來自角蠅的抗凝血酶核苷酸和蛋白質的製作方法

2023-12-09 01:21:31 3

專利名稱：來自角蠅的抗凝血酶核苷酸和蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及預防家畜感染吸血昆蟲的獸用疫苗和血栓症的醫學治療。
背景技術：
據估計在美國每年由於外部寄生蟲感染而引起的家畜產量的損失超過22.6億美元(Byford等，(1992)美國科學雜誌J.Anim.Sci,70:579-602)。在有關的5-6種主要節肢動物害蟲種類中，西方角蠅Haematobia irritans linnaeus是最重要和分布最廣的。在美國每年由它造成的家畜產量的經濟影響估計達730.3百萬美元。在加拿大，由於控制這種影響家畜產量的外部寄生蟲，以1977年的美元價值計算，每年可以減少71-107百萬美元的損失(Haufe和Weintraub(1985)加拿大昆蟲學(Can.Entomol.)117:901-907)。而在南美洲，由這種吸血蠅造成的家畜產量的經濟影響年均近10億美元。
角蠅感染引起的生理學表現包括心率，呼吸頻率和直腸溫度的升高。另外，水消耗和尿生成以及尿氮分泌顯著增加。血皮質醇濃度也明顯增加。體重增加減緩，活動增多，和食草量減少也有報導(Schwinghammer等(1986)經濟昆蟲學雜誌(J.Econ.Entomol.)79:1010-1014)。
西方角蠅(H.irritans)雌雄成蟲階段是一天24小時內間斷地吸血的專性外部寄生蟲。不象其它短暫吸血的雙翅目昆蟲(黑蠅，蚊子，馬蠅，廄螫蠅)，西方角蠅的有翼成蟲仍逗留在牛宿主上，當需要營養時，將其口器反覆地插入皮膚吸食。Harris等(1974)Ann.Entomol.Soc.Am.67:891-894，注意到在實驗條件下，雌性西方角蠅平均每天用163分鐘吸食，雄性平均每天用96分鐘吸食。由於每天吸食次數的不同，每隻雌性西方角蠅平均每天攝取17.1mg血，而雄性西方角蠅平均每天吸取12.1mg血(Harris和Frazer(1970)Ann.Entomol.Soc.Am.63:1475-1476)。
描述西方角蠅唾液腺的生理學，尤其是涉及吸血的科學文獻很少。Hori等，(1981)Appl.Ent.Zool.16:16-23比較了西方角蠅和廄螫蠅(Stomoxys calcitrans(Linnaeus))消化道和唾液腺中幾種消化酶的類別。在西方角蠅的唾液中測到微弱的氨肽酶活性，提示存在於消化道中的蛋白酶和糖苷酶專門負責消化血液。
西方角蠅H.irritans linnaeus與H.i.exigua de Meijere是一亞類，後者是在澳大利亞和南半球的某些地方出現的水牛蠅。Kerlin和Hughes(1992)醫學和獸醫昆蟲學(Med.Vet.Entomol.)6:121-126，比較了H.irritans exigua、微小牛蜱(Boophilusmicroplus(Canestrini))、埃及伊蚊(Aedes aegypti(Linnaeus))和銅綠蠅(Lucilia cuprina(Wiedemann))四種寄生的節肢動物唾液中的酶，觀察到這四種昆蟲間唾液中的酶是不同的，這明顯反映了它們不同的攝食策略。這些不同主要在於糖苷酶和蛋白酶活性的種類和水平。用5-羥色胺刺激並收集H.irritans exigua的唾液，然後用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，銀染產生7-8條帶。在這個種類的唾液和唾液腺提取物(SGE)中可模糊地檢測到腺苷三磷酸雙磷酸酶活性，提示這個亞種不能以與其它許多吸血節肢動物相同的方式阻止牛血小板的凝集(Ribeiro(1987)昆蟲學綜述年鑑(Ann.Rev.Entomol.)32:463-478)。
更進一步，對暴露於H.irritans exigua的牛的免疫反應的研究顯示產生了針對一些但不是所有的水牛蠅(buffalo fly)抗原的高水平的循環抗體；儘管如此，吸食曾暴露於H.irritans exigua的家畜的蠅之死亡率並不比以不曾暴露於H.irritans exigua的家畜為食的蠅高(Kerlin和Allingham(1992)獸醫寄生蟲學(Vet.Parasitol.)43:115-129)。
在過去的十年間，有關闡明吸血節肢動物採用的生物化學策略已取得了進展。儘管至少在80年前已經知道在節肢動物吸血昆蟲的唾液中存在抗凝血劑，直到最近才純化了一些活性成份並確定了其分子結構。現已明確凝血因子如因子Xa和凝血酶(因子Ⅱ)，即出現在凝血級聯反應中的連接物，經常是作用的靶子。
有關幾種黑蠅唾液的研究提示特定酶的靶分子可能與宿主的選擇相關(Abebe等，(1994))。例如，嗜家畜的動物昆蟲類的資料顯示，凝血酶是一種重要的靶分子，它的失活可阻止不可逆的血小板聚集，以及阻礙凝血級聯反應。見Hudson(1964)加拿大動物學雜誌(Can.J.Zool.)42:113-120(有關廄螫蠅)，和Parker和Mant(1979)Thrombos.Haemostas(Stuttg.),42:743-751(有關刺舌蠅(G.morsitans(Westwood))唾液腺)。
由於上述的外部寄生蟲對家畜感染的不利影響，在治療和經濟上都需要阻止這種感染。
同樣也需要治療血栓栓塞性疾病。血栓栓塞性疾病是循環系統最重要的疾病之一。血栓是一種部分或完全堵塞血液流過血管的血凝塊。栓子是指在身體其它的部位形成的血栓，破裂成游離態，並轉移到阻塞發生的部位。腦內阻塞會導致中風，也就是腦梗塞，死細胞的局部區域。肺部的栓子可引起肺栓塞，臥床病人中最主要的肺部疾病之一。臥床病人和老年人尤其容易患血栓性靜脈炎，這是由栓子阻斷腿部血液循環而引起的。栓子或血栓塞進入一種給心臟供血的血管中會引起部分心臟組織的壞死，即心肌梗塞，通常稱心絞痛(heart attack)。
許多心肌梗塞最初的起因是動脈粥樣硬化斑內的出血。這種出血常常會導致為梗死區供血的冠狀動脈內發生血栓(或血凝塊)形成。這種血栓由纖維蛋白和血小板組成。血纖維蛋白-血小板凝塊的形成具有嚴重的臨床上的支狀分布。由纖維蛋白-血小板凝塊引起的閉塞程度和持續時間決定梗死區的大小和損傷的程度。
在循環系統其它部位的纖維蛋白-血小板凝塊形成可以通過使用抗凝劑如用肝素，而部分地預防。不幸的是，已證實用肝素預防血管閉塞程度超過或等於70％的心肌梗塞病人，尤其對具有嚴重殘餘冠狀動脈狹窄的病人的再閉塞不是普遍有效。更有希望的試劑之一是水蛭素及其類似物，它們與凝血酶結合併使其失活。作為抗血凝劑水蛭素較肝素有理論上的優勢。凝血酶與血栓或血小板結合可相對地使其免受肝素的抑制，然而水蛭素，至少在體外，仍然是有效的。其它有希望研究的試劑包括纖維蛋白原受體拮抗劑，它們能夠以與阿司匹林截然不同的機理阻止血小板的凝集和緻密顆粒的釋放，還包括凝血噁烷產生的抑制劑。
因此需要其它的具有低毒，低或無抗原性以及很短時間內可以從循環中清除掉的抗凝血酶試劑。
發明概述本發明提供了分離的具有抗凝血酶活性的蛋白質以及編碼該蛋白質的核苷酸序列。名為凝血抑制素(thrombostasin)的蛋白質是從西方角蠅這種吸血角蠅的唾液腺中分離而來。提供的蛋白質和核苷酸尤其可用作預防感染的角蠅對家畜吸血的獸用疫苗。
本發明的蛋白質在治療血栓症方面也有用。
提供了施用本發明蛋白質和核苷酸序列的方法。
附圖簡述

圖1表示通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳上的相對遷移率，比較群體型角蠅的蛋白質與野外收集的角蠅蛋白質的分子量。
圖2表示以再鈣化時間試驗檢測西方角蠅唾液中的抗凝活性。
圖3表示西方角蠅唾液對無因子Ⅱ血漿的凝集影響。
圖4表示西方角蠅唾液對凝血酶水解S238的抑制作用。
圖5表示以HPLC純化的有活性的唾液凝血抑制素。
圖6表示用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析以HPLC純化的唾液抗凝集蛋白質凝血抑制素。
發明詳述本發明提供了預防家畜吸血昆蟲(吸血)以及治療哺乳動物血栓症的方法和組合物。該組合物包含來自吸血昆蟲角蠅，即西方角蠅唾液腺的蛋白質，如同Yeates等所描述的，(1999)昆蟲學綜述年鑑(Annu.Rev.Entemol.)44:397-428。西方角蠅屬於雙翅目的環裂亞目(Cyclorrhapha)。另外提供了編碼該抗凝血酶蛋白質的核苷酸序列。該蛋白質命名為凝血抑制素，其主要的功能是通過抑制凝血酶(因子Ⅱ)的活性來阻止血液凝集。
所謂「吸血性」是指另外一種生物體以宿主生物體的血液為食物。所謂「吸血性感染」是指一種包含寄生蟲以宿主血液為食物的宿主與寄生蟲之間的關係。所謂「血栓形成」是指血栓的形成，發展或存在。所謂「抗凝血酶活性」是指具有降低或消除凝血酶促凝血作用和/或抑制血栓形成的生物學活性。
