一種鴨病毒性肝炎自殺性dna疫苗及其構建方法和應用的製作方法

2023-12-09 03:39:36

專利名稱：一種鴨病毒性肝炎自殺性dna疫苗及其構建方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物病毒學與動物傳染病學的技術領域，特別涉及一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗及其構建方法和應用。
背景技術：
鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是由鴨病毒性肝炎病毒(DHV)弓丨起的雛鴨的一種高度致死、快速傳播的病毒性傳染病。該病的特徵是發病急、病程短、死亡率高。臨床症狀以痙攣、抽搐和角弓反張等神經症狀為主要特徵，病理變化主要以肝臟腫大和斑點出血為特徵性病變。DHV分為三個血清型，即I型、II型和III型，三個血清型之間無交叉保護作用。I型DHV呈世界性分布，並常和其它病毒、細菌混合感染，對養鴨業的危害很嚴重，給養鴨業造成了巨大的經濟損失，同時也是對養鴨業威脅最大的一種傳染病。DHV-I 結構蛋白為VP0、VP3、VP1構型，其中，結構蛋白中VPl位於衣殼表面，含有主要的抗原決定簇,包含了大多數能夠與細胞受體相互作用的抗原表位,能夠誘導宿主機體產生中和抗體, 所以認為VPl與DHV的致病性有密切的關係。經試驗證實，殼體蛋白含有多個β片層結構， 與其相連的環形結構位於殼粒表面，這在免疫學中佔有重要作用。現有的DVH疫苗有DVH雞胚化弱毒苗、DVH雞胚化滅活苗和DVH鴨胚化滅活苗3 種。通常認為弱毒苗的免疫效果要好於滅活苗，但是存在毒力返強的危險。與弱毒苗相比， 滅活苗雖然安全，但是往往需要多次免疫接種，而且效果不穩定，還經常導致免疫失敗。Berglund等於1998年率先提出了以甲病毒複製子為基礎的自殺性DNA疫苗 (suicidal DNA vaccine)的設想，即利用自殺性DNA疫苗的甲病毒進入細胞後能表達出甲病毒的非結構蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下，甲病毒基因組RNA進行高效複製，在此過程中產生大量的雙鏈RNA(dsRNA)中間體，最終可使轉染的細胞凋亡，基於甲病毒複製子的DNA 疫苗可引起轉染的細胞凋亡，也稱自殺性DNA疫苗，它比傳統DNA疫苗更安全，無整合到宿主染色體的潛在危險性。自殺性DNA疫苗可引起高水平的體液免疫和細胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因組高效複製同時，目的抗原在亞基因組啟動子的調控下獲得高效表達，從而可以較低的免疫劑量引起較強的免疫反應。自殺性DNA疫苗的載體是以甲病毒複製子為基礎的複製型DNA載體。病毒複製時結構基因拷貝數高達IO5之多，因此可以利用亞基因組的啟動子使外源基因獲得高效表達。 自殺性DNA疫苗由於其具有RNA複製子，大量複製可導致感染細胞的凋亡。該凋亡可能是複製型載體在表達外源基因的過程中產生雙鏈RNA(dsRNA)複製中間體介入的結果。dsRNA 能在細胞和體液免疫中起強大的輔助作用。後來，研究者將RNA複製子載體系統改造成以 DNA為基礎的、RNA聚合酶η依賴的系統。這種載體攜帶了甲病毒複製酶基因和外源基因的重組質粒DNA，缺失了病毒結構蛋白基因。它通過將人巨細胞病毒(CMV)早期增強子/啟動子序列插入到SP6啟動子的上遊或替換SP6啟動子啟動轉錄。同時，在多克隆位點下遊插入強轉錄終止信號SV40晚期聚A信號序列，正常終止轉錄。該質粒DNA轉染宿主細胞後，利用宿主RNA聚合酶η在細胞核內轉錄，合成甲病毒複製酶，再合成亞基因組RNA及大量外源蛋白，從而大大提高表達效率。因此，從自殺性DNA疫苗的構建上我們可以看出其具有RNA 疫苗和DNA疫苗的優點，能自主複製、大量表達。甲病毒複製子載體表達效率高，在理論上，在4h內單個細胞內可產生20萬個RNA 拷貝，表達的外源蛋白可佔細胞總蛋白的25%。甲病毒複製酶可在多種細胞中發揮作用，如哺乳動物細胞、禽類細胞、兩棲類動物細胞和昆蟲細胞等。RNA的複製在細胞漿內進行，是與宿主的複製系統分開的。甲病毒複製子載體的高表達效率、廣泛的宿主細胞類型和獨立的細胞漿複製系統等特性，很適合作為DNA疫苗。該類載體轉染細胞後，其RNA複製酶可合成大量的雙鏈RNA (dsRNA)，而dsRNA可誘導轉染細胞凋亡，，因此稱為自殺性DNA疫苗。

發明內容
本發明的第一目的在於提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，以解決現有技術中現有的DVH疫苗一般為弱毒苗或滅活苗，弱毒苗存在毒力返強的危險，而滅活苗往往需要多次免疫接種，而且效果不穩定，還經常導致免疫失敗的技術性問題。本發明的第二目的在於提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構建方法。本發明的第三目的在於提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在製備預防和治療鴨病毒性肝炎藥物中的應用。本發明目的通過以下技術方案實現一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，該疫苗由DHV-VPl基因和甲病毒複製子載體 PSCAl組成，所述DHV-VPl基因是DHV病毒的致病決定基因，其為DHV病毒基因中第2106至 2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列ggtgattccaaccagttgggggatgatgagccagtttgctttctaaattttgagacagct60
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714。一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構建方法，包括如下步驟I) DHV病毒總RNA的提取及純化將DHV ZJ08病毒株腿部肌注射兩日齡的小鴨， 待小鴨死亡後，取其肝臟製備研磨液，按常規方法提取DHV病毒總RNA ；2)設計特異性引物根據DHV病毒VPl蛋白基因序列分析設計出一對特異性引物，在上遊引物中引入Kozak序列VPl-F :5』 -CGGGATCC Banffl TGCCACCATG,^GGTGATTCCAACCAGTT-3，,
