在哺乳動物宿主細胞中高水平表達重組抗體的製作方法

2023-12-09 00:40:36 1

專利名稱：：在哺乳動物宿主細胞中高水平表達重組抗體的製作方法在哺乳動物宿主細胞中高水平表達重組抗體本發明涉及以高水平表達重組抗體的哺乳動物宿主細胞，其中所述宿主細胞包含具有基因優化的編碼抗體重鏈和輕鏈的核苷酸序列的雙基因載體，並涉及所述雙基因載體自身和提高哺乳動物宿主細胞中重組抗體產量的方法。抗體，也稱為免疫球蛋白，是特異性識別稱為抗原的外源分子的糖蛋白。當外源抗原侵襲人類或其它動物時，免疫應答被觸發從而由B-淋巴細胞產生抗體。通過這種免疫應答，微生物、病毒和細菌毒素可能被變得無害。已知脊椎動物有5種在免疫系統中有不同功能的免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。它們的基本結構為兩條相同的重鏈多肽和兩條相同的輕鏈多肽。重鏈和輕鏈通過二硫橋和非共價相互作用結合在一起。鏈本身包括可變區和恆定區。重鏈和輕鏈的可變區位於抗體分子的N-末端部分，其胺基酸序列比恆定區更易發生變化。重鏈和輕鏈可變區各含有三段超變序列或互補決定區(CDR)序列，它們一起形成獨特的抗原識別位點。可通過對抗體進行蛋白酶解來工程構建一些功能性抗原結合片段，例如通過木瓜蛋白酶消化、胃蛋白酶消化或其它酶學方法，產生例如Fab、F(ab')2或Fv片段。重組DNA技術的發展導致可以設計出一些新的抗體和抗體片段。例如，這些蛋白質的官能度已被改變從而產生新的並改進的功能。因此有可能減少醫學應用中不需要的免疫學特性。同時，在要求組織穿透和從血液中快速清除的應用中表達較小的重組抗體片段可能優於表達完整抗體。'正在日益開發工程構建的抗體分子以及它們的片段作為疾病治療和診斷的科學和臨床工具。抗體特有的特異性識別並以高親和力結合實際上任何抗原類型的能力使它們成為了有吸引力的新型生物製藥產品和科學研究的起點。也可考慮除研究和藥物之外的更多應用，如被消費者使用。其例子分別為，將抗體用於香波以防止頭屑形成或用於牙膏以防止齲齒及抵抗由齲齒造成的牙齒腐爛。其它可以想到的用途包括，例如，用於生物傳感器、廢水處理、工業規模的分離過程或作為抗體酶，即將人工創造的抗體用作酶。在設計融合蛋白時抗體片段結合能力的用途完全不同。例如，重鏈恆定區基因的3'端與酶基因的5'端融合。例如，如果抗體對腫瘤抗原具有特異性,則可利用該融合物將毒素或毒性酶遞送到腫瘤細胞以選擇性將其殺死。或者可將螯合物(能夠結合放射性同位素)化學偶聯到重組抗腫瘤抗體或抗體片段，這樣也可選擇性殺死腫瘤細胞。在人類藥物中，這些方法有時被成為"魔術彈"。然而，就這些目的而言需要大量抗體。一些表達系統可同原核和真核來源獲得。對表達系統的選擇取決於多種因素，其中包括要表達的分子類型和各抗體的準確序列。最廣泛使用的重組蛋白(包括抗體)表達系統之一是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞哺乳動物表達系統。它是少數幾種能夠簡便且有效地高密度懸浮成批培養動物細胞的細胞類型之一。CHO細胞允許非常高的產物產率且能相對抵抗代謝應激。通過在CHO細胞中表達重組蛋白，有可能獲得與人類細胞相似但不相同的糖基化模式。最近，通過優化培養基組分、生物反應器設計和細胞培養參數，CHO細胞內重組抗體的產量已經大大提高。因此已經做出了巨大改進以實現高密度生長、高特異性生產及延長的培養細胞存活力。此外，通過採用主要為病毒來源的可能最強的啟動子和增強子元件，轉錄水平的產量增加已被大大優化。此外，對載體系統和宿主細胞進行的比較研究顯示，與使用各重鏈載體和輕鏈載體的混合物相比，採用其中同時插入了重鏈和輕鏈基因轉錄單元的串聯載體可導致高得多的抗體產量水平。然而，儘管基因表達技術有所改進，但看來抗體表達水平還可提高達200倍。根據Bentley等，Hybridoma，17(1998)，559-567，各抗體以特有的效率表達，該效率由各種因素的組合決定，其中包括輕鏈合成水平以及重鏈和輕鏈的"相容性"。根據Strutzenberger等，J.Biotechnol.，69(1999)，215-226,輕鍊表達率高有益於提高完整抗體的分泌率。在基於CHO細胞的表達系統中，由於被侶伴蛋白截留，輕鍊表達減少導致輕鏈的胞內濃度降低並使重鏈在內質網內累積。Borth等，J.Biotechnol.，8(1999)，57-66，分析了輕鏈和重鏈mRNA的胞內含量及它們各自的多肽以及具有低、中和高特異性產生率的三種亞克隆的特定分泌率。對於這三種亞克隆而言，發現輕鏈的胞內含量與分泌率相關，而重鏈的胞內含量對所有三種亞克隆是相同的。作者總結到，在內質網內的裝配是抗體產量的主要速度限制因素之一。Smales等，Biotechnol.Bioeng.，88(4)(2004)，474-488,報導說，在GS-NSO細胞系內生產重組單克隆抗體時，胞內輕鏈含量明顯超過胞內重鏈含量。他們的結論是兩者的胞內摩爾比約為10:1。因此，完全有可能在通過抗體產生通路時有相當部分的輕鏈和重鏈未被正確裝配成四聚體免疫球蛋白。首先，單體蛋白質鏈存在裝配問題；即使存在70%游離IgG輕鏈時仍有相當量的單體IgG重鏈可被檢測到。也可能有過量的輕鏈分泌入細胞培養基中與功能性完全裝配的單克隆抗體(mAb)—起存在。這種質量作用化學定律不能簡單地應用於細胞。選擇性提高重鍊表達水平的努力證明不成功。Gass等，TrendsImmunol.25(1)(2004)，17-24，提出，在天然的分泌抗體的B細胞一漿細胞中存在過量輕鏈時方可達到最高mAb效價。可能的解釋也是由於靶向蛋白體而導致的重鏈的無效裝配和/或提前選擇性降解；已知質量控制和降解時限與在糖類部分上添加葡萄糖標記有關。蛋白質結構域的裝配可由親和相互作用、形成二硫鍵以使結構域非常接近和/或需要將暴露的疏水碎片埋沒在各結構域表面所驅動；據信，在裝配和摺疊的最初階段，這種碎片被侶伴蛋白屏蔽。現在熟知的是，分泌性糖蛋白在蛋白質合成後立即在細胞的細胞內部內質網(ER)區室內摺疊並裝配成較高等級的複合物。ER是單獨的區室，其中含有特定的輔助裝配因子並具有質量控制機制(EUgaard等，Qualitycontrolinthesecretorypathway(分泌途徑中的質量控制)，Science.1999-12-3;286:1882-8;Helenius等，IntracellularfunctionsofN-linkedglycans(N-連接的聚糖的胞內功能)，Science.2001-3-23;291:2364-9)。一旦成功裝配，則在通過細胞的分泌途徑時不再發生進一步的裝配，事實上，一些細胞類型如CHO細胞分泌兩種類型的未裝配的鏈，而其它細胞類型如NSO細胞僅選擇性保留IgG重鏈類型的非裝配鏈，且很可能將它們耙向降解途徑。之前的研究將特定重組單克隆抗體產量的變化與由於細胞環境(Lambert和Merten，Biotechnol.Bioeng.,54(2)(1997)，165墨180)或培養時間(Downham等，Biotechnol.Bioeng.，51(6)(1996)，691-696)變化而致細胞分泌途徑蛋白質豐餘度相關聯。因此，ER侶伴蛋白和摺疊酶的過表達已經被用來設計真核細胞分泌重組抗體的速率。例如，WO03/057897披露了一種表達重組蛋白的方法，該方法包括共表達侶伴蛋白和小的熱激蛋白。