眾所周知，利用本領域使用的方法可以得到本發明抗凝血酶蛋白質的全部編碼序列。這些方法已公開，例如在Sambrook等(1989)分子克隆實驗指南(冷泉港實驗室出版社，Planinview,New York)。
提供了基本上純化的凝血抑制素製劑。這種基本上純化的製劑包括基本上不含任何通常與其天然狀態蛋白質相關聯的化合物的蛋白質。該蛋白質的純度可以通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，色譜，電泳或其它方法鑑定，見M.P.Deutscher(ed)，蛋白質純化指南(Guide to ProteinPurification)，科學出版社公司(1990)。
術語「基本純」或「基本純化了的」並不意味著排除該蛋白質與其它成份的人為或合成混合物。普遍認為，本發明的抗凝血酶蛋白質包括那些與此處描述的抗凝血酶蛋白質同源的，並具有基本相同的生物學特性的蛋白質，尤其是此處在SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7中公開的蛋白質。這種定義目的是為了包括該基因的天然等位基因變體。普遍認為本發明這裡所描述的「基本純化了的」蛋白質可以是其它種類來源的，包括但不局限於環裂亞目的其它種類。
本發明還提供了公開於SEQ ID NO:1、2、4、5、6和7的抗凝血酶蛋白質的片段和/或核苷酸序列。該蛋白質片段的大小至少是10、20、30或更多胺基酸。該片段可以保留了生物學活性或包含蛋白質的活性區。
多核苷酸片段大小也可以是至少15、20、30或更多個連續的核苷酸。這些序列可用作雜交或分子標記。
這種片段可容易地通過化學方法製備，包括商業可利用的自動化方法或通過本領域技術人員熟知的重組DNA方法，和如下所述的方法。普遍認為，利用上述片段可以實施抗止血的生物學功能，包括與抗凝血酶抗凝集活性相關的和/或免疫應答調節相關的功能。
本發明還包括了編碼本發明蛋白質的核苷酸序列。自西方角蠅以PCR克隆的編碼序列的核苷酸序列提供於SEQ ID NO:1中；顯然，普遍認為本發明克隆的基因也可以來源於其它種類，包括但不局限於環裂亞目的其它種類。
能夠與來源於角蠅的抗凝血酶基因雜交的核苷酸序列也是本發明的一個方面。允許其它DNA與此處公開的DNA雜交的條件，可以由一些已知的技術來確定。例如，可以在標準雜交試驗中，在低嚴緊，中等嚴緊或高度嚴緊的條件(例如嚴緊程度不同的洗滌條件依次為在37℃以含5X Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE的35-40％甲醯胺洗滌；在42℃用含5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE的40-45％甲醯胺洗滌；在42℃以含5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE的50％甲醯胺洗滌)進行該序列與此處公開的基因編碼DNA的雜交。見J.Sambrook等，(1989)分子克隆實驗指南(第二版)(冷泉港實驗室))。
通常，編碼抗凝血酶蛋白質並可與此處公開的核苷酸序列雜交的序列至少與該公開序列有40％的同源性，約60％到70％同源性，甚至約80％、85％、90％的同源性或更高的同源性。這樣的序列與此處公開的核苷酸序列基本上同源，並為本發明所包含。更進一步，以與此處公開的DNA雜交分離得到的抗凝血酶蛋白質的胺基酸序列也是本發明的一個方面。遺傳密碼的簡併性，即允許不同的核酸序列編碼相同蛋白質或多肽在文獻中是公知的。見U.S．專利4,757,006。
雜交的探針可以是cDNA片段或寡核苷酸，可以用本領域熟知的可檢測基團標記。可以根據US專利4,683,202和4,683,195中描述的方法使用可用作抗凝血酶基因或其蛋白質的PCR引物的探針對。
本發明的多肽也可經過一種或多種翻譯後修飾，如多肽鏈的硫酸化，羧基端醯胺化，醯化或化學修飾。
普遍認為，對本發明的核苷酸和多肽序列可以給予多種方式的改造，包括胺基酸的替代，缺失，截短和插入。這些操作的方法為本領域普遍熟知。例如，多肽和蛋白質的胺基酸序列變體可以通過DNA的突變而製備。誘變和核酸序列改變的方法為本領域所熟知。見，例如Kunkel,T.(1985)，美國科學院研究進展(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)82:488-492；Kunkel等，(1987)酶學方法(Methods in Enzymol.)154:367-382；U.S．專利4,873,192；Walker和Gaastra(eds)分子生物學技術(Techniques in Molecular Biology),MacMillan出版公司，紐約(1983)，以及其中引用的參考文獻。因此，本發明的核苷酸序列包括天然序列和突變序列。同樣，本發明的肽和蛋白質包括天然的蛋白質和其修飾形式。這種變體同樣具有目的活性。人們認為，在編碼變體的DNA上的突變必須不能置於閱讀框之外，並且最好不產生不利於基因產物表達的序列，見EP專利申請書公開號75,444。
本發明的蛋白質包括天然形式和其變體。這些變體與天然蛋白基本上同源並與天然蛋白質有相同功能。如此處所用的，當它們的胺基酸序列一般至少有約40％，更典型地至少約60％-70％，最典型地至少約80％，85％,90％或更多的相同，則兩種蛋白質(或蛋白質的區域)是基本上同源的。根據本發明，基本上同源的胺基酸序列將由能夠與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示的核酸序列或其中的部分雜交的核酸序列編碼，或由在如下文更全面描述的就嚴緊條件所描述的核酸序列編碼。
因此，當一種天然蛋白質的變體其胺基酸序列與天然蛋白質的胺基酸序列至少有約40％，更優選地至少約60％-70％，最優選地至少約80％,85％,90％或更多相同，則該變體與天然蛋白質基本同源。變體可以有少至1,2,3或4個胺基酸的不同。變體多膚胺基酸序列的不同可以是有一個或更多個替換，缺失，插入，倒位，融合和截短或它們間的任意不同的組合。
「功能上相同」是指變體序列確定的鏈產生的蛋白質具有與目的天然蛋白質基本上相同的生物學活性。本發明也包括含有基本序列變異的功能相同的變體。因此，與天然蛋白質功能相同的變體具有充分的生物學活性而在治療上有用。所謂治療上有用是指能夠有效達到如下所討論的治療目的。
本領域有可用的測定功能等價的方法。可利用專門設計用於測定該天然蛋白質活性的試驗來檢測生物學活性，包括本發明描述的試驗。此外，針對有生物活性的天然蛋白質產生的抗體，能夠檢測其與功能上相同的變體的結合能力。有效的結合則提示該蛋白質具有與天然蛋白質相似的構象。
變體多肽可以具備完整的功能或缺乏一種或多種活性。因此，在此情形下，變異可影響功能，例如，影響本發明的蛋白質或多肽的一種或多種模塊，結構域，或功能亞區的功能。
具備完整功能的變體通常僅包含保守的變異或者非關鍵殘基或非關鍵區域內的變異。有功能的變體也可包含相似胺基酸的替代，這種替代不導致功能的改變或僅導致功能上不重要的改變。或者，在一定程度上這種替代可以正性或負性地影響功能。
無功能突變體通常包含一種或多種非保守胺基酸的替代，缺失，插入，倒位或截短，或者關鍵殘基或關鍵區域內的替代，插入，倒位或缺失。如所描述的，變體可以是自然發生的，或通過重組的方法或通過化學合成的方法賦予多肽有用和新的特性。
對功能必不可少的胺基酸可以通過本領域公知的方法來確定，如定點誘變或丙氨酸-掃描誘變(Cunningham等，科學(Science)244:1081-1085(1989))。後一種方法能夠向分子的每一個殘基中引入單個丙氨酸的突變，測定突變後分子的生物學活性。也可以通過結構分析來確定關鍵位點，如結晶、核磁共振或光親合標記(Smith等，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)224:899-904(1992)；de Vos等，科學255:306-312(1992))。
本發明進一步包含變異多核苷酸和其片段，其核苷酸序列與SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6所表示的，或其他此處描述的核苷酸序列，由於遺傳密碼的簡併性而有所不同，因此編碼與SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6所表示的或其他此處描述的核苷酸序列所編碼的蛋白質相同的蛋白質。
本發明也提供了編碼此處描述的變異多肽的核酸分子。這種多核苷酸可以是自然發生的，如等位基因變體(相同位點)，同系物(不同位點)和直向同源物(ortholog)(不同生物體)，或可以通過DNA重組方法或化學合成的方法構建。這種非天然產生的變體可以通過誘變技術，包括適用於多核苷酸，細胞或生物體的技術。綜上所述，變體可以包括核苷酸替代、缺失、倒位和插入。
