50μl的一種vGL2病毒上清液(1×104cfu/ml)。在病毒接種後28、35、42和49天從四隻小鼠中取出附睪以製備精子部分。使用FACS測量來自GFP基因產物的螢光並從螢光陽性部分收集細胞。同時，使用PCR分析檢測來自螢光陽性部分的細胞中的GFP基因。
(2)分析GFP基因在鼠附睪精子細胞中的表達在2％青黴素/鏈黴素溶液中，用剪刀將如實施例3-(1)中所述的鼠附睪剪成小塊。然後用30微米的篩除去細胞團以製備精子部分。按照如實施例2-(5)中所述的方法使用FACS分析GFP基因在精子部分中的表達。在那時對GFP陽性的細胞部分進行分類。
得到了對接種病毒後42天由小鼠中分離的精子部分的分析結果。同時，獲得了對由同樣周齡但在給予二甲磺酸丁酯後未接種病毒的小鼠得到的睪丸細胞製備物的結果作為對照分析。圖5顯示了這些結果。如圖中所示，證實了病毒接種後42天從小鼠取出的附睪中表達GFP的精子的存在(在圖中水平軸上標出的GFP相對螢光密度上，該區域範圍為從8到20)。
(3)檢測鼠附睪精子細胞中的GFP基因將從實施例3-(2)中用FACS分類的GFP陽性精子中得到的約1×105細胞懸浮於700μlDNA提取液(10mM Tris-HCl(pH8.0),100mMNaCl,10mMEDTA,39mM DTT和2％SDS)中。在懸浮液中加入35μl蛋白酶K(10mg/ml)。將混合物在37℃溫育過夜後，在混合物中加入2μl核糖核酸酶A(20mg/ml)，然後在37℃下繼續溫育兩小時。經酚-氯仿提取終止反應；進行乙醇沉澱以回收DNA，然後將DNA溶解於30μlTE緩衝液中以獲得染色體DNA溶液。
根據如實施例2-(5)中所述的方法檢測染色體DNA溶液中的GFP基因。結果，如表6所示，由給予病毒後42和49天獲得的精子製備的染色體DNA觀察到了代表GFP基因存在的234-bpDNA片段的擴增。
表6通過PCR檢測GFP基因
+擴增了一個234-bp片段。-沒有擴增234-bp片段。
序列表110Takara Shuzo Co.,Ltd.等120將基因轉移進生殖細胞的方法130661149150JP10-156291511998-1-281602210121122212DNA213人工序列4001catcatggcc gacaagcaaa ag22210221121212DNA213人工序列4002atcccagcag cggtcacaaa c2權利要求
1．將基因轉移進脊椎動物睪丸細胞的方法，包括降低睪丸細胞的數目並將攜帶外源基因的重組病毒接種進睪丸。
2．依照權利要求1的轉移基因的方法，其中通過選自以下的方法來降低所述睪丸細胞數目化學方法、物理方法和生物學方法。
3．依照權利要求2的轉移基因的方法，其中使用烷化劑。
4．依照權利要求1到3中任一項的轉移基因的方法，其中在所述睪丸細胞的恢復期內將所述重組病毒接種進所述睪丸。
5．依照權利要求1到4中任一項的轉移基因的方法，其中接種能夠將基因整合進染色體中的重組病毒。
6．依照權利要求5的轉移基因的方法，其中使用一種複製缺陷型病毒載體製造所述重組病毒。
7．依照權利要求5或6的轉移基因的方法，其中接種一種重組逆轉錄病毒。
8．外源基因轉移進睪丸細胞的脊椎動物，其中所述外源基因通過依照權利要求1到7中任一項的方法轉移到所述睪丸細胞中。
9．帶有轉移外源基因的睪丸細胞，得自依照權利要求8的脊椎動物。
10．依照權利要求9的睪丸細胞，選自精原細胞、精母細胞、精子細胞和精子。
11．帶有轉移外源基因的脊椎動物，通過使依照權利要求8的脊椎動物交配而獲得。
12．帶有轉移外源基因的脊椎動物，由使用依照權利要求9或10的睪丸細胞人工產生的受精卵獲得。
全文摘要
其中整合了所需外源基因的生殖細胞;獲得帶有這些細胞的脊椎動物的便利方法;以及使用這些細胞和所述脊椎動物構建新脊椎動物系的方法。亦即將外源基因轉移進脊椎動物的睪丸的方法,該方法包括減少睪丸細胞的步驟和將攜帶所述外源基因的重組病毒接種入所述睪丸的步驟;通過上面的方法在其中轉移了所述外源基因的脊椎動物;由所述脊椎動物獲得並且其中轉移了所述外源基因的睪丸細胞;通過使上述脊椎動物交配而獲得並且攜帶有所述轉移外源基因的脊椎動物;以及通過使用所述睪丸細胞進行人工受精獲得並且攜帶所述轉移外源基因的脊椎動物。
文檔編號A01K67/027GK1289370SQ99802368
公開日2001年3月28日 申請日期1999年1月20日 優先權日1998年1月28日
發明者上野充博, 小西治子, 森下三保, 結城惇, 淺田起代蔵, 加藤鬱之進 申請人:寶酒造株式會社