據說那些其它的蛋白質能促進成功摺疊和裝配，因此提高了正確摺疊的、最具活性的產物蛋白的比例。然而，各侶伴蛋白和摺疊酶的過表達不會增加哺乳動物細胞中單克隆抗體的產量。例如，已知BIP在哺乳動物細胞中過表達會減少其相關蛋白質的分泌(Domer和Kaufman,Biologicals,22(2)(1994)，103-112)，而PDI在CHO細胞中過表達會降低富含二硫鍵的融合蛋白的分泌((Davis等，Biotechnol.Prog.，16(5)(2000)，736-743)。因此，一些輔助因子的共表達可降低蛋白質產物的總表達率，因此要求小心地最佳化這種輔助因子各自的共表達速率。不同產物蛋白在不同程度上取決於僅部分個別重疊侶伴蛋白的功能，迄今已經知道許多這種侶伴蛋白，例如GroEL、GroES、DnaK、DnaJ、GrpE、ClpB、IbpA、Ibp。因此似乎不需要或不可能以一種產物蛋白產生率同時共表達它們中的所有。構成本發明基礎的技術問題是避免現有技術的缺點及提供提高哺乳動物宿主細胞中抗體產量的新的方法和過程，該方法和過程允許以高水平產生具有Fc受體活性並由至少兩條不同多肽鏈構成的標準的完整四聚IgG抗體。本發明解決該技術問題的方法是提供一種哺乳動物表達載體，其至少包含含有編碼第一多肽鏈的第一合成核苷酸序列的第一轉錄單元和含有編碼第二多肽鏈的第二合成核苷酸序列的第二轉錄單元，其中所述第一和第二合成核苷酸序列基於天然產生的核苷酸序列，且所述第一和第二多肽鏈可形成含有所述第一和第二多肽鏈中每一條的至少一個或多個拷貝的分子，其中，所述第一和第二核苷酸序列的密碼子組成都適應於給定的哺乳動物宿主種類基因的密碼子偏倚，該給定的種類不同於最初衍生出天然產生的核苷酸序列的哺乳動物種類。因此，本發明提供了一種哺乳動物表達載體，其具有適應於給定的哺乳動物宿主細胞的密碼子偏倚的核苷酸序列，即基因優化的核苷酸序列。本發明的發明人檢測了本發明的雙基因載體，其包含在哺乳動物CHO細胞表達系統中基因優化的輕鏈和重鏈基因，其中所述輕鏈和重鏈的胺基酸序列未通過基因優化加以改變。奇怪且出乎意料的是，發現使用重鏈和輕鏈基因都被基因優化的載體能將抗體產量的中間水平從37.8pg/ml顯著提高到51.3pg/ml。相反，與未優化的輕鏈一起表達基因優化的重鏈不足以提高抗體表達水平。因此，與含有一種基因優化的基因和一種非優化基因的對照載體或其中重鏈和輕鏈基因都未經基因優化的對照基因相比，通過使用本發明的包含優化基因的重鏈和輕鏈基因的哺乳動物雙基因表達載體能夠顯著提高分泌抗體的總產率。通過具有基因優化的重鏈和輕鏈基因的載體獲得的抗體產量水平的顯著提升歸功於基因優化的重鏈和輕鏈基因。本發明的發明人獲得的其它結果提示，優化完整的編碼基因序列而非僅其某些部分是有益的。例如，如果僅輕鏈和重鏈基因的N-末端被基因優化則抗體的總產量不會增加或僅輕微增加。由本發明的發明人獲得的結果完全不同於現有技術中描述的現象。由現有技術可知，胞內輕鏈含量與抗體的分泌比率相關，這說明與重鏈相比輕鏈必需過量表達以獲得高水平的抗體產量，而如果不是這樣則重鏈將被侶伴蛋白保留而在內質網內累積。相反，本發明人的結果卻暗示，在哺乳動物表達系統中，輕鍊表達和重鍊表達必需平衡以實現高水平產生分泌的抗體。不希望局限於任何特定理論，據信，為實現以高水平產生抗體，僅提高胞內輕鏈含量是不夠的。似乎高的胞內重鏈含量也是必需的。本發明人的其它結果顯示，抗體產量的主要限速因子之一不僅僅是在內質網內裝配，還包括轉錄及對mRNA穩定性的調節。由於發明人使用的基因優化不能改變重鏈和輕鏈的胺基酸序列，因此較高的抗體產量不可能歸功於改變的鏈裝配或改變的ER-相關的錯誤摺疊或未摺疊多肽鏈的降解。利用重鏈和輕鏈基因都經基因優化的本發明的雙基因載體獲得了提高的抗體產量還說明，由於除去了如內部TAT-盒、x-位點、重複序列、隱蔽剪接位點等導致重複基因翻譯效率提高的順式作用序列基序，轉錄效率和mRNA穩定性被優化。因此，本發明解決所述技術問題的方法是提供一種哺乳動物表達載體，其至少包含含有編碼第一多肽鏈的第一合成核苷酸序列的第一轉錄單元和含有編碼第二多肽鏈的第二合成核苷酸序列的第二轉錄單元，其中所述第一和第二合成核苷酸序列基於天然產生的核苷酸序列，且所述第一和第二多肽鏈可形成含有所述第一和第二多肽鏈中每一條的至少一個或多個拷貝的分子，其中，所述第一和第二核苷酸序列的密碼子組成經改進而能以較高效率翻譯它們的mRNA。在本發明文中，"含有所述第一和第二多肽鏈中每一條的至少一個或多個拷貝的分子"是一種多亞基分子，尤其是分泌性多亞基分子。該分子可由兩種不同多肽鏈中每一種的一個或多個拷貝構成。該分子可包含兩種以上不同的多肽鏈。在優選的實施方式中，該分子是分泌性抗體。然而，該分泌的分子也可以是另一種由不同多肽鏈或亞基構成的蛋白。這種多亞基蛋白的例子包括但不限於多亞基酶、受體分子和離子通道。在本發明文中，"哺乳動物表達載體"優選為分離和純化的DNA分子，將其轉染入適當的哺乳動物宿主細胞中可提供該在宿主細胞內高水平表達兩種多肽鏈。本發明的哺乳動物表達載體包含至少兩個單獨的轉錄單元。具有兩個單獨轉錄單元的表達載體也稱為雙基因載體。因此其例子為兩基因載體，其中第一轉錄單元的第一合成核苷酸序列或第一基因編碼抗體的重鏈或其片段，第二轉錄單元的第二合成核苷酸序列編碼抗體輕鏈。另一個例子是雙基因載體，其中兩條合成核苷酸序列編碼蛋白質(如酶)的兩個不同亞基。然而，還可能本發明的表達載體包含兩個以上單獨是轉錄單元，例如三個、四個或者更多單獨的轉錄單元，各轉錄單元包含編碼不同多肽鏈的不同的合成核苷酸序列。因此其例子為具有四個單獨轉錄單元的載體，各轉錄單元含有編碼由四個不同亞基構成的酶的一個亞基的不同的合成核苷酸序列。在本發明文中，術語"基因優化"指一種技術，通過該技術可在天然核苷酸序列如感興趣的基因內引入多個改變，從而產生新的合成的核苷酸序列。在本發明文中，"合成的核苷酸序列"因此指通過基因優化從天然核苷酸序列衍生的核苷酸序列。天然核苷酸序列可以是基因組序列或是從基因組序列得到並缺乏內含子序列的CDNA。基因優化的目的是提高基因的翻譯效率和確保其在靶生物或這種靶生物的組織或細胞內最優表達，從而使所述耙生物不同於最初衍生出其核苷酸序列的生物。根據不同物種中不同簡併轉運RNA的豐度不同，各生物具有其優選使用的密碼子。在給定的生物或物種中具有最高表達水平的蛋白質具有高密碼子偏倚(即傾向於在基因中利用相同胺基酸密碼子的程度)。因此，基因優化包括用耙生物優選使用的同義密碼子替代至少一個天然核苷酸序列中存在的密碼子。與對應於被替代的密碼子的同工-tRNA相比，同義密碼子對應於在靶細胞或生物中具有較高豐度的同工-tRNA。在本發明的一個優選實施方式中，第一和第二核苷酸序列的密碼子組成適應於特定耙哺乳動物宿主細胞基因的密碼子偏倚。最優選的第一和第二核苷酸序列的密碼子組成適應於CHO或NSO細胞基因的密碼子偏倚。在另一實施方式中，第一和第二核苷酸序列的密碼子組成適應於智人(Homosapiens)基因的密碼子偏倚。真核基因表達是一種複雜機制，可在轉錄、轉錄後、翻譯和翻譯後水平對其進行調節。在酵母上進行的實驗顯示，80%的蛋白質組是在指數生長期間表達的，而85%的核糖體參與翻譯，說明mRNA不得不與核糖體競爭。本發明人對產生嵌合抗體的NSO細胞系進行的研究進一步揭示，重組mRNA約佔總mRNA的20n/。。