變異可出現在編碼區和/或非編碼區。變異可產生保守和非保守的胺基酸替代。
可用本領域公知的方法證實直向同源物、同系物和等位基因變體。這些變體包含編碼一種蛋白質的核苷酸序列，與SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6所示的或其他此處描述的序列或這種序列的片段通常有至少約40％，更進一步至少約60-70％，最典型地至少為約80％,85％,90％或更高的同源性。由於這種核酸分子能夠在嚴緊的條件下與SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或其他此處描述的核苷酸序列或其片段雜交而容易地證實。應該理解嚴緊雜交不是指由於廣泛同源性的原因，如多聚腺苷酸序列，或因一種生物體或蛋白質組中所有或大多數蛋白質共有的序列的存在而導致的基本同源性。
為確定兩種胺基酸序列或核苷酸序列的同源百分數，為實現最佳序列比較的目的，將序列對齊(例如，可將缺口引入一種蛋白質或核酸序列之中以獲得與另外一種蛋白質或核酸最佳的對齊)。然後將相應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸進行比較。當一個序列中某個位置與另外一個序列對應位置被相同的胺基酸殘基或核苷酸所佔據時，則在此位點兩分子是同源的。如此處所用的，胺基酸或核酸「同源性」等同於胺基酸或核酸「同一性」。兩序列間的同源百分數是序列間共有的相同位置數目的函數(也就是說同源百分數等於相同位置數目/總位置數×100)。
本發明也包括具有較低程度相同性的蛋白質或多肽，但其具有的相似性足以使之展現出與此處描述的抗凝血酶蛋白質的一種或多種功能相同的功能。相似性可通過保守胺基酸的替代決定。這種替代是指多肽中特定胺基酸被另外一個特性相似的胺基酸所替代。保守替代有可能是表型沉默型。有關哪種胺基酸變化可能是表型沉默型可參考Bowie等，科學247:1306-1310(1990)。
同一性和相似性能夠容易地計算出(計算分子生物學(Computational Molecular Biology),Lesk,A.M編，牛津大學出版社，紐約，1988；生物計算信息學和基因組計劃(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W編，科學出版社，紐約，1993；序列數據的計算機分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin,A.M和Griffin,H.G編，Humana出版社，新澤西，1994；分子生物學中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology),von Heinje,G.，科學出版社，1987；和Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M和Devereux,J．編，M Stockton出版社，紐約，1991)。確定兩種序列間的同一性和相似性優選的電腦程式包括，但不僅僅局限於GCG程序包(Devereux,J.(1984)核酸研究(Nuc.Acids Res.)12(1):387),BLASTP,BLASTN，和FASTA(Atschul,S.F.(1990)分子生物學雜誌，215:403)；其中利用程序內可用的默認參數。所謂序列基本上相似、同一或同源，是指序列間具有至少約60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的相似性。
DNA序列可以用化學合成或以定點誘變加以修飾以體現宿主細胞的密碼子偏性並增加表達效率。
依據本發明，本發明的蛋白質可以通過化學方法或分子生物學技術工程化。由於蛋白質可以通過處理編碼它們的DNA序列而被工程化，因此分子生物學方法是最方便的，基因組DNA,eDNA，合成的DNA，和它們的任意組合可以用於該目的。基於蛋白質的胺基酸序列或蛋白質的某些特徵，基因組DNA序列或編碼蛋白質的cDNA序列可以分離出來。許多分離序列的方法為分子生物學領域所熟知。尤其見Sambrook等(1989)分子克隆實驗指南(冷泉港實驗室出版社，Planinview，紐約)，在此引入作為參考。
為了以重組DNA技術生產一種抗凝血酶多肽，可製備編碼本發明多肽的基因。DNA編碼區通常不包含內含子。分離並純化DNA序列，將基因插入一種能夠啟動表達並產生重組產物的表達載體。DNA序列可以是cDNA序列，或也可以是合成的DNA序列。合成的基因通常由化學合成全部與目的基因相同的寡核苷酸製備而成。然後裝配合成的寡核苷酸獲得基因。
如果需要，可以通過定點誘變以引入一個或多個編碼的改變，從而修飾基因。通常，在基因的每一端加上限制性酶切位點，以利於其後的操作。
也可以構建DNA序列使之包含一段前導肽，前導肽能夠引導多肽自表達該多肽的細胞中分泌出來。編碼前導肽的序列通常被融合在編碼多肽的DNA序列的5′端。本領域公知前導肽，包括OmpA導肽；皰疹性口腔炎病毒G蛋白(VSV G蛋白)前導肽。當在細菌宿主中如大腸桿菌表達時，OmpA前導肽是有用的，而VSVG蛋白前導肽則在昆蟲細胞中表達時有用。
也可以構建DNA序列使之包含一種可切割位點以釋放本發明多肽。可使用編碼一種藉助可切割連鍵融合於本發明多肽N端的載體多肽序列的DNA序列。可切割連鍵可以是一種能夠被溴化氰切割的連鍵。
為表達多肽，構建包含能夠在合適的宿主細胞之中表達該多肽的編碼DNA的表達載體。還提供合適的轉錄和翻譯調控元件，包括DNA序列的啟動子，轉錄終止位點，和翻譯起始與終止密碼子。使該DNA序列處於正確的框架之中，使之能夠在與載體相容的宿主細胞中表達該多肽。
表達載體通常包含複製起點，如果需要，還可以含有選擇標記基因如抗生素抗性基因。表達載體可以是質粒，病毒，尤其是杆狀病毒等。
一旦編碼本發明抗凝血酶蛋白質的核苷酸被分離出來，它們即可以被處理並用來在多種宿主包括其他生物體(如微生物)之中表達蛋白質。
一旦核酸序列被證實並已知，本領域技術人員可以生產大量用於治療的蛋白質。因此，本發明包括重組蛋白質和生產重組蛋白質的方法。如此，可以利用載體在多種類型的宿主細胞中，包括原核和真核細胞中，表達編碼抗凝血酶蛋白質的核苷酸序列，從而生產大量的蛋白質，或有活性的類似物，或其片段，以及其他具有抗凝血酶活性的構建體。
通常，本領域熟知表達重組DNA的方法，見，例如，Sambrook等(1989)分子克隆，冷泉港實驗室。另外，宿主細胞和表達載體，如杆狀病毒的表達在美國專利4,745,051和4,879,236中有描述。一般而言，杆狀病毒表達載體包含杆狀病毒基因組，其中含有插入在多角體基因中轉錄起始信號到ATG間的位置並在杆狀病毒多角體基因啟動子轉錄控制下的待表達基因。
有許多合適的原核和微生物載體可用。同樣，用於外源性蛋白質表達的啟動子和其他調控元件在本領域可用。通常用於重組微生物表達載體的啟動子為本領域所公知，包括β-lictamase(青黴素酶)和乳糖啟動子系統(Chang等(1987)自然(Nature)275:615和Goeddel等(1979)自然281:544；色氨酸啟動子系統(TRP)Goeddel等(1980)核酸研究(Nucleic Acids Res.)8:4057和EPO申請公開36,776)；和Tac啟動子(DeBoer等(1983)美國科學院研究進展，80:21)。儘管這些是常用的，其他微生物啟動子也是可以用的。有關它們的核苷酸序列細節已經發表，能夠使專業技術人員容易地把它們可操作地連接到質粒或病毒載體內編碼蛋白質的DNA上。見，例如，Siedenlist等(1980)細胞(Cell)20:269。
可以以適當的編碼蛋白質的載體轉化真核宿主細胞如酵母。參閱，例如，美國專利NO.4,745,057。釀酒酵母是較低等真核宿主微生物中最常用的，儘管許多其他菌株也是常用的。酵母載體也可包含來源於2μ酵母質粒的複製起點或自主複製序列(APS)，啟動子，編碼目的蛋白質的DNA，多聚腺苷酸化和轉錄終止序列，和篩選基因。一種示例性的質粒是YRp7,(Stinchcomb等(1979)自然，282:9；Kingsman等(1979)，基因，7:141；Tschemper等(1980)基因，10:157)。這種質粒含trp1基因，它可作為在色氨酸之中缺乏生長能力的突變株的篩選標記，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,(1997)遺傳(Genetics)85:12)。酵母宿主細胞基因組中trp1損害的存在，為通過生長在缺乏色氨酸的培養基中進行轉化子鑑定提供了一種有效的環境。
