使植物產生雜草防治化合物耐受性的方法

2023-12-10 04:17:56 2

專利名稱：使植物產生雜草防治化合物耐受性的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於使植物產生雜草防治化合物耐受性的方法。
雜草防治對於提高栽培的植物產量和質量來說是一項很重要的工作。對於這一目的來說，主要使用雜草防治化合物、諸如除草劑。然而，對於使用雜草防治化合物來說，將栽培植物與相關來源的物種區別開來以便僅能有選擇地控制雜草並不總是容易的。已經嘗試生產對雜草防治化合物具有耐受性(下文稱作耐雜草防治化合物)作用的植物並且某些耐受性植物已經得到了實際應用。
近來，已經將基因工程技術用於生產具有耐雜草防治化合物作用的植物。作為這樣一種技術，例如Hinchee,M.A.W.等公開了一種用於生產具有耐除草劑(草甘膦)作用的植物的方法，其中將作為草甘膦的耙酶的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因進行誘變以便降低對草甘膦的親和性、並將該基因引入植物[Hinchee，M.A.W.等，《生物/技術》(BIO/TECHNOLOGY),6:p915(1988)]。
使植物產生耐雜草防治化合物作用的各種不同的公知方法不一定能滿足需要且已經需要開發另外的用於使植物產生耐雜草防治化合物作用的各類方法。
本發明的主要目的是提供一種使植物產生耐雜草防治化合物作用的新型方法。
從下面的描述並參照附圖可以清楚地理解這一目的以及其它目的和本發明的優點，這對於本領域技術人員來說是顯而易見的。
附

圖1是質粒pETBCH的限制圖。bchH是光合細菌類球紅細菌(Rhodobactore sphaeroides)的鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結合亞單位基因。T7pro代表T7噬菌體的啟動子序列，且T7ter代表T7噬菌體的終止子序列。Ampr是耐氨苄青黴素基因，lacⅠq是乳糖操縱子的阻抑蛋白基因，且ori是複製起點。
附圖2是質粒pACYCSP的限制圖。PPO是大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶基因且lac pro代表乳糖操縱子的啟動子序列。Cmr是耐氯黴素基因且ori是複製起點。
附圖3是質粒pTVBCH的限制圖。bchH是光合細菌類球紅細菌(Rhodobactore sphaeroides)的鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結合亞單位基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動子序列。Ampr是耐氨苄青黴素基因且ori是複製起點。
附圖4是質粒pBIBCH的限制圖。bchH是光合細菌類球紅細菌(Rhodobactore sphaeroides)的鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結合亞單位基因。NP是胭脂氨酸合酶基因的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶基因的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖5是質粒pNO的限制圖。NP是胭脂氨酸合酶基因的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶基因的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖6是質粒pTCHLH的限制圖。TCHLH是葉綠體轉運信號已經缺失菸草鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動子序列。Amr是耐氨苄青黴素基因，Kmr耐卡那黴素基因且ori是複製起點。
附圖7是質粒pBITCHLH的限制圖。TCHLH是葉綠體轉運信號已經缺失的菸草鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖8是質粒pTVGMP的限制圖。GMP是葉綠體轉運信號和FAD結合序列已經缺失的大豆原卟啉原Ⅸ氧化酶基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動子序列。Ampr是耐氨苄青黴素基因且ori是複製起點。
附圖9是質粒pBIGMP的限制圖。GMP是葉綠體轉運信號和FAD結合序列已經缺失的大豆原卟啉原氧化酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖10是質粒pTVCRP的限制圖。CRP是葉綠體轉運信號和FAD結合序列已經缺失的Chlamydomonas reinhardtii的原卟啉原氧化酶基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動子序列。Ampr是耐氨苄青黴素基因且ori是複製起點。
附圖11是質粒pBICRP的限制圖。CRP是葉綠體轉運信號和FAD結合序列已經缺失的Chlamydomonas reinhardtii的原卟啉原氧化酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖12是質粒pTVHVF1的限制圖。HVF是信號序列已經缺失的大麥鐵螯合酶基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動子序列。Ampr是耐氨苄青黴素基因且ori是複製起點。
附圖13是質粒pBIHVF的限制圖。HVF是信號序列已經缺失的大麥鐵螯合酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖14是質粒pTVCSF的限制圖。CSF是信號序列已經缺失的黃瓜鐵螯合酶基因。lac pro代表乳糖操縱子的啟動子序列。Ampr是耐氨苄青黴素基因且ori是複製起點。
附圖15是質粒pBICSF的限制圖。CSF是信號序列已經缺失的黃瓜鐵螯合酶基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖16是質粒pHEMF的限制圖。HEMF是大腸桿菌的糞卟啉原(coproporphyrinogene)Ⅲ氧化酶基因hemF。lac pro代表乳糖操縱子的啟動子序列。Ampr是耐氨苄青黴素基因且ori是複製起點。