這說明要求核糖體超出細胞來源，因此核糖體短缺可能會阻礙細胞維持和生長。對mRNA穩定性的調節是基因表達調節的一個重要組成部分。個體mRNA的結構特徵會影響翻譯過程。在高級真核生物中，已知例如前導序列的長度、二級結構存在於起始密碼子的上遊或下遊以及多聚(A)尾的長度會影響mRNA的翻譯效率。前導序列內的穩定的二級結構會阻止40S核糖體亞基掃描檢索起始密碼子從而抑制翻譯。已知存在的共有順式作用序列和序列基序參與決定mRNA的穩定性。核酸內元件的協同相互作用也在轉錄後水平上參與限制細胞基因的表達。這種抑制序列(INS)在mRNA內具有活性。此外，一些病毒和細胞mRNA也是調控元件，即前導序列中的內部核糖體進入位點(IRES)元件通過不依賴於加帽的機制發揮作用以促進40S核糖體亞基在內部結合mRNA。根據本發明，基因優化因此還包括提高合成的核苷酸序列轉錄效率及賦予mRNA提高的穩定性和/或提高mRNA翻譯效率的改變。因此，在本發明的一個優選實施方式中，基因優化包括與天然核苷酸序列相比改變一條或兩條合成的核苷酸序列中的GC含量或GC分布。因此，本發明涉及一種哺乳動物表達載體，其中所述兩條合成核苷酸序列的GC含量和/或GC分布不同於其相應的天然核苷酸序列。"不同的"GC含量是指，根據耙哺乳動物宿主細胞，合成的核苷酸序列的GC含量可高於或低於天然產生的核苷酸序列。尤其優選相比其相應的天然核苷酸序列，所述一條或兩條合成的核苷酸序列5'UTR的GC含量被降低。還優選相比其相應的天然核苷酸序列，所述一條或兩條合成的核苷酸序列3'UTR的GC含量被降低。在本發明另一個優選的實施方式中，所述兩條合成的核苷酸序列之一或兩者的AT含量和/或AT分布不同於其相應的天然核苷酸序列。尤其優選相比其相應的天然核苷酸序列，所述一條或兩條合成的核苷酸序列3'UTR的AT含量被降低。在本發明的再一個優選的實施方式中，相比其相應的天然核苷酸序列，所述一條或兩條合成的核苷酸序列3'UTR和/或5'UTR的長度被改變。尤其優選3'UTR的長度增加。還優選5'的UTR的長度被調至約60bp。在另一個優選實施方式中，與其相應的天然核苷酸序列相比，所述兩條合成的核苷酸序列之一或兩者含有較少順式作用序列基序。"較少順式作用序列基序"是指，與合成的核苷酸序列相比，天然產生的核苷酸序列含有的順式作用序列基序至少多1個。優選地，所述合成的核苷酸序列含有天然產生的核苷酸序列中存在的所有順式作用序列基序的95%以下、90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、或者升至10%以下。最優選的，所述合成的核苷酸序列根本不含順式作用序列基序。優選基因優化尤其包括改變5'UTR和3'UTR中存在的順式作用序列基序。根據本發明，"順式作用序列基序"或"順式作用序列元件"包括但不限於內部TATA盒，x-位點，核糖體進入位點如IRES位點、富含AT或富含GC的序列串，ARE、INS或CRS序列元件，可影響RNA穩定性的重複序列，隱蔽剪接供體和受體位點等。因此，與天然產生的核苷酸序列相比，所述兩條合成的核苷酸序列優選含有較少的內部TATA盒、x-位點和/或核糖體進入位點。與天然產生的核苷酸序列相比，這兩條合成的核苷酸序列也可含有較少ARE、INS和/或CRS序列元件。此外，與天然產生的核苷酸序列相比，這兩條合成的核苷酸序列可含有較少重複序列，因此，與天然產生的核苷酸序列相比，它們的RNA將形成較少二級結構。同時，與天然產生的核苷酸序列相比，這兩條合成的核苷酸序列可含有較少隱蔽剪接供體和受體位點。在本發明的一個實施方式中，基因優化僅包括改變順式作用序列基序的特定類型，如改變和/或刪除天然產生的核苷酸序列中存在的ARE元件。在另一實施方式中，基因優化包括改變和/或刪除兩種或更多類型的天然產生的核苷酸序列中存在的順式作用序列基序，例如，刪除TATA盒、ARE序列元件和隱蔽剪接供體和受體位點。再在另一個實施方式中，基因優化包括改變和/或刪除所有可能類型的順式作用序列基序。第一和第二合成核苷酸序列的基因優化可包括改變和/或刪除不同的順式作用序列基序。在另一個優選實施方式中，基因優化包括能除去另路起始位點如uCDS和uAUG的改變。因此，本發明還涉及一種哺乳動物表達載體，其中所述兩條合成的核苷酸序列之一或兩者相比其相應的天然核苷酸序列含有較少另路起始位點。在本發明的一個實施方式中，編碼多肽鏈的完整核苷酸序列是基因優化的。在進一步的實施方式中，僅核苷酸序列的某些區域是基因優化的。這種實施方式的一個例子是基因優化核苷酸序列的N-末端。根據本發明，第一和第二合成核苷酸序列當然可能是不同基因優化的結果。例如，可能兩條合成的核苷酸序列之一的整個序列被基因優化，而另一條合成的序列僅部分序列被基因優化。然而也可能合成的核苷酸序列中的不同特徵被改變。例如，在一條合成的核苷酸序列中僅GC含量被改變，而在另一條合成的核苷酸序列僅某些順式作用元件被除去。在特別優選的本發明的實施方式中，基因優化不改變胺基酸序列，即與由天然產生的核苷酸序列編碼的相應多肽鏈相比，由合成的核苷酸序列編碼的第一和第二多肽鏈具有相同的胺基酸序列。然而，根據本發明，基因優化當然可能導致由合成的核苷酸序列編碼的一條或兩條多肽鏈的胺基酸序列改變；即與由天然產生的核苷酸序列編碼的相應多肽鏈相比，由第一合成核苷酸序列編碼的第一多肽或由第二合成核苷酸序列編碼的的第二多肽或者這兩者具有不同的胺基酸序列。一個優選的例子是，與由天然產生的核苷酸序列編碼的相應多肽鏈相比，多肽鏈具有較少的糖基化位點或改變的糖基化位點。一個優選的本發明的實施方式涉及一種哺乳動物表達載體，其中第一合成核苷酸序列編碼抗體的輕鏈或其片段，第二合成核苷酸序列編碼抗體的重鏈或其片段。優選地，第一和第二多肽鍊表達後可形成抗體或免疫球蛋白或其片段。在另一個優選實施方式中，第一和/或第二合成核苷酸序列與效應蛋白的基因融合。此時，第一和第二多肽鏈在表達後可形成融合蛋白，其中的效應蛋白與抗體或免疫球蛋白或其片段偶聯。本發明所述的免疫球蛋白可具有Fc-受體活性或補體活化活性或同時具有這兩種活性。由於本領域已經將補體活化明確定義為誘導補體級聯(可能通過不同途徑)，因此Fc-受體活性在本發明文中可被理解為激活細胞Fc受體，細胞Fc受體可引發細胞反應，例如在天然產生的IgG或IgA引發的吞細胞活性或細胞毒活性的情況下或者例如在天然IgE類免疫球蛋白引發細胞受體而釋放肥大細胞顆粒的情況下。類似的，在天然抗體中，IgM和IgG類抗體都可引發補體活化。不言而喻，任何此類效應活性在天然產生的抗體亞類和它們已知的同種異型中是可變的，並因此在本發明的抗體中是可變的。然而，在本發明文中，可通過功能域交換工程改造Fc-受體活化或補體活化效應器結構域，成為任何給定的免疫球蛋白結構，從而在這樣產生的免疫球蛋白中有效轉移或加入各自的效應器性能。免疫球蛋白除了能特異性結合給定的抗原，它可以是天然產生的免疫球蛋白，或者可以是構建的、人工類型的免疫球蛋白。這包括種-嵌合抗體或CDR接枝抗體、通過基因改組或定點工程產生的抗體、用PEG或放射性同位素螯合部分化學修飾的抗體、或是具有上述活性的免疫球蛋白與任何其它蛋白質部分如另一種酶活性結構域結合形成的融合蛋白。由給定的免疫球蛋白提供的每種活性的程度是可變的。免疫球蛋白重鏈的恆定部分區域可產生兩種類型的效應功能；例如，不同的人IgG亞類改變其相對效率以活化或放大補體級聯步驟。