抗-血管內皮生長因子的抗體的製作方法

2023-12-10 07:16:12

專利名稱：：抗-血管內皮生長因子的抗體的製作方法
技術領域：
：本發明一般涉及抗-VEGF的抗體，具體地，涉及人源化的抗-VEGF抗體和變異的抗-VEGF抗體。相關技術的描述目前已充分確定，在多種疾病的發病才幾理中涉及血管生成。這包4舌實體瘤、眼內新血管綜合症如增生性視網膜病或年齡相關性黃斑變性(AMD)、類風溼性關節炎、和牛皮癬(Folkman等人，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)267:10931-10934;Klagsbrun等人，Annu.Rev.Physiol.53:217-239(1991);和GamerA,Foscw/arZ)z、e(xses/W/zo6/o/ogyo/ocw/arc/z、ease.Jc(y"謹fca，rocc/j.GamerA,KlintworthGK編，2版,MacelDekker，NY,ppl625-1710(1994))。在實體瘤情況下，新血管生成使得與正常細胞相比腫瘤細胞能夠獲得生長優勢和增殖自主性。因此，觀察到腫瘤切片的微血管密度和乳腺癌及數種其他腫瘤的病人存活率之間的相關性(Weidner等人,新英格蘭醫學雜誌(N.Engl.J.Med.)324:1-6(1991);Horak等人，柳葉刀(Lancet)340:1120-1124(1992);和Macchiarini等人，柳葉刀(Lancet)340:145-146(1992))。對血管生成的正調節物的研究已得到了許多候選物質，其中包括aFGF、bFGF、TGF畫ot、TNF誦(3、HGF、TNF-a、血管生成素、IL-8等(Folkman等人和Klagsbmn等人)。目前為止被鑑別出的負調節物包括血小板反應蛋白(Good等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:6624-6628(1"0))、16千道爾頓的促乳素N末端片段(Clapp等人，Endocrinology,133:1292-1299(1993))、血管抑制素(angiostatin)(O'Reilly等人，細胞(Cell)79:315-328(1994))和內皮抑制素(endostatin)(O'Reilly等人，細月包(Cell)88,277-285(1996》。在過去數年中所做的工作已確立了血管內皮生長因子(VEGF)在調節正常和異常血管生成方面的關鍵地位(Ferrara等人，Endocr.Rev.18:4-25(1997))。丟失甚至一個VEGF等位基因會導致胚胎死亡，這一發現指明了該因子在血管系統發育和分化過程中所起的不可替代的作用(Ferrara等人)。此外，還表明VEGF是與腫瘤和眼內疾病相關的新血管生成的關4建介質(Ferrara等人)。在受檢查的大多數人腫瘤中，VEGFmRNA是過度表達的(Berkman等人，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)91:153-159(1993);Brown等人，HumanPathol.26:86-91(1995);Brown等人，癌症研究(CancerRes.)53:4727-4735(1993);Mattern等人，Brit.J.Cancer.73:93l-934(1996);hDvorak等人，Am.J.Pathol.146:1029-1039(1995))。而且，在眼睛液體中VEGF濃度，與患糖尿病和其他局部缺血有關的視網膜疾病的病人中存在的血管活躍增殖現象是高度相關的(Aidlo等人，新英格蘭醫學雜誌(N.Engl.J.Med.)331:1480-1487(1994))。此外，最近的研究已表明，在患AMD的病人中脈絡膜的新血管膜中存在VEGF(Lopez等人，Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37:855-868(1996))。抗-VEGF中和抗體可抑制棵鼠中各種不同人腫瘤細胞系的生長(Kim等人，自然(Nature)362:841-844(1993);Warren等人,臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)95:1789-1797(1995);Borgstrom等人，癌症研究(CancerRes.)56:4032-4039(1996)和Melnyk等人，癌症研究(CancerRes.)56:921-924(1996)),並且在缺血性視網膜疾病模型中也抑制眼內的血管生成(Adamis等人，Arch.Ophthalmol,114:66-71(1996))。因此，對於治療實體瘤和各種眼內新血管疾病，抗-VEGF的單克隆抗體或其他抑制VEGF作用的抑制劑是有前途的候選物質。發明概述本發明描述了具有治療前景的有利特性的人源化抗-VEGF抗體和變異的抗-VEGF抗體，這些特性包括與VEGF的強結合親和力；在體外抑制VEGF-誘導型內皮細胞增殖的能力；和在體內抑制VEGF-誘導型血管生成的能力。此處優選的人源化抗-VEGF抗體或變異的抗-VEGF抗體結合於人VEGF時的Kd值不超過約lxlO-SM,更佳地不超過約5xl0"M。此外，對於在體外抑制VEGF誘導型內皮細胞增殖，人源化或變異的抗-VEGF抗體的ED50值不超過約5nM。此處特別感興趣的人源化或變異抗-VEGF抗體，是那些在抗體劑量為5毫克/千克下在A673體內腫瘤模型中能抑制至少50%肺瘤生長的種類。在一實例中，抗-VEGF抗體具有重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區包括具有如下胺基酸序列的高變區CDRH1(GYX,FTX2YGMN，其中X,是T或D，而X2是N或H;SEQIDNO:128)，CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQIDNO:2)和CDRH3(YPX,YYGX2SHWYFDV,其中X!是Y或H,而X2是S或T;SEQIDNO:129)。例如，重鏈可變區可包含CDRHl(GYTFTNYGMN;SEQIDNO:1)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQIDNO:2)和CDRH3(YPHYYGSSHWYFDV;SEQIDNO:3)的胺基酸序列。較佳地，3個重鏈高變區在人構架區域中，例如作為由下式表示的連續序列FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4。本發明還提供了抗-VEGF抗體重鏈可變區，它具有胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX,FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQ畫SLRAEDTAVYYCAKYPX3YYGX4SHWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:125)，其中X,是T或D;X2是N或H;X3是Y或H以及X4是S或T。一種特別有用的重鏈可變區序列是實施例l的F(ab)-12人源化抗體的重鏈可變區，它包含SEQIDNO:7的重鏈可變區序列。這種優選的重鏈可變區序列可與下面優選的輕鏈可變區序列或其他輕鏈可變區序列組合，只要這樣產生的抗體能結合於人VEGF。本發明還提供了優選的輕鏈可變區序列，它可與上述重鏈可變區序列或其他重鏈可變區序列組合，只要這樣產生的抗體能結合於人VEGF。例如，輕鏈可變區可包含具有下列胺基酸序列的高變區CDRL1(SASQDISNYLN;SEQIDNO:4),CDRL2(FTSSLHS;SEQIDNO:5)和CDRL3(QQYSTVPWT;SEQIDNO:6)。較佳地，3個輕鏈高變區在人構架區域中，例如作為由下式表示的連續序列FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4。在一實例中，本發明提供了人源化的抗-VEGF抗體輕鏈可變區，它具有胺基酸序列DIQX!TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:124),其中X,是M或L。一種特別有用的輕鏈可變區序列是實施例1的F(ab)-12人源化抗體的輕鏈可變區，它包含SEQIDNO:8的輕鏈可變區序列。本發明還提供了親代抗-VEGF抗體的變異抗體(該親代抗體宜為人源化或人的抗-VEGF抗體)，其中變異抗體結合於人VEGF並且在親代抗-VEGF抗體的重鏈或輕鏈可變區的高變區中包含了胺基酸取代。變異抗體較佳地在抗-VEGF抗體的一個或多個高變區中具有一個或多個取代。較佳地，取代位於親代抗體的重鏈可變區中。例如，胺基酸取代可以位於重鏈可變區的CDRH1和/或CDRH3。較佳地，在這兩種高變區中都有取代。這體更有力地結合於人VEGF，即它們的Kd值明顯低於親代抗-VEGF抗體。較佳地，與親代抗-VEGF抗體相比，變異抗體的在體外抑制VEGF-誘導型內皮細胞增殖的ED50值低至少約10倍，較佳地低至少約20倍，最佳地低至少約50倍。一種特別優選的變異抗體是實施例3的Y0317變異抗體，它具有胺基酸序列為GYDFTHYGMN(SEQIDNO:126)的CDRH1以及具有胺基酸序列為YPYYYGTSHWYFDV(SEQIDNO:127)的CDRH3。這些高變區和CDRH2通常位於人構架區，例如導致重鏈可變區具有SEQIDNO:116的胺基酸序列。這種重鏈可變區序列可任選地與具有SEQIDNO:124胺基酸序列的輕鏈可變區組合，更佳地與具有SEQIDNO:ll胺基酸序列的輕《連可變區組合。各種形式的抗體被包括在本發明之中。例如，抗-VEGF抗體可以是全長的抗體(例如具有完整的人Fc區)，或是抗體片段(如Fab、Fab'或F(ab')2)。此外，抗體可以用可檢測的標記物進行標記，固定在固相載體上，和/或偶聯於異源化合物(如細胞毒性物質)。抗體的診斷和治療用途被包括在內。在一種診斷應用中，本發明提供了一種確定VEGF蛋白是否存在的方法，它包括將懷疑含有VEGF蛋白的樣品暴露於抗-VEGF抗體，然後測定抗體與樣品的結合。對於該應用，本發明提供了一試劑盒，它含有抗體和使用抗體來檢測VEGF蛋白的說明書。本發明還提供了分離的編碼該抗體的核酸；含有該核酸的載體，其中該核酸可任選地操作性連接於被載體所轉化的宿主細胞所識別的控制序列；含該載體的宿主細胞；產生該抗體的方法，它包括培養該宿主細胞從而表達核酸，以及任選地從宿主細胞培養物(如從宿主細胞培養液中)中回收抗體。本發明還提供了一種組合物，它含抗-VEGF抗體和藥學上可接受的載體或稀釋劑。用於治療的組合物是滅菌的並且可以是凍幹的。本發明還提供了治療患肺瘤或視網膜疾病的哺乳動物的方法，它包括將治療有效量的抗-VEGF抗體施用於哺乳動物。本發明涉及l.一種人源化抗-VEGF抗體，它與人VEGF結合的Kd值不超過約lxi(r62.—種人源化抗-VEGF抗體，它與人VEGF結合的Kd值不超過約5xl(T9M。3.—種人源化抗-VEGF抗體，它在體外抑制VEGF誘導型內皮細胞增殖的ED50值不超過約5nM。4.一種人源化抗-VEGF抗體，它在體內抑制VEGF-誘導型血管生成。5.如4所述的人源化抗-VEGF抗體，5毫克/千克的該抗體在A673體內腫瘤模型中抑制至少50%腫瘤生長。6.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它具有重鏈可變區，該重鏈可變區包括具有如下胺基酸序列的高變區CDRH1(GYX,FTX2YGMN,其中X!是T或D,而X2是N或H;SEQIDNO:128)，CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQIDNO:2)和CDRH3(YPX,YYGX2SHWYFDV,其中X,是Y或H，而X2是S或T;SEQIDNO:129)。7.如6所述的人源化抗-VEGF抗體，它包含SEQIDNO:7所述的胺基酸序列。8.如6所述的人源化抗-VEGF抗體，它具有重《連可變區，該重鏈可變區包括具有如下胺基酸序列的高變區CDRHl(GYTFTNYGMN;SEQIDNO:1)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQIDNO:2)和CDRH3(YPHYYGSSHWYFDV;SEQIDNO:3)。9.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它具有輕鏈可變區，輕鏈可變區可包含具有下列胺基酸序列的高變區CDRLl(SASQDISNYLN;SEQIDNO:4)，CDRL2(FTSSLHS;SEQIDNO:5)和CDRL3(QQYSTVPWT;SEQIDNO:6)。10.如9所述的人源化抗-VEGF抗體，它包含SEQIDNO:8所述的胺基酸序列。11.如l所述的人源化抗-VEGF抗體，它具有的重鏈可變區包括SEQIDNO:7的胺基酸序列，而且它具有的輕鏈可變區包括SEQIDNO:8的胺基酸序列。12.—種抗-VEGF抗體輕鏈可變區，它包括胺基酸序列DIQX,TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:124)，其中X,是M或L。13.—種抗-VEGF抗體重鏈可變區，它包括胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX,FTX2YGMNWVRQA7PGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQ固SLRAEDTAVYYCAKYPX3YYGX4SHWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:125)，其中X,是T或D;Xs是N或H;Xg是Y或H以及X4是S或T。14.一種親代抗-VEGF抗體的變異抗體，該變異抗體結合於人VEGF，而且在該親代抗體的重鏈可變區的高變區中有胺基酸取代。15.如14所述的變異抗體，該親代抗體是人抗體或人源化抗體。16.如14所述的變異抗體，它與人VEGF結合的Kd值不超過約lxl(T8M。17.如14所述的變異抗體，它與人VEGF結合的Kd值不超過約5x10'9M。18.如14所述的變異抗體，該取代位於重鏈可變區的CDRH1中。19.如14所述的變異抗體，該取代位於重鏈可變區的CDRH3中。20.如14所述的變異抗體，該胺基酸取代位於CDRH1和CDRH3兩者中。21.如14所述的變異抗體，它與人VEGF結合的Kd值小於該親代抗體的W直。22.如14所述的變異抗體，它在體外抑制VEGF誘導型內皮細胞增殖的ED50值比該親代抗體的ED50值j氐至少10倍。23.如18所述的變異抗體，該CDRH1具有胺基酸序列GYDFTHYGMN(SEQIDNO:126)。24.如19所述的變異抗體，該CDRH3具有胺基酸序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQIDNO:127)。25.如14所述的變異抗體，該重鏈可變區具有SEQIDNO:116的胺基酸序列。26.如25所述的變異抗體，該輕鏈可變區具有SEQIDNO:124的胺基酸序列。27.如26所述的變異抗體，該輕鏈可變區具有SEQIDNO:115的胺基酸序列。28.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它是全長的抗體。29.如28所述的人源化抗-VEGF抗體，它是人IgG。30.如1所述的人源化抗-VEGF抗體，它是抗體片段。31.如30所述的抗體片段，它是Fab。32.—種組合物，它含有1所述的人源化抗-VEGF抗體和藥學上可接受的載體。33.—種組合物，它含有14所述的變異的人源化抗-VEGF抗體和藥學上可接受的載體。34.分離的編碼1所述抗體的核酸。35.含有34所述核酸的載體。36.含有35所述載體的宿主細胞。37.—種產生人源化抗-VEGF抗體的方法，它包括培養36所述的宿主細胞，從而使核酸被表達出。38.如37所述的方法，還包括從宿主細胞培養物中回收人源化的抗-VEGF抗體。療有效量的1所述的人源化抗-VEGF抗體施用於該哺乳動物。40.如39所述的方法，該哺乳動物是人。41.如39所述的方法，該哺乳動物有胂瘤。42.如39所述的方法，該哺乳動物有#見網膜疾病。附圖簡述圖1A和lB顯示了muMAbVEGFA4.6.1的重鏈可變區(SEQIDNO:9)和輕鏈可變區(SEQIDNO:10),人源化的F(ab)(F(ab)-12)的重鏈可變區(SEQIDNO:7)和輕鏈可變區(SEQIDNO:8)，以及人共有構架(重鏈亞組III，humIII(SEQIDNO:11);輕鏈k亞組I，humid(SEQIDNO:12))。圖IA排列了可變的重鏈區序列，而圖1B排列的可變的輕鏈區序列。星號表示在人源化F(ab)-12和鼠單克隆抗體之間，或F(ab)-12和人構架之間的差別。互補決定區(CDR)用下劃線標出。圖2是人源化F(ab)-12VL和VH區模型的帶狀圖。Vl區用棕色表示，而CDR用黃褐色表示。殘基L46的側鏈用黃色表示。Vh區用紫色表示，而CDR用粉紅色表示。從人的變為鼠的Vh殘基的側鏈用黃色表示。圖3顯示了實施例1的人源化抗-VEGFF(ab)-12對VEGF誘導型有絲分裂的抑制作用。將衍生自牛腎上腺皮質的毛細血管內皮細胞，以6xl0^田胞/孔的密度接種於6孔板中，如實施例l所述。按所示濃度加入muMAbVEGFA4.6.1或rhuMAbVEGF(IgGl;F(ab)-12)。在2-3小時後，加入rhVEGF165至終濃度為3ng/ml。在5或6天之後，用胰蛋白酶處理細胞並計數。所示的數值是兩次測量的平均值。與平均值的變差不超過10%。圖4顯示了實施例1的人源化抗-VEGFF(ab)-12在體內對腫瘤生長的抑制作用。將A673成橫紋肌細胞瘤細胞以2xl09鼠的密度注入BLAB/c棵鼠。在腫瘤細胞接種開始後24小時，動物每周兩次腹膜內注射對照單克隆抗體、muMAbVEGFA4.6.1或rhuMAbVEGF(IgGl;F(ab)-12)。對照單克隆抗體的劑量是5mg/kg;抗-VEGF單克隆抗體的劑量按指示是0.5或5mg/kg(n40)。在注射腫瘤細胞4周後，動物^皮安樂死亡，然後取出腫瘤並稱量。t用ANOVA比4交，與對照組相比有顯著區別(p<0，05)。圖5A和5B分別顯示了實施例2的下列抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列鼠抗體A4.6.1(SEQIDNO:IO是Vl而SEQIDNO:9是Vh)、人源化的A4.6.1變異抗體hu2.0(SEQIDNO:13是Vl而SEQIDNO:14是Vh)和人源化的鼠A4.6.1變異抗體hu2.10(SEQIDNO:15是Vl而SEQIDNO:16是Vh)。序列編號才艮才居Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,(5th)，PublicHealthService,NIH,Bethesda，MD(1991)，並且錯配用星號(A4.6.1vshu2.0)或點(hu2.0vshu2.10)表示。變異抗體hu2.0僅含有鼠抗體的CDR序列(粗體)，它被移植於人輕鏈k亞組I共有構架(SEQIDNO:12)和重鏈亞組III共有構架(SEQIDNO:ll)上。hu2.10是用本文所述的噬菌體挑選試驗而獲得的共有人源化克隆。圖6顯示了實施例2中隨機誘變所針對的構架殘基。圖7顯示了用於在噬菌體上表面展示Fab-pIII融合蛋白的噬菌粒構建物。噬菌粒編碼融合於一部分M13基因III外被蛋白的人源化的A4.6.1抗體Fab片段。該融合蛋白包括Fab，該Fab在重鏈的羧基端處連於單個穀氨醯胺殘基(受到SupEE.coli的琥珀密碼子的抑制)，然後連於基因III蛋白的C末端區域(殘基249-406)。轉入F+大腸桿菌，然後用M13K07輔助噬菌體進行超感染，這樣產生了噬菌粒顆粒，其中一部分展示出單拷貝的融合蛋白。圖8A-8F顯示了實施例3中噬菌體展示抗體在載體phMB4-19-1.6的雙鏈核苦酸序列(SEQIDNO:99)和編碼的胺基酸序列(SEQIDNO:100)。圖9A和9B顯示了輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列排列圖，被比較的分別是實施例3的親和力成熟的抗-VEGF抗體和實施例1的F(ab)-12(SEQIDNO:8和7分別為輕鏈和重鏈可變區)。CDR用下劃線標出，用L表示輕鏈，用H表示重鏈，並且用l-3編號。殘基在Vl和Vh區中被依次杯號，這與Kabat的編號方法相反。