適用於酵母載體的啟動子序列包括金屬硫蛋白，乙醇脫氫酶，腺苷酸環化酶，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等(1980)生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)255:2073)，和其它的糖酵解酶(Hess等，(1968)酶調控進展雜誌(J.Adv.Enzyme Reg.)7:149；和Holland等，生物化學(Biochemistry)17:4900)，如烯醇化酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄糖異構酶，3-磷酸甘油酸變構酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶基因的啟動子。用於酵母中表達的合適的載體和啟動子更進一步的描述在R.Hitzeman等，EPO公開73,657。
本發明提供了可選擇性地結合本發明蛋白質或已描述的任何變體或其片段的抗體製劑。抗體被認為可選擇性地結合，即使它也可以和與抗凝血酶蛋白質基本上無同源性的其它蛋白質結合。這些其它蛋白質與抗凝血酶蛋白質的引起產生抗體的片段或區域有同源性，因同源序列的存在，該抗體可與兩種蛋白質結合。基於此，可以認為抗體與抗凝血酶蛋白質的結合仍然是選擇性的。
該製劑包含單克隆或多克隆抗體，完整的抗體或其片段(例如，Fab)，純化的製劑如親合純化的製劑，或不純的製劑如腹水液，血清等。產生抗體的方法為本領域所公知，並包含但不局限於Harlow和Lane(1988)在《抗體，實驗室指南》(冷泉港實驗室出版社)中描述的方法，其中的內容此處引入作為參考。本發明也描述了能夠中和本發明蛋白質，變體和其片段的生物功能的抗體製劑。這種功能包括但不局限於抗凝血酶活性。本發明也提供了能夠調控免疫反應的組合物。所謂調節免疫反應是指將此處描述的本發明組合物施於宿主，可引起該宿主生物體免疫系統中可確定的變化。實施這種免疫反應調節的實施例和實施方法以及抗體製劑選擇性的評價提供於本申請的實驗部分，此處引入做為參考。
本發明的組合物可以用做治療哺乳動物吸血病(hematophagy)的獸用疫苗。該方法包括給哺乳動物施用一種包含治療有效量本發明組合物的獸用疫苗。在此方面，治療有效量是指能夠在施用過本發明疫苗的哺乳動物中取得一種可確定的減少、改善、消除或預防吸血性感染的量。儘管本發明的疫苗可用於任何哺乳動物，但其中感興趣的是家畜，更具體的是馬、牛等。該組合物在抗環裂亞目吸血性蠅，更具體的是西方角蠅，尤其是irritans或exigua亞種的接種方面是有用的。然而，以本發明的這種組合物和方法接種本發明抗任何吸血生物的疫苗都是有治療效果的。
為了獸醫方面的應用，本發明的組合物可以製成如下述的任何可接受的藥劑學製劑或任何其它可接受的獸用製劑。在本發明的一實施例之中，該疫苗包含治療有效量的本發明蛋白質或如此處描述的任何變體或其片段。
在其中一個優選的實施方案之中，該疫苗包含如此處描述的本發明的核苷酸組合物。如Cox等，(1993)病毒學雜誌(J.Virol.)67:5664-5667；Fynan等，(1993)美國科學院研究進展，90:11478-11482；和Lewis等，(1997)疫苗(Vaccine)15:861-864；和綜述Robison(1997)疫苗15:785-787；和Tighe等(1998)今日免疫學(Immunol.Today)19:89-97(所有的內容此處引入作為參考)所述，核酸疫苗可很容易地構建和生產。通常，將編碼待用做免疫原的蛋白質的目的DNA序列克隆入真核表達載體。使構建的質粒在細菌之中生長並純化。通常通過肌肉內注射直接將純化的質粒DNA注入動物體內，但也可通過皮下注射；在此處接種宿主的細胞表達質粒產生目的蛋白，從而引發免疫反應。見，例如，如Cox等，(1993)病毒學雜誌，67:5664-5667，此處引入作為參考。通過皮膚，肌肉和靜脈接種DNA，納克水平的DNA表達蛋白質即可能引起免疫反應，取得抗感染試劑的效果，見，例如，Fynan等，(1993)美國科學院研究進展，90:11478-11482；Cox等，(1993)病毒學雜誌，67:5664-5667，此處引入作為參考。這種經肌肉內或皮內注射引入質粒可誘導保護性反應，從而免除攻擊後的臨床疾病。
本發明的組合物可以製成作為抗凝血酶試劑的有治療用途的藥物製劑。這種組合物可以用於治療靜脈血栓，血管分流栓塞和含凝血酶的彌散性血管內凝集。
本發明的製劑可以單獨使用或與其它抗凝血酶和治療性試劑包括獸醫試劑如疫苗聯合使用。其他的試劑為本領域所公知。
可以按照已知的方法將抗凝血酶組合物製成藥劑學上有用的組合物，例如與藥劑學可接受的載體相混合。適宜的載體和其組成也有描述，例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第19版，Osol.A(編)，Mack Easton PA(1980)．為形成藥劑學上可接受的適於有效給藥的組合物，這種組合物將包含有效量的單獨的或與適量的載體相混合的抗凝血酶蛋白質。
其它藥劑學方法也可以用來控制作用的持續時間。能夠通過多聚體複合或吸收該組合物實現製劑的受控釋放。可以通過選擇適宜的大分子(例如，聚酯，多聚胺基酸，聚乙烯吡咯酮，乙烯乙酸乙烯酯，甲基纖維素，羧甲基纖維素，或硫酸魚精蛋白)實現受控送遞。還可以通過改變大分子的濃度控制藥物釋放的速度。
另外一種可能控制作用持續時間的方法，包括向多聚體微粒中摻入治療性試劑，如聚酯、多聚胺基酸，水凝膠，多聚乳酸，或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。另外，也可以將治療性試劑包裹入微囊之中，例如，通過共凝集技術或界面多聚化來製備，例如分別使用羥甲基纖維素或明膠微囊或多聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，或包裹在一種膠體藥物釋放系統，例如脂質體，白蛋白，微球體，微乳劑，納微粒，納微囊，或在粗乳劑中。此類內容公開於Remington的藥劑學中。
在更具體的實施方案之中，本發明的多肽也可以轉變成藥劑學上可接受的鹽，它也可以轉化成與有機酸或無機酸的酸加成鹽。合適的酸包括乙酸，琥珀酸，鹽酸。可選擇地，該肽也可以轉化成羧酸鹽，如銨鹽或鹼金屬鹽如鈉鹽或鉀鹽。
多肽或其藥劑學上可接受的鹽可以與藥劑學上可接受的載體或它的賦形劑一起用於藥物組合物中。這種製劑通常是經靜脈給藥(在這種條件下，載體通常是無菌鹽水或可接受純度的水)。因此多肽可用來治療和預防人或其他哺乳動物的血栓症和血栓栓塞，包括預防手術後血栓形成，用於急性休克的治療(如敗血症性或多發性創傷性休克)，治療消耗性凝血病，以及血液透析，血液分離和體外循環。在本發明的一個實施方案中，多肽或其鹽可以與纖溶酶原激活劑，如組織纖溶酶原激活劑一同施用。
劑量尤其取決於特定的給藥形式和治療或預防的目的。可通過判斷疾病的特定狀況來很好的確定個體的用量大小和給藥方案；本領域技術人員熟知確定為此目的必要的相關血液參數的方法。通常，注射時，本發明化合物治療有效量的範圍大約為0.005或0.01至0.05或0.1mg/kg體重，更優選大約為0.01-約0.05mg/kg體重。
可經靜脈內、肌肉內或皮下注射給藥。因此，依賴於給藥的方式，以單劑形式用於腸胃外給藥的藥物組合物一個劑量包含從約0.4到大約7.5mg的本發明化合物。除了有活性的組分外，藥物組合物中通常也包括緩衝液，例如磷酸緩衝液，其目的是維持pH值在大約3.5至7之間，而且也可以包括氯化鈉、甘露醇或山梨醇，以調節等滲性。該製劑可以是凍幹的或溶解的。也可包含抗細菌活性的防腐劑，例如，0.2-0.3％4-羥基苯甲酸甲酯或乙酯。
局部使用的組合物可以是水溶液形式，洗液，或凝膠，油性溶液或懸浮液，或者含脂或尤其是乳化的軟膏。水溶液形式的組合物可以通過例如將根據本發明的活性成份或其在治療上可接受的鹽溶解於例如pH4-6.5的水性緩衝液中製備，如果必要，還可以加入另外一種活性成份，例如，抗感染試劑，和/或聚合粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮，和/或防腐劑。在10ml溶液或10g凝膠之中，活性成份的濃度在約0.1-1.5mg，優選0.25-1.0mg。
局部給藥用的油性製劑可通過例如在油內懸浮根據本發明的活性成份或其在治療上可接受的鹽而製備，並可任選添加膨脹劑，如硬脂酸鋁，和/或HLB值(親水-親脂平衡常數)低於10的表面活性劑，如多元醇的脂肪酸單聚物，例如甘油單硬脂酸酯、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯或失水山梨糖醇單油酸酯。含脂的軟膏可通過例如在一種可擴展的脂性基質內懸浮根據本發明的活性成份或其鹽而製備，並可任選加入HLB值低於10的表面活性劑。通過在一種柔軟的可擴展的脂性基質中研製根據本發明的活性成份或其鹽的水溶液，並加入一種HLB值低於10的表面活性劑，可以得到乳化的軟膏。這些局部使用的製劑也可以含防腐劑。約10g的基質中活性成份的濃度在約0.1-1.5mg，更優選約0.25-1.0mg。