通常，人IgGl和IgG3最有效地固定補體，IgG2的功效較差，而lgG4不活化補體。檢測上述活性之一的測定模式是免疫學家及其它人所熟知的；合適的方法可在以下標準免疫化學實驗室手冊中找到，如Harlow等的《抗體實驗室手冊》(Antibodies-alaboratorymanual),ColdSpringHarborLaboratoryPress1988。例如，在天然產生的免疫球蛋白中，輕鏈具有單個恆定區結構域，而重鏈具有若干恆定區結構域。一所有的人亞類IgGl、IgG2、IgG3和IgG4通過恆定鏈部分介導細胞毒效應功能(ADCC:抗體介導的細胞毒性)，這種功能是由抗體與殺傷細胞/細胞毒T-淋巴細胞相互作用帶來的；由於通常認為IgG4不能介導這種效應，因此非常值得注意。然而，已經發現人IgG4本身也能夠介導ADCC，儘管其程度受到試驗(如"Cr-釋放試驗)中所採用的效應細胞來源的強烈調節或取決於所採用的效應細胞，這至少是由於人類獨特的天然多態性所致。這種現象已由GreenwoodJ，ClarkM，WaldmannH.在《參與人IgG抗體效應功能的結構基序》(StructuralmotifsinvolvedinhumanIgGantibodyeffectorfunctions)EurJImmunol1993;5:1098-1104中展示。天然產生的抗體或免疫球蛋白類型IgG和IgA天然具有3個恆定區結構域，稱為CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE類型具有4個恆定區結構域。相反，例如WO02/056910描述了不含CH1結構域的用於人類治療的人工抗體；這種抗體也包含在本發明所述的免疫球蛋白當中。優選地，免疫球蛋白或Ig分子包含至少一個絞鏈結構域、CH2和CH3結構域或其功能變體。那些結構域形成例如天然IgG中必需的Fc部分。關於免疫球蛋白這些結構元件的詳細描述和定義可見Amzel等，Three-dimensionalstructureofimmunoglobulins(免疫球蛋白的三維結構)，Ann.Rev.Biochem.48，961-997(1979);Davies等，Structuralbasisofantibodyfonction(抗體功能的結構基礎)，Ann.Rev.Immunol.1，87-117(1983);Hunkapiller等，Diversityofimmunoglobulinsgenesuperfamily(免疫球蛋白基因超家族的多樣性)，Adv.Immunol.44，1-63(1989)。所述結構域可以是天然產生的結構域、人為產生的這種結構域的嵌合形式或是這種結構域的嵌合裝配體或是例如通過定點誘變構建的形式。過去通常使用嵌合的、CDR接枝的小鼠人嵌合抗體；同樣，可變區結構域或CH1/CL結構域部分中的潛在糖基化位點通常通過定點誘變被除去。當然，除了互補決定區所固有的天然可變性，本發明所述免疫球蛋白任何部分的構建程度通常會受到需要的限制以避免在工程抗體中形成過於強的免疫原性基序。除此之外，絞鏈部分上遊的抗原結合部分通常形成例如IgG類型抗體的Fv部分(包含VH和VL結構域)，本發明的唯一要求是，這種部分由兩個不同的多肽鏈(分泌時)構成並具有一些抗原結合特性。本發明所述的免疫球蛋白可能通過以'珠串'方式排列在抗原結合Fv部分中的多個可變區而具有升高的抗原結合價。在一個特別優選的本發明的實施方式中，第一合成核苷酸序列編碼包含SEQIDNo.3所示序列的抗體輕鏈，而第二合成核苷酸序列編碼包含SEQIDNo.1所示序列的抗體重鏈。由SEQIDNo.3編碼的輕鏈的胺基酸序列示於SEQIDNo.4。由SEQIDNo.1編碼的重鏈的胺基酸序列示於SEQIDNo.2。除了編碼多肽鏈的合成的核苷酸序列，所示哺乳動物表達載體還包含從編碼序列有效轉錄mRNA以及將mRNA有效翻譯入宿主細胞系所必需的的調控DNA序列。當該調控序列操作性連接於合成的核苷酸序列時，它們將在哺乳動物細胞環境內介導這種核苷酸序列轉錄的啟動並促進從相應的mRNA有效合成蛋白質。在本發明的一個優選實施方式中，在兩個轉錄單元的每一個中，編碼兩條不同多肽鏈的合成的核苷酸序列受相同調控單元的控制。優選地，本發明的哺乳動物表達載體還含有至少一個在動物細胞中可選擇的表達標記。因此，在優選的實施方式中，本發明的哺乳動物表達載體包含編碼可選標記的第三轉錄單元。可採用任何通常使用的選擇標記，如胸苷激酶(tk)、二氫葉酸還原酶(DHFR)或穀氨醯胺合成酶(GS)。在優選的實施方式中，釆用可表達的GS選擇標記(Bebbington等，1992，High-levelexpressionofarecombinantantibodyfrommyelomacellsusingaglutaminesynthetasegeneasanamplifiableselectablemarker(採用穀氨醯胺合成酶基因作為可擴增的可選標記從骨髓瘤細胞高水平表達重組抗體)，Bio/Technology10:169-175;Cockett等，1990，HighlevelexpressionoftissueinhibitorofmetalloproteinasesinChineseHamsterOvary(CHO)細胞susingglutaminesynthetasegeneamplification(採用穀氨醯胺合成酶基因擴增在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中高水平表達組織金屬蛋白酶抑制劑)，Bio/Technology8:662-667)。GS系統是僅有的兩種對於產生治療性蛋白質特別重要的系統之一。與二氫葉酸還原酶(DHFR)系統相比，GS系統在發育期間提供長時期優勢，這是由於從最初的轉染子通常可產生高生產性細胞系從而在存在升高濃度的選擇劑時不需要多輪選擇便可實現基因擴增(Brown等，1992，Processdevelopmentfortheproductionofrecombinantantibodyusingtheglutaminesynthetase(GS)system(採用穀氨醯胺合成酶(GS)系統生產重組抗體的工藝過程開發)，Cytotechnology9:231-236)。尤其當僅用於瞬時/游離表達時，本發明的表達載體還可含有複製起點，如EB病毒(EBV)或SV40病毒起點以便在真核宿主細胞中維持自發複製/游離型複製，但也可缺乏可選標記。本發明的表達載體可以是，例如但不限於，線性DNA片段、包含核靶向序列的DNA片段或者可以是經特殊優化以便與轉染劑相互作用的DNA片段，可在細菌中穿梭和生產的動物病毒或合適的質粒。本發明還通過以下方法解決了該技術問題提供一種含有本發明所述哺乳動物表達載體的宿主細胞。因此，本發明的再一方面涉及一種優選含有本發明所述哺乳動物表達載體的脊椎動物宿主細胞。在本發明的一個實施方式中，本發明所述的宿主細胞可以是任何脊椎動物脊椎動物宿主細胞系，與原代細胞系不同，該細胞系可在細胞培養物中穩定增殖。可能的細胞系是，例如，COS細胞、NSO細胞、CHO細胞、HT1080細胞、PER-C6細胞、BHK細胞、Sf-9細胞、293或293-EBNA細胞。