顯示了模板分子MB1.6(SEQIDNO:101和102分別是輕鏈和重鏈可變區)以及下列變異抗體H2305.6(SEQIDNO:103和104分別是輕鏈和重鏈可變區)、Y0101(SEQIDNO:105和106分別是輕鏈和重鏈可變區)以及Y0;92(SEQIDNO:107和108分別是輕鏈和重鏈可變區)。與F(ab)-12的區別用陰影框標出。圖10A和10B顯示了輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列排列圖，被比較的分別是實施例3的親和力成熟的抗-VEGF抗體和實施例1的F(ab)-12(SEQIDNO:8和7分別為輕鏈和重鏈可變區)。CDR用下劃線標出，用L表示輕鏈，用H表示重鏈，並且用l-3編號。變異抗體被命名為Y0243-1(SEQIDNO:109和110分別是輕鏈和重鏈可變區)、Y0238-3(SEQIDNO:111和112分別是輕鏈和重鏈可變區)、Y0313-1(SEQIDNO:113和114分別是輕鏈和重鏈可變區)以及Y0317(SEQIDNO:115和116分別是輕鏈和重鏈可變區)。與F(ab)-12的區別用陰影框標出。圖11顯示了實施例3中對變異抗體Y0238-3、Y0192和Y0313-1以及實施例1的全長F(ab)-12進行HuVEC活性測定的結果。圖12顯示了實施例1的全長F(ab)-12(rhuMAbVEGF)、實施例1的F(ab)-12(rhuFabVEGF(親和力成熟型)對VEGF誘導型有絲分裂的抑制作用。'優選例的詳細描述I.定義如本文所用，術語"人VEGF，指如Leung等人，科學(Science)246:1306(1989)和Houck等人，Mol,Endocrin.5:1806(1991)所述的165個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子，以及相關的121、189和206個胺基酸的血管內皮細胞生長因子，以及這些生長因子的天然存在的等位基因的或加工的形式。本發明提供了抗_VEGF的拮抗性抗體，它能夠抑制VEGF的一種或多種生物活性，例如其促分裂或血管生成活性。VEGF的拮抗劑通過幹擾VEGF與細胞受體的結合、通過使被VEGF激活的細胞失去功能或被殺滅、或通過幹擾VEGF結合於細胞受體後血管內皮細胞的激活過程而起作用。出於本發明目的，VEGF拮抗劑的所有這些幹擾應被認為是等價的。如本文所用，術語"VEGF受體，，或"VEGFr，，指VEGF的細胞受體，通常是在血管內皮細胞上的細胞表面受體，以及保留與hVEGF結合能力的變異受體。VEGF受體的一個例子是fms樣酪氨酸激酶(flt),它是酪氨酸激酶家族的一種跨膜受體(DeVries等人，科學(Science)255:989(1992);Shibuya等人，Oncogene5:519(1990))。flt受體包括一個月包外結構域、一個5爭膜結構域和一個具有酪氨酸激酶活性的胞內結構域。胞外結構域涉及與VEGF的結合，而胞內結構域涉及信號傳導。VEGF受體的另一例子是flk-l受體(也被稱為KDR)(Matthews等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88:9026(1991);Terman等人，Oncogene6:1677(1991);Terman等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.187:1579(1992))。VEGF與flt受體的結合導致形成至少2種高分子量的複合物，表7見分子量為205,000和300，000道爾頓。據信，300,000道爾頓的複合物是包含結合於一個VEGF分子的2個受體分子的二聚體。除非另外說明，術語"表位A4.6.1，，在本文指可與Kim等人，GrowthFactors7:53(1992)和Kim等人，自然(Nature)362:841(1993)所公開的A4.6.1抗體結合的，人VEGF的區域。"治療"指治療性處理和預防性或防禦性措施。需要治療者包括已經患病以及要預防疾病的生物。出於治療目的，"哺乳動物"指任何劃為哺乳動物的動物，包括人、家畜和農場動物，以及動物園動物、運動動物和寵物，如狗、馬、貓、牛等。較佳地，此處的哺乳動物為人。"抗體(Ab)"和"免疫球蛋白(Ig)"是有相同結構特徵的糖蛋白。抗體表現出對特異抗原的結合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和缺少抗原特異性的抗體樣分子。後一類多肽可由例如淋巴系統低水平地產生，而由骨髓瘤高水平地產生。"天然抗體"和"天然免疫球蛋白"是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫4建。每條重鏈的一端有可變區(Vh)，其後是多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VO,另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。據信特殊的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界面。了各種特^抗體對其特定抗i的結合和特異性。然而，可變性i不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中於輕鏈和重鏈可變區中被稱為高變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為構架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區(分別是FR1、FR2、FR3和FR4)，它們大致上呈P-摺疊構型，由三個高變區相連。這些高變區形成連接f3摺疊結構的環並且在某些情況下是P摺疊結構的一部分。每條鏈中的高變區通過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的高變區一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,(5th版),PublicHealthService,NationalInstistutesofHealth,Bethesda,MD(1991)，第647-669頁)。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應子功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。如本文所用，術語"高變區"指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包括來自"互補決定區"即"CDR"的胺基酸殘基(即輕鏈可變區的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重鏈可變區的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3》Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,(5th版)，PublicHealthService,NationalInstistutesofHealth,Bethesda,MD(1991))和/或來自"高變環"的殘基(即輕鏈可變區的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重《連可變區的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk等人,分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196，901(1987))。"構架"或"FR"殘基是除了此處所定義的高變區殘基之外的那些可變區殘基。木瓜蛋白酶消化抗體產生了兩個相同的抗原結合片段(稱為"Fab"片段，每個片段有單個抗原結合位點)以及一個殘餘的"Fc"片段(該名稱反映了其容易結晶的能力)。用胃蛋白酶處理產生了一個F(ab')2片段，該片段有兩個抗原結合位點，並仍能與抗原交聯。"Fv"是最小的抗體片段，它含有全部抗原識別和結合位點。該區域由非共價地緊密結合的一個重鏈和一個輕鏈可變區的二聚物組成。在該構型中，各可變區中的三個高變區相互作用，在Vh-Vl二聚物表面上界定了抗原結合位點。6個高變區共同地賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或Fv的一半，它只包含對抗原有特異性的三個高變區)也能識別並結合抗原，只是其親和力比完整的結合位點低。Fab片段還含有輕鏈的恆定區和重鏈的第一個恆定區(CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於，在重鏈CH1區的羧基端多幾個殘基(包括來自鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸)。Fab'-SH在本文表示恆定區的半胱氨酸殘基攜帶了游離巰基的Fab'。F(ab')2抗體片段最初是以Fab'片段對的形式產生的，在其間有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其它化學偶聯方式也是已知的。脊推動物抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"，可根據其恆定區的胺基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為kappa(K)和lambda(X))中的一類。根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-l、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-l和IgA-2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為a、5、s、y、和P。不同類免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是眾所周知的。術語"抗體"被最廣義地使用，並且具體地包括單克隆抗體(包括全長的單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、以及抗體片段，只要它們表現出所需的生物活性即可。"抗體片段"包括完整抗體的一部分，通常是完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；二體(diabody);線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。本文所用的術語"單克隆抗體"指從一類基本均一抗體獲得的抗體，即該群體中包含的各抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變之外。單克隆抗體是高特異性的，針對單個抗原位點。而且，與常規的(多克隆)抗體製劑(它通常是包括針對不同的決定簇(表位)的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。修飾語"單克隆"表示了抗體的特性-即從基本均一的抗體群中獲得的，而不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。例如，用於本發明的單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature,256:495(1975)首先提出)製得，或可用重組DNA方法(例如參見美國專利No.4，816,567)製得。"單克隆抗體"還可利用例如Clackson等人，自然(Nature)352:624-628(1991)和Marks等人，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)222:581-597(1991)所述的技術從噬菌體抗體文庫中分離得到的。單克隆抗體在此特別包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與某一特定物種的抗體對應序列相同或同源，或是屬於特定的抗體類別或亞類，而鏈的其餘部分則與另一物種的抗體對應序列相同或同源、或是屬於另一種抗體類別或亞類，以及這種抗體的片段，只要該片段具有所需的生物活性即可(美國專利No.4,816,567和Morrison等人，美國科學院院報81:6851-6855(1984))。"人源化，，形式的非人(如鼠)抗體是嵌合的抗體，它們含有非人免疫球蛋白的最小序列。對於大多數情況，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者高變區殘基被非人源(供者抗體)(例如有所需特異性、親和力和活性的小鼠、大鼠、兔或非人靈長動物抗體)的高變區殘基所代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的構架區(FR)殘基可被對應的非人殘基代替。另外，人源化的抗體可包括既不存在於受者抗體、又不存在於供體抗體的殘基。這些修飾能進一步提高抗體的性能。通常，人源化抗體包含了基本上所有的(至少一個、通常兩個)可變區，其中所有或基本上所有的高變區區對應於非人免疫球蛋白的高變區區，而所有或基本上所有FR區是人免疫球蛋白序列的FR區。人源化抗體最好還包括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恆定區(Fc)的至少一部分。更詳細的情況可參見Jones14等人，Nature,321:522-525(1986);Reichmann等人，Nature,332:323-329(1988);和Presta，C就Op.Struct.Biol"2:593-596(1992)。"單鏈Fv，，或"sFv，，抗體片段包含存在於單條多肽鏈內的抗體Vh和Vl區。一般說來，Fv多肽還包含位於VH和VL區之間的多肽接頭，使得sFv形成適合抗原結合所需的結構。有關sFv的綜述，可參見Pluckthum的"單克隆抗體的的藥物學"(PharmacologyofMonoclonalAntibodies)第113巻，Rosenburg和Moore編，Spring-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。"二體(diabody)"指有兩個抗原結合位點的小抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈(VH-VO內與輕鏈可變區(VO連接的重鏈可變區(VH)。通過使用短至使同一鏈內兩功能區無法配對的接頭，功能區被迫與另一鏈的互補區配對，由此形成兩個抗體結合位點。例如歐洲專利404，097;W093/11161;和Hollinger等在美國科學院院報90:6444-6448(1993)中對二體有更為全面的論述。術語"線性抗體，，在本申請中指Zapata等人，蛋白質工程(ProteinEng.)8(10):1057-1062(1995)中所述的抗體。筒而言之，這些抗體包括一對串聯的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，它們構成了一對抗原結合區。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的。"變異的"抗-VEGF抗體指與因在親代抗體序列中插入、缺失和/或取代一個或多個胺基酸殘基而在胺基酸序列上與"親代"抗-VEGF抗體胺基酸序列有所不同的分子。在優選例中，變異抗體包含位於親代抗體的一個或多個高變區中的一個或多個胺基酸取代。例如，變異抗體在親代抗體的一個或多個高變區中可含有至少一個(例如1-10個，較佳地2-5個)取代。通常，變異抗體的胺基酸序列與親代抗體的重鏈或輕鏈可變區序列(如SEQIDNO:7或8)有至少75%,4交佳地至少80%，更佳地至少85%，更好地至少90%,最佳地至少95%的胺基酸序列相同。關於序列的相同性或同源度，在本文是將序列排列對齊並引入空隙(如果需要)從而達到最大的序列相同百分比之後，用候選序列中與親代抗體殘基相同的胺基酸殘基百分比表示。抗體序列的N末端、C末端、或內部延伸區、缺失或插入都不認為會影響序列相同性或同源度。變異抗體保留結合人VEGF的能力，並且較佳地具有優於親代抗體的特性。例如，變異抗體具有更強的結合親和力，更強的抑制VEGF誘導型內皮細胞增殖的能力和/或更高的在體內抑制VEGF誘導型血管生成的能力。為了分析這些特性，人們可例如將Fab形式的變異抗體與Fab形式的親代抗體比較，或將全長形式的變異抗體與全長形式的親代抗體比較，因為已發現抗-VEGF抗體的形式影響其在此處公開的生物活性測定中的活性。此處特別感興趣的變異抗體是與親代抗體相比生物活性高至少約10倍，較佳地至少約20倍，更佳地至少約50倍的抗體。"親代"抗體在此是具有用於製備變異抗體的胺基酸序列的抗體。較佳地，親代抗體具有人構架區，而且具有人抗體恆定區(如果存在)。例如，親代抗體可以是人源化抗體或人抗體。"分離的"抗體是經鑑定的和分離和/或回收自其天然環境組份的抗體。其天然環境中的汙染組份是指會干擾所述抗體的診斷或治療性用途的物質，可包括酶、激素和其它蛋白質類或非蛋白質類溶質。在優選實施方案中，抗體純化至(l)經Lowry法測定，按重量計抗體純度高於95%，最好高於99%，(2)其純度足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個N末端殘基或內部胺基酸序列，或者(3)用Coomassie藍或最好用銀染色法，經還原或非還原條件下SDS-PAGE測定時達到均質。分離的抗體包括存在於重組細胞內的原位抗體，因為該抗體天然環境的至少一種組份是不存在的。但是，通常，分離的抗體是經至少一步純化步驟製備的。術語"表位標記的"在此表示抗-VEGF抗體被融合於"表位標記，，。表位標記(epitopetag)應具有足夠的殘基來形成可產生其對應抗體所需的表位，但又短到不至於影響VEGF抗體的活性。表位標記宜具有相當的獨特性，以致針對其的抗體基本上不與其它表位交叉反應。適宜的標記多肽一般具有至少6個胺基酸殘基，一般介於約8至50個胺基酸殘基(以約9至30個殘基為宜)。例子包括fluHA標記多肽及其抗體12CA5(Field等人，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)旦:2159-2165(1988));c-myc標記及其抗體8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Evan等人，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)i(12):3610-3616(1985);和單純性皰滲病毒糖蛋白D(gD)標記及其抗體(Paborsky等，ProteinEngineering2(6):547-553(1990))。在某些例子中，表位標記是"補救受體結合表位"。如本文所用，術語"補救受體結合表位"指IgG分子(如IgG,、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區的表位,它負責提高IgG分子在體內血清半衰期。術語"細胞毒劑"在此指抑制或阻止細胞功能和/或導致細胞破壞的物質。該術語包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9Q、和Re186)、化療劑和毒素(例如來自細菌、真菌、植物或動物的酶活毒素或其片段)。"化療劑"是用於治療癌症的化合物。化療劑包括例如阿黴素(Adriamycin)、阿黴素(Doxombicin)、5-氟尿嘧，定、阿糖胞苷("Ara-C，，)、環磷醯胺、塞替派、白消胺、Taxotere(docetaxel)、細胞毒素、紅豆杉醇、曱氨蝶呤、順氯銨鉑、美法侖、長春鹼、博來黴素、依託泊戒、異環磷醯胺、絲裂黴素C、米託蒽醌、長春新鹼、長春瑞賓、卡鉑、替尼泊甙、道諾黴素、洋紅黴素、氨基蝶呤、放線菌素D、絲裂黴素、Esperamicins(參見美國專利4,675,187)、美法侖以及其它相關的氮齊。術語"前藥(prodrug)"在此指藥學活性物質的前體或衍生形式，其對腫瘤細胞的細胞毒性低於親代藥物，並且能夠被酶激活或轉化成較高活性的親代形式。參見Wilman，"癌症化療中的前藥"("ProdrugsinCancerChemotherapy")，生物化學協會學報(BiochemicalSocietyTransaction)14,pp.375-382，第615次會議，Belfast(1986)和Stella等人，"前藥定輩巴藥物釋放的化學方法，，("Prodmg:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery"),受控藥物釋方文(DirectedDrugDelivery),Borchardt等編，pp.247匿267，HumanaPress(1985)。