除上面描述的組合物及在醫藥上直接用於人或哺乳動物身體的其類似藥物組合物外，本發明也涉及活的人體或哺乳動物體外使用的藥物組合物和製劑。這種組合物和製劑特別是作為在體外循環或處理(如血液分離)的血液中的抗凝添加劑。這種製劑，諸如貯存液或單劑量形式的製劑，在組成上與上述注射劑是相似的；但活性成份的濃度可方便地由待處理血液量決定，或更精確地由其凝血酶的含量決定。取決於特定的用途，其適宜的劑量是在大約0.01-1.0mg活性成份/升血，上限可以超過而不至於有危險，因為即使在相對高的量，該製劑也是無毒害的。
實驗西方角蠅的收集和飼養蛹兩周一次自U.S.D.A家畜昆蟲研究室(Kerrville，德克薩斯)運來，貯存在4℃待用。將它們移至不鏽鋼籠內(18″×18″×18″)在室溫下(21-22℃),16:8小時(L:D)以促進成蟲的孵化。每個籠子之上放置一個脫酯棉墊，作為每日1次向成蟲提供新鮮血液的燈芯。
用在一些試驗中的野外捕獲的成蟲收集自Arizoma大學奶牛群和Auburn大學菜牛和奶牛群。在收集後的1小時內將它們轉移至實驗室，並按上述方法飼養直到實驗。唾液腺的回收雌雄西方角蠅都是專性食血昆蟲，它們的唾液腺在形態上和在身體上的位置與廄螫蠅(Stomoxys calcitrans)和舌蠅(Glossina spp)是相似的。以下面的方案來解剖唾液腺(a)以溼潤的CO2「擊落」角蠅，簡單的通過70％的乙醇(ETOH)溶液，並以去離子水衝洗；(b)將其放在一清潔玻璃片上的一滴預冷的0.15M鹽水中，切除腿、翅膀和頭，用剃刀片或解剖刀沿矢狀線切開胸；(c)將角蠅轉入到裝滿石蠟的觀察玻璃杯或小盤中的一滴預冷的新鮮鹽水中。使用微型解剖針，將兩瓣胸撥到後面；(d)用鑷子將腹側外皮揭掉，暴露內部器官。將唾液腺自消化組織中摘下。夾住消化道的前端(前胃)，然後通過拖動它們穿過腹胸連接處，將消化道-唾液腺同時拖出；(e)將腺體自消化道摘下，在冰冷的鹽中洗1次，置於冰浴中等待收集的Eppemdorf管中，然後冰凍在-70℃。唾液腺提取物的製備按Cupp等，(1993)昆蟲生理學雜誌(J.Insect Physiol.)39:817-821描述的方法或通過超聲製備唾液腺提取物(SGE)。前一種方法中將腺體在1∶1的0.15M NaCl混合物中勻漿，將0.1％Triton X-100溶液加入解凍樣品中，之後再冷凍樣品。通過解凍溶解的樣品，旋渦振蕩30秒，在4℃,14,000×g離心30秒製備提取物。後一種方法中以Sonifier 450(Branson Ultrasoncs,Danbury,CT)按70％的循環和70％的輸出強度超聲2分鐘獲得超聲破碎的腺體。解凍裝有腺體的Eppemdorf管，將每一個試管尖放至浸於冰浴中便於散熱的超聲探頭的底基以裂解內容物，在4℃,12,000×g離心5分鐘除去細胞碎片後，將唾液腺提取物轉移至一新試管之中。用BCA蛋白質分析試劑盒(Pierce,Rockford,IL)確定每個腺體的蛋白質量。初步確定通過超聲從雌性西方角蠅唾液腺中獲得的可溶性蛋白質為0.54±0.09ug/對腺體，雄性為0.63±0.02ug/對腺體。唾液的收集為確定特別是歸屬於唾液分泌物的抗凝血酶活性，結合兩種以前用於牛蠅(Kerlin和Hughes,(1992)獸醫昆蟲學(Med.Vet.Entomol.),6:121-126)和蚊子(Hurlbut,(1996)美國營養衛生醫學(Am.J.Trop.Med.Hyg.)15:989-993)的方法收集這些昆蟲的唾液。將成年角蠅放在室溫之中，飢餓24小時，以確保分泌液保留在唾液腺之中，並且全部的消化道內容物已被消化。後一種防範是必須的，由於蠅在進食期間常常有回流。然後用溼潤的CO2麻醉角蠅，用微型解剖剪剪去翅膀，將脫翅的蠅粘在敷貼器的杆上使其口部能夠置於裝礦物油的毛細管內。在此步驟之前，每隻角蠅注入1μl 80mM 5-羥色胺。然後將蠅的吻部插入油中，由於油與唾液具不同的粘性，故可作為5-羥色胺誘導分泌物的收集介質。通常唾液分泌在30-60秒內開始，由於唾液被吸入油中時呈清亮的小水滴，很容易看見。凝膠電泳除非特別指出，按Laemmli,(1970)自然，227:680-685的方法，以15％聚丙烯醯胺/SDS凝膠電泳(SDS PAGE)分辨蛋白質，並通過銀染(Bassam等，(1991)生物化學年鑑，196:80-83)顯色。掃描染色的凝膠以密度計量學分析條帶的遷移和染色強度(Personal DensitometerS.I.,ImageQuaNT for Windows NT,Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)。唾液中的蛋白質圖1描述通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳的相對遷移率，比較克隆唾液腺(泳道C)與野外收集角蠅唾液腺(泳道B)中蛋白質的分子量。10-220kDa範圍的分子量標準見泳道A和D。除了在田野收集的角蠅在約36kDa處多一條弱帶以外，在它們之間觀察到非常相似的圖譜。但以條帶染色的相對強度分析，30隻野外收集的角蠅唾液腺中蛋白質(B)的濃度超過84隻克隆角蠅唾液(C)中對應條帶的濃度。這種差別在銀染的膠上常常可觀察到，提示野外西方角蠅群比集落化的角蠅株產生更高濃度的唾液蛋白質。三磷酸腺苷雙磷酸酶活性應用標準的試驗(見Cupp等，(1993)昆蟲生理學雜誌，39:817-821)檢測SGE中三磷酸腺苷雙磷酸酶的活性。這種酶能夠迅速地將三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)降解成單磷酸腺苷，從而消除了一種通常促進血小板凝集的關鍵的化學信號。解剖前將野外捕獲的雄性和雌性角蠅在水上維持48小時，然後製備提取物。在西方角蠅唾液腺提取物中該酶的活性可勉強檢測到(2.59±0.21毫單位/對唾液腺等價物)。這種三磷酸腺苷雙磷酸酶活性的缺乏也可以通過西方角蠅唾液不能夠影響富含血小板的牛血漿之中ADP誘導的血小板聚集而證實。(未發表的結果)。因此，三磷酸腺苷雙磷酸酶活性被消除是西方角蠅吸血的機理之一。紅斑活性通過皮內注射SGE或直接由雌性和雄性角蠅叮吸紐西蘭大白兔剃毛的後背，我們評估了西方角蠅唾液誘導紅斑的能力。作為對照，我們也注射了帶蚋(Simulium vittatum)的SGE，它能夠在皮內注射後15分鐘內產生持續的紅斑(Cupp等，(1994)Am.J.Trop.Med.Hyg.,50:235-240)。一種群體型的帶蚋株作為唾液腺材料的來源，(Bernardo等，(1986)Ann.Entomd.Soc.Am.,79:610-621)。無論是以SGE注射或通過叮咬輸入，雌性和雄性西方角蠅唾液都沒產生紅斑。在15分鐘之內帶蚋的SGE可產生可見的紅斑。因此，紅斑活性的消除是西方角蠅吸血的一種機制。其他血管舒張活性在有或無完整的內皮的條件下，利用大鼠胃(前列腺素試驗)和兔主動脈條的張力測定進行實驗，以檢測西方角蠅SGE或唾液中血管舒張活性的存在情況(見Ribeiro等，(1992)實驗寄生蟲學，74:112-116；Ribeiro等(1994)，醫學昆蟲學雜誌31:747-753)。為確定西方角蠅SGE中緩激肽或組胺活性，按Webstet和Prado(1970)的方法進行測定，該方法是以體外豚鼠迴腸的收縮作為激肽活性的一種直接生物測定。獲得對待檢測物質(對於大鼠胃條為前列腺素E2，對於兔主動脈條為去甲腎上腺素或乙醯膽鹼)的正常反應，而西方角蠅SGE無血管活性。起初，在大鼠胃條試驗中誘導唾液的收集物確實有活性，當包含methysergidemaleate時，這種活性喪失(Pertz和Eich,(1992)NavnynSchmiedebergs Arch.Pharmacol.,345:394-401)。這種物質是一種已知的5-羥色胺抑制劑，而角蠅利用5-羥色胺這種化合物來誘導唾液分泌。這種活性在5-羥色胺誘導的唾液中存在，但不存在於SGE之中，表明這些樣品中5-羥色胺的活性來源於誘導唾液分泌而注射的化合物。西方角蠅SGE的提取物能夠加強前列腺素活性的檢測，證實了更早期血管舒張研究的陰性結果。在檢測緩激肽或組胺的豚鼠迴腸試驗之中沒有檢測到唾液活性。因此，檢測到的血管舒張活性被消除是西方角蠅吸血的一種機制。當給紐西蘭大白兔去毛皮膚皮內注射時，應用雷射都卜勒貫流顯像(laser Doppler perfusion imaging)證實在體內角蠅SGE不能誘導血管舒張。抗凝集活性以再鈣化時間試驗鑑定抗凝活性，因為這種常用的試驗能夠探測影響凝血級聯反應三個主要步驟外源性通路，內源性通路和最終的共同通路中任何步驟的抑制劑。從雌性和雄性西方角蠅以及雌性帶蚋中製備唾液腺提取物。從後一種類中製備的SGE作為陽性對照，因為以前已用相同的再鈣化時間試驗來檢測該種類中的抗凝活性(Abebe等，(1994)醫學昆蟲學雜誌，31:908-911)。如圖2所示，雌性西方角蠅與帶蚋的SGE延緩標準血漿的再鈣化時間的能力是相同的。雄性SGE也可減緩再鈣化時間(未提供資料)。儘管西方角蠅提取物之中測到的蛋白質的含量有50％降低，但有相當的抑制效果。所以，這種抗凝活性為西方角蠅中檢測到的唯一抗止血活性。抗止血活性的特並性再鈣化時間試驗能夠檢測最終導致血液凝集(凝血)的凝血級聯反應中任一步驟的抑制，因此它是一種探測未知抑制劑的存在常用的試驗。因為血液凝集是一系列反應的結果，角蠅唾液可通過抑制血液凝固級聯反應中某一特定步驟而延緩血液凝固，或可選擇地，可通過在血塊形成後將其溶解(纖溶活性)而延遲正常的止血速度。