VPl-R :5』 -TCCCCCGGG,^ tTTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA~3』 ；3)通過反轉錄-聚合酶鏈式擴增方法，克隆得到DHV-VPl的全長cDNA基因序列；4)將步驟3)擴增的VPl片段，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VPl cDNA片段； 5)將VPl全長cDNA片段重組到甲病毒複製子載體pSCAl真核表達載體中，構建成鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗——抗DHV的pSCAl-VPlDHV疫苗。進一步地,步驟3)進一步包括在聚合酶鏈式反應中，反應程序為95°C預變性5min，然後94°C變性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸lmin，35個循環，72°C延伸IOmin後，10°C終止反應，於I %瓊脂糖凝膠電泳膠回收聚合酶鏈式反應產物。一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在製備預防鴨病毒性肝炎藥物中的應用。一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在製備治療鴨病毒性肝炎藥物中的應用。與現有技術相比，本發明有以下優點I、所需的免疫劑量小；2、與現有的弱毒苗和滅活苗相比，本發明的自殺性DNA疫苗更加安全、高效；3、本發明的自殺性DNA疫苗在動物體內一過性表達外源基因後，隨細胞凋亡而被機體清除，從而可避免DNA質粒可能整合到宿主細胞染色體或可能造成免疫耐受等隱患；4、本發明的自殺性DNA疫苗更長效，穩定，且操作便捷。


圖I為用RT-PCR方法擴增VPl基因的電泳檢測圖；圖2為pSCAl-VPl重組質粒酶切鑑定的電泳檢測圖；圖3為VPl基因在細胞中表達RT-PCR的電泳檢測圖；圖4為VPl蛋白在細胞中表達後在螢光顯微鏡下的結構圖，其中，a為重組質粒 pSCAl-VPl轉染400 X ；b為重組質粒pSCAl_VPl轉染100X ；c陰性對照；圖5為構建本發明的自殺性DNA疫苗PSCA1/VP1的策略示意圖；圖6為本發明的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗刺激雛鴨T淋巴細胞增殖後，試驗組與對照組於λ 570nm處測定OD值的對比圖；圖7為本發明的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗刺激雛鴨產生特異性抗體後，試驗組與對照組於λ 450nm處測定每孔的OD值的對比圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。本發明的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，該疫苗由DHV-VPl基因和甲病毒複製子載體pSCAl組成，如圖5，DHV-VPl基因是DHV病毒的致病決定基因，其為DHV病毒基因中第 2106至2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列ggtgattcca accagttggg ggatgatgag ccagtttgct ttctaaattt tgagacagct 60aatgtcccaa tacaaggtga atctcacact cttgttaaac acctgtttgg gaggcaatgg 120
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實施例I :本發明的鴨病毒性肝炎自殺性DNV疫苗-PSCAI-VPI自殺性DHV疫苗的
構建方法，包括如下步驟I)DHV病毒總RNA的提取及純化^fDHV ZJ08病毒株腿部肌肉注射兩日齡的小鴨， 待小鴨死亡後，解剖取其肝臟，用剪刀將肝臟剪碎研磨，並加入I %的雙抗，將研磨液反覆凍融3次後,用TakaRa Catrimox-14 試劑盒提取RNA,具體步驟參照試劑盒說明書。2)設計特異性引物根據DHV病毒VPl蛋白基因序列分析設計出一對特異性引物，在上遊引物中引入Kozak序列VPl-F :5』 -CGGGATCC一 ,GCCACCATG,...,糾GGTGATTCCAACCAGTT-3，,VPl-R :5』 -TCCCCCGGG,^ JTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA-3 。3)提取RNA後，再用Takara M-MLV反轉錄試劑盒進行轉錄,具體步驟如下將 9 μ L提取的RNA和I μ L VPl-R引物均勻混合，70°C水浴IOmin後，冰上極冷2min，最後離心數秒。配製反轉錄緩衝液，參照反轉錄試劑盒。反應體系M-MLV Buffer 2μ 、ΚΝΑ/引物變性溶液 6yL、dNTP Mixture (2. 5mM) 2 μ L、RNase Inhibitor O. 25 μ L>RTase M-MLVO. 5 μ L、 加滅菌蒸餾水至20 μ L。42°C溫浴Ih後，70°C水浴15min，最後在冰上2min，得到的cDNA 於-20°C保存備用。4)通過反轉錄-聚合酶鏈式擴增方法，克隆得到DHV-VPl的全長cDNA基因序列； 在聚合酶鏈式反應中，反應程序為95°C預變性5min，然後94°C變性lmin，54°C退火lmin， 72°C延伸lmin，35個循環，72°C延伸IOmin後，10°C終止反應，於I %瓊脂糖凝膠電泳膠回收聚合酶鏈式反應產物，請參閱圖1，為VPl基因擴增後的電泳檢測圖。5)將步驟4)擴增的VPI片段，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收 VPIcDNA片段，具體步驟參照試劑盒說明書。6)將步驟5)回收的VPl全長cDNA片段和pSCAl空載體用BamHI和SmaI進行雙酶切，並利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VPl cDNA和pSCAl空載體片段，具體步驟參照試劑盒說明書。7)將回收的VPIcDNA和pSCAl空載體片段用solution I進行連接，連接體系如