本發明的前藥包括(但不限於)含磷酸鹽的前藥、含硫代磷酸鹽的前藥、含硫酸鹽的前藥、含肽的前藥、經D-胺基酸修飾的前藥、糖基化的前藥、含P內醯胺的前藥、任選地取代的苯氧基乙醯胺的前藥或任選地取代的苯乙醯胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前藥，它們可以被轉化為細胞毒性更高的游離藥物。可以衍生成為本發明所用前藥形式的細胞毒性藥物的例子，包括(但不限於)前文所述的化療劑。詞語"標記"在此指直接或間接與抗體偶聯的可檢測化合物或組合物。標記自身可以被檢測到(例如放射性同位素標記或焚光標記)，或者，如果"固相"指本i明抗體可吸;t於其上的非液態i質。固相的例;在此包括部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和矽氧烷構成的固相。在某些實施方案中，根據上下文，固相可能包括測試板的孔；而在其它實施方案中，可能是純化柱(例如親和色譜柱)。該術語還包括分散的顆粒構成的不連續固相，如美國專利No.4,275,149中所述的。"脂質體，，是由各種脂類、磷脂和/或表面活性劑構成的，通常被用來向哺乳動物傳遞藥物(例如本文所述的抗VEGF抗體和任選的化療劑)的小嚢泡。脂質體的組份通常排列成雙層結構，與生物膜的脂排列類似。"分離的"核酸分子是經鑑定的，並且與通常與之相伴存在於該抗體核酸天然來源中的至少一種汙染核酸分子分離的核酸分子。分離的核酸分子不是其天然形式或處於其天然環境中。所以，分離的核酸分子與存在於天然細胞內的核酸分子在形式上是不同的。但是，分離的核酸分子包括正常表達抗體的細^^內所含的核酸分子，例如，該核酸分子可以位於不同於天然細胞內的某個染色體位置上。術語"調控序列"指在特定的宿主微生物內表達與之可操作性連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合原核細胞的調控序列包括啟動子、任選的操縱子序列和核糖體結合位點。已知，真核細胞利用啟動子、聚腺普酸化信號和加強子。當與另外的核酸序列形成功能關聯的時，核酸是"操作性相連的"。例如，前序列(presequense)或分泌性前導序列的DNA是與多肽的DNA操作性相連的，如果它被表達成參與多肽分泌的前蛋白原(preprotein);啟動子或增強子是與編碼序列操作性相連的，如果它影響序列的轉錄；或者，核糖體結合位點是與編碼序列搡作性相連的，如果它的位置能夠促進翻譯。通常，"操作性相連"指相連的DNA序列是毗鄰的，而在分泌性前導序列情況下，是毗鄰的並處於同一閱讀框下。然而，增強子不必毗鄰。可通過方便的限制性位點處的連接來實現相連。如果這樣的位點不存在，則可按常規實踐採用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。在本文中，"細胞""細胞系"和"細胞培養物"是互換使用的，而且所有這些名稱都包括子代。所以，詞語"轉化體"和"轉化細胞"包括原代細胞及其衍生的培養物(不論傳代多少次)。還應理解，由於有意或無意的突變，所有子代也許在DNA內容上並不精確相同。它包括了篩選出的，具有與原始轉化細胞相同功能或生物活性的突變型子代。當採用不同的命名時，可以從上下文中明顯看出。II.發明的實施方式下面的實施例描述了人源化和變異的抗-VEGF抗體的產生方法，這些抗體從治療角度看具有有益的特性，其中包括(a)與VEGF的強結合親和力；(b)在體外抑制VEGF-誘導型內皮細胞增殖的能力；和(c)在體內抑制VEGF-誘導型血管生成的能力。抗體的親和力如下面的實施例所述進行測定。優選的人源化或變異的抗體是那些與人VEGF結合時Kd值不超過約lxlo^M,較佳地不超過lxl(T8M,最佳地不超過約5xlO力M的抗體。除了與人VEGF具有強結合親和力的抗體之外，還需要選擇具有其他有利的治療特性的人源化或變異的抗體。例如，抗體可以是能抑制對VEGF應答而導致的內皮細胞生長的抗體。在一個實施例中，抗體能夠抑制牛毛細血管內皮細胞對幾乎最大有效濃度的VEGF(3ng/ml)應答時的增殖。較佳地，對於在該"內皮細胞生長測定"中抑制VEGF誘導型的內皮細18胞生長，抗體的有效劑量50(ED50)不超過約5nM，4交佳地不超過lnM,最佳地不超過0.5nM,即在這些濃度下抗體能夠在體外抑制50。/。VEGF誘導型內皮細胞生長。一種優選的"內皮細胞生長測定"包括基本上如實施例l所述，將衍生自牛腎上腺皮質的毛細血管內皮細胞，在補充有10°/。牛血清、2mM穀氨醯胺和抗生素的低葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle培養基(DMEM)(GIBCO)(生長培養基)中培養。這些內皮細胞，以6乂103細胞/孔的密度接種於6孔板中的生長培養基中。以l-5000ng/ml之間的濃度加入親代抗-VEGF抗體(對照)、人源化的或變異的抗-VEGF抗體。在2-3小時後，加入純化的VEGF至終濃度為3ng/ml。對於特異性對照，將每種抗體以5000ng/ml的濃度加至內皮細胞，或者單獨加入，或者在有2ng/mlbFGF下加入。在5或6天之後，通過暴露於胰蛋白酶而使細胞解離，並在Coulter計數器(CoulterElectronics,Hialeah，FL)上計數。用四參數曲線擬合程序(KaleidaGraph)分析數據。優選的人源化或變異的抗-VEGF抗體還可以是具有體內抑制肺瘤活性的抗體。例如，該抗體可抑制人八673成橫紋肌細胞瘤細胞或乳房癌1\10八-MB-435細胞在棵鼠中的生長。對於體內腫瘤研究，如實施例1所述將A673成橫紋肌細胞瘤細胞(ATCC;CRL1598)或MDA-MB-435細胞(可從ATCC獲得)在補充有10。/。胎牛血清、2mM穀氨醯胺和抗生素的DMEM/F12培養基中培養。將2x106腫瘤細胞(體積20(M殷升)皮下注入6-10周齡雌性BLAB/c棵鼠的背部。然後，在該測試中用人源化或變異的抗體以及無活性的對照抗體來處理動物。人源化或變異的抗-VEGF單克隆抗體的劑量是0.5或5mg/kg。在腫瘤細胞接種開始後24小時，將每種單克隆抗體以100微升體積進行腹膜內注射，每周兩次。每周確定腫瘤大小。在注射腫瘤細胞4周後，動物被安樂死亡，然後取出肺瘤並稱量。用ANOVA進行統計分析。較佳地，在這種"體內肺瘤測定"中5mg/kg劑量的抗體可抑制約50-100。/。，較佳地約70-100%，最佳地約80-100%人A673肺瘤細胞的生長。在優選例中，在將治療有效量的抗體施用於病人時，人源化或變異的抗體不會引發免疫應答。如果引發了免疫應答，則該應答較佳地仍使抗體能夠給被治療的病人帶來治療好處。人源化的或變異的抗體還宜能夠抑制人體中VEGF誘導型血管生成，例如，抑制人腫瘤生長和/或抑制視網膜疾病中眼內的血管生成。優選的抗體與本文所述的"表位A4.6.1"結合。為了篩選能結合於被感興趣抗體結合的人VEGF表位的抗體(如阻斷A4.6.1抗體與人VEGF結合的抗體)，可以進行常規的交叉阻斷測定，例如在Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane(1988)中所述的方法。或者，可進行表位定位(例如用Champe等人，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)270:1388-1394(1995)中所述的方法)，以確定抗體是否結合於有關的表位。本文優選例的抗體具有一重鏈可變區，它包括由下式表示的胺基酸序列FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4，其中，"FR1-4"表示4個構架區，而"CDRHl-3"表示抗-VEGF抗體重鏈可變區的3個高變區。FR1-4可如下面實施例那樣衍生自"共有序列"(即一類、亞類或亞組人免疫球蛋白的重鏈或輕鏈中最常見的胺基酸)，或者可來自某個人抗體構架區或來自組合的不同構架區序列。許多人抗體構架區序列被收集在例如Kabat等人(同上)的文獻中。在一個優選例中，可變的重鏈FR是由如Kabat等人(同上)編纂的人免疫球蛋白的共有序列所提供。較佳地，人免疫球蛋白亞組是人重鏈亞組III(如SEQIDNO:11)。人可變的重鏈FR序列宜在其中具有取代，例如人FR殘基被相應的非人殘基取代(非人殘基指當人和非人的序列被排列對齊時，與有關的殘基具有相同Kabat位置編號的非人殘基)，但是不一定必須用非人殘基進行取代。例如，除了相應的非人殘基之外的FR殘基替換，可以用噬菌體展示法進行選擇(參見下面的實施例2)。可以被取代的代表性可變重鏈FR殘基包括任何一個或多個下列編號的FR殘基37H、49H、67H、69H、71H、73H、75H、76H、78H、94H(此處採用Kabat的殘基編號法)。較佳地，這些殘基中有至少2個，或至少3個或至少4個被取代。一種優選的FR取代組合是49H、69H、71H、73H、76H、78H和94H。對於重鏈高變區，較佳地具有如下胺基酸序列CDRH1GYXiX2X3X4YGXsN(SEQIDNO:117)，其中X!是D、T或E，但較佳地是D或T;X2是F、W、或Y,但較佳地是F;Xg是T、Q、G或S，但較佳地是T;X4是H或N;而且Xs是M或I，但4交佳地是M。CDRH2WINTXJGEPTYAADFKR(SEQIDNO:118)，其中X,是Y或W，但較佳地是Y。CDRH3YPXYX2X3X4X5HWYFDV(SEQIDNO:119)，其中X!是H或Y;X義Y、R、K、I、T、E、或W，但較佳地是Y;X義G、N、A、D、Q、E、T、K、或S，但較佳地是G;X4是S、T、K、Q、N、R、A、E、或G，但較佳地是S或T;而且Xs是S或G,但較佳地是S。重鏈可變區可任選地包括FR3中的、在此處被命名為"CDR7"的序歹'J(參見圖9B和10B)，其中CDR7可具有如下胺基酸序列CDR7X,SX2DX3X4XsX6TX7(SEQIDNO:120)，其中X,是F、I、V、L或A，但較佳地是F;X2是A、L、V或I，但較佳地是L;X3是T、V或K，但較佳地是T;X4是S或W，但較佳地是S;Xs是S或K，但較佳地是K;Xe是N或S，但較佳地是S;而X7是V、A、L或I，但較佳地是A。本文優選例的抗體具有一輕鏈可變區，它包括由下式表示的胺基酸序列FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4,其中，"FRl-4，，表示4個構架區，而"CDRLl-3"表示抗-VEGF抗體輕鏈可變區的3個高變區。FRl-4可如下面實施例那樣衍生自"共有序列"(即一類、亞類或亞組人免疫球蛋白的重鏈或輕鏈中最常見的胺基酸)，或者可來自某個人抗體構架區或來自組合的不同構架區序列。在一個優選例中，可變的輕鏈FR是由如Kabat等人(同上)編纂的人免疫球蛋白的共有序列所提供。較佳地，人免疫球蛋白亞組是人K輕鏈亞組I(如SEQIDNO:12)。人可變的輕鏈FR序列宜在其中具有取代，例如人FR殘基被相應的小鼠殘基取代，但是不一定必須用非人殘基進行取代。例如，除了相應的非人殘基之外的FR殘基替換，可以用噬菌體展示法進行選擇(參見下面的實施例2)。可以被取代的代表性可變輕鏈FR殘基包括任何一個或多個下列編號的FR殘基4L、46L和71L(此處採用Kabat的殘基編號法)。較佳地，僅46L被取代。在另一實例中，4L和46L被取代。對於CDR，較佳地具有如下胺基酸序列CDRL1X,AX2X3X4XsSNYLN(SEQIDNO:121)，其中X,是R或S,但較佳地是S;X2是S或N,但較佳地是S;X3是Q或E，但較佳地是Q;X4是Q或D，但較佳地是D;而且Xs是I或L，但較佳地是I。CDRL2FTSSLHS(SEQIDNO:122)CDRL3QQYSX,X2PWT(SEQIDNO:123)，其中X,是T、A或N，但較佳地是T;而且X2是V或T，但較佳地是V。鏈可變區序列'的抗體及其變異體，例如;和:成熟形式的變異抗體，其^包括實施例3中的變異抗體Y0317、Y0313-l和Y0238-3，並且Y0317是優選的變21異抗體。產生感興趣的人源化抗-VEGF抗體的方法，將在下面詳細描述。A.製備抗體異體的方法^為了使抗-VEGF抗體抗體人源化,製備非人的抗體原料。當需要產生變異抗體時，可製備親代抗體。在下一節中將描述產生這種非人的抗體原料和親代抗體的代表性技術。(i)製備抗原用於產生抗體的VEGF抗原可以是例如完整的VEGF或VEGF片段(如含"A4.6.1表位"的VEGF片段)。可用於產生抗體的其他形式的VEGF，對於本領域技術人員而言是顯而易見的。用於產生抗體的VEGF抗原宜是人VEGF，例如在Leung等人，科學(Science)246:1306(1989)和Houck等人，Mol.Endocrin.5:1806(1991)所述的。(ii)多克隆抗體多克隆抗體宜通過多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑在動物體內生成的。可以用例如馬來醯亞氨苯曱醯磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R'N-C二NR(其中的R和R'是不同的烷基)的雙官能劑或衍生劑，將有關抗原與在待免疫物種中具有免疫原性的蛋白質進行偶聯，後者包括例如匙孔蟲戚血藍蛋白、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物。用抗原、免疫偶聯物或衍生物免疫動物，例如將100微克或5微克(分別適合兔或小鼠)蛋白質或偶聯物與3倍體積Freund完全佐劑混合後，在多處皮內注射該溶液。一個月後，通過多處皮下注射1/5至1/10最初劑量的肽或偶聯物和Freund完全佐劑，對動物進^"加強免疫。7至14天後，對動物放血，分析血清的抗體效價。對動物的加強免疫進行至效價穩定為止。較好的是，用相同抗原但與不同蛋白和/或通過不同的交聯劑偶聯而成的偶聯物進行加強免疫。偶聯物還可以在重組細胞內以融合蛋白的形式製備。而且，凝聚劑(例如明礬)適合用來加強免疫應答。(iii)單克隆抗體單克隆抗體可以用Kohler等人，自然256:495(1975)首次公開的雜交瘤方法製得，或者利用重組DNA方法製得(美國專利4,816,567)。在雜交瘤方法中，鼠或其它合適的宿主動物，例如倉鼠或獼猴，如前文所述接受免疫，以引發產生或能夠產生特異性結合免疫所用蛋白的抗體22的淋巴細胞。或者，可以體外免疫淋巴細胞。然後使用合適的融合劑(例如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體理論與實踐(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractic)，pp.59-103(AcademicPress,1986))。將如此製得的雜交瘤細胞接種並培養在合適的培養基中，培養基中最好含有一種或多種抑制非融合親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃噤呤鳥。票呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養基中一般含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷這些抑制HGPRT缺陷型細胞生長的物質(HAT培養基)。優選的骨髓瘤細胞是那些融合效率高、支持選定的抗體生產細胞穩定且高水平地生產抗體、而且對諸如HAT培養基敏感的細胞。其中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，例如來自MOPC-21和M.C.-ll鼠肺瘤的(可以從SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA獲得)，和SP-2或X63-Ag8-653細胞(可由美國典型培養物保藏中心，Rockville,MarylandUSA獲得)。也有用人骨髓瘤細胞和人-鼠異源骨髓瘤細胞系來生產人單克隆抗體的(Kozbor,免疫雜誌(J.Immunol.)133:3001(1984);Brodeur等,單克隆抗體的生產技術和應用(MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications),pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。對生長有雜交瘤細胞的培養液進行分析，檢測是否產生針對抗原的單克隆抗體。較好的是，用免疫沉澱法或例如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA)的體外結合分析法，來測定由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性。例如，單克隆抗體的結合親和性可以利用Scatchard分析(Munson等，生物化學年刊(Anal.Biochem.)l07:220(1980))來測定。在雜交瘤細胞經鑑定生產了具有所要求的特異性、親和性和/或活性的抗體後，可以利用有限稀釋程序將克隆亞克隆化，並利用標準方法培養(Goding,單克隆抗體理論與實踐(Mo露lonalAntibodies:PrinciplesandPractice)pp.59-103(AcademicPress,1986))。就此目的而言，合適的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養液。此外，雜交瘤細胞可以以腹水瘤的形式在動物體內生長。利用常規免疫球蛋白純化技術，例如A蛋白-瓊脂糖柱(proteinA-Sepharose)、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和性色譜，可從培養液、腹水液或血清中合適地分離出由亞克隆分泌的單克隆抗體。使用常規方法，可以方便地分離出編碼單克隆抗體的DNA並進行測序(例如，利用能與編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是所述DNA的優選來源。一旦被分離，可以將DNA置於表達載體中，表達載體然後被轉染到例如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卯巢(CHO)細胞或雜交瘤細胞等原本並不產生免疫球蛋白的宿主細胞內，從而在重組宿主細胞內獲得生成的單克隆抗體。下面更詳細地描述抗體的重組產生法。(iv)人源化和胺基酸序列變異體下面的實施例l-2描述了使抗-VEGF抗體人源化的程序。在某些例子中，可能需要產生這些人源化抗體的胺基酸序列變異體，尤其是在需要提高人源化抗體的結合親和力或其他生物特性的場合。實施例3描述了產生具有比親代抗體更高親和力的抗-VEGF抗體的胺基酸序列變異體的方法。抗-VEGF抗體的胺基酸序列變異體可這樣製備將合適的核香酸變化引入抗-VEGF抗體的DNA,或通過肽合成。這樣的變異抗體包括例如，在此處實施例的抗-VEGF抗體的胺基酸序列中有胺基酸殘基缺失、和/或插入和/或取代。可進行缺失、插入和取代的任何組合，以製備最終的構建物，只要該最終構建物具有所需的特性。胺基酸改變也可改變人源化或變異的抗-VEGF抗體的翻譯後加工過程，例如改變糖基化位點的數目或位置。置的方法，是Cunningham和Wells，科學(Science),244:1081-1085(1989)中描述的"丙氨酸掃描誘變"。在該方法中，確定一個或一組靶殘基(如帶電荷的殘基如arg、asp、his、lys和glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸(最佳的是丙氨酸或聚丙氨酸)加以替換，以影響胺基酸與VEGF的相互作用。那些在功能上表現出對替換敏感的胺基酸位置，再通過在置換位點處卩I入進一步的或其他的突變而進行結構的精細研究。這樣，儘管引入胺基酸序列變異的位點被預先確定，但是突變本身的性質不必被預先確定。例如，為了優化給定位點處突變的性能，可以對靶密碼子或區域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，然後篩選表達的抗-VEGF抗體變異體是否有所需活性。丙氨酸掃描誘變在實施例3中描述。胺基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端的融合，長度為一個殘基至含100個或更多殘基的多肽，還包括在序列內插入單個或多個胺基酸殘基。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酸殘基的抗-VEGF抗體，或融合於表位標記的抗體。抗-VEGF抗體分子的其他插入變異體包括將抗-VEGF抗體的N端或C端融合於會導致抗體血清半衰期更長的酶或多肽(見下面)。另一種變異體是胺基酸置換變異體。