為了分析的目的，凝集反應通常被分成三個亞通路，這些通路能夠通過不同的凝集試驗監測；例如，內源性(激活的部分促凝集酶原激酶時間試驗=APTT)，外源性(凝血酶原時間試驗=PTT)和最終的共同通路(凝血酶時間=TT)。本領域普通的專業技術人員熟知再鈣化時間、PTT、TT和APTT試驗。例如，再鈣化時間試驗見Biggs等(1962)人血液凝集和紊亂(Human Blood Coagulation And Its Disorders)，第三版，Blackwell科學出版社，牛津大學)。APTT、PTT和TT試驗見Turgeon M.L.((1993)臨床血液學原理和方法(Clinical Hematology.Theory andProcedures)，第二版，Little,Brown and Company,Boston)。APTT Ⅱ是APTTⅠ試驗的一種改進，它更靈敏。
如表1所示，用這些試驗確定了角蠅抗凝活性的幾種特徵1)角蠅唾液腺提取物或唾液導致所有試驗的凝集延緩，表明至少存在一種在最終的共同途徑中起作用，即在凝血酶原變成凝血酶後起作用的抑制劑。2)野生型蠅的唾液比相同數量群體型蠅的唾液含更多的抑制活性。3)克隆蠅在羽化48小時後比羽化24小時後的抑制活性高。
表1西方角蠅唾液腺提取物(SGE)或5-羥色胺誘導的唾液減緩血液凝固
ND沒有測定*每個值是4次試驗的平均值角蠅唾液對TT試驗中凝集的抑制表明針對的是凝血酶形成後發生的一個反應。在凝血酶形成後有兩種反應出現1)通過凝血酶(因子Ⅱ)作用於纖維蛋白原形成纖維蛋白單體和2)在因子ⅩⅢ的作用下纖維蛋白單體發生交聯。凝血酶也參與了因子ⅩⅢ的激活。因此，凝血酶(因子Ⅱ)可能是角蠅唾液腺的靶分子。為檢測這種可能性，檢測以特定抗體(Sigma Chemical,St.Louis,MO)剔除因子Ⅱ的血漿的凝集時間。加入漸增量的正常血漿(包含因子Ⅱ)，可縮短PTT試驗中檢測的凝集時間(圖3,-唾液)。當角蠅的唾液(相當於兩隻角蠅)與漸增量的正常血漿(圖3,+唾液)一同加入時，凝集時間延緩百分數隨因子Ⅱ(存在於正常血漿中)的增加量一同增加。這種結果表明唾液含因子Ⅱ的特異性抑制劑。
可以用人工合成的底物(S238,American Diagnostica Inc.,Greenwich,CT)檢測凝血酶的凝集作用，該底物經凝血酶水解後產生一種生色團。底物濃度在2.5-100uM間遞增的條件下，檢測牛凝血酶單獨(250pM；圖4，-唾液)和加有角蠅唾液(相當於兩隻)時水解S238的速度。這些結果證實角蠅唾液含一種凝血酶抑制劑，並提示它可能是一種競爭性抑制劑，因為當底物過量(100μM)時，其效果消失。幾種模型能夠說明此種生物化學行為(Segel(1976)，生物化學計算，John Wiley＆Sons,New York)。為了分析，通過確定凝血酶在不同固定濃度的底物存在時對底物的水解速度(v)，並作1/V對抑制劑濃度的曲線，繪製Dixon曲線。這樣提供了確定抑制類型和確定抑制常數Ki的方法。確定角蠅唾液腺中抗凝成分的物理特性以設計純化方案表2中的APTT凝集時間表明，在室溫放置60分鐘或暴露於100℃ 5分鐘後，SGE中的活性喪失。該活性成份可用乙醇沉澱，在以乙腈/TFA處理和凍幹時是相當穩定的。這些物理特性與蛋白質抑制劑是一致的，能夠在標準HPLC程序下用乙腈/TFA梯度洗脫純化。
表2確定西方角蠅唾液腺提取物中抗凝活性的物理特性
HPLC純化和HPLC唾液級分的再鈣化試驗分析時，每次HPLC收集100-150隻角蠅的唾液。製備型分離時，每次分離收集多於500隻角蠅的唾液。在注入柱內之前，總是以配對的梯度洗脫A溶劑的原溶劑稀釋收集的唾液。使用大球形C18,4.6×250mm，300柱(AllTech)進行所有的HPLC製備。經檢測肽鍵在220nM處的UV吸收監測蛋白質洗脫。以0.5或1分鐘的間隔收集從柱上洗脫的成份。在凍幹所有樣品除去有機溶劑之前，自每一級分中取一小份轉移到含牛血清白蛋白(BSA)的第二個試管中用於活性試驗。以Tris緩衝液(5mMTris,150mM NaCl，在37℃ pH為7.4)重新溶解與BSA(用來增加純化蛋白質的溶解性)一起乾燥的組分。利用上述再鈣化試驗，通過延緩凝集的形成確定組分中的抑制活性。
圖5描述了用來獲得高純度的抗凝活性製劑的三種反相HPLC柱程序。黑線是HPLC色譜圖，而灰條表示再鈣化試驗的凝集時間。A圖表示用梯度洗脫(乙腈，異丙醇和TFA)時西方角蠅唾液的HPLC分離圖譜，B圖表示用梯度洗脫(乙腈和TFA)時「A」中具最大抗凝活性的組分的HPLC分離圖譜。C圖表示利用梯度洗脫(乙腈和HCl)時，「B」中具最大抗凝活性的組分的HPLC分離圖譜。來源於第一次分離過程(A)的凝集資料顯示角蠅唾液中僅含一種凝集抑制劑，其在所用的條件下大約在45分鐘被洗脫。在第二次HPLC分離中，合併來自目的峰的級分並直接注入以初始溶劑平衡後的柱內。連續3次HPLC分離後，抗凝活性依然保留，真空乾燥，4℃貯存4天。
圖6表示角蠅唾液的抗凝蛋白經3步HPLC分離後的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳。泳道1為蛋白質濃度標準；泳道2為蛋白質分子量標準；泳道3為具較高抗凝活性的HPLC級分(圖5-C)，泳道4為具較低抗凝活性的HPLC級分(圖5-C)。這種圖譜顯示有相對遷移率約為16.5Kda的一種高純度的單一蛋白質。角蠅唾液腺cDNA文庫的構建融解、合併唾液腺總RNA(貯存於-70℃約3年之久的數等分)，並以poly(A)QuickR試劑(Stratagene,LaJolla,CA)分離mRNA。利用Stratagene的ZAP ExpressTM載體和試劑盒構建CDNA文庫。對插入片段數目的原始分析表明獲得的原始插入子數目相對較少(～3×104)。貯存約1/5的原始文庫，剩餘部分用於一輪擴增以達到5.1×106噬斑形成單位(PUF)/毫升的滴度。編碼凝血抑制素的cDNA的克隆將估計約110pmol HPLC純的凝血抑制素送往哈佛微化學實驗室，通過質譜分析獲得精確的分子量並確定氨基端(N)30個殘基的序列。儘管以SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析反覆地表明其分子量約16.5KDa(見，例如，圖6)，但質譜檢測到HPLC純樣品為由4種蛋白質組成的明顯「家族」，其平均分子量為9.3±0.06kDa。自9kDa的蛋白質獲得一段N端序列(SEQID NO:3)，表明可變的分子量源於非常相似的蛋白質，它們可能具有不同的離子對或僅有少至1-2個胺基酸的差別。N端的序列也提示該蛋白質是高度酸性的。經HPLC純化並送去分析的第二個凝血抑制素樣品，得到相似的分子量。以SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳再次分析第二個樣品的剩餘部分。蛋白質電泳的分子量仍約為16.5kDa。檢索科學文獻揭示了另外一篇有關一種高度酸性蛋白質的報導(Takano等(1988)生物化學，27:1964-1972)，該蛋白質以聚丙烯醯胺凝膠電泳分析時有異常高的分子量。為確定分子量，以SDS/PAGE分析經再鈣化試驗確定有活性的第三批凝血抑制素樣品。將16.5kDa蛋白質的單一條帶轉移至PVDF膜上。以麗春紅S染色印跡以顯示轉移的凝血抑制素條帶。剪下該條帶和相似區域的對照區，送往哈佛實驗室進行序列分析。此次N-端序列分析(SAGPI)證實了N-端前5個胺基酸的同一性。
利用列於SEQ ID NO:3中來源於凝血抑制素前30個殘基的N-端序列來由Auburn大學Scott-Ritchey研究中心(SRRC)DNA實驗室構建簡併核苷酸引物。將如上面描述構建cDNA文庫時在合成第一條cDNA鏈後取出並凍存於-20℃的一小部分西方角蠅唾液腺cDNA作為模板DNA。依據凝血抑制素N端序列設計簡併性正向引物，寡聚dT為反向引物，以上述模板進行PCR反應，擴增出大約350bp的產物。以1μl PCR產物與PCR2.1載體(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)在14℃連接過夜。以連接產物轉化OneShotTM細胞(Invitrogen Corporation)，並轉移到含氨苄青黴素的LB瓊脂板上。生長過夜後，可觀察到各代表包含無插入片段的質粒(藍色)，和有破壞β-半乳糖苷酶基因之插入片段的質粒(白色菌落)的藍和白菌落出現。挑選10個白色和2個藍色克隆接種在液體培養基中，30℃過夜生長擴增。取每種培養物的一部分在-70℃貯存於甘油中。通過溴化乙錠染色並與分子量標準比較目測質粒大小。小量製備DNA並由SRRC DNA實驗室以基於質粒載體中多克隆插入位點側翼序列的引物測序。