在本發明的一個優選實施方式中，本發明所述的脊椎動物宿主細胞是哺乳動物細胞，最優選人類細胞，例如HT1080細胞、293、293-EBNA或HBK-11細胞(ATCC-CRL12569;也可見US6，136,599)。更優選地，本發明所述的人類細胞選自HT1080細胞或Per-C6細胞(CrucellB.V.，Netherlands;WO97/00326,也可見EP-1161548)。最優選地，所述細胞是HT1080細胞。例如，HT1080細胞可從美國模式培養物保藏所(Manassas八A，U.S.A.)獲得，其ATCC編號為CCL-121。已發現當與穀氨醯胺合成酶選擇標記系統組合使用時HT1080細胞能夠提高產物的糖基化(WO03/064630)。在特別優選的實施方式中，所述哺乳動物宿主細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或細胞系(Puck等，1958，J.Exp.Med.108:945-955)，尤其是適應於在無血清懸浮培養基(即除了攜帶微載體的培養基)中生長的CH0-K1細胞(ATCCCCL-61)、CHOpro3-、CHODG44、CHOP12、dhfr-CHO細胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS77，1980，4216-4220)，DUXB11(Simonsen等，PNAS80，1983，2495-2499)或CHO細胞。再在本發明的另一個實施方式中，所述宿主細胞是淋巴細胞，更優選哺乳動物淋巴細胞，其中包括例如雜交瘤、骨髓瘤和三重雜交瘤(trioma)細胞系。例子包括例如非分泌型雜交瘤如SP2/0和非分泌型骨髓瘤細胞如來自小鼠的NSO細胞系ECACCNo.85110503(歐洲細胞培養物保藏中心(Eur叩eanCollectionofCellcultures),應用微生物學中心(CentreforAppliedmicrobiology),索爾茲伯裡/威爾特郡SP40JG，英國)或來自大鼠的YB2/3.0Ag20(描述於GB2070313)。骨髓瘤細胞如NSO細胞實際為B-淋巴細胞類型，叫做漿細胞瘤細胞系，但在本領域通常也叫做'骨髓瘤'(Barnes等，Cytotechnology32:109-123，2000)。其它優選的哺乳動物宿主細胞的例子包括但不限於MRC5人成纖維細胞、983M人黑色素瘤細胞、MDCK狗腎細胞、分離自Sprague-Dawley大鼠的RF培養的大鼠肺纖維母細胞、B16BL6鼠黑色素瘤細胞、P815鼠肥大細胞瘤細胞和MT1A2鼠乳腺腺癌細胞。為了將表達載體引入本發明的哺乳動物宿主細胞中，如果對給定的宿主細胞類型合適，可採用任何轉染技術，例如本領域熟知的技術，如電穿孔、磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡萄糖轉染、脂轉染。應該注意，可用本發明載體轉染的哺乳動物宿主細胞應是可瞬時或穩定轉染的細胞系。因此，本發明的哺乳動物表達載體可維持於游離體形式或可穩定地整合進哺乳動物宿主細胞的基因組中。瞬時轉染的特徵是對含有選擇標記的載體不施加任何選擇壓力。來源於瞬時轉染的細胞群或一批細胞包括插入了外來DNA並表達的細胞和沒有插入外來DNA的細胞的混合細胞群。在轉染後通常持續20-50小時的瞬時表達實驗中，轉染的載體維持為游離型元件尚未整合入基因組中。即轉染的DNA經常沒有整合入宿主細胞基因組中。宿主細胞傾向於丟失轉染的DNA培養瞬時轉染細胞群時細胞群中的轉染細胞過度生長。因此在緊接轉染後的時間內表達最強而隨時間推移減弱。優選理解本發明的瞬時轉染子是能在轉染後在沒有選擇壓力的細胞培養中維持表達90個小時的細胞。在本發明的一個優選實施方式中，用本發明的哺乳動物表達載體穩定轉染哺乳動物宿主細胞，如CHO宿主細胞。穩定轉染指新引入的外來DNA(例如載體DNA)，通常通過隨機非同源重組而摻入基因組DNA中。可通過選擇擴增地載體序列已整合入宿主細胞DNA中的細胞系來提高載體DNA的拷貝數和伴隨的基因產物數量。因此，這種穩定整合有可能在接觸基因擴增進一步選擇壓力時在CHO細胞中加倍產生微小染色體。而且，就載體序列而言，穩定轉染會導致丟失與重組基因產物表達不直接相關的載體序列部分，如細菌拷貝數目控制區在基因組整合時可產生過剩。因此，轉染的宿主細胞基因組中已整合了至少一部分或不同部分的表達載體。本發明解決上述技術問題的方法還包括提供一種提高分泌的分子產量水平的方法，所述分子包含第一和第二多肽鏈各自的多個拷貝，該方法包括以下步驟a)用編碼至少第一和第二多肽鏈的本發明的表達載體轉染哺乳動物宿主細胞，b)在適當條件下培養該宿主細胞以使細胞增殖和表達並在細胞內將兩條多肽鏈裝配成含有第一和第二多肽鏈各自的多個拷貝的分子並分泌形成的分子，和C)收穫形成的分子。這種提高分泌的分子、尤其是分泌的抗體產量水平的方法基於使用本發明的哺乳動物雙基因表達載體，該表達載體包含兩種不同的編碼不同多肽鏈即抗體的重鏈和輕鏈的基因優化的基因，其在表達後形成所需分子。與僅含有一種基因優化的基因的對照載體或兩種基因均未經基因優化的對照載體相比，通過使用本發明的載體有可能顯著提高分泌分子的總產率。因此，本發明的方法可有利的導致分泌分子的產量水平有相當程度的提高。優選地，在本發明的方法中，兩條不同多肽鏈以幾乎l:l的比例表達。如果所需分子是由重鏈和輕鏈的多個拷貝構成的抗體這將特別有利。然而，也可能將兩條多肽鏈的表達調節成其它比例。這可通過對編碼多肽鏈的兩條不同的合成的核苷酸序列採用不同的基因優化策略或通過將兩條合成的核苷酸序列一不同啟動子操作性相連來實現。本發明的方法可用來提高任何有至少兩條不同多肽鏈構成的分泌分子的產率。優選地，所分泌的分子是分泌性抗體。然而，所分泌的分子也可以是任何由不同多肽鏈或亞基構成的蛋白質。這種多亞基蛋白的例子包括但不限於含有若干不同亞基的酶、受體分子和離子通道。哺乳動物細胞系的合適培養基和培養方法是本領域熟知的，例如可見US5,633,162中的描述。用於實驗室燒瓶培養或低密度細胞培養可滿足特定類型細胞需要的標準細胞培養基的例子包括但不限於RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)1640培養對Morre，G，ThejournaloftheAmericanMedicalAssociation,199，第519頁起，1967)、L-15培養基(Leibovitz，A等，Amer.J.ofHygiene,78，1第173頁起，1963)、Dulbecco改進的Eagle培養基、Eagle極限必需培養基(MEM)、HamF12培養基(Ham，R等，Proc.Natl.Acad.Sc.53，第288頁起，1965)或缺少白蛋白、運鐵蛋白和卵磷脂的Iscoves改進的DMEM(Iscoves等，J.Exp.med.1，第923頁起，1978)。例如，HamF10或F12培養基是專門為CHO細胞培養設計的。特別適合於CHO細胞培養的其它培養基見EP-481791中所述。已知此類培養基中可增添胎牛血清(FBS，也稱為胎小牛血清FCS)，後者提供了天然來源的豐富激素和生長因子。目前哺乳動物細胞的培養是常規操作，在科學教科書和手冊中有全面的描述，細節可參見R.IanFresney，CultureofAnimalcells(動物細胞的培養)，手冊，第4版，Wiley-Liss/N.Y.