這些變異體在抗-VEGF抗體分子中至少有一個胺基酸殘基被除去並在其位置上插入不同的殘基。置換誘變最感興趣的位置包括高變區，但FR改變也在範圍之中。保守性置換示於表l，標題是"優選的置換"。如果這種置換導致生物活性的改變，那麼可引入更接近的變化即表l中指出的"代表性置換"、或進一步按下面胺基酸類型引入置換，然後篩選產物。表1tableseeoriginaldocumentpage25對抗體生物性能的基本修飾，可以通過選擇在下列方面的效應上差別明顯的置換而實現(a)維持取代區域中多肽骨架的結構，例如摺疊或螺旋構象，(b)維持靶位置處分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈體積。根據共同的側鏈特性，天然存在的殘基被分成下列幾類(1)疏水的正亮氨酸，met，ala,val，leu,ile;(2)中性親水的cys，ser，thr;(3)臥臾'l"生的asp，glu;(4)石威'1"生的asn,gln，his,lys,arg;(5)影響鏈取向的殘基gly,pro;和(6)芳香類的trp,tyr,phe非保守性取代需要用這些類別中一類的某種胺基酸替換另一類的某種胺基酸。在維持人源化或變異的抗-VEGF抗體的正常構象中不涉及的任何半胱氨酸殘基也可被取代，一般是用絲氨酸取代，以改善分子的氧化穩定性並防止異常交聯。相反地，可以在抗體中添加半胱氨酸鍵以提高穩定性(尤其是在抗體是抗體片段(如Fv片段)的情況下)。一種特別優選的置換變異體涉及替換親代抗體(如人源化抗體或人抗體)的一個或多個高變區殘基。通常，形成的並選出用於進一步開發的變異抗體應與產生它們的親代抗體相比具有更高的生物活性。一種方便的產生這種置換變異體的方法，是用噬菌體展示法(見實施例3)進行親和力成熟化。簡而言之，對數個高變區位點(如6-7個位點)進行突變，從而在每個位點上產生所有可能的胺基酸置換。這樣產生的變異抗體以單價形式在絲狀噬菌體顆粒上展示，即作為在每個顆粒中包裝且融合於M13基因III產物的融合蛋白。然後按此處所述的那樣，篩選噬菌體展示的變異抗體的生物活性(如結合親和力)。為了鑑別用於修飾的候選高變區位點，可進行丙氨酸掃描誘變(見實施例3)以鑑別出對抗原結合有重大貢獻的高變區殘基。另外或額外的，分析抗原-抗體複合物的晶體結構可能是有利的，以鑑別出抗體和人VEGF之間的接觸點。根據此處所述的技術，這些接觸殘基和相鄰殘基是置換的候選殘基。一旦得到了這些變異體，那麼可如本文所述的那樣對一組變異體進行篩選，並選出在一個或多個相關測試中有優異性能的抗體作進一步開發。另一種抗體的胺基酸變異體是是改變抗體的原來的糖基化方式。"改變"指刪去一個或多個在抗體中發現的碳水化合物分子(部分)，和/或增加一個或多個在抗體中不存在的糖基化位點。抗體的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。"N-連接"指碳水化合物部分連在天冬醯胺殘基的側鏈上。天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸這樣的三肽序列，是將碳水化合物酶連於天冬醯胺側鏈的識別序列，其中26X是除脯氨酸之外的任何胺基酸。因此，在多肽中存在任何一種這樣的三肽便會形成一個潛在的糖基化位點。"O-連接的，，糖基化指N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、或木糖等糖中的一種被連於羥基胺基酸上，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，儘管也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基絲氨酸。在抗體中添加糖基化位點，通常可通過改變胺基酸序列從而使其含有一個或多個上述的三肽序列(對於N-連接的糖基化位點而言)而實現。還可以通過在原來的抗體中添加或取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基而實現改變(對於N-連接的糖基化位點而言)。編碼抗-VEGF抗體胺基酸序列變異體的核酸分子，可用本領域中已知的各種方法製備。這些方法包括(但並不限於)從天然來源中分離出(在天然存在的胺基酸序列變異體的情況下)，或通過對早先製備的變異或非變異的抗-VEGF抗體進行寡核香酸介導的(或定點)誘變、PCR誘變、和盒式誘變而製備。(v)人抗體作為人源化的替換形式，可產生人抗體。現在可以產生轉基因動物(如小鼠)，一旦免疫，它們能夠在沒有內源免疫球蛋白產生的情況下產生所有種類的人抗體。例如，已有報導，在嵌合的種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合缺失，會導致完全抑制內源抗體的產生。將人種系免疫球蛋白基因陣列(genearray)轉入這種種系突變的小鼠中，會導致在抗原攻擊時產生人抗體。參見例如Jakobovits等人，美國科學院院報，90:2551-255(1993)和Jakobovits等人，自然362:255-258(1993);Bruggermann等人,Year.InImmuno.，7:33(1993);和美國專利5，591,669、5,589,369和5，545，807。還可從噬菌體展示文庫中產生人抗體(Hoogenboom等人，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)，227:381[1991];Marks等人，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)，222:581[1991];和美國專利5,565,332和5,573,905)。如上所述，人抗體還可在體外用激活的B細胞來產生(參見美國專利5,5W,610和5,229，275)。(vi)抗體片段在某些例子中，人源化或變異的抗-VEGF抗體是抗體片段。已經有了各種方法生產抗體片段。通常，所述片段是通過用蛋白酶消化完整的抗體而得到的(參見Morimoto等人，生物化學和生物物理學方法雜誌(JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods)24:107-117(1992)和B認nan等，科學229:81(1985))。但是，現在，抗體片段可以直接由重組宿主細胞產生。例如，可以直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段，然後化學偶合而形成F(ab')2片段(Carter等，生物技術10:163-167(1992))。在另一例子中，F(ab')2的形27成，可通過用亮氨酸拉鏈GCN4來促進F(ab')2分子的裝配。根據另一方法，Fv、Fab或F(ab')2片段可以從重組宿主細胞培養物中直接分離得到。生產抗體片段的其它方法是本領域一般技術人員眾所周知的。(vii)多特異性抗體在某些例子中，產生多特異性(如雙特異性)的人源化或變異的抗-VEGF抗體是有利的，它們具有針對至少兩個不同表位的結合特異性。代表性的雙特異性抗體可與VEGF蛋白的兩個不同表位結合。或者，抗VEGF臂可與能結合於白細胞觸發分子的臂組合，後者例如T細胞受體分子(例如CD2或CD3),或IgG的Fc受體(FcyR)例如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRni(CD16)，從而使細胞防禦機制主要針對VEGF表達細胞。雙特異性抗體還可以用於將細胞毒劑定位於表達VEGF的細胞。所述抗體具有結合VEGF的臂和結合細胞毒劑(例如皂草素、抗a幹擾素、長春花生物鹼、蓖麻毒蛋白A鏈、氨曱蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以製備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。根據另一種製備雙特異性抗體的方法，可對一對抗體分子之間的界面進行工程化，以便使從重組細胞培養物中回收的異二聚體的百分比最大化。優選的界面含有抗體恆定區的至少一部分CH3區。在該方法中，第一抗體分子界面上的一個或多個小胺基酸側鏈被用更大的側鏈(如酪氨酸或色氨酸)加以替換。與大側鏈大小相同或相似的、補償性的"空穴，，可在第二抗體分子的界面上形成，即將大的胺基酸側鏈用更小的側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)加以替換。這樣提供了一種使異二聚體比不需要的終產物(如同二聚體)的產率更高的才幾理。參見1996年9月6日出版的W096/27011。雙特異性抗體包括交聯的或"異偶聯(heteroconjugate)，，抗體。例如，異偶聯體中的一個抗體可被偶聯於親和素，而另一抗體被偶聯於生物素。這種異偶聯抗體可用任何方便的交聯方法製備。合適交聯劑在本領域中是已知的，並與多種交聯技術一起公開於美國專利No.4,676,980中。文獻中也記載了從抗體片段產生雙特異性抗體的技術。例如，雙特異性抗體可用化學連接方法製備。Brennan等，Science229:81(1985)描述了一種方法，其中完整的抗體被蛋白酶解切斷，產生F(ab')2片段。這些片段在二碌^酚複合劑亞砷酸鈉存在下被還原，從而穩定了連位的二碌u酚並防止形成分子間的二硫鍵。產生的Fab'片段接著被轉變成硫代硝基苯曱酸(thionitrobenzoate,TNB)衍生物。Fab'-TNB衍生物中的一種然後通過用巰基乙胺還原而被再轉變成Fab'-巰基，再與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物相混合，從而形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作選擇性地固定酶的試劑。在另一例子中，從大腸桿菌中直接回收的Fab'-SH片段，被體外化學偶聯形成雙特異性抗體。Shalaby等人，實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.),175:217-225(1992)各種直接從重組細胞培養物製備和分離雙特異性抗體片段的技術已有描述。例如，已用亮氨酸拉鏈生成了雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學雜誌148(5):1547-1553(1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩個不同抗體的Fab'部分連接。該抗體同二聚體在鉸鏈區被還原成單體，然後重新氧化成抗體異二聚體。該方法還可以被用來產生抗體同二聚體。Hollinger等人在美國科學院院報90:6444-6448(1993)中所述的"二體"技術，提供了另一種製造雙特異性抗體片段的機制。所述片段包含通過接頭而連接在一起的輕鏈可變區(VO和重鏈可變區(Vh)，接頭很短以致於同一鏈上的兩個功能區之間無法配對。所以，同一片段上的Vh和Vl功能區被迫與其它片段上的互樸性Vl和Vh功能區配對，由此形成兩個抗原結合所報導。參見Gruber等，免々疫學雜誌(J.Immunol.)152:5368^1994)。或者，雙特異性抗體可以是按Zapata等人，蛋白質工程(ProteinEng.)8(10):1057-1062(1995)中所述方法製備的"線性抗體"。可考慮使用二價以上的抗體。例如可以製備三特異性抗體。Tutt等人，免疫學雜誌147:60(1991)。(viii)其他修飾形式人源化或變異的抗-VEGF抗體的其他修飾形式也在範圍之中。例如，可能需要就效應子功能對本發明抗體進行修飾，從而加強抗體在例如治療癌症中的效果。例如，可在Fc區內引入半胱氨酸殘基，由此允許在該區形成鏈間二硫鍵。由此形成的同源二聚體抗體可以具有改善的內在能力和/或提高的補體介導的細胞殺傷性和抗體依賴性細胞毒性(ADDC)。參見Caron等，實驗醫學雜誌176:1191-1195(1992)和Shopes,B,,免疫學雜誌148:2918-2922(1992)。抗癌活性增強的同源二聚體抗體，還可以如Wolff等在癌症研究(CancerResearch)53:2560-2565(1993)中所述利用異源雙功能(heterobifunctional)交聯劑來製備。或者，抗體可以經改造後具有兩個Fc區，並由此加強其補體裂解性和ADDC能力。參見Stevenson等，抗癌藥的設計(Anti畫CancerDrugDesign)3:219-230(;i989)。本發明還涉及包含與細胞毒劑偶聯的所述抗體的免疫偶聯物，細胞毒劑例如化療劑、毒素(例如細菌、真菌、才直物或動物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶聯物)。用於產生所述免疫偶聯物的化療劑已在前文論述過。可以使用的酶活性毒素或其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、modeccinA《連、a/v疊3求菌素(ot-sarcin)、油牙同蛋白、dianthin蛋白、美商3各(屍/y^o/"c"^7w/cam0蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、gelonin、mitogellin、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素和單端孢菌素(tricothecenes)。有多种放射性核素可用於生成放射性偶聯的抗VEGF抗體。例如2"Bi、131I、131In、9丫和1861^。抗體與細胞毒劑的偶聯物可用各種不同雙官能蛋白偶合劑製備的，例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫代戊環(iminothiolane)(IT)、亞胺酯的雙官能衍生物(例如己二亞氨酸二曱酯鹽酸鹽)、活潑酯(例如二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮基化合物(例如二(對疊氮基苯曱醯)己二胺)、二重氮衍生物(例如二-(對重氮苯曱醯)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如曱苯2,6-二異氰酸酯)和二活性氟化合物(例如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等在科學(Science)238:1098(1987)中所述的方法來製備。碳14標記的l-異硫氰酸根合千基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種代表性的用於將放射性核素與抗體偶聯的螯合劑。參見W094/11026。在另一實施方案中，為了用於腫瘤導向，抗體可以與"受體"(例如鏈黴親和素)偶聯，並給患者使用抗體-受體偶聯物，接著用清除劑去除循環系統中的未被結合的偶聯物，然後施用與細胞毒劑(例如放射性核素)偶聯的"配體"(例如親和素)。本處所述的抗VEGF抗體還可以製成免疫脂質體。含有抗體的脂質體是利用本領域已知方法製備的，例如以下所述Epstein等，美國科學院院報82:3688(1985);Hwang等，美國科學院院報77:4030(1980);和美國專利4，485,045和4,544,545。美國專利5,013,556公開了具有更長循環時間的脂質體。特別有用的脂質體可以通過含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物，用反相蒸發法生成。將脂質體擠壓通過一定孔徑的濾器形成具有所需直徑的脂質體。如Martin等在生物化學雜誌257:286-288(1982)中所述，可通過二石克4建互換反應將本發明中抗體的Fab'片段與脂質體偶聯。脂質體中可以任選的包含化療劑(例如阿黴素)。參見Gabizon等人，國立癌症研究所雜誌(J.NationalCancerInst.)81(19)1481(1989)。30通過將抗體與可將前藥(例如肽基化療劑，參見WO81/01145)轉化成活性抗癌藥物的前藥激活酶偶聯，本發明的抗體還可以用於抗體依賴性酶介導的前藥療法(ADEPT)。例如，可參見WO88/07378和美國專利No.4,975,278。用於ADEPT的免疫偶聯物的酶組份，包括任何能以此途徑作用於前藥使之轉化為更具活性、更有細胞毒性的形式的酶。可用於本發明的該方法的酶組份包括(但不限於)用於將含磷酸根的前藥轉化成游離藥的鹼性磷酸酶；將含硫酸根的前藥轉化成游離藥的芳基硫酸酯酶；將無毒的5-氟胞嘧啶轉化成抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；用於將含肽前藥轉化成游離藥的蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L);用於轉化含D-胺基酸取代基的前藥的D-丙胺醯基羧基肽酶；用於將糖基化前藥轉化成游離藥的糖切割酶，例如P-半乳糖芬酶和神經氨酸酶；用於將P-內醯胺衍生的藥物轉化成游離藥的(3-內醯胺酶；和用於分別將在其胺氮原子上帶有笨氧基乙醯基或苯基乙醯基基團的藥物轉化成游離藥的青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶和青黴素G醯胺酶。或者，可以用具有酶活性的抗體(在本領域中又稱"抗體酶")將本發明的前藥轉化成游離的活性藥(參見Massey，自然328:457-458(1987))。可以如本文所述製備抗體-抗體酶偶聯物，用於向肺瘤細胞群輸送抗體酶。本發明的酶可以利用本領域的公知技術與抗VEGF抗體共價結合，例如利用前文所述的異源雙官能交聯劑。或者，利用本領域公知的重組DNA技術構建這樣的融合蛋白，它包含與本發明酶的至少一個功能活性部分連接的本發明抗體的至少一個抗原結合區(參見Neuberger等，自然312:604-608(1984))。在本發明某些例子中，可能需要採用抗體片段而不是完整的抗體來加強對腫瘤的穿透。此時，為了延長它的血清半衰期可能需要對抗體片段加以修飾。這可以通過例如在抗體片段中加入補救受體結合表位來做到(例如，通過對抗體片段對應區的突變，或通過將表位引入肽標記中，然後通過例如DNA或肽合成將肽標記融合在抗體片段的兩端或中部)。參見1996年10月17日出版的WO96/32478。補救受體結合表位通常構成這樣一個區域，在其中，Fc區一個或兩個環的一個或多個胺基酸殘基被轉移到抗體片段的類似位置上。較佳地，Fc區一個或兩個環的三個或更多個殘基被轉移。更佳地，表位來自(例如IgG的)Fc區的CH2區，並^C轉移到抗體的CH1、CH3或Vh區，或一個以上的此31類區域。或者，表位來自Fc區的CH2區，並被特移到抗體片段的Cl區或Vl區，或轉移到CL和V^兩個區。在一個最佳例子中，補救受體結合表位含有序列PKNSSMISNTP(SEQIDNO:17),而且可任選地含有選自下組的序列HQSLGTQ(SEQIDNO:18)、HQNLSDGK(SEQIDNO:19)、HQNISDGK(SEQIDNO:20)、或VISSHLGQ(SEQIDNO:21)，尤其當抗體片段是Fab或(Fab')2時。在另一最佳例子中，補救受體結合表位是這樣的多肽，該多肽是含有以下序列的多肽HQNLSDGK(SEQIDNO:19)、HQNISDGK(SEQIDNO:20)、或VISSHLGQ(SEQIDNO:21),以及序列PKNSSMISNTP(SEQIDNO:17)。人源化或變異的抗-VEGF抗體的共價修飾形式也在本發明範圍之內。它們的製備可以通過化學合成，或用化學法或酶法來切割抗體(如果可行)。抗體的其他類型共價修飾形式，可以通過將抗體的靶殘基與能和所選側鏈或N-端或C-端殘基反應的有機衍生劑反應，而被引入到分子中。代表性的多肽共價修飾形式在美國專利5,534,615中有描述，該專利在此引用作為參考。一種優選抗體共價修飾包括，將抗體連於各種非蛋白質的聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其方法描述於美國專利No.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192;或4,179,337中。B.載體、宿主細胞和重組方法
技術領域：