由列於SEQ ID NO:1的PCR克隆的cDNA編碼的列於SEQ ID NO:2中的蛋白質推斷的胺基酸序列被證實與凝血抑制素是同一的，即該cDNA編碼一種約9kDa的蛋白質並包含N端測序揭示的全部胺基酸，雖然僅利用一小部分信息合成允許PCR擴增的簡併性引物。推斷蛋白質的21％由天冬氨酸和穀氨酸殘基組成。這些信息也證實了編碼有活性凝血抑制素的cDNA包含在西方角蠅cDNA文庫之中。在GeneBank的蛋白質資料庫中檢索未發現相似序列。地高辛標記的凝血抑制素探針的製備利用上述PCR克隆的凝血抑制素cDNA片段產生地高辛標記探針，用於在很嚴緊的條件下篩選西方角蠅cDNA文庫。利用克隆的凝血抑制素片段為模板和GeniusTM系統(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，在地高辛-11-dUTP與dTTP比值為1∶5條件下，通過PCR合成地高辛標記的探針。以瓊脂糖凝膠電泳純化地高辛標記的DNA。標記探針的產量以滴定和與Genius試劑盒提供的DIG標記的對照DNA相比較來確定。全長cDNA的克隆和序列分析以來源於擴增文庫的50,000噬斑形成單位(pfu)轉染XL1blue細胞並鋪在150-mm NZY平板上。孵育過夜後，平板在4℃預冷2小時，將噬斑複製到尼龍膜上，並以地高辛標記的DNA片段檢測。簡而言之，將「粘起的」的DNA在室溫變性5分鐘，乾燥5分鐘，中和5分鐘，並在Stratalinker 1800(Stratagene,La,Jolla,CA)中按自動交聯循環交聯；在5×SSC,0.1％N-月桂基肌氨酸，0.02％SDS,2％封閉試劑和50％甲醯胺溶液中，65℃進行預雜交和雜交；洗膜4次，然後通過與抗地高辛綴合的鹼性磷酸酶孵育，並加入能夠生成藍色產物的底物，觀察雜交的地高辛-凝血抑制素。將從第一輪篩選中挑選的幾個噬斑亞克隆以確定第二輪篩選的陽性克隆。從SM緩衝液中的噬斑提取噬菌體，如上所述使其在NZY平板上培養的XL1-Blue MRF細胞中生長而得以擴增。自小量生長過夜的細菌克隆中分離DNA。以凝血抑制素特異性正向引物和基於克隆PCR片段的序列合成的反向內部引物，用PCR擴增檢測陽性克隆。以另外一次噬斑試驗進一步檢測陽性克隆，因所有的集落均與地高辛標記的探針雜交表明陽性克隆是純的。
利用ExAssist/XLOLR系統和Stratagene的方法，通過自動切割獲得包含克隆的插入片段的噬菌粒。在LB-卡那黴素的平板上培養集落，並製備甘油貯存液貯存在-70℃。挑選相似的集落經過夜生長擴增。小量提取DNA，正向以T3和凝血抑制素-F1引物，反向以T7和凝血抑制素-R1引物，以自動循環測序(SRRC)分析，並用正向和反向引物測定內部到末端的序列。得到數個cDNA克隆並測定其序列。命名為TB8的部分cDNA的核苷酸序列列於SEQ ID NO:4，其編碼的胺基酸序列列於SEQ ID NO:5。需要指出的是列於SEQ ID NO:4中263-505位的核苷酸編碼的列於SEQ ID NO:5中88-168位的胺基酸殘基對應於活性凝血抑制素。
用Genetics Computer Group的Wisconsin PackageTM(GCG,MadisonWI)分析核酸和凝血抑制素cDNA的推算蛋白質序列。
為獲得全長cDNA序列，利用唾液腺mRNA和具有對應於上述cDNA克隆3′共有序列的內部引物，使用5′RACE(快速擴增cDNA末端)程序。編輯重疊序列以確定全長cDNA序列組成。通過改建使克隆包含由5′RACE程序所確定的5′端核苷酸，用上述TB8 cDNA克隆構建編碼凝血抑制素的全長cDNA。全長cDNA的核苷酸序列列於SEQ ID NO:6，其中編碼的胺基酸序列列於SEQ ID NO:7。需指出的是由列於SEQ ID NO:6中283-525位核苷酸編碼的列於SEQ ID NO:7中的95-175位胺基酸殘基對應於活性凝血抑制素。重組凝血抑制素蛋白質的產生以能夠切割質粒多克隆位點但不切割凝血抑制素內部序列的2種限制性內切酶消化凝血抑制素質粒DNA和轉移載體pBacPAK8(CLONTECH,Palo Alto,CA)。以TAE凝膠電泳純化切下的凝血抑制素和線性化的pBacPAK8。切下消化條帶並以「Sephaglas」Band製備試劑盒(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)提取DNA。建立1∶2(載體插入片段)連接反應，並在15℃連接過夜。用包含PCR片段部分所述的凝血抑制素插入片段的pBacPAK8質粒轉化OneshotTM細胞。將轉化的細胞在LB氨苄青黴素平板上生長過夜。挑選數個集落在37℃，液體培養基中生長過夜。製備甘油儲存物，並冷凍在-70℃，快速製備質粒以瓊脂糖凝膠成像確定大小。以柱純化法(Qiagen Corp.,Santa Clarita,CA)小量製備DNA，以Bac 2引物(CLONTECH)進行DNA序列分析。
利用lipofectinTM(Life Technologies,6rand Island,NY)為轉染試劑和High FiveTM無血清培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以BacPAK8/凝血抑制素質粒TB8/3和Bsu36I消化的BacPAK6病毒DNA共轉染Sf9細胞，獲得包含凝血抑制素插入片段的重組杆狀病毒。對照包括野生型病毒(陽性對照)和僅DNA質粒本身(陰性對照)。將細胞在室溫與轉染培養基孵育5小時後，加含10％胎牛血清的TNM-FH培養基(TNM-FH/FBS)，並在27℃繼續孵育72小時。收集含病毒的細胞培養上清，並貯存在4℃。進行噬斑試驗，從而從細胞上清中分離純的凝血抑制素病毒克隆。以100μl上清或100μl TNM-FH/FBS培養基中稀釋高達10-3的稀釋液，感染每個平板含1.5×106個Sf9細胞的35mm平板，重複兩份。室溫放置1小時後，移去感染培養基，以3.5ml含10％胎牛血清，50μg/ml慶大黴素和1％瓊脂糖的Grace培養基(Life Technologies,Grand Island,NY)覆蓋在細胞上。將細胞在有溼紙巾的27℃塑料箱中孵育。5天後，在細胞上再鋪第二層還含0.16mg/ml中性紅染料和250μg/ml Xgal的培養基。在瓊脂糖復蓋層形成凝膠後，顛倒平板，室溫孵育48小時。挑選清晰的陽性噬斑，在TNM-FH培養基中孵育過夜洗脫病毒。用洗脫的病毒感染Sf9細胞並在27℃孵育4天以形成第一代病毒。
將細胞收集在磷酸緩衝鹽水(10mM,pH7.4)中，按使用手冊中的方案Ⅱ，利用Stratagene DNA小量提取試劑盒提取DNA。以提取的DNA為模板，以凝血抑制素正向引物和反向引物對以及Bac1/Bac2引物對(CLONTHCH)，進行PCR。兩種引物對的擴增均證實轉化正確，進行第二次噬斑試驗以確定克隆的純度和病毒的滴度。重組凝血抑制素產品的鑑定以病毒(感染複數=2)感染sf9細胞並在27℃孵育，在12、24、48、72和96小時收集培養液。在CentriplusTM100濃縮儀(Amicon,Beverly,MA)中以3,000×g，在室溫下離心2小時濃縮病毒，並從培養基之中移出，按改良的Lowry試驗(Sigma Chemical,St.Louis,MQ)評估小於100kDa級分中的總蛋白質。
以上述的生色底物S238試驗檢測重組凝血抑制素的抗凝集和/或抗凝血酶活性。重組凝血抑制素的RP/HPLC純化將無病毒的細胞培養上清之中的大分子量組份(≥10kDa)在CentriplusTM10微型濃縮儀中以3,000×g離心4小時濃縮。以C18大球柱進行RP/HPLC，以乙腈梯度洗脫，從上所述的其他培養基組分之中分離重組凝血抑制素。
檢測凝血抑制素在實驗室動物模型(兔子)中的免疫特性，作為生產抗吸血角蠅的核酸(DNA)疫苗的第一步。
吸血昆蟲唾液中的抗止血蛋白質不是高免疫原性的(見Cupp和Cupp(1997)昆蟲藥物雜誌(J.Med.Entomol.),34:87-94)。這種實驗性觀察結果與免疫反應的產生，尤其是產生中和性抗體的有可能阻止或減少吸血和子代產生及適應性的直覺性概念相吻合，因此，開發誘導針對這種分子的強大免疫反應的方法十分重要。更重要的是，有效地免疫田野中的家畜也要求有僅需要最小量的處理和貯存的實用疫苗。在過去的幾年間，已經證明應用核酸免疫能夠產生強的針對所編碼蛋白質的免疫反應，通過改變給予核苷酸的位置和/或量可使該蛋白質導向特定的免疫空間。通過相對簡單的細菌培養技術，能夠廉價生產這種包含帶插入的目的DNA的質粒的疫苗，它們在室溫下貯存是穩定的，這樣就可克服許多基於蛋白質的疫苗存在的問題。因此，首先以凝血抑制素核酸檢測兔子的免疫。