附圖17是質粒pBIHEMF的限制圖。HEMF是大腸桿菌的糞卟啉原(coprophyrinogen)Ⅲ氧化酶基因hemF。NP是胭脂氨酸合酶的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖18是質粒pBIHASYS8的限制圖。HASYS8是編碼MG(HASYS)8蛋白質的基因。NP是胭脂氨酸合酶的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
附圖19是質粒pBIRASSL8的限制圖。RASSL8是可編碼MG(RASSL)8蛋白質的基因(RASSL8 is MG(RASSL)8protein.)。NP是胭脂氨酸合酶的啟動子序列，NT是胭脂氨酸合酶的終止子序列，且35S是花椰菜花葉病毒的35S啟動子。NPTⅡ代表耐卡那黴素基因，且RB和LB分別代表T-DNA的右和左的邊緣序列。
在這些情況下，本發明者已經進行了集中研究以便開發一種使植物產生雜草防治化合物耐受性的新型方法。結果發現通過使植物在植物細胞中產生某種蛋白質而使植物產生雜草防治化合物耐受性。由此完成本發明。
即本發明提供了下列技術方案1．一種使植物產生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質的基因引入植物細胞，所述的蛋白質具有至少下列(a)至(c)特徵(a)對涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質具有特異性親和性；(b)對與所述蛋白質具有特異親和性的物質基本不具有修飾能力(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區的構架區；並且，表達該基因(以下稱為本發明的第一方面)2．根據上述1的方法，其中以這樣一種方式將基因引入植物細胞、即以可操作的方式將它與均可在植物細胞中起作用的啟動子和終止子進行連接。
3．根據上述1或2的方法，其中涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是雜草防治化合物自身。
4．根據上述1或2的方法，其中涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是衍生於一種植物的內源性物質。
5．根據上述1或2的方法，其中雜草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物質。
6．根據上述1或2的方法，其中雜草防治化合物是原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
7．根據上述5或6的方法，其中可導致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是原卟啉Ⅸ。
8．根據上述5或6的方法，其中蛋白質是鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白、或對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的蛋白質變體。
9．根據上述8的方法，其中蛋白質是衍生於光合微生物的鎂螯合酶。
10．根據上述8的方法，其中蛋白質是衍生於一種植物的鎂螯合酶。
11．根據上述8的方法，其中蛋白質是衍生於菸草的鎂螯合酶。
12．根據上述5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:53的胺基酸序列。
13．根據上述5或6的方法，其中蛋白質具有SEQ ID NO:54的胺基酸序列。
14．根據上述5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:55的胺基酸序列。
15．根據上述5或6的方法，其中蛋白質具有SEQ ID NO:56的胺基酸序列。
16．根據上述5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:57的胺基酸序列。
17．根據上述5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:58的胺基酸序列。
18．根據上述5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:59的胺基酸序列。
19．根據上述5或6的方法，其中蛋白質具有SEQ ID NO:60的胺基酸序列。
20．根據上述5或6的方法，其中蛋白質由4-100個胺基酸組成。
21．根據上述5或6的方法，其中涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是原卟啉原Ⅸ。
22．根據上述5或6的方法，其中蛋白質是一種對原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力、而對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
23．根據上述5或6的方法，其中蛋白質是一種對原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力、而對原卟啉Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物具有特異性親和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
24．根據上述22或23的方法，其中蛋白質是一種衍生於植物的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
25．根據上述22或23的方法，其中蛋白質是一種衍生於大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
26．根據上述22或23的方法，其中蛋白質是一種衍生於藻類的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
27．根據上述22或23的方法，其中蛋白質是一種衍生於衣藻屬的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