：本發明還提供了分離的編碼人源化或變異的抗-VEGF抗體的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞，以及用於產生該抗體的重組技術。為了重組產生抗體，其編碼核酸被分離出來並插入到用於進一步克隆(擴增DNA)或表達的複製載體中。在另一例子中，抗體是用例如美國專利5，204,244中所述的同源重組法產生的(該專利在此引用作為參考)。利用常規技術可方便地分離出編碼單克隆抗體的DNA並測序(例如使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。有許多載體可以使用。載體的組成通常包括(但不限於)以下之一或幾個信號序列、複製起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列，例如在1996年7月9日授權的美國專利5,534，615(該專利在此引用作為參考)中所描述。適於在本發明載體中克隆或表達DNA的宿主細胞是所述的原核、酵母或高等真核相比。適於此目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌。例如腸桿菌科(￡"&ra6ac&Waceae)如埃希氏桿菌屬Cfoc/7en'ac/n'a)(比如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文氏菌屬(￡nWm'a)、克雷伯32氏桿菌屬(i:/eZwW/a)、變形桿菌屬CPro&M力、沙門氏菌屬如鼠傷寒沙門氏菌(5"a/wo"g〃a^;/2/附wn'M附)、沙雷氏菌屬如粘質沙雷氏菌warcwca"力、志賀氏菌屬(幼/ge〃a)，以及芽胞桿菌屬如枯草桿菌和蘚樣芽胞桿菌(S.//c/^m/wvm、)(如1989年4月12日出版的DD266，710中所公開的蘚樣芽胞桿菌41P)、假單胞菌屬如綠膿假單胞菌(屍.^n^/mwa)和鏈黴菌屬。一種優選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，儘管其他的菌^^朱如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)、和大腸桿菌W3110(ATCC27，325)也是合適的。這些例子僅僅是闡述性的，並不起限制作用。用於克隆和表達栽體內的DNA的合適宿主細胞是上述的原核、酵母或其他更高級的真核細胞。用於該目的的合適原核生物包括真細菌如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科CE"/era6"c/eWaceae)如埃希氏桿菌屬(&c/7en^c/z/a)(比如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文氏菌屬(￡rw/m'a)、克雷伯氏桿菌屬(A7eZmW/a)、變形桿菌屬(屍TO&w)、沙門氏菌屬如鼠傷寒沙門氏菌(iSa/,"e〃a妙/n'羅n'ww)、沙雷氏菌屬如粘質沙雷氏菌(6"erra"awarc^cfl"力、志賀氏菌屬(幼/ge〃a)，以及芽胞桿菌屬如枯草桿菌和蘚樣芽胞桿菌(5."c/2em/w7m、)(如1989年4月12日出版的DD266，710中所^>開的蘚樣芽胞桿菌41P)、假單胞菌屬如綠膿假單胞菌(屍."wwg/mwa)和鏈黴菌屬。一種優選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，儘管其他的菌4朱如大腸桿菌B、大腸桿菌X,776(ATCC31,537)、和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些例子僅僅是闡述性的，並不起限制作用。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適用於抗-VEGF抗體編碼載體的克隆或表達宿主。S良酒酵母0Sacc/7arawycwcwev/w'ae),即常見的發麵酵母，是低級真核宿主微生物中最常用的。然而，大量其他屬、種或林通常是可得到並可用於此處的，如裂殖酵母(Sc/7/zosacc/zarawyc^;ow^);克魯維酵母屬宿主，如乳克魯維酵母(《./ac"》、脆壁克魯維酵母(A7rag//^)(ATCCl2,424)、保加利亞克魯維酵母(K.^/gan'cM》(ATCC16,045)、威克曼氏克魯維酵母(尤vWc/eram〃)(ATCC24,178)、Kwa/"/(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(尺.夯oso;/n7www)(ATCC36,906)、KAwwWo/erara和馬克斯克魯維酵母(《.war;aVwws);;巴士德畢赤氏酵母CP!'c/n'apa倉^)(EP183,070);念珠菌屬；7Wc/zcxie簡areew'4EP244,234];粗糙鏈孢黴(A^wras/wracra^a);i午旺氏酵母屬(Sc/2wa"m'omyces)西方^午旺氏酵母(5"c/z測wm'謹ycesocc/tfe"to/z、)；和絲狀真菌如鏈孑包黴屬(A^wn^/ora)、青黴菌屬(pe"/"7/Z應)、7b(ypoc/"(i/畫和麴黴屬(A/^rg〃/w力如構巢麴黴"油/"w力和黑麴黴(」.m'ger)。適用於表達糖基化抗-VEGF抗體的宿主細胞可衍生自多細胞生物體。無脊推動物細胞的例子包括植物和昆蟲的細胞。已經鑑別出許多杆狀病毒抹和變異抹，以及相應的來自宿主[如草地夜蛾(S/0t/0/7/eraWa)(蟲蜀)、埃及4尹蚊(/lec/esaeg少;f0(蚊子)、白糹丈4尹蚊04et/esa/Z)o/7zWws)(蚊子)、果蟲電(Z)n9so;/zz7(3me/awogos化r)(果蟲龜)和家蠶(5om6少xmon〕]的允"i午'l"生昆蟲宿主細胞。用於轉染的各種不同的病毒抹是公眾可以獲得的，如苜蓿銀紋4艾蛾04wtograp/wca/z/orm'CG)NPV的L-1變異體和家蠶NPV的Bm-5抹，而且這類病毒可根據本發明在此處用作病毒，尤其是用於轉染草地夜蛾OS^oflb//era/rag0enia)細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛花、番茄和菸草的植物細胞培養物也可以被用作宿主。然而，脊推動物細胞是最感興趣的，而通過培養繁殖脊推動物細胞(組織培養)已經成為一種常規的程序。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子是，被SV40轉化的猴腎CVl系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎細胞系(293細胞或亞克隆的懸浮培養生長的293細胞，Gmham等人，J.GenVirol.36:59[1977]);幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卯巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，美國科學院院才艮,77:4216[1980]);小鼠Sertoli細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251[1980]);猴腎細胞(CV1ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細月包(HELA，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK,ATCCCCL34);水牛鼠(buffalomt)肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138,ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2,HB8065);小鼠乳房腫瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68[1982]);MRC5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系(HepG2)。宿主細胞用本發明上述的用於產生抗-VEGF抗體的表達或克隆載體進行轉化，然後在常規的營養培養基上培養，其中培養基可被加以改進以便誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼所需序列的基因。用於產生本發明的抗-VEGF抗體的宿主細胞可在各種不同培養基中培養。市售的培養基如Ham'sF10(Sigma)、極限必需培養基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM，Sigma)都適合培養這些宿主細胞。此外，任何在例如下列文獻中描述的培養基也可用作宿主細胞的培養基Ham和Wallace,Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人，分析化學(Anal.Biochem)102:255(1980),美國專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利RENo.30,985。所有這些培養基都可按需要添加激素和/或其他的生長因子(如胰島素、運鐵蛋白、或表皮生長因子[EGF])、鹽類(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸普)、抗生素(如慶大黴素(GentamycinTM)藥物)、痕量元素(定義為以微摩爾級的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等價的能量源。任何其他必要的補充物也可以合適的濃度加入，這是本領域技術人員知曉的。培養條件如溫度、pH等是以往用於培養所選的表達宿主細胞的條件，這是一般技術人員所熟知的。在使用重組技術時，抗體可以產生在細胞內、周質間隙內或直接分泌在培養基中。如果抗體產生在細胞內，第一步是通過例如離心或超濾去除顆粒狀碎片(或者是宿主細胞或者是裂解片段)。Cater等人在生物技術(Bio/Technology)10:163-167(1992)中，敘述了分離分泌在大腸桿菌周質間隙內的抗體的方法。簡而言之，在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯曱基磺醯氟(PMSF)存在下融解細胞糊約30分鐘。細胞碎片可以通過離心去除。如果抗體分泌在培養基中，通常，首先用市售的蛋白質濃縮濾膜(例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元)將得自此類表達系統的上清液濃縮。可以在任何前述步驟中加入諸如PMSF這樣的蛋白酶抑制劑以抑制蛋白酶解，並加入抗生素以阻止外來汙染菌的生長。由細胞製得的抗體組合物可以利用例如羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析和親和色譜來純化，其中親和色鐠是最好的純化技術。A蛋白是否適合用作親和性配體取決於抗體中的免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。A蛋白可以用於純化基於人yl、Y2或y4重鏈的抗體(Lindmark等，免疫學方法雜誌(J.Immunol.Meth.)62:l-13(1983))。G蛋白可推薦用於所有的鼠同種型和人丫3(Guss等，歐洲生物學雜誌(EMBO)5:1567-1575(1986))。對於固定親和性配體的基質，最常用的是瓊脂糖，但是也可以用其它基質。機械性能穩定的基質例如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以獲得比瓊脂糖更快的流率和較短的處理時間。如果抗體包含Ch3區，可以使用BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Philipshburg，NJ)來純化。根據待回收的抗體，也可以使用其它蛋白質純化技術，例如離子交換柱分級、乙醇沉澱、反相HPLC、矽膠柱色譜、肝素SepharoseTM上的色譜、陰離子或陽離子交換樹脂上的色譜(例如聚天冬氨酸色譜柱)、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱。35在任何初步純化步驟之後，可以對包含感興趣抗體和汙染物的混合物進行低pH疏水性色譜，用pH在約2.5-4.5的洗脫緩沖液進行，最好在低鹽濃度(例如約0-0.25M的鹽)下進行。C.藥物製劑受的載體、賦形劑或穩定劑混合，製成凍幹製劑或水溶液形式的抗體治療用製劑(《雷明頓藥物科學》(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版，Osol,A.編(1980))。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在使用劑量和濃度對接受者是無毒的，它們包括例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸的緩沖液；包括維生素C和曱硫氨酸在內的抗氧化劑；防腐劑(例如氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；氯化苯曱烴銨；氯化千乙氧銨；苯酚、丁醇或千醇；對羥苯曱酸曱酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間曱苯酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘氨酸、谷胺醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖或其它糖，其中包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA;糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬絡合物(例如Zn-蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫TMpiuronicsTM或聚乙二醇(PEG)。本發明製劑還可以包含一種以上治療特殊狀況所需的活性混合物，它們最好具有互補的活性但是不相互產生負影響(見下面的章節F)。所述分子，以適合各自預定目的所需的有效含量相互組合。活性成份還可以包裹在分別通過凝聚法或界面聚合法製備的例如羥曱基纖維素或明膠膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢中。亦可在膠態藥物釋放系統(例如脂質體、白蛋白微珠、微乳液、毫微顆粒和毫微膠囊)或粗滴乳液(macroemulsion)。(《雷明頓藥物科學》(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編(1980))中敘述了此類技術。用於體內使用的製劑必須是無菌的。通過滅菌濾膜過濾可以方便地做到這一點。可以製備緩釋製劑。合適的緩釋製劑包括例如包含所述抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質體，所述的基質體是有形的物體，例如膜或微膠嚢。合適的緩釋基質體包括例如聚酯、水凝膠(例如聚(曱基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-穀氨酸和L-穀氨酸y乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、諸如LupronDepotTM(*乳酸-乙36醇酸共聚物和leuprolideacetate組成的可注射微球)之類可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之類聚合物能夠使分子釋放持續100天以上，有些水凝膠可在較短的時間內釋放蛋白質。當膠嚢化的抗體在體內保留較長時間時，它們可能會因為在37r接觸水分而變性或凝聚，結果造成生物活性降低並可能造成免疫原性改變。根據有關的機制可以設計出合理的穩定化策略。例如，如果發現凝聚機制是通過硫-二硫鍵互換反應而形成了分子間的S-S鍵，穩定化可以是通過修飾巰基殘基、凍幹酸性溶液、控制含水量、使用合適的添加劑和設計特殊的聚合基質組合物而達到。D.抗體的非治療性用途本發明的抗體可以用作親和純化試劑。在這種方法中，抗體利用本領域公知的方法固定在例如Sephadex樹脂或濾紙的固相上。^皮固定的抗體與待純化的含VEGF蛋白(或其片段)的樣品接觸，然後用合適的溶劑洗滌載體，所述的溶劑能夠基本上去除樣品中除了與固定化抗體結合的VEGF蛋白之外所有其它物質。最後，用另一種能將VEGF蛋白從抗體上釋放的溶劑洗滌載體，例如pH5.0的甘氨酸緩沖液。抗VEGF抗體還可以用於VEGF蛋白的診斷性分析中，例如4企測其在特定細胞、組織或血清中的表達。這種診斷方法可用於診斷癌症。用於診斷時，抗體通常用可4全測分子進行標記。有許多標記可以使用，它們可以大致如下分類(a)放射性同位素，例如"S、14C、1251、311和1311。可以利用例如《現代免疫學方法》(CurrentProtocolsinImmunology)第l和第2巻，Coligen等編，Wiley-Interscience，NewYork,NewYork,Pubs.(1991)中所述的方法以放射性同位素來標記抗體，放射性可以利用閃爍計數法來測定。(b)焚光標記，例如稀土螯合劑(銪螯合劑)或螢光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹醯，麗絲胺，藻紅素和德克薩斯紅(Texasred)。螢光標記可以利用例如上文《現代免疫學方法》中所述的方法與抗體偶聯。螢光可以利用螢光計來定量。(c)有各種酶底物標記可供使用，而美國專利4，275,149公開了其中部分。所述的酶通常催化可以用各種技術測定的生色底物的化學改變。例如，酶催化底物的顏色變化，這種變化可以用分光光度計來測定。或者，酶改變底物的焚光性或化學發光性。前文已經說明了定量測定焚光變化的技術。化學發光底物因化學反應而被電激發，並由此發光，發出的光可以被測定(例如利用化學光度計)或向螢光受體供能。酶標記包括例如螢光素37酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利4，737,456)，螢光素，2,3-二氬二氮雜萘二酮P^-dihydrophthalazinediones),蘋果酸脫氬酶，脲酶，過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)，鹼性磷酸酶，(3-半乳糖苷酶，葡糖澱粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，雜環氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)，乳過氧化物酶，微過氧化物酶等。O'Sullivan等在"製備用於酶免疫分析的酶-抗體偶聯物的方法，，，《酶學方法》("MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay，，(MethodsinEnzym.)(J.Langone和H.VanVunakis編)，Academicpress,NewYork,73:147-166(1981)中描述了酶與抗體偶聯的技術。酶-底物的組合包括，例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)和作為底物的氫過氧化物酶，其中的氫過氧化物酶使染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或鹽酸3，3'，5,5'-四曱基聯苯胺(TMB))氧化；(ii)鹼性磷酸酶(AP)和作為生色底物的對硝基苯磷酸；(iii)P-D-半乳糖苷酶((3-D-Gal)和生色底物(例如對硝基苯-(3-D-半乳糖苷酶)或螢光底物4-methylumbelliferyl-P-D-半乳糖苷酶。對本領域技術人員來說還有許多其它酶-底物組合。對這些組合的綜述可參見美國專利4275149和4318980。有時，標記物與抗體間接偶聯。技術人員也知道各種獲得所述組合的方法。例如，抗體可以與生物素偶聯，上述三大類標記中的任何一種都可以與親和素偶聯，或者正相反。生物素選擇性地結合親和素，標記可以間接方式與抗體偶聯。或者，為了將標記與抗體間接偶聯，抗體可以與小的半抗原(例如地高辛)偶聯，而上述不同類型的標記之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯。這樣就獲得的標記與抗體的間接偶聯。在本發明另一實施方案中，抗VEGF抗體不必被標記，其存在可以利用標記過的結合該VEGF抗體的抗體來4企測。本發明抗體可以用在任一種已知的分析方法中，例如竟爭性結合分析，直接或間接夾心分析和免疫沉澱分析。Zola單克隆抗體技術手冊》(MonocloneAntibodies:AManualofTechniques),pp.l47-158(CRCPress,Inc.,1987)。竟爭性結合分析依賴於標記過的標準物與被測樣品中分析物竟爭結合有限量抗體的能力。被測樣品中VEGF蛋白的量與與抗體結合的標準物的量成反比。