，2000。在本發明的一個優選實施方式中，所採用的細胞培養基不含胎小牛血清(FCS或FBS)，因此稱為"無血清"。為了獲得最佳的生長，無血清培養基中的細胞通常需要在無血清培養基中含有胰島素和運鐵蛋白。運鐵蛋白可以至少部分可用非肽螯合劑或鐵運載體如環庚三烯酚酮(如WO94/02592所述)或遞增水平的易於與抗氧化劑如維生素C結合的有機鐵源取代。大多數細胞系需要一種或多種合成的生長因子(包括重組多肽)，包括例如表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子I和II(IGFI、IDFII)等。可能是必需的其它類型因子包括前列腺素、運輸和結合蛋白(如血漿銅藍蛋白、高和低密度載脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA))、激素(包括類固醇激素)和脂肪酸。最好在發現具有生長刺激作用的物質存在下以檢測新多肽因子的逐步方式進行多肽因子的檢測。那些生長因子是合成或重組的生長因子。動物細胞培養的檢測有許多方法，以下描述了其中一個例子。最初步驟是獲得細胞存活條件和/或從添加血清的培養基轉移出後緩慢生長3-6天。在大多數細胞類型中，這是接種細胞密度函數的至少一部分。一旦找到最優的激素/生長因子/多肽添加物，存活所需的接種細胞密度將減小。在另一優選實施方式中，所述細胞培養基不含蛋白質，即不含胎牛血清和各蛋白質生長因子添加物或其它蛋白質如重組運鐵蛋白。在另一實施方式中，本發明的方法包括例如在工業化補料分批生物反應器中高密度培養動物宿主細胞。然後進行常規的下遊加工。接著，釆用高密度生長培養基。這種高密度生長培養基要添加營養物(如所有胺基酸)、上述範圍內的能源(如葡萄糖)、無機鹽、維生素、微量元素(定義為通常以微摩爾終密度存在的無機化合物)、緩衝液、四種核苷或其對應核苷酸、抗氧化劑(如穀胱甘肽(還原))、維生素C和其它組分，如重要的膜脂(如膽固醇或卵磷脂)或脂質前體(如膽鹼或肌醇)。高密度培養基富含大多數或所有這些化合物，如GB2251249與RPMI1640比較得到的那樣，除了基於調節培養基等滲摩爾滲透壓的無機鹽以外，可含有比比以上提到的標準培養基更高含量(強化)的這些化合物。優選強化本發明的高密度培養基加入所有的胺基酸(除色氨酸外)超過75毫克/升培養基。高密度培養基一般的胺基酸需求優選穀氨醯胺和/或天冬醯胺超過l克/升，更優選地2克/升高密度培養基。本
發明內容中，高密度細胞培養定義為在恆定的或不斷增加的培養基體積中，從一個細胞開始連續培養或以較低的活細胞密度接種細胞培養基並連續培養動物細胞群使活細胞的瞬時密度至少或超過105細胞/毫升，優選地至少或超過106細胞/毫升。本發明方法的另一優選實施方式包括補料分批培養。補料分批培養是一種培養體系，在如GB2251249所述的細胞培養基中，除另外進料控制葡萄糖濃度外至少補料加入穀氨醯胺，和任選的一種或多種其它胺基酸(優選甘氨酸)，以維持它們在培養基中的濃度。更優選在如EP229809-A所述在細胞培養基中補加穀氨醯胺和任選的一種或多種其它胺基酸以及一種或多種能源如葡萄糖。補料通常在培養開始後25-60小時時開始；例如，當細胞密度達到大約106細胞/毫升時開始補料。本領域熟知培養動物細胞的穀氨醯胺代謝(McKeehan等，1984，動物細胞中的穀氨醯胺代謝(Glutaminolysisinanimalcells),CarbohydrateMetabolisminCulturedCells(i咅養細胞的碳水化合物代謝)，M.J.Morgan,PlenumPress出版，紐約，第U-150頁)可變為生長階段重要的能量來源。穀氨醯胺和/或天冬氨酸進料總量(以天冬氨酸取代穀氨醯胺，參見Kurano，N.等，1990，J.Biotechnology15，113-128)範圍通常為0.5-10克/升，優選1-2克/升培養基體積；其它可用作進料的胺基酸為10-300毫克總進料/升培養基體積，具體說，甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸進料量常比其它胺基酸高至少為150-200毫克。加入補料可以是噴射加入或用泵連續加入補料，優選將所述補料用泵連續加入生物反應器。不言而喻，在生物反應器分批補料培養過程中應通過添加鹼或緩衝液來小心控制pH使其在給定細胞系最佳生理pH左右。當用葡萄糖作為能源時，葡萄糖進料總量通常為1-10克，優選3-6克/升培養基。除加入胺基酸外，進料優選加入範圍5-20毫克/升培養基的低含量膽鹼。更優選如US6,048,728所述，膽鹼補料必需與乙醇胺一起添加，特別是與穀氨醯胺一起補料。不言而喻，由於過量穀氨醯胺的累積加上內源產生穀氨醯胺會導致氨的產生伴發毒性，與非GS標記系統相比，採用用GS標記系統需要的穀氨醯胺應較少。對於GS系統，培養基或補料中的穀氨醯胺大部分可用其等效物和/或前體替代，即用天冬氨酸和/或穀氨酸鹽替代。收穫方法，即從細胞、細胞培養物或細胞培養基中分離和/或純化給定蛋白質的方法是為本領域熟知的。例如，可通過用鹽或有機溶劑進行分級沉澱、離子交換層析、凝膠層析、HPLC、親和層析等，分離和/或純化生物材料中的蛋白質。在優選的實施方式中，所述哺乳動物宿主細胞是CHO細胞。圖中圖l:含有重鏈基因組序列的載體pcB72.3的圖。圖2:含有重鏈cDNA的載體pcB72.3HCcDNA的圖。圖3:含有在hCMV-M正啟動子控制之下編碼重鏈的基因優化基因的載體pcB72.3GeneartHC的圖，以及含有編碼重鏈的基因優化基因和編碼輕鏈的基因優化基因的載體pcB72.3GeneartHC/LC的圖，其中各基因處於hCMV-MIE啟動子控制之下。圖4:抗體在轉染的CH0-K1SV細胞中的相對表達水平。比較了含有編碼重鏈的基因組DNA的載體pcB72.3和含有編碼重鏈的cDNA的載體pcB72.3HCcDNA。圖5:抗體在轉染的CH0-K1SV細胞中的相對表達水平。比較了含有編碼重鏈的cDNA的載體pcB72.3HCcDNA、含有編碼重鏈的基因優化基因的載體pcB72.3HC和含有編碼重鏈的基因優化基因及編碼輕鏈的基因優化基因的載體pcB72.3HC/LC。圖6:該圖顯示了基因優化的恆定區對轉染的CH0-K1SV細胞中抗體產量的影響。載體pConGlGA含有具有優化恆定區和非優化可變區的IgGl基因序列。載體pConG2GA含有具有優化恆定區和非優化可變區的IgG2基因序列。載體pConG4GA含有具有優化恆定區和非優化可變區的IgG4基因序列。載體GlcDNA含有非優化的IgGl基因序列，載體G2cDNA含有非優化的IgG2基因序列，載體pcB72.3HCcDNA含有非優化的IgG4序列。具有基因優化的恆定區和基因優化可變區的載體pcB72.3GAHC/LC被用作對照。pcB72.3(7)和pConG4GA(8)的數據獲得單獨的實驗，這就解釋了在pcB72.3(l)和pcB72.3(7)之間觀察到的對照值的差異。序列表中SEQIDNo.l顯示了編碼優化cB72.3重鏈的核酸序列。SEQIDNo.2顯示了由SEQIDNo.1的核酸序列編碼的優化eB72.3重鏈的胺基酸序列。SEQIDNo.3顯示了編碼優化cB72.3輕鏈的核酸序列。SEQIDNo.4顯示了由SEQIDNo.3的核酸序列編碼的優化cB72.3輕鏈的胺基酸序列。