構建包含CMV啟動子和卡那黴素抗性篩選標記的質粒疫苗。用上文就杆狀病毒轉移載體的限制性消化和再連接所述的方法，產生含凝血抑制素的疫苗質粒(TS-Vac)。
從由每隻兔的大耳靜脈採來的血樣中獲得血清作為免疫前對照，在PBS中將三種Ts-Vac質粒(500μg無插入片段的質粒=對照；200μg或500μgTS-Vac=檢測質粒)之一，皮內注射9隻兔子。大約4周後採血樣，並檢測針對凝血抑制素的體液(特異性抗體滴度的存在)和細胞(母細胞形成反應)反應。注射後20周內每周檢測一次這些參數。所有的免疫試驗均是標準試驗，並在以前發表的有關吸血昆蟲唾液因子的免疫反應工作(Cross等(1993)J.Med.Entomol.30:725-734；Cross等(1993)J.Med.Entomol.30:928-935)中使用過。
以直接ELISA試驗確定抗體的滴度(Cross等，(1993)J.Med.Entomol.30:725-734；Cross等(1993)J.Med.Entomol.30:928-935)。簡單地說，以重組凝血抑制素或非特異性蛋白質包被96孔平底微滴定平板，然後用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS液封閉。各孔用免疫前血清或測試血清孵育，然後以PBS-吐溫洗孔，再加入鹼性磷酸酶綴合的抗-兔IgG(Sigma Immunochemicals,St.Louis,MO)或抗兔IgM(SouthernBiotechnology Assoc.Inc.,Birmingham,AL)。與對硝基苯基磷酸(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)進行底物反應後，用Spectramax微滴定平板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在405nm處讀取顏色強度。計算抗體滴度並在治療組中比較以確定產生抗體的最適免疫原劑量。
用重組凝血抑制素，以點印跡(Cross等(1993)J.Med.Entomol.30:725-734)評估抗體對凝血抑制素的特異性。將重組凝血抑制素或牛血清白蛋白(BSA)對照點在96孔硝酸纖維素底的微滴度平板(Millipore,Manborough,MA)上。用含3％脫脂奶粉的PBS做封閉液。在洗滌和底物反應前，加入待測血清孵育1小時。通過目測確定抗體的特異性反應。
利用在以EDTA為抗凝劑對血液進行Ficoll-Paque離心分離的外周血單核細胞(PBM)，檢測對凝血抑制素的細胞反應(Ramachandra和Wikel(1992),J.Med.Entomol.29:818-826)。分離細胞的活力通過取小份細胞用能夠明亮地標記健康細胞的二乙酸螢光素(FDA；Sigma,St.Louis,MO)確定。在加入重組凝血抑制素、角蠅唾液或非特異蛋白質之前，將PBM以5×105細胞/孔加入微滴定平板之中。加入有絲分裂原ConA後繼續孵育72小時，利用在570nm處讀值的MTT比色試驗(Denizot和Land(1986)免疫學方法雜誌89(2):271-277)確定對檢測蛋白質的細胞反應。通過超過對照的增加值來確定對凝血抑制素的母細胞生成反應。比較完整唾液存在時的免疫反應可以探測唾液中的免疫調節因子。
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序列表110Cupp,Eddie WayneCupp,Mary Smith120來自角蠅的抗凝血酶核苷酸和蛋白質1305721-101607170FastSEQ for Windows Version 3.02101211370212DNA213Haematobia irritans220
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1．一種基本上純化的具有抗凝血酶活性的蛋白質，其中所述的蛋白質是從環裂亞目中一個物種的唾液腺中分離的。
2．根據權利要求1的蛋白質，其中所述的蛋白質從角蠅屬一個物種的唾液腺中分離的。
3．權利要求2的蛋白質，其中所述的物種是西方角蠅。
4．一種基本上純化的蛋白質，其具有選自下述的胺基酸序列a)來自環裂亞目一個物種的抗凝血酶蛋白質的胺基酸序列；b)列於SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7之中的胺基酸序列；c)與列於SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7之中的胺基酸序列具有顯著序列相似性的胺基酸序列；d)是列於SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7之中的胺基酸序列的變體的胺基酸序列；
5．SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7所示胺基酸序列的片段；其中所述的片段包含所述序列的至少15個連續的胺基酸。
6．權利要求4的蛋白質，其中所述的蛋白質是通過重組的方法產生的。
7．權利要求4的蛋白質，其中所述的蛋白質能夠調節免疫反應。
8．分離的編碼具有抗凝血酶活性的蛋白質的核苷酸序列，其中所述的蛋白質是從環裂亞目一個物種的唾液腺中分離的。
9．一種分離的核苷酸序列，其選自a)包含列於SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6之中的核苷酸序列的核苷酸序列；b)與列於SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6之中的核苷酸序列具有顯著序列相似性的核苷酸序列；c)是列於SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:6之中的核苷酸序列的變體的核苷酸序列；d)編碼列於SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7的胺基酸序列的核苷酸序列。
10．一種核苷酸序列，該序列包含列於SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7的胺基酸序列中的至少15個連續胺基酸殘基。
11．一種核苷酸序列，該序列在嚴緊的條件下可與列於SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6之中的核苷酸序列雜交。
12．一種載體，該載體包含權利要求9的核苷酸序列。
13．一種宿主細胞，該細胞包含權利要求9的核苷酸序列。
14．一種載體，該載體包含權利要求11的核苷酸序列。
15．一種宿主細胞，該細胞包含權利要求11的核苷酸序列。
16．一種可選擇性地與具有抗凝血酶活性的蛋白質結合的抗體製劑，其中所述的蛋白質來自環裂亞目一個物種的唾液腺。
17．權利要求16的抗體製劑，其中所述的蛋白質包含根據SEQID NO:2,SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:7的胺基酸序列。
18．一種抗體製劑，該製劑可選擇性地結合權利要求5所述的片段。
19．一種藥物組合物，該組合物包含治療有效量的權利要求4的蛋白質。
20．一種獸用疫苗，該疫苗包含治療有效量的權利要求4的蛋白質。
21．一種獸用疫苗，該疫苗包含治療有效量的權利要求9-11中任何一項的核苷酸序列。
22．一種治療家畜中吸血病的方法，所述方法包含將權利要求20或21任何一項的疫苗給予所述家畜。
23．一種治療哺乳動物血栓症的方法，所述方法包含將治療有效量的具有抗凝血酶活性的蛋白質給予所述哺乳動物，其中所述的蛋白質具有選自列於權利要求4的胺基酸序列組中的胺基酸序列。
24．權利要求23的方法，其中所述蛋白質由重組方法產生。
25．一種生產具有抗凝血酶活性的蛋白質的方法，該方法包含a)在可以生產所述蛋白質的條件下培養以編碼權利要求2的蛋白質的核苷酸序列轉化了的原核或真核細胞；和b)分離該蛋白質。
全文摘要
本發明提供了預防家畜中吸血性感染的組合物和方法,以及具抗凝血酶活性的分離蛋白質和編碼該蛋白質的核苷酸序列。從西方角蠅唾液腺中分離出了命名為凝血抑制素的蛋白質。該組合物能夠作為獸用疫苗預防侵染性角蠅對家畜吸血。本發明的蛋白質在治療血栓症中也有用。
文檔編號A61K39/00GK1320165SQ99811525
公開日2001年10月31日 申請日期1999年8月19日 優先權日1998年8月20日
發明者E·W·卡普, M·S·卡普 申請人:奧本大學