為了方便測定被結合標準物的量，通常令抗體在竟爭前或竟爭標準物和分析物分離。夾心分析法涉及使用兩種抗體，各自結合待測蛋白不同的免疫原性部位或表位。在夾心分析中，被測樣品分析物與固定在固相載體上的第一抗體結合，然後第二抗體與分析物結合，由此形成不溶性三部分複合物。參見美國專利4，376,110。第二抗體本身可以是用可4企測部分標記過的(直接夾心分析法)，或者利用被可檢測部分標記的抗免疫球蛋白抗體來測定(間接夾心分析法)。例如，夾心分析法之一是ELISA，其中的可檢測部分是酶o對於免疫組織化學來說，腫瘤樣品可以是新鮮的或者冷凍的或者包在石蠟和以福馬林之類防腐劑固定的。抗體還可以用於體內診斷分析。通常，以放射性核素(例如"'In、"Tc、14C、131I、125I、3H、"P或"S)標記抗體，使得可以利用免疫閃爍照相術來定位腫瘤。E.診斷試劑盒為了方便，本發明抗體可以試劑盒的形式提供，即將預定量的試劑與進行診斷分析的說明書的包裝組合在一起。如果抗體是用酶標記的，試劑盒將包含酶所需的底物和輔因子(例如提供可測定的生色團和螢光團的底物前體)。此外，還可能包括其它添加劑，例如穩定劑、緩衝劑(例如封閉緩衝劑或裂解緩衝劑)等。為了使所提供的試劑濃度能使得分析的靈敏度最高，各種試劑的相對量變化很大。具體地說，試劑可以是乾粉，通常是凍乾粉末形式的，可包括賦形劑在內，它們一經溶解將形成具有合適濃度的試劑溶液。F.抗體的治療用途對於治療用途，可將上述的在藥學上可接受的劑型中的本發明抗-VEGF抗體，用已知方法施用於哺乳動物，最好是人。所述方法包括在靜脈內(例如靜脈注射濃縮藥團(bolus)或在一段時間內連續輸注)、肌內、腹膜內、腦脊髓腔內、皮下、動脈內、滑膜腔內、鞘內注射、口服、局部或吸入途徑使用。抗體還可合適地通過瘤內、瘤周圍、損傷部位內、損傷部位周圍的途徑給藥，以發揮局部和全身的治療效果。腹膜內途徑預計特別有用，例如對於治療卵巢癌。為了預防或治療疾病來說，抗體的合適劑量將取決於上述定義的待治疾病的類型、疾病的嚴重程度和病程、抗體給予是用來預防還是用來治療、以前的治療情況、患者病史和對抗體的應答性，以及主治醫師的獨立39判斷。抗體適合一次性或系列地給患者使用。抗-VEGF抗體可用於治療各種腫瘤和非腫瘤的疾病。可被治療的腫瘤和相關病症包括乳房癌、肺癌、胃癌、食管癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、泡膜細胞瘤、卵巢男胚瘤、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮內膜增生、子宮內膜異位、纖維肉瘤、絨毛膜上皮癌、腦癌和頸癌、鼻咽癌、喉癌、肝母細胞瘤、Kaposi氏肉瘤、黑色素瘤、皮膚癌、血管癌、海綿狀血管瘤、成血管細胞瘤、胰腺癌、成視網膜細胞瘤、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、神經鞘瘤、少突神經膠質瘤、成神經管細胞瘤、成神經細胞瘤、4黃紋肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、曱狀腺癌、Wilm氏瘤、腎細胞瘤、前列腺瘤、與斑痣性錯構瘤病相關的血管異常增生、水腫(如與腦瘤相關的水腫)以及Meigs氏綜合症。可被治療的非肺瘤性病症包括類風溼性關節炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、糖尿病，和其他增生性視網膜疾病包括早熟性視網膜疾病、晶狀體後纖維增生症、新生血管性青光眼、年齡相關性黃斑變性、甲狀腺增生(包括Grave氏病)、角膜和其他組織的移植、慢性炎症、肺炎、腎病綜合症、先兆子癇、腹水、心包積液(如與心包炎相關的)和胸膜腔積液。年齡相關性黃斑變性(AMD)是在老年人群中導致嚴重喪失視力的主要原因。滲出性AMD的特徵是脈絡膜的新血管生成和視網膜色素上皮細胞的脫落。因為脈絡膜的新血管生成與預後劇烈惡化相關，因此，本發明的抗-VEGF抗體預期在降低AMD嚴重性方面特別有用。根據疾病的類型和嚴重程度，不論是一次或多次分開給藥，還是連續輸注，l微克/公斤至50毫克/公斤(例如0.1-20毫克/公斤)的抗體是給患者使用的最初候選劑量。典型的日劑量或周劑量可在約l微克/公斤-20毫克/公斤或以上，這取決於上述提到的因素。對於幾天或更長時間內的重複給藥(這取決於病況)來說，治療需持續直至疾病症狀發生所期望的抑制。但是，也可以使用其它給藥方案。所述治療的進展可以方便地利用常規技術和分析方法(例如放射性肺瘤成像技術)來監測。根據本發明的另一例子，抗體的預防或治療疾病有效性可以通過連續地施用，或者通過與其他對該目的有效物質聯用而提高。這些有效物質有例如肺瘤壞死因子TNF，能夠抑制或中和酸性或鹼性成纖維細胞生長因子(FGF)或肝細胞生長因子(HGF)的血管生成活性的抗體，能夠抑制或中和組織因子、C蛋白或S蛋白的促凝活性的抗體(見Esmon等人，PCT專利申請出版物No.WO91/01753，1991年2月21日出版)，能結合於HER2受體的抗體(參見Hudziak等人，PCT專利申請出版物No.WO89/06692,1989年7月27日出版)，或一種或多種常規的治療劑例如烷基化試劑、葉酸拮抗劑、抗-核酸代謝的代謝產物、抗生素、嘧啶類似物、5-氟尿嘧啶、順鉑、嘌呤核苷、胺、胺基酸、三唑核苷、或皮質類固醇。這些其他物質可以存在於被施用的組合物中，或者被分開施用。此外，抗體可合適地連續施用或與放射性治療(無論是用放射性物質進行輻射還是給藥)聯用。在一個例子中，用聯合療法攻擊腫瘤的血管生成。將抗體和一種或多種抗-VEGF拮抗劑施用於肺瘤病人，用量為通過例如觀察肺瘤或轉移性病灶(如果有的話)的壞死而確定的治療有效量。這種療法被繼續，直至觀察不到進一步的有利效果或者臨床檢測顯示沒有肺瘤或轉移性病灶的跡象。然後，施用TNF，或者單獨施用，或者與下列的輔助性試劑聯用例如a-、P-或y-幹擾素，抗-HER2抗體、heregulin、抗-heregulin抗體、D匿因子、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素2(IL-2)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，或者促進腫瘤微血管凝結的物質如抗-C蛋白抗體、抗-S蛋白抗體、或C4b結合蛋白(見Esmon等人，PCT專利申請出版物No.WO91/01753，1991年2月21日出版)，或者熱，或者輻射。因為輔助性試劑的有效性有所不同，因此需要按常規的矩陣篩選法比較其對肺瘤的影響。施用抗-VEGF抗體和TNF可重複進行，直至達到所需的臨床效果。或者，將抗-VEGF抗體和TNF以及任選地的輔助性試劑一起施用。當在實體瘤位於四肢或其他懷疑與全身循環系統隔開的部位時，此處公開的治療劑可被施用於隔開的腫瘤或器官。在其他例子中，可將FGF或血小板衍生生長因子(PDGF)拮抗劑(例如抗-FGF或抗-PDGF中和抗體)與抗-VEGF抗體一起施用於病人。在傷口癒合或需要新血管生成的期間，最好宜停止抗-VEGF抗體治療。G.產品本發明另一實施方案提供了一種含有用於治療上述疾病的材料的產品。該產品包括容器和標籤。合適的容器包括例如普通瓶、藥瓶、注射器和試管。容器可以用各種材料製成，例如玻璃或塑料。容器中含有治療疾病的有效組合物，並具有一個無菌的出入口(例如容器可以是一個有塞子的靜脈輸液袋或藥瓶，該塞子可用皮下注射針頭穿透)。該組合物中的有效成份是抗VEGF抗體。容器上或與容器相聯的標籤說明組合物所治療的特定病症。產品還可以含有另一個容器，其中包含藥學上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩衝液、林格氏(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根據商業上的需要或使用者的需要，它還可以包括其它材料，例如其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、以及附有使用說明的包裝說明書。41實施例l該實施例描述了具有有利的治療特性的人源化抗-VEGF抗體的產生。材料和方法鼠A4.6.1單克隆抗體的克隆和小鼠-人嵌合Fab的構建鼠抗-VEGF單克隆抗體A4.6.1已被描述過(Kim等人，生長因子(GrowthFactors)7，53(1992);Kim等人，自然(Nature)362,841(1993))。從產生抗-VEGF單克隆抗體A4.6.1的雜交瘤細胞中用RNAsol(TEL-TEST)分離出總RNA，然後用oligo-dT引物和SuperscriptII系統(GIBCOBRL,Gaithersburg,MD)反向轉錄成cDNA。根據抗體輕鏈和重鏈的N端胺基酸序列，合成簡併的寡核香酸引物混合物，然後用作正向引物。反向引物根據從鼠輕鏈亞組kV和重鏈亞組II(Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,(5th),PublicHealthService,NationalInstistutesofHealth,Bethesda,MD(1991))獲得的構架4序列製備。在聚合酶鏈反應(PCR)擴增之後，將DNA片段連於TA克隆載體(Invitrogen,SanDiego,CA)。對8個克隆的輕鏈和重鏈都進行測序。一個具有輕鏈VL區共有序列的克隆和一個具有重鏈VH區共有序列的克隆，被分別亞克隆入含人CL和CHI區的pEMXi載體(Werther等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)157:4986-4995(1996))，從而產生鼠-人嵌合抗體。這種嵌合的F(ab)由在胺基酸SerHl13處融合於人CHl區完整的鼠A4.6.1VH區以及在胺基酸LysL107處融合於人CL區的完整的鼠A4.6.1VL區構成。嵌合F(ab)的表達和純化與人源化F(ab)相同。嵌合F(ab)被用作結合測試中的標準物。鼠的和人源化F(ab)的計算機立體圖模型VL和VH區的序歹'_1(圖1A和1B)被用來構建鼠A4.6.1VL-VH區的計算機立體圖模型。該模型被用來確定哪些構架殘基應被引入人源化抗體。人源化F(ab)模型的構建還被用來證實正確選擇了鼠構架殘基。模型的構建按早先描述的方法進行(Carter等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:4285畫4289(1992)和Eigenbrot等人，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)229:969-995(1993))。構建人源化的F(ab):用於誘變和在大腸桿菌中表達的質粒pEMX!早已被描述過(Werther等人，同上)。簡而言之，該質粒含有編碼共有的人k亞組I輕鏈(VLkI-CL)和共有的人亞組III重鏈(VHIII-CH1)的DNA片段以及鹼性磷酸酶啟動子。VL和VH共有序列的使用，早已被描述過(Carter等人，同上)。為了構建人源化A4.6.1的第一個F(ab)變異體F(ab)-l，在pEMX,的含脫氧尿苷的模板上進行定點誘變(Kunkel等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:488-492(1985))。將根據Kabat等人(同上)的6個CDR變為鼠A4.6.1序列。因此，F(ab)-l由完整的人構建(VLK亞組I和VH亞組III)和6個完整的鼠CDR序列構成。所有其他F(ab)變異體的質粒是用F(ab)-1的質粒模板構建的。將質粒轉入大腸桿菌XL-1Blue林(Stmtagene,SanDiego，CA)中，以製備雙鏈和單鏈DNA。對於每種變異體，用雙脫氧核苷酸法(Sequenase,U.S.BiochemicalCorp.,Cleveland,OH)乂十編碼輕4連和重4連的DNA進行全部測序。質粒被轉入大腸桿菌16C94朱(這是MM294的一種衍生菌抹)，接種在Luria肉湯平板(含50微克/毫升羧苄青黴素)，然後選擇有蛋白質表達的單一克隆。單一克隆在5毫升Luria肉湯-100毫克/毫升羧苄青黴素中37。C生長5-8小時。將5毫升培養物加至500毫升AP5-50微克/毫升羧千青黴素中，在4升帶擋板的搖瓶中於30。C生長20小時。AP5培養液是在1升水中含有1.5克葡萄糖，ll.O克HycaseSF、0.6克酵母提取物(已檢驗合格)、0.19克MgS04(無水)、1.07克NH4C1、3.73克氯化鉀、1.2克氯化鈉、120毫升1M三乙醇胺，pH7.4,然後通過0.1mmSealkeen過濾器滅菌過濾。細胞通過在l升離心瓶中於3000xg離心而收穫，上清液被棄去。在水凍l小時後，將沉澱再懸浮於25毫升冷的10mMTris-1mMEDTA-20。/o蔗糖，pH8.0中。加入250毫升0.1M苯曱脒(Sigma,St.Louis,MO)以抑制蛋白水解。在冰上輕柔攪拌3小時後，樣品在40000xg離心15分鐘。然後將上清液上樣於用10mMTris-1MMEDTA(pH7.5)平#f過的G蛋白-SepharoseCL-4B(Pharmacia,Uppsala,Sweden)柱(0.5毫升床體積)。柱用10毫升10mMTris-1MMEDTA(pH7.5)洗滌，然後用3毫升0.3M甘氨酸(pH3.0)洗脫入1.25毫升1MTris(pH8.0)中。用Centricon-30(Amicon,Beverly,MA)將F(ab)的緩沖液換成PBS，並濃縮至終體積為0.5毫升。對所有F(ab)進行SDS-PAGE凝膠電泳，以確定純度，每種變異體的分子量用電噴質譜法驗證。嵌合的和人源化IgG的構建和表達為了產生嵌合的(chlgGl)和人源化(hulgG1)A4.6.1的人IgG1變異抗體，將合適的鼠或人源化VL和VH區(F(ab)-12,表2)亞克隆入早已描述過的各個pRK載體(Eaton等人，Biochemistry25:8343-8347(1986))。編碼每種變異體的完整輕鏈和完整重鏈的DNA，用雙脫氧核苷酸測序法進行驗證。為了瞬時表達變異抗體，用高效程序(Gorman等人，DNAProt.Eng.Tech.2:3-10(1990))將重鏈和輕鏈質粒共轉入人293細胞(Graham等人，J.Gen.Virol.36:59-74(1977))。培養基被換成無血清型，並在5天之內每天收穫。從合併的上清液中用A蛋白-SepharoseCL-4B(Pharmacia)純化抗體。洗脫抗體的緩沖液用Centricon-30(Amicon)交換成PBS，濃縮至0.5毫升，用Millex-GV(Millipore,43Bedford,MA)滅菌過濾，並在4。C貯存。為了穩定地表達最終的人源化IgGl變異抗體(rhuMAbVEGF)，用設計的共表達重鏈和輕鏈的雙順反子型(dicistronic)載體(Lucas等人，《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)24:1774-79(1996))轉染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。將質粒通過脂質轉染法引入DP12細胞(這是由L.Chasin(ColumbiaUniversity)開發的CHO-K1DUXBll細胞系的一種專有衍生抹)，然後根據在無GHT的培養基上的生長情況而選擇(Chisholm，V.Highefficiencygenetransferinmammaliancells.In:Glover,D.M.,Hames,BD.C7om>zg4Mamma//aw，fems.OxfordUniv.Press.Oxfordpp1-41(1996))。隨機挑選出約20個未擴增的克隆，並再接種於96孔板。用ELISA監測各菌落的相對特異性產量，以定量每個孔中在3天後所積累起的全長人IgG數量，一種螢光染料CalcienAM被用作每個孔中存活細胞的代用標記物。根據這些數據，選擇了數種未擴增的克隆用於在氨曱蝶呤濃度逐漸增加下進一步擴增。在10、50和100nM氨曱蝶呤下存活的各克隆被選出，轉移至96孔板以便進行產量篩選。一個重複性地表現出高特異性產量的克隆在T-燒瓶中繁殖並用於接種旋轉培養基。在數次傳代後，適應懸浮的細胞被用於接種生產培養基，該培養物位於含GHT、無血清並添加有各種激素和蛋白質水解酶的培養基中。收穫的含rhuMAbVEGF的細胞培養液，用A蛋白-SepharoseCL-4B純化。該步驟後的純度約為99%。用離子交換色譜步驟進行隨後的純化至均質。最終的純化抗體的內毒素含量小於0.10eu/mg。F(ab)和IgG的定量為了定量F(ab)分子，ELISA板用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中的2微克/毫升羊抗-人IgGFab(OrganonTeknika，Durham,NC)在4。C進行包被，然後用PBS-0.5。/。牛血清白蛋白(封閉緩衝液)在室溫下封閉l小時。標準物(0.78-50ng/ml人F(ab))購自Chemicon(Temecula,CA)。樣品在PBS-0.5。/。牛血清白蛋白(封閉緩衝液)-0.05°/。聚山梨醇酯20(分析緩衝液)作一系列稀釋，在板上孵育2小時。被結合的F(ab)的檢測，是用辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgGF(ab)(OrganonTeknika),再用3，3,5'，5'-四甲基聯苯胺(Kirkegaard&PerryLaboratories,Ga他erburg，MD)作為底物。在各步驟之間板被洗滌。吸光度是在Vmax板閱讀器(MolecularDevices,MenloPark,CA)上於450納米處讀取。標準曲線用四參數非線性回歸曲線擬合程序進行擬合。在標準曲線範圍內的數據點被用來計算樣品的F(ab)濃度。全長抗體濃度的確定，是用羊抗-人IgGFc(Cappel，Westchester,PA)進行捕獲並用辣才艮過氧化物酶標記的羊抗-人Fc(Cappel)進行檢測。人的IgG1(Chemicon)被用作標準物。VEGF結合分析為了測量F(ab)的VEGF結合活性，ELISA板用2微克/毫升針對人IgGFc的羊抗-人IgGF(ab')2(JacksonImmunoResearch，WestGrove,PA)進行包被，然後用上述的封閉緩沖液封閉。加入用封閉緩衝液配的含3ng/mlKDR-IgG(Park等人，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)269:25646-25645(1994))的稀釋條件培養液，在板上孵育l小時。將標準物(6.9-440ng/ml嵌合的F(ab))和2倍系列稀釋的樣品與2nM生物素化的VEGF在管中一起孵育1小時。然後將管中的溶液轉移至ELISA板並孵育1小時。洗滌後，檢測結合於KDR的生物素化VEGF,其中用辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素(Zymed,SouthSanFrancisco,CA或Sigma，St.Louis,MO)，再用3，3，5',5'-四甲基聯苯胺作為底物。效價曲線用四參數非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph,SynergySoftware,ReadingPA)進行擬合。計算對應於標準效價曲線中點吸光度的F(ab)變異抗體的濃度，然後除以對應於標準效價曲線中點吸光度的標準物濃度。對全長IgG的分析與F(ab)相同，不同點在於分析緩衝液含有10%人血清。BIAcoreTM生物傳感器分析用BIAcore生物傳感器(Karlsson等人，Methods:AComparisontoMethodsinEnzymology6:97-108(1994))比4交人源化的和嵌合的F(ab)的VEGF結合性。F(ab)的濃度用定量胺基酸分析加以確定。按製造商的說明(Pharmacia)，通過伯胺基團將VEGF偶聯於CM-5生物傳感器晶片。解離速率(off-rate)動力學的測量是通過用F(ab)(35微升2)aMF(ab),流速為20微升/分鐘)飽和晶片然後切換至緩沖液(PBS-0.05。/。聚山梨醇酯20)。0-4500秒的數據點被用作解離動力學分析。通過ln(R0/R)-時間曲線的斜率，獲得解離速率常數(k。ff)，其中R0是在t-0時的信號，而R是各時間點時的信號。結合速率(on-rate)動力學是用F(ab)的2倍系列稀釋液(0.0625-2mM)進行測量的。對於每種F(ab)濃度，用BIAcoreTM動力學評估軟體按Pharmacia生物傳感器手冊中所述的方法，從ln(-dR/dt)-時間曲線得出斜率Ks。R是在時間t時的信號。在80與168、148、128、114、102和92秒之間的數據分別用於0.0625、0.125、0.25、0.5、l和2mMF(ab)。結合速率常數(K。