應理解本發明說明書對給出的優選實施方式進行的解釋和參考內容同樣適合本發明的所有其它優選實施方式。本發明通過以下實施例作更詳細說明。實施例材料和方法採用的細胞CHO細胞系CH0K1SV是細胞系CHO-K1的變體，已適應懸浮生長和無蛋白培養基。CH0K1SV細胞的增殖CH0K1SV細胞通常在裝有添加了6mML-穀氨醯胺的CD-CHO培養基(Invitrogen)的搖瓶中懸浮增殖。接種密度為2X105細胞/毫升，每4天細胞分裂一次。瓶中充入5%(:02氣體，36.5。C(在35.5。C-37.0。C之間)軌道式搖床140rpm培養。瞬時轉染用懸浮生長的細胞進行瞬時轉染。對細胞計數並以每孔2.5X10"舌細胞將細胞分布到24孔板的孔中，孔中含有添加了10%血清和6mML-穀氨醯胺的DMEM-基培養基，於36.5"培育過夜。第二天用1mL新鮮的培養基(如上所述)替換用過的培養基並在37'C培育細胞3小時。每次轉染時將5嗎各SGV(HC和LC-SGV的混合物)或5嗎DGV重懸於100轉染培養基(OptiMEM，Invitrogen)。陽性對照的細胞也用載體pcB72.3轉染，該載體編碼作為模型抗體的IgG4/K抗體的重鏈和輕鏈基因。還使用了陰性對照(僅水)。每次轉染時用100^L轉染培養基稀釋5^L脂轉染胺-2000試齊U(Invitrogen)，混合併室溫靜置5分鐘。將DNA與稀釋的脂轉染胺試劑合併、混合併再於室溫靜置20分鐘。然後將這200nL混合物加入含有細胞的24孔板的孔中，並在37。C培育細胞4或10天。收集培養物上清液並通過離心澄清，然後通過裝配ELISA(assemblyELISA)檢測抗體的存在情況。穩定轉染如前所述，用於轉染的細胞以細胞懸浮液培養。離心培養的細胞後用無血清培養基洗滌一次，然後重懸浮濃度為1.43Xl(^細胞/毫升。將0.7ml體積的細胞懸液和40嗎質粒DNA加入電穿孔小杯中。然後將小杯放入電穿孔裝置中施加250V和400^iF的單脈衝。轉染後，用添加有10。/。dFCS的非選擇性DMEM基礎培養基將細胞以約2500個宿主細胞/孔(5X10Vml)分配入％孔板。在含有10%C02的空氣中於36.5。C(在35.5t:-37.(TC之間)培養該平板。轉染後當天，每？L(150微升/孔)中加入添加有10%dFCS的DMEM基礎培養基/66nML-甲硫氨酸磺醯亞胺(L-methioninesulphoximine)，至L-甲硫氨酸磺醯亞胺最終濃度達到50nM。監測96孔板確定未轉染細胞死亡和轉染細胞集落出現的時間。轉染細胞集落大約在轉染後3到4周變得明顯。檢査所有的細胞系，進一步增殖單個集落孔中的細胞。評估靜態培養細胞系的產率培養96孔轉染平板約3周後形成細胞集落。顯微鏡檢得到的集落以驗證具有進行試驗的合適大小(覆蓋孔底面積60%以上)的和每孔只有一個的集落。將合適的集落轉移到含有lmL選擇性培養基(DMEM基礎培養基/10%dFCS/25pML-甲硫氨酸磺醯亞胺)的24孔板的孔中。在含有10。/。C02的空氣中36.5。C(在35.5。C-37.(TC之間)培養這些細胞14天。收集各孔上清液用蛋白AHLPC方法分析存在的抗體濃度。裝配ELISA:用夾心ELISA(測量裝配的人IgG)測定樣品的抗體濃度。其包括將樣品和標準品捕獲到包被有抗人Fc抗體的96孔板上。用連接辣根過氧化物酶的抗人輕鏈抗體和產色的酶底物TMB顯示結合的抗體。與標準品比較，顯色程度與樣品中存在的抗體濃度成比例。蛋白AHPLC:在Agilent1100HPLC上進行蛋白A親層析法測定IgG。IgG產物選擇性地結合於Poros蛋白A免疫檢測柱。從柱子上洗去不結合的物質，留下的結合抗體通過降低溶劑pH釋放。檢測洗脫液280nm吸光度值，用通用的抗體標準品(用Chemstation軟體)並對消光係數的差異進行修正來定量產物。載體構建a)重鏈cDNA採用脂轉染胺-2000(Invitrogen)按照製造商的說明將pcB72.3表達載體(示於圖1)瞬時轉染入CHOK1SV細胞以得到pcB72.3的HCcDNA。第二天提取轉染細胞的總RNA作為cDNA合成的模板。採用特異性引物擴增cDNA在的cB72.3HC序列。由於該序列衍生自mRNA因此缺乏內含子序列。然後將該序列克隆入載體pEE6.4，並與載體pConK+VL組合產生pcB72.3HCcDNA載體(示於圖2)。b)經基因優化的基因對編碼HCcB72.3和LCcB72.3的cDNA序列進行基因優化。對序列進行優化以除去所有潛在的副作用序列並優化密碼子利用。然後採用基因裝配法合成最佳序列。裝配後，然後將分別描述於SEQIDNo.1禾B3的HC和LC編碼序列通過州"cHI1和￡coRI位點克隆入載體pEE6.4(用於HC)和載體pEE12.4(用於LC)。然後通過克隆I和feI限制性酶位點將HC和LC表達盒合併以產生DGV。如此產生的載體pcB72.3GeneartHC和pcB72.3GeneartHC/LC示於圖3。c)製備DNA進行轉染對於cDNA和Geneart載體，用QiagenMaxipr印試劑盒產生一批DNA。對於所有轉染，用i^wI消化以將載體DNA線性化。取樣品跑瓊脂糖凝膠以便檢測消化的質粒從而證實是否完全線性化。用苯酚:氯仿萃取純化DNA並等分成每份40嗎。加入0.1體積的3M乙酸鈉(pH5.2)和2體積份冰冷的100%乙醇以沉澱每份中的DNA，並儲存於-20i5。C直至使用。培養物的轉染、選擇和過度生長採用標準電穿孔法用載體構建物轉染CH0K1SV細胞。將細胞接種到96孔板上。第二天加入50選擇培養基。轉染4周後篩選平板中產生的集落。每次轉染時將約100個合適大小的集落轉移到24孔板內含25pMMSX的培養基中。使細胞過度生長2周，之後收集各孔內的細胞培養培養基並通過蛋白AHPLC評價存在的cB72.3抗體的水平。結果和討論基因組和cDNA重鏈序列的對比評估了穩定轉染中從pcB72.3HC編碼序列中除去內含子的作用。使每個轉染子組的104個集落在24孔板內過度生長並確定所得各細胞系的抗體濃度。結果總結於圖4和表1。從數據可見，pcB72.3HC編碼序列中存在內含子對產生的抗體的水平沒有影響。證明啟動子序列中的內含子是使基因表達最大化所必需的，因此可能該內含子單獨促進了有效的基因表達。這是通過兩種可能的機制實現的。其一是當存在內含子時啟動子本身更加有效，或者是該啟動子衍生的內含子剪切後產生的mRNA更加穩定。由該數據可見，對內含子如那些存在於HC編碼序列中的內含子進行額外剪切不會提高基因表達。表h基因組和cDNA數據的統計分析比較構建物n平均值(叫/ml)最大值(嗎/ml)佔對照的％與對照相比的p值1pcB72.3(對照)10437.2144一—pcB72.3HCcDNA10441.1145.71000.686^ANOVA分析一p值《0.05被認為是顯著的對經基因優化的基因序列的分析評估了穩定轉染中DNA序列優化的作用。使每個轉染子組的104個集落在24孔板內過度生長並確定所得各細胞系的抗體濃度。由於基因優化序列為cDNA形式而非標準基因組形式，因此將數據與對照的cDNA形式進行比較。結果總結於圖5和表2。基因優化顯示，同時對兩條鏈進行優化使抗體濃度中值提高35%(p=0.006)。然而，僅對HC優化未導致抗體表達顯著增加。這些數據說明，對LC進行優化也是提高抗體表達所必需的。