下
權利要求
1.一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，其特徵在於，該疫苗由DHV-VPl基因和甲病毒複製子載體PSCAl組成，所述DHV-VPl基因是DHV病毒的致病決定基因，其為DHV病毒基因中第2106至2819的核苷酸，具有如下所示的核苷酸序列ggtgattccaaccagttgggggatgatgagccagtttgctttctaaattttgagacagct60aatgtcccaatacaaggtgaatctcacactcttgttaaacacctgtttgggaggcaatgg120ttagttaagactgtgcaacacgcttcaactgtgcaagagttggacctccaagttccagac180agaggacatgcctctctcattcagttctttgtctatttttctggagagatcattctcact240attgttaacaatggcactacaccagcaatggtagcacactcctattctatggatgacctc300agttcagagtatgctgttacagcaatgggaggtgtgatgattcctgctaacagtgccaaa360aatatttctgtaccattctactctgtaacaccactcaggccaactcgaccaattcctggc420acatcagaggcaacttttggcagactgttcatgtggactcaatcaggaagtctttcagtt480tttatgggtctcaaaaagccagctctcttctttccactccctgctcccacctccacaata540ctaccacagaaatccaaagatgttattcccacattgaatcagtctggggatgaagtagat600tgtcacttctgcgaaatttgctctaaaatgaagaggaggtggaagccaagagggtacttc660agattttgccttaggctcaaaacactagcatctgaactcaatctggaaattgaa714。
2.一種如權利要求I所述的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構建方法，其特徵在於，包括如下步驟1)DHV病毒總RNA的提取及純化將DHV ZJ08病毒株腿部肌注射兩日齡的小鴨，待小鴨死亡後，取其肝臟製備研磨液，按常規方法提取DHV病毒總RNA ；2)設計特異性引物根據DHV病毒VPl蛋白基因序列分析設計出一對特異性引物，在上遊引物中引入Kozak序列VPl-F :5』 -CGGGATCC BamH IGCCACCATG,GGTGATTCCAACCAGTT-3，,VPl-R :5』 -TCCCCCGGG Sma JTCAATTTCCAGATTGAGTTCAGA-3 ；3)通過反轉錄-聚合酶鏈式擴增方法，克隆得到DHV-VPl的全長cDNA基因序列；4)將步驟3)擴增的VPl片段，利用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒純化回收VPlcDNA 片段；5)將VPl全長cDNA片段重組到甲病毒複製子載體pSCAl真核表達載體中，構建成鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗——抗DHV的pSCAl-VPl DHV疫苗。
3.如權利要求2所述的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構建方法，其特徵在於，步驟3)進一步包括在聚合酶鏈式反應中，反應程序為95°C預變性5min，然後94°C變性lmin，54°C退火 lmin，72°C延伸lmin，35個循環，72°C延伸IOmin後，10°C終止反應，於I %瓊脂糖凝膠電泳膠回收聚合酶鏈式反應產物。
4.一種如權利要求I所述的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在製備預防鴨病毒性肝炎藥物中的應用。
5.一種如權利要求I所述的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在製備治療鴨病毒性肝炎藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及動物病毒學與動物傳染病學的技術領域，特別涉及一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗及其構建方法和應用。本發明的鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，該疫苗由DHV-VP1基因和甲病毒複製子載體pSCA1組成，該DNA疫苗的構建包括如下步驟DHV病毒總RNA的提取及純化，設計特異性引物，通過RT-PCR擴增，克隆得到DHV-VP1的全長cDNA基因序列，最後將純化後的VP1全長cDNA片段重組到甲病毒複製子載體pSCA1真核表達質粒中。與現有技術相比，本發明的疫苗所需的免疫劑量小，安全，高效；可隨細胞凋亡而被機體清除，從而可避免DNA質粒可能整合到宿主細胞染色體或可能造成免疫耐受等隱患，且更長效，穩定，操作便捷。
文檔編號A61P31/14GK102580116SQ20111043378
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者劉光清 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所