n)是通過Ks-F(ab)濃度曲線的斜率而得出。在每輪循環結束時，通過注入5微升50mM鹽酸(流速20微升/分鐘)去除結合的F(ab)，從而使晶片再生。內皮細胞生長分析基本上按以前所述的方法(Leung等人,科學(Science)246:1306-1309(1989))，在補充有10%牛血清、2mM穀氨醯胺和抗生素的低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)(GIBCO)(生長培養基)中，培養牛腎上腺皮質衍生毛細血管內皮細胞。對於促有絲分裂分析，將內皮細胞以6xl(^細胞/孔的密度接種於6孔板的生長培養基中。muMAbVEGFA4.6.1或rhuMAbVEGF的加入濃度為l-5000ng/ml。在2-3小時後，加入純化的大腸桿菌表達的rhVEGF165至終濃度為3ng/ml。對於特異性對照，以每種抗體以5000ng/ml的濃度加至內皮細胞，或者單獨加入，或者在2ng/mlbFGF存在下加45入。在5或6天之後，通過暴露於胰蛋白酶而使細胞解離，並在Coulter計數器(CoulterElectronics,Hialeah，FL)上計數。用四常數曲線擬合程序(KaleidaGraph)分析數據。體內腫瘤研究按以前所述的方法，在補充有10%胎牛血清、2mM穀氨醯胺和抗生素的DMEM/F12中培養人A673成橫紋肌細胞瘤細胞(ATCC;CRL1598)(Kim等人，自然(Nature)362:841-844(1993)和Borgstrom等人，癌症研究(CancerRes.)56:4032-4039(1996))。將6-10周齡的雌性BLAB/c棵鼠，在背部區域皮下注射200樣i升體積、2xl(^個腫瘤細胞。然後用muMAbVEGFA4.6.1、rhuMAbVEGF或針對gpl20蛋白的對照單克隆抗體處理動物(Kim等人,自然(Nature)362:841-844(1993))。兩種抗-VEGF單克隆抗體的施用劑量是0.5和5mg/kg;而對照單克隆抗體的給藥劑量是5mg/kg。在腫瘤細胞接種開始後24小時，每種單克隆抗體在腹膜內一周施用2次，體積各為100微升。每組由10隻小鼠構成。每周測定肺瘤大小。在腫瘤細胞接種4周後，動物被安樂死亡，然後取出肺瘤並稱量。用ANOVA進行統計分析。結果人源化人重鏈亞組III和輕鏈亞組Kl的共有序列被用作人源化構架(Kabat等人，同上)(圖1A和1B)。該構架已經被成功地用於使其他鼠抗體人源化(Werther等人，同上；Carter等人，同上；Presta等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)151:2623-2632(1993);和Eigenbrot等人,Proteins,18:49-62(1994))。CDR-H1包括殘基H26-H25。其他CDR根據Kabat等人(同上)。所有的人源化變異抗體最初以大腸桿菌中表達的F(ab)形式製備，然後根據結合性進行篩選。500毫升搖瓶的典型產量是O.1-0.4毫克F(ab)。嵌合的F(ab)被用作結合分析中的標準物。在最初的變異抗體F(ab)-1中，CDR殘基被從鼠抗體轉移到人構架上，並且根據鼠和人源化F(ab)模型將H49位殘基(在人中為Ala)改為鼠的Gly。此外，產生了由嵌合重鏈/F(ab)-l輕鏈構成的F(ab)(F(ab)-2)和由F(ab)-l重鏈/嵌合輕鏈構成的F(ab)(F(ab)-3),並測試其結合性。F(ab)-l的結合親和力比嵌合F(ab)高100倍(表2)。F(ab)-2和F(ab)-3之間結合親和力的比較提示，在F(ab)-lVH區中的構架殘基需要被改變以提高結合力。表2:人源化抗-VEGFF(ab)變異抗體對VEGFa的結合tableseeoriginaldocumentpage47抗-VEGFF(ab)變異抗體與生物素化的VEGF—起孵育，然後轉移至包被有KDR-IgG(Park等人，同上)的ELISA板b鼠殘基帶下劃線；殘基編號根據Kabat等人(同上)。c平均值和標準差是各獨立分析中計算出的比率的平均值；嵌合F(ab)的EC50是0.049士0.013mg/ml(1.OnM)4倍(表2)。對鼠和人源:F(ab)模型的研究揭示，':埋在，L-VH界面中^"且與CDR-H3作用的殘基L46(圖2),可能在確定CDR-H3的構型和/或影響VL和VH區相互關係方面起作用。在L46中當鼠的Val與人的Leu交換(F(ab)-5)，結合親和力增加了近4倍(表2)。3個其他的包埋構架殘基也根據分子模型進行了評估H49、H69和H78。H69位可影響CDR-H2構型，而H78位可影響CDR-H1構型(圖2)。當各殘基從人的變為鼠的對應殘基時，在每種情況下都使結合力增加了2倍(F(ab)-6和F(ab》7，表2)。當兩者同時改變時，結合力增加了8倍(F(ab)-8，表2)。最初包含的H49殘基是鼠的Gly;當變為人共有的對應殘基Ala時，結合力下降了15倍(F(ab)-9，表2)。在F(ab)-1O和F(ab)-11中，構架環3(FR-3)中的兩個殘基被變為鼠的對應殘基AsnH76被變為鼠Ser(F(ab)-10)和LysH75被變為鼠Ala(F(ab)-11)。兩種變化都使結合力有小幅提高(表2)。最後，在H94位，人和鼠序列最常見的是Arg(Kabat等人，同上)。在F(ab)-U中，該精氨酸被鼠抗體(圖l)中罕見的Lys所替換，而這導致結合力比嵌合F(ab)小2倍(表2)。還用BIAcoreTM系統(Pharmacia)將F(ab)-12與嵌合F(ab)作比較。用該技術，人源化F(ab)-12的Kd因為更慢的k加和更快的k。ff而比嵌合F(ab)弱2倍(表3)。表3:用BIAcoreTM系統測得的抗-VEGFF(ab)變異抗體與VEGF的結合tableseeoriginaldocumentpage48a以共振單位(RU)表示的F(ab)結合量，是將2微克F(ab)注射到含2480RU固定化VEGF的晶片上，用BIAcoreTM系統進行測量。解離速率動力學(k。ff)的測量是通過用F(ab)來飽和晶片，然後在切換緩沖液之後檢測解離情況。結合速率動力學(k。n)的測量是用F(ab)的2倍系列稀釋液。平衡解離常數Kd按k。ff/k。。進行計算。bchim-F(ab)是嵌合的F(ab)，其中鼠VL和VH區被融合於人的CL和CH1重鏈區。全長單克隆抗體的構建是通過將嵌合F(ab)和變異抗體F(ab)-12的VL區和VH區融合於人K輕鏈和人IgGl重鏈的恆定區。全長的12-IgGl(F(ab)-12融合於人lgGl)表現出的結合力比嵌合IgGl弱1.7倍(表4)。12-IgGl和嵌合IgGl兩者的結合力都稍弱於原始的鼠單克隆抗體A4.6.1(表4)。tableseeoriginaldocumentpage49a抗-VEGFIgG變異抗體與生物素化的VEGF—起孵育，然後轉移至包被有KDR-IgG(Park等人(1994)，同上)的ELISA板。bchlgGl是嵌合的IgGl，其中鼠的VL和VH區被融合於人CL和IgGl重鏈；chlgGl的EC50是0.113士0.013微克/毫升(0.75nM)。CmurlgGl是從腹水中純化出的muMAbVEGFA4.6.1。d12-IgGl是將F(ab)-12的VL和VH區融合於人CL和IgGl重鏈。生物學研究比較rhuMAbVEGF和muMAbVEGFA4.6.1在接近VEGF最大有效濃度(3ng/ml)下對牛毛細血管內皮細胞增殖的抑制能力。如圖3所示，這兩種單克隆抗體在效能和效力方面基本上相近。ED50值分別為50士5ng/ml和48±8ng/ml(約3nM)。在兩種情況下，在約500ng/ml(約3nM)的濃度下達到了90%抑制。rhuMAbVEGFA4.6.1和muMAbVEGFA4.6.1兩者對基底或bFGF-刺激的毛細血管內皮細胞的增殖都沒有效力，這證實了這種抑制作用是對VEGF特異的。為了確定這種等價性是否適用於體內系統，比較了兩種抗體在棵鼠中抑制人A673成橫紋肌細胞瘤細胞生長的能力。早先的研究已表明，muMAbVEGFA4.6.1對這種腫瘤模型有強抑制效應(Kim等人，自然(Nature)362:841-844(1993)和Borgstrom等人，癌症研究(CancerRes.)56:4032-4039(1996))。如圖4所示，在兩種測試劑量(0.5和5毫克/千克)下，通過在細胞接種後4周測量肺瘤重量加以評估，兩種抗體都顯著抑制了腫瘤生長。與對照組相比，用muMAbVEGFA4.6.1在各劑量下處理的動物其腫瘤重量分別下降85。/。和93。/。，用rhuMAbVEGF處理的動物其肺瘤重量各下降卯％和95%。用乳房癌細胞系MDA-MB435,也獲得了類似的結果。實施例2在該實施例中，對上述的鼠抗-VEGF抗體A4.6.1如下進行人源化通過使一小組構架殘基隨機變化以及通過將形成的抗體分子文庫在絲狀噬菌體表面上單價展示出來，以便用基於親和力的選擇法鑑別出高親和力的構架序列。材料和方法構建抗-VEGF抗體的噬菌粒載體pMB4-19:鼠抗-VEGF單克隆抗體A4.6.1如實施例1中所述。A4.6.1的第一個人源化Fab變異體hu2.0是這樣構建的對編碼人VLKl-Ciq輕鏈和人VHm-Ch1"^重鏈Fd片段的質粒pAK2的含脫氧尿苷的模板進行定點誘變(Carter等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285-4289(1992》。根據Kabat等人(同上)中的序列定義，選擇被移植的A4.6.1的CDR序列，除了CDR-H1之外(CDR-H1包括殘基26-35)。Fab編碼序列被亞克隆入噬菌粒載體phGHamg3(Bass等人，Proteins,8,309-314(1990);Lowman等人,Biochemistry.30:10832-10838(1991))。該構建物pMB4-19編碼最初的人源化A4.6.1的Fab(即hu2.0),其中重鏈的C末端被精確地融合於M13基因III外被蛋白的羧基部分。pMB4-19這個構建物的構建與pDH188(—種早已描述過的用於單價展示Fab片段的質粒(Garrard等人，Biotechnology.9:1373-1377(1991)))相子249-406)以及使用緊跟在抗體重鏈Fd片段之後的琥珀終工止密碼子。這樣可以在大腸桿菌的supE抑制型菌抹中表達分泌的重鏈或重鏈-基因III融合蛋白兩種物質。人源化A4.6.1Fab片段的表達和純化:用噬菌粒pMB419或其變異噬菌粒來轉化大腸桿菌34B8菌抹(一種非抑制型菌抹)。單菌落在5毫升含50微克/毫升羧苄青黴素的2YT培養基中37。C生長過夜。將這些培養物稀釋於200毫升含20微克/毫升羧千青黴素的AP5培養液(Chang等人,Gene,55，18屮196(1987))，然後在30。C孵育26小時。細胞在4000xg下離心，在-20。C下冷凍至少2小時。然後將細胞沉澱再懸浮於5毫升含lmMEDTA的10mMTris-HCl(pH7.6)中，在4。C振蕩90分鐘，然後在10,000xg下離心15分鐘。上清液被加至1毫升鏈球菌G蛋白-Sepharose柱(Pharmacia)上，用10毫升10mMMES(pH5.5)洗滌。結合的Fab片段用2.5毫升100mM乙酸洗脫並立刻用0.75毫升1MTris-HCl，pH8.0中和。Fab製劑的緩衝液被換成PBS，然後用CENTRICON-30濃縮器(Amicon)濃縮。在G蛋白純化之後，典型的Fab產量約為l毫克/升培養物。純化的Fab樣品用電噴射質譜法加以確定，而濃度用胺基酸分析確定。構建抗-VEGFFab喧菌粒文庫按照Kunkel等人，MethodsEnzymol.204，125-139(1991)的方法，通過定點誘變而構建人源化A4.6.1噬菌粒文庫。製備用作誘變模板的pMB4-19的衍生質粒，它在VH的密碼子24、37、67和93處含有TAA終止三聯體密碼(所有的序列編號按照Kabat等人，同上)。這種修飾可防止以後野生型序列所造成的背景汙染。定點隨機變化的密碼子是4和71(輕鏈)，以及24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94(重鏈)。為了用一個誘變寡核苷酸來使重鏈密碼子67、69、71、73、75、76、93和94隨機化，2個126-聚物的寡核苷酸先通過模板協助式酶連接法用60-聚物和66-聚物的片段預組裝成。具體地講，將1.5nmo15'磷酸化的寡核苷酸503-l(5'-GATTTCAAACGTCGTNYTACTWTTTCTAGAGACAACTCCAAAAACACAIXJTACCTGCAGATGAAC畫3'(SEQIDNO:22))或503-2(5'匿GATTTCAAACGTCGTNYTACTWTTTCTJIAGACACCTCCGCAAGCACATACCTGCAGATGAAC-3'(SEQIDNO:23))與1.5nmol503-3(5'-AGCCTGCGCGCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTDYAARGTACCCCCACTATTATGGG畫3'(SEQIDNO:24))混合。隨機化的密碼子帶下劃線，而N表示A/G/T/C;W表示A/T;B表示G/T/C;D表示G/A/T;R表示A/G;而Y表示C/T。然後，加入1.5nmol模板寡核苷酸(5'-CTCAGCGCGCAGGCTGTTCATCTGCAGGTA-3'(SEQIDNO:25))(具有與503-1/2的5'端以及503-3的3'端互補的序列)，使其與連接接頭處的各末端雜交。向該混合物中，加入Taq連接酶(NewEnglandBiolabs的耐熱連接酶)和緩沖液，反應混合物經過40輪熱循環(95°C1.25分鐘和50。C5分鐘)，從而使模板寡核苦酸在連接的和未連接的接頭之間循環。產物126-聚物寡核苦酸在6。/。尿素/TBE聚丙烯醯胺凝膠上純化，然後以緩沖液從聚丙烯醯胺膠上提取出來。將兩個126-聚物產物等比例地混合，乙醇沉澱，最後溶解在10mMTris-HCl,lmMEDTA中。將混合的126-聚物寡核苷酸產物標記為504-01。在兩個步驟中實現對選定構架密碼子(V^的4、71;Vh的24、37、67、69、71、73、75、76、93和94)的隨機誘變。首先，通過製備修飾的pMB4-19模板的另外3個衍生模板而實現VL的隨機化。輕鏈的構架密碼子4和71，用兩個誘變寡核苷酸5'-GCTGATATCCAGUSACCCAGTCCCCG-3'(SEQIDNO:26)和5'畫TCTGGGACGGATJACACTCTGACCArcs'(SEQIDNO:27)單個地或成對地予以替換。從每個新的衍生模板製備含脫氧尿香的模板。與最初的模板一起，這4個構建物編碼輕鏈構架序列4種可能組合中的每一種組合(見表5)。用寡核香酸504-l(2種126-聚物寡核苷酸的混合物(見上面))以及5-ATGAACTGGRIQCGTCAGGCCCCGGGTAAG-3'(SEQIDNO:28)，在用剛才所述的4種模板中的一種模板時使重鏈構架密碼子隨機誘變。將4種文庫電穿孔導入大腸桿菌XL-1BLUE細胞(Stmtagene)並合併。各種轉化子的總數估計M.2x108,比文庫中的DNA序列最大數約大1500倍。已開發了各種不同的系統用於在絲狀噬菌體表面上功能性地展示抗體片段(Winter等人,Ann.Rev.Immunol.12,433(1994))。它們包括以融合於M13噬菌體基因III或基因VIII包被蛋白的融合蛋白形式，來展示Fab或單鏈Fv(scFv)片段。本文所選的系統與Garrard等人，Biotechn.9:1373-1377(1991)所述的系統相似，其中Fab片段以基因III融合物形式被單價地展示(圖7)。該系統有兩個顯著特徵。具體地講，與scFv不同，Fab片段沒有形成二聚體物質的傾向，而二聚體的存在會因親合效應而阻礙選出最強的結合物。此外，被展示蛋白質的單價性消除了第二種親合效應的潛在來源，而原本在每個噬菌粒顆粒上存在一個蛋白的多個拷貝會產生這種親合效應(BassandWells，Proteins,8,309(1990);Lowman等人，Biochem.30，10832(1991))。使展示人源化A4.6.1Fab片段的噬菌粒顆粒，在大腸桿菌XL-1Blue細胞中繁殖。簡而言之，使攜帶隨機化pMB4-19構建物的細胞，在25毫升含50微克/毫升羧千青黴素和約101M13K07輔助噬菌體的2YT培養基中，37°C生長過夜(VieiraandMessing,MethodsEnzymol.153，3[1987])。用聚乙二醇鹽水溶液沉澱培養上清液純化噬菌粒原液，然後重懸於100微升PBS中(約10"噬菌粒/毫升)。選擇人源化的A4.6.1Fab變異體將純化的VEGFm(100微升，10微克/毫升PBS)包被微量滴定板孔，4"C過夜。棄去包被溶液，用6%脫脂奶封閉這個孔以及未包被的孑U小時，並用含0.05。/。吐溫20(洗滌劑)的PBS洗孔，然後每孔加入噬菌粒原液10微升(用含l。/。BSA和0.05。/。吐溫20的20mMTris,pH7.5稀釋至100微升)。2小時後洗滌各孔，然後用100微升0.1M甘氨酸(pH2.0)洗脫結合的噬菌體並用25微升1MTrispH8.0液中和，取其等份用於洗脫噬菌體數目的滴定。從VEGF包被孔上洗脫下的留存噬菌體被繁殖，以用於下一輪選擇循環。總計進行了8輪選擇，之後20個克隆可以被選出並測序(Sanger等人，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),74，5463(1977》。測定VEGF的結合親和力通過表面胞質團共振法(surfaceplasmonreso腿ce)(Karlsson等人，J.Immun.Methods145,229-240(1991》，在PharmaciaBIAcore儀器上測定了人源化A4.6.1Fab變異體與VEGF^結合的結合速率常數(k。n)和解離速率常數(k。ff)。VEGF^通過伯氨基而共價固定於生物傳感器晶片上。人源化A4.6.1Fab變異體的結合性的測定，是通過將Fab(以PBS/0.05。/。TWEEN-20(去汙劑)配)溶液以20微升/分鐘的流速流過晶片。在每次結合測量之後，用5微升50mM鹽酸水溶液以3微升/分鐘速度洗滌，從而將殘留的Fab從固相化的配體上脫下。用筒單的單價結合模式(BIAevaluation軟體2.0版；Pharmacia),通過非線性回歸法分析結合曲線。結果構建人源化A4.6.1抗體構建最初的人源化A4.6.1Fab片段(hu2.0,圖5A和5B),其中A4.6.1的CDR被移植於人的VLKl-VHlII構架上。hu2.0中所有其他的殘基都保留與人序列相同。該最初的人源化抗體與VEGF的結合力如此力，hu2.0的結合KD估計大於7(iM。這與嵌合Fab構建物(由鼠A4.6.1的完整VL和vh區和人的恆定區所構成)的1.6nM親和力形成了反差。因此，hu2.0與VEGF的結合比嵌合抗體下降了至少4000倍。設計抗體文庫在本發明中對人構架序列進行構架改變的一組殘基列於表5和圖6。表5:對於抗原結合至關重要以及作為定點隨機變化目標的關鍵性構架殘基tableseeoriginaldocumentpage53bVH71、73、75、76被隨機化以產生全鼠(L71/T73/A75/S76)或全人(R71/D73/K75/N76)的VHlII四聯體(tetrad)在設計人源化A4.6.1噬菌粒文庫時的一個著眼點是，定點隨機化的目標殘基是廣泛分布於Vl和Vh序列中的。合成的寡核苷酸長度方面的限制，要求這些構架部位各點同時進行隨機化只能通過使用多個寡核苷酸而實現。然而，隨著寡核苷酸總數的增加，誘變的效率(即獲摻入了所有誘變寡核苷酸序列的突變體的比例)會下降。為了巧妙地克服這一問題，在文庫構建中引入兩個特徵。第一個特徵是製備4個不同的、編碼每種可能的V^勾架組合的誘變模板。由於輕鏈構架的多樣性很有限(僅4種不同序列)，這是簡單可行的，但是其優點是不再需要使用誘變策略的兩種寡核苷酸。第二，兩個126鹼基的寡核苷酸用更小的合成片段預組裝成。這樣可以用一個長寡核香酸而不是用兩個較短的寡核苷酸隨機誘變vh密碼子67、69、71、73、75、76、93和94。因此，最終的隨才幾誘變策略是在4種不同模板上同時採用僅兩種寡核苷酸。選擇牢固結合的人源化A4.6.1Fab，:根據與VEGF的結合性選出人源化的A4.6.1Fab噬菌粒文庫的變異體。通過比較VEGF包被的和未包被的微量滴定板孔中所洗脫出的噬菌體效價，確定功能性噬菌粒的富集程度，在7輪親和力淘選之內富集程度是增加的。在又一輪挑選之後，對20個克隆進行測序以鑑定在每個隨機化位點處選出的優選構架殘基。這些結果總結於表6，揭示出在所選的克隆之間有強共有序列。20個克隆中的10個有相同的DNA序列，命名為h2.10。在13個被隨機化的構架位置中，在hu2.10中選出了8個取代(Vl71;VH37、71、73、75、76、78和94)。有趣的是，選出的殘基Vh37(11e)和78(Val)既不是人VhIII的也不是鼠A4.6.1序列的。