其原因可能是LC序列不是最佳的，而優化能使LC的表達水平與HC齊平。例如，從LC序列中除去HC序列中不存在的RNA不穩定性基序。表2:基因優化數據的統計分析tableseeoriginaldocumentpage24^ANOVA分析一p值《0.05被認為是顯著的基因優化恆定區對抗體產量的影響分別產生含有IgGl、IgG2和IgG4重鏈和輕鏈基因的載體，其中，重鏈和輕鏈基因的恆定區被基因優化，而重鏈和輕鏈基因的可變區未被優化。因此產生了含有具有優化恆定區和非優化可變區的IgGl基因序列的載體pConGlGA，含有具有優化恆定區和非優化可變區的IgG2基因序列的載體pConG2GA，和含有具有優化恆定區和非優化可變區的IgG4基因序列的載體pConG4GA。用標準方法檢測所得載體的抗體產量並與非優化的cDNA載體尤其是含有非優化IgGl重鏈和輕鏈基因的載體GlcDNA、含有非優化IgG2重鏈和輕鏈基因的載體G2cDNA和含有非優化IgG4序列的載體pcB72.3HCcDNA的進行比較。同時將完全優化的載體pcB72.3GAHC/LC，一種具有基因優化的恆定區和基因優化可變區的載體，用作第一個實驗的對照。結果總結於圖6。將載體pConGlGA和GlcDNA進行比較顯示，IgGl優化恆定區使表達提高。同時，直接比較載體pConG2GA和G2cDNA顯示，IgG2優化恆定區使表達提高。相反，比較載體pConG4GA和pcB72.3HCcDNA可知，IgG4優化不能使表達提高。因此，這些結果顯示，使用基因優化的恆定區能提高平均抗體表達。注意，從單獨實驗獲得的IgG4數據解釋了在兩組轉染中觀察到的對照值之間的差異。權利要求1.一種哺乳動物表達載體，其至少包含含有編碼第一多肽鏈的第一合成核苷酸序列的第一轉錄單元和含有編碼第二多肽鏈的第二合成核苷酸序列的第二轉錄單元，其中所述第一和第二合成核苷酸序列基於天然產生的核苷酸序列，且所述第一和第二多肽鏈可形成含有所述第一和第二多肽鏈中每一條的至少一個或多個拷貝的分子，其中，所述第一和第二核苷酸序列的密碼子組成都適應於給定的哺乳動物宿主種類基因的密碼子偏倚，該給定的種類不同於最初衍生出天然產生的核苷酸序列的哺乳動物種類。2.如權利要求1所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述第一和第二核苷酸序列的密碼子組成適應於CHO細胞基因的密碼子偏倚。3.—種哺乳動物表達載體，其至少包含含有編碼第一多肽鏈的第一合成核苷酸序列的第一轉錄單元和含有編碼第二多肽鏈的第二合成核苷酸序列的第二轉錄單元，其中所述第一和第二合成核苷酸序列基於天然產生的核苷酸序列，且所述第一和第二多肽鏈可形成含有所述第一和第二多肽鏈中每一條的至少一個或多個拷貝的分子，其中，所述第一和第二核苷酸序列的密碼子組成經改進而以較高效率翻譯它們的mRNA。4.如權利要求1-3中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述兩條合成核苷酸序列的GC含量和/或GC分布不同於其相應的天然核苷酸序列。5.如權利要求1-4中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述兩條合成核苷酸序列的AT含量和/或AT分布不同於其相應的天然核苷酸序列。6.如權利要求1-5中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述兩條合成核苷酸序列所含的順式作用序列基序少於其相應的天然核苷酸序列。7.如權利要求6所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述兩條合成核苷酸序列含有較少內部TATA盒、x-位點和/或核糖體進入位點。8.如權利要求6或7所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述兩條合成核苷酸序列含有較少ARE、INS和/或CRS序列元件。9.如權利要求6-8中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述兩條合成核苷酸序列含有較少重複序列，因此它們的RNA所形成的二級結構將少於天然產生的核苷酸序列。10.如權利要求6-9中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述兩條合成核苷酸序列含有較少隱蔽剪接供體和受體位點。11.如權利要求1-10中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述兩條合成核苷酸序列含有的另路起始位點少於其相應的天然核苷酸序列。12.如權利要求1-11中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述由合成核苷酸序列編碼的第一和第二多肽鏈具有與由天然產生的核苷酸序列編碼的相應多肽鏈相同的胺基酸序列。13.如權利要求1-11中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述由合成核苷酸序列編碼的第一和第二多肽鏈具有與由天然產生的核苷酸序列編碼的相應多肽鏈不同的胺基酸序列。14.如權利要求13所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，與由天然產生的核苷酸序列編碼的相應多肽鏈相比，所述由合成核苷酸序列編碼的第一和第二多肽鏈含有較少糖基化位點或改變的糖基化位點。15.如權利要求1-14中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述第一合成核苷酸序列編碼抗體的輕鏈或其片段。.16.如權利要求1-14中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述第二合成核苷酸序列編碼抗體的重鏈或其片段。17.如權利要求1-16中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述第一和第二多肽鏈可形成抗體或其片段。18.如權利要求1-17中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述第一和/或第二合成核苷酸序列與效應蛋白的基因融合。19.如權利要求18所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述第一和第二多肽鏈可形成融合蛋白，該融合蛋白中的效應蛋白與抗體或其片段偶聯。20.如權利要求1-19中任一項所述的哺乳動物表達載體，其特徵在於，所述載體包含編碼可選標記的第三轉錄單元，該可選標記優選為穀氨醯胺合成酶(GS)標記。全文摘要本發明涉及以高水平表達重組抗體的哺乳動物宿主細胞，該宿主細胞包含具有基因優化的編碼抗體重鏈和輕鏈的核苷酸序列的雙基因載體，並涉及所述雙基因載體自身和提高哺乳動物宿主細胞中重組抗體產量的方法。文檔編號C07K16/00GK101180316SQ200680017582公開日2008年5月14日申請日期2006年5月19日優先權日2005年5月20日發明者J·蘭斯,R.蓋,R·楊,S·卡爾維申請人:英國龍沙生物醫藥股份有限公司