這個結果提示，通過將多樣性擴展至靶定的人和親代鼠構架序列之外，可以使某些構架位置受益。表6從人源化A4.6.1噬菌粒Fab文庫中選出的序列變異體殘基取代tableseeoriginaldocumentpage55Hu2.0和鼠A4.6.1抗體之間的區別用下劃線標出。對於每種嗟菌體選出序列相同的克隆數目在括號中標出。在噬菌體選出的克隆序列中的破折號表示選出的是人V,Kl-VHlII構架序列(即與hu2.0中相同)。在被分析的其餘10種克隆中，有另外4種獨特的胺基酸序列hu2.1、hu2.2、hu2.6和hu2.7。除了hu2.10之外，所有逸些克隆在位置Vh37(Ile)、78(Val)和94(Lys)處含有相同的構架取代，但是在位置24和93保留了人VhIII共有序列。4個克隆丟失了輕鏈編碼序列，在噬菌體ELISA試驗(Cunningham等人，EMBOJ.13,2508-251(1994))中測試時不結合於VEGF。通過減少選擇循環次數或者通過在固相培養基上繁殖文庫，常可最大程度減少這種人為現象。人源化A4.6.1變異抗體的表達和結合親和力用搖瓶在大腸桿菌中表達噬菌體選出的變異體hu2.1、hu2.2、hu2.6、hu2.7和hu2.10，然後用G蛋白親和層析從周質提取物中純化得到Fab片段。這5種克隆的Fab回收產率在0.2(hu2.6)-1.7毫克/升(hu2.1)之間。這些變異體對抗原(VEGF)的親和力用表面胞質團共振法在BIAcore儀器上測定(表7)。對這些結合數據的分析揭示，在5種被測試的變異體中，共有序列的克隆hu2.10對VEGF具有最高親和力。因此，Fab噬菌粒文庫選擇性富集了結合最牢的克隆。計算出的hu2.10的Ko是55nM，至少比沒有構架變化的hu2.0(KD"^iM)結合牢固125倍。其他4種選出的變異體都表現出與VEGF的弱結合，最弱的(hu2.7)低至Ko為360nM。有趣的是，hu2.6的KD是67nM，只比hu2.10略低，但是在20個被測序克隆中發現此克隆只有一個拷貝。這可能是因為表達和展示的水平較低，正如表達該變異體的可溶性Fab時一樣。然而，儘管表達率較低，該變異體仍可用作人源化抗體。表7人源化A4.6.1Fab變異體的VEGF結合親和力tableseeoriginaldocumentpage56力u2.10V二具有VlLeu46—Val突變的Hu2.10;估計在Biacore結合測量值中的誤差為±25%;"太弱以致於無法測量，更低結合的估計值人源化變異抗體hu2.1的進一步改進:儘管抗原親和性已比最初的人源化變異體有了大幅提高，hu2.10與VEGF的結合仍比含有鼠A4.6.1Vl和Vh區的嵌合Fab片段弱35倍。這種相當大的差別提示，可通過額外的突變使人源化構架進一步優化。在Foote&Winter等人,分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)224，487-499(1992)所鑑別的遊標殘基中，僅殘基VL46、Vh2和Vh48在A4.6.1和人V,kI-VhIII枸架之間是不同的(圖5A和5B)但在我們的噬菌粒文庫中沒有被隨機變化。人源化A4.6.1Fv片段的分子模型顯示，VL46位於Vt-VH界面處而且可能影響CDR-H3的構型。此外，該胺基酸在大多數V!k構架中幾乎總是亮氨酸(Kabat等人，同上)，但是在A4.6.1中是纈氨酸。因此，在hu2.10的基礎上在該位置進行了Leu—Val取代。對該新變異體hu2.10V的結合動力學分析表明，56VEGF結合的Kd又提高了6倍。這表明在抗體A4.6.1的VL46位上纈氨酸的重要性。這樣，hu2.10V的KD(9.3nM)就在嵌合體KD的6倍之內。與Vl46相反，將VH2或Vh48殘基用鼠A4.6.1的相應殘基進行替換時，未見hu2.10結合親和力的提高。實施例3在該實施例中，通過使用以下手段來提高人源化抗-VEGF抗體的親和力CDR隨機變化、通過單價Fab噬菌體展示進行的親和力突變、以及將突變累積組合起來。構建人源化抗體pY0101:將噬菌體展示的抗體載體phMB4-19-1.6(見圖8A-8F)用作親代載體。在該構建物中，抗-VEGF是以Fab片段形式表達，其中它的重鏈被融合於截斷的g3p的N端。輕鏈和重鏈兩者都在phoA啟動子和上遊stll周質分泌信號序列的控制之下。在CDR區之外的點突變是用下表8所示寡核香酸通過定點誘變法進行，以改善VEGF的親和力寡核苷酸HL-242、HL-243、HL-244、HL-245、HL-246、和HL-242。表8:用於定點誘變的寡核苷酸tableseeoriginaldocumentpage57tableseeoriginaldocumentpage58形成的變異體被命名為Y0101(圖9A和9B)。構建第一代抗體-噬菌體文庫為了防止野生型序列的汙染，製備在靶定隨機化位點處具有TAA終止密碼子的模板，並通過定點誘變構建文庫，其中具有簡併NNS密碼子(N是A、G、C和T的等量混合物，而S是G和C的等量混合物)寡核苷酸進行飽和誘變。將VL1和VH3選作潛在的候選者用於提高親和力(圖9A和9B)。在CDR中，用pY0101模板構建了2個文庫。VL1用終止模板寡核芬酸HL-248和HL249(表9)和文庫寡核苷酸HL-258和HL259(表10)進行突變。類似地，用終止模板寡核苦酸HL-250、HL-251、和HL-252(表9)以及文庫寡核苷酸HL-260、HL-261和HL262(表10)構建了3個VH3的文庫。文庫的構建總結於下表9和和10中。表9:用於誘變的模板寡核苷酸tableseeoriginaldocumentpage58tableseeoriginaldocumentpage59將隨機誘變反應產物電穿孔導入大腸桿菌XL-1BLUE細胞(Stratagene),然後通過與M13K07輔助噬菌體一起生長15-16小時而得以擴增。通過將最初轉化物接種於含羧千青黴素的平板而加以評估，每個文庫的複雜度為2xl7-1.5x108。最初的親和力選擇對於每輪選擇，根據與包被有2微克/毫升VEGF(重組的，殘基為9-109個)(在50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.6中)並用5%速溶牛奶(在50mM碳酸鹽緩衝液，pH9.6中)封閉的板(NuncMaxsorp96孔)的結合情況，篩選109-1010個噬菌體。在存在0.5。/。牛血清白蛋白和0.05y。TWEEN20tm的PBS溶液下，室溫下結合l-2小時之後，用PBS/TWEENtm(含0.05。/。TWEEN20tm的PBS緩衝液)洗滌板。典型地，為了選擇解離速度更慢的親和力提高的變異體，將板與PBS/TWEENTM緩沖液孵育一段時間，孵育時間在每輪選擇中逐漸延長(第一輪為O分鐘，然後逐漸增加至第9輪選擇中為3小時)。在去除PBS/TWEENtm緩沖液之後，將剩餘的噬菌體用0.1M鹽酸洗脫，然後立刻用1/3體積的1MTris-HCl,pH8.0中和。洗脫下的噬菌體通過感染XL1-BLUE細胞(Stratagene)而進行繁殖，以用於下一輪選擇。測序數據揭示，兩種VL文庫，即使在4兆選了8和9輪之後，仍然保留了多樣性，在隨機化位點處能容忍各種不同殘基。與之相反，VH3文庫僅保留了野生型殘基和非常保守的取代。這表明，VL1更暴露於溶劑並且位於結合界面外側。與之相反，VH3沒有明顯不同的側鏈取代，因此可能更密切地在抗原結合中被涉及。結合親和力的噬菌體-ELISA測定從每種這些文庫中，在噬菌體-ELISA測定中分析代表性克隆(由豐富序列所代表的克隆)相比親代克隆pYO101而言的親和力。在該測定中，先將噬菌體系列稀釋，以確定保持穩定的組份飽和效價，然後將其用於與不同濃度的VEGF(200nM-0nM)溶液一起孵育。接著將混合物轉移至包被有VEGF(2微克/毫升)並用5%速溶牛奶封閉的板，在室溫下平衡1小時。之後，除去噬菌體溶液，對殘留的結合噬菌體用兔抗-噬菌體抗體和山羊抗-兔抗體和辣根過氧化物酶的偶聯物的混合溶液檢測。在室溫下孵育1小時後，用生色底物鄰-苯二胺(Sigma)使板顯色。通過加入1/2體積2.5MH2S04而終止反應。用分光光度計板閱讀器測量在492納米處的光密度。儘管在噬菌體-ELISA測定中，從這5個文庫中選出的所有克隆都表現出比野生型pY0101更弱或類似的親和力，但是來自文庫HL-258的一個特殊的變異體(pY0192)卻在表達水平或噬菌體展示方面表現出優於pY0101的明顯優勢(高約10倍)。該克隆在VL區含有突變S24R、S26N、Q27E、D28Q和I29L(圖9A)。此外，發現該變異抗體在VH區有亂真的突變M341。這個變異抗體與pY0101相比，對VEGF的結合親和力沒有明顯差異。為了提高Fab在噬菌體上的展示水平以及噬菌體-ELISA測定的信號-噪音比，將pY0192中的相應取代引入背景模板，以構建兩種CDR的Ala突變體和第二代抗-VEGF文庫。對抗-VEGF的CDR進行丙氨酸掃描為了確定CDR區中各胺基酸對結合力的貢獻並更好地選擇用於隨機變化的靶定殘基，通過用丙氨酸替換每個殘基而對CDR區進行篩選。每個丙氨酸變異體的構建是通過定點誘變法並使用編碼各具體丙氨酸取代的合成寡核苷酸。當丙氨酸是野生型殘基時，用絲氨酸加以替換以測試側鏈取代的效應。如上所述，對具有單個丙氨酸突變的噬菌體克隆進行純化和用噬菌體-ELISA分析。丙氨酸掃描的結果表明，在不同位置上的丙氨酸替換可能有效，與pY0192相比抗原結合親和力下降了2-150倍。此外，證實了早先的觀察結果，即在抗原結合中涉及的是VH3而不是VL1。CDR丙氨酸掃描的結果總結於下表ll。表11:丙氨酸掃描的Fab變異抗體的相對VEGF親和力tableseeoriginaldocumentpage61tableseeoriginaldocumentpage62所有變異抗體都以pY0192("野生型(wt)，，；見圖9A-B)為基礎。IC50通過竟爭性噬菌體-ELISA分析加以測定。在CDRHl、H2和H3中觀察到了丙氨酸替換的最大效應，其中包括Y27A(親和力下降34倍)、N31A、Y32A、W50A、N52A、Y99A、S106A和W108A(各下降了〉150倍)；N35A(下降66倍)、P100A(下降38倍)和F110A(下降25倍)。與之相反，僅有一個VL替換對結合親和力有大影響，即W96A(下降〉150倍)。這些結果表明，3個VHCDR是Fab與VEGF結合的主要力能決定因素，而VL3有部分貢獻。設計第二代CDR突變文庫根據對晶體結構的研究，設計了另2種對抗-VEGF抗體Y0192中現有殘基進行隨機變化的文庫。在VH2中，對殘基52-55隨機變化，因為它們位於與VEGF的結合界面中。稱為"CDR7"的一個Fab額外區域，也被選定進行隨機化，因為在該環中有數個殘基儘管不與VEGF接觸但是卻與抗體的VH環接觸。這些是通過界面殘基的二級效應來提高親和力的潛在位點。在該CDR7文庫中，殘基L72、T74和S77被隨機變化。還根據晶體結構，再構建了一個原始CDR文庫來再次測試VH1CDR中親和力成熟的潛力。用新的Y0192為背景，對殘基27、28和30-32進行隨枳^變化。抗-VEGF文庫的第二代選擇根據丙氨酸掃描結果和抗原-抗體(F(ab)-12)複合物的晶體結構，用pY0192模板和終止模板寡核苷酸(在靶定的隨機化位點具有終止密碼子的寡核芬酸)YC-80、YC-IOO、YC-102、HL-263、和HL-264(上表9)構建總計17個文庫。對應的隨才幾化寡核香酸(在靶定的隨機化位點為NNS)是YC81、YC-lOl、YC-103、HL-265、和HL-266(上表10)。形成的轉化子產生了複雜度為6xlO乙5xls的文庫，這表明文庫是全面的且覆蓋了所有可能的變異體。用下表12所述的條件，對噬菌體文庫挑選7-8輪。表12Fab變異抗體的第二代選擇的條件選擇輪次孵育時間(小時)孵育溶液孵育溫度(。c)100室溫21ELISA緩沖液室溫32l|iMVEGF/ELISA室溫418lpMVEGF/ELISA室溫371,VEGF/ELISA室溫617小時，室溫/30小時,37。C1|LiMVEGF/ELISA室溫/37°。763lpMVEGF/ELISA37。C81211|liMVEGF/ELISA37。CELISA緩衝液在PBS中含有0.5。/o牛血清白蛋白和0.05。/oTWEEN20TM。將63VEGF包含在孵育緩沖液中以減少噬菌體與包被在板表面上的VEGF之間的再結合。對這些文庫的挑選導致噬菌體在7-8輪選擇後富集。第二代克隆的噬菌體-ELISA測定在8輪選擇之後，從攜帶大腸桿菌(XL1)菌落(已用洗脫的噬菌體混合物感染)的含羧千青黴素的平板上，分離出各文庫的10-20個克隆。菌落被分離並與輔助噬菌體一起生長，以獲得單鏈DNA用於測序。選出的與VEGF結合更好CDR取代，是通過噬菌粒克隆的DNA推導出的。選定克隆的採樣結果示於下表13。tableseeoriginaldocumentpage64tableseeoriginaldocumentpage65僅示出了根據DNA測序推導出的隨機變化區域的序列。當大量克隆與親代克隆pY0192—起用噬菌體-ELISA法測試時，沒有一個克隆表現出比親代克隆明顯改善。這可能是因為測試進行的時間(<3小時)所限。為了定量分析與親代克隆相比在抗原結合性方面的改善，將數種抗-VEGF變異體的DNA轉入大腸桿菌34B8菌抹，以Fab形式表達，然後將周質破石卒物(periplasmicshockate)如上面實施例2所述通過G蛋白柱(Pharmacia)進4亍純化。CDR組合型變異抗體為了進一步改善VEGF結合親和力，將噬菌體展示中所發現的突變與不同的CDR組合，以產生多種CDR變異體。具體地，將VHl、VH2和VH3文庫中親和力提高程度最大的噬菌體變異體中所鑑別出的突變合併(表14)，以測試它們對結合親和力的增加程度。表14:抗-VEGF變異抗體的CDR組合tableseeoriginaldocumentpage66將所示的親代載體中的突變與所示寡核苷酸中的突變，通過定點誘變進行組合(合併)，以產生所示的組合型變異抗體。Y0317與Y0313-l是相同的，不同點僅在於在VL1中的背景突變被去除並將其序列逆轉回pY0101中的序列。突變H101Y和S105T的效應是通過用Y0238-3構建回復突變體而加以測試的。BIAcore分析Fab片段的VEGF-結合親和力是根據用BIAcore-2000TM表面胞質團共振系統(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)測得的結合速率常數和解離速率常數計算出的。根據供應商(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的說明，用鹽酸N-乙基-N'-(3-二曱基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺將生物傳感器晶片活化，以便與VEGF共價偶聯。將VEGF的緩沖液換為20mM乙酸鈉(pH4.8)，然後稀釋至約50微克/毫升。將一等份樣品(35微升)以2微升/分鐘的流速注入，以達到約700-1400共振單位(RU)的偶聯蛋白。最後，注入1M乙醇胺作為封閉劑。對於動力學測量，將25。C的、Fab在PBS/TWEENTM緩沖液(含0.05%TWEEN20TM的磷酸鹽緩衝液)中的的2倍系列稀釋液，以10微升/分鐘的速度注入。結合和解離速率用標準方法(Karlsson等人，免疫學方法雜誌(J.Immun.Methods)145:229-240(199l))計算。平衡解離常數Kd(表面胞質團共振(SPR)測量值的Kd)是按k。ff/kon進行計算。數據列於下表15。表15:根據BIAcore"^測量值的Fab-VEGF結合動力學tableseeoriginaldocumentpage67*觀察到的解離速率可能反映了在這些試驗中真實解離速率的上限，因為解離速率接近BIAcore的測量極限。在表15中所示的BIAcoreTM數據表明，數種變異抗體具有高於YO192的親和力。例如，CDRH1變異抗體Y0243-1(具有突變T28D和N31H)的親和力高4.1倍。變異抗體Y0238-3的結合親和力比Y0192高至少14倍。兩種CDRH3突變都使Y0238-3的親和力上升，因為將T105回復至S(變異抗體Y0313-3)將Y0238-3的親和力從0.15nM降至0.65nM(見表15)。相對於Y0192而言更大的親和力提高見於Y0313-1，它含有CDRH3突變和CDRH1突變。基於細胞的VEGF抑制分析測試了數種A4.6.1抗-VEGF抗體拮抗VEGF(重組型，種類l-165)誘導HuVEC(人臍靜脈內皮細胞)生長的能力。以1000個HuVEC/孔接種96孔板，然後在分析培養液(F12:DMEM(50:50)，並補充有1.5。/。滲濾處理過的胎牛血清)中禁食24小時。用於誘導細胞的VEGF濃度，通過測定能刺激80。/。最大DNA合成所需的VEGF量而加以確定。然後，加入含固定量VEGF(0.2nM終濃度)以及抗-VEGFFab或MAb濃度逐漸增加的新鮮分析培養基。在孵育40小時後，通過含氚胸苷的摻入量來測量DNA合成情況。將0.5iaCi卩H]-胸苷/每孔加入細胞培育2U、時，然後收穫，用T叩Count伽馬計數器計數。結果(圖ll)表明，在抑制VEGF活性方面，全長IgG形式的F(ab)-12明顯強於Fab形式(此處使用的是Y0192)。然而，兩種變異抗體Y0238-3和Y0313-1甚至表現出強於Y0192Fab或F(ab)-12單克隆抗體的對VEGF活性的抑制作用。通過比較Fab形式，變異體Y0313-l表現出比野生型Fab強〉30倍。應注意，用於此分析中的VEGF量(0.2nM)，可能潛在地限制了對變異體IC50的精確測量。例如，如果變異體的結合親和力(Kd)事實上小於0.2nM，那麼在該試驗中IC50會明顯高於在更低VEGF濃度下所測得的IC50。因此，這個結果支持這樣的結論親和力提高的變異體與VEGF的親和力至少提高了30倍，而且它可在體外有效地阻斷VEGF活性。因為變異抗體Y0317與Y0313-1的差別僅在於VL1序列回復至野生型(圖IO)，因此可預計Y0317具有與Y0313類似的活性。將變異抗體Y0317(Fab)與實施例1的人源化F(ab)-12(全長及Fab)進行比毛細血管^皮細胞增殖的抑制能力。如圖12所°示:，-在曰該分析中，在抑制牛毛細血管內皮細胞增殖方面，Y0317明顯比全長或Fab形式的F(ab)-12更有效。在該分析中，Y0317親和力成熟形式的Fab表現出的ED50值比F(ab)-12的Fab低至少20倍。權利要求1.一種人源化抗-VEGF抗體，它在體外抑制VEGF誘導型內皮細胞增殖的ED50值不超過約5nM。2.—種人源化抗-VEGF抗體，它在體內抑制VEGF-誘導型血管生成。3.如權利要求2所述的人源化抗-VEGF抗體，5毫克/千克的該抗體在A673體內腫瘤^^莫型中抑制至少50%腫瘤生長。4.如權利要求l-3任一項所述的人源化抗-VEGF抗體，其中該人源化抗-VEGF抗體包含具有胺基酸序列GYDFTHYGMN(SEQIDNO:126)的CDRH1。5.如權利要求l-3任一項所述的人源化抗-VEGF抗體，其中該人源化抗-VEGF抗體包含具有胺基酸序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQIDNO:127)的CDRH3。6.如權利要求l-5任一項所述的人源化抗-VEGF抗體，具有重鏈可變區，該重鏈可變區包括具有如下胺基酸序列的高變區序列GYX,FTX2YGMN所示的CDRH1,其中X,是D，X2是H;WINTYTGEPTYAADFKR所示的CDRH2;以及序列YPX,YYGX2S鼎YFDV所示的CDRH3，其中X!是Y,X2是T。7.如權利要求6所述的人源化抗-VEGF抗體，它包括含有胺基酸序列SEQIDNO:116的重4連可變區。8.如權利要求l-5任一項所述的人源化抗-VEGF抗體，具有輕鏈可變區，該輕鏈可變區包括具有如下胺基酸序列的高變區CDRL1(SASQDISNYLN;SEQIDNO:4)，CDRL2(FTSSLHS;SEQIDNO:5)andCDRL3(QQYSTVPWT;SEQIDNO:6)。9.如權利要求8所述的人源化抗-VEGF抗體，它包括含有胺基酸序列SEQIDNO:115的輕鏈可變區。10.如權利要求l-9任一項所述的人源化抗-VEGF抗體，它包括含有胺基酸序列SEQIDNO:116的重鏈可變區和含有胺基酸序列SEQIDNO:115的輕鏈可變區。全文摘要本發明涉及抗-血管內皮生長因子的抗體。公開了人源化和變異的抗-VEGF抗體及其各種不同用途。抗-VEGF抗體對VEGF有很強的結合親和力，可在體外抑制VEGF誘導的內皮細胞增殖，並且可在體內抑制腫瘤生長。文檔編號C12N15/66GK101665536SQ20091014701公開日2010年3月10日申請日期1998年4月3日優先權日1997年4月7日發明者H·B·洛曼,J·A·韋爾斯,L·G·普雷塔,M·巴卡,Y·M·Y·陳申請人:基因技術股份有限公司