28．一種使植物產生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質的基因引入植物細胞並且表達該基因，所述的蛋白質具有下列(a)至(c)特徵(a)對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性；(b)對原卟啉原Ⅸ基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區的構架區。
(以下稱為本發明方法的第二方面)29．根據上述28的方法，其中在植物細胞中以這樣一種方式將基因引入植物細胞、即以可操作的方式將該基因與均可在植物細胞內起作用的啟動子和終止子進行連接。
30．根據上述28或29的方法，其中雜草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物質。
31．根據上述28或29的方法，其中雜草防治化合物是一種原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
32．根據上述30或31的方法，其中蛋白質是鎂螯合酶或對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的所述蛋白質的變體。
33．根據上述30或31的方法，其中蛋白質是鐵螯合酶或對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的所述蛋白質的變體。
34．根據上述30或31的方法，其中蛋白質是衍生於一種植物鐵螯合酶。
35．根據上述30或31的方法，其中蛋白質是衍生於大麥屬的鐵螯合酶。
36．根據上述30或31的方法，其中蛋白質是來自黃瓜的鐵螯合酶。
37．根據上述0或31的方法，其中蛋白質是一種由4-100個胺基酸組成的肽。
38．一種使植物產生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質的基因引入植物細胞並且表達該基因，所述的蛋白質具有下列(a)至(c)特徵(a)對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性；(b)對糞卟啉原Ⅲ不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區的構架區。
(以下稱為本發明的方法的第三部分)39．根據上述38的方法，其中以這樣一種方式將基因引入植物細胞、即以可操作的方式將該基因與均可在植物細胞內起作用的啟動子和終止子進行連接。
40．根據上述38或39的方法，其中蛋白質是糞卟啉原Ⅲ或對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的所述蛋白質的變體。
41．根據上述38或39的方法，其中蛋白質是衍生於一種微生物的糞卟啉原Ⅲ氧化酶。
42．根據上述38或39的方法，其中蛋白質是衍生於大腸桿菌的糞卟啉原Ⅲ氧化酶。
43．一種耐雜草防治化合物的植物，其耐受性按照上述1、2、28或29的方法而產生。
44．一種耐雜草防治化合物的植物，其耐受性按照上述38或39的方法而產生。
45．一種用於保護上述43的植物的方法，包括給所述植物的生長區施用所述的雜草防治化合物。
46．一種用於保護上述44的植物的方法，包括給所述植物的生長區施用所述的雜草防治化合物。
47．一種用於選擇植物的方法，包括給上述43的植物和其它植物的生長區施用對上述43植物來說是耐受性的雜草防治化合物、並且根據植物間的生長差異來選擇植物。
48．一種用於選擇植物的方法，包括給上述44的植物和其它植物的生長區施用對上述44植物來說是耐受性的雜草防治化合物、並且根據植物間的生長差異來選擇植物。
49．根據上述47的方法，其中植物是植物細胞。
50．根據上述48的方法，其中植物是植物細胞。
51．根據上述1或2的方法，其中雜草防治化合物是選自下列(1)至(3)化合物的原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物；並且涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是原卟啉Ⅸ、原卟啉原Ⅸ或一種原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚(CNP)、氟鎖草醚、5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基(nitoro)苯甲酸及其乙酯、氟鎖草醚鈉、氟硝草醚、2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-三氟苯、惡草靈、3-[2,4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1,1-二甲基乙基)-1,3,4-氧代二唑-2-(3H)-酮、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氫化-1H-異吲哚-1,3-二酮、N-(4-氟-2-氟-5-炔丙基羥苯基)-3,4,5,6-四氫苯鄰二甲醯亞胺、N-(4-氯苯基)-3,4,5,6-四氫苯鄰二甲醯亞胺chlorphthalim、TNPP乙基2-[1-(2,3,4-三氯苯基)-4-硝基吡唑基-5-氧基]丙酸乙酯、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)煙醯胺；(2)由一般通式J-G(1)所代表的化合物，其中G由下列通式G-1至G-9之任一，J由下列通式J-1至J-30之任一所代表。
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虛線代表含有單鍵的左旋環；或環中的一個鍵是碳原子間的雙鍵；X是氧原子或硫原子；Y是氧原子或硫原子；R1是氫原子或滷原子；R2是氫原子、C1-C8烷基、C1-C8滷代烷基、滷原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一個或多個以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；P是0、1或2；R3是C1-C2烷基、C1-C2滷代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、滷原子、氰基或硝基；R4氫原子、C1-C3烷基、C1-C3滷代烷基或滷原子；R5是氫原子、C1-C3烷基、滷原子、C1-C3滷代烷基、環丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或當G是G-2或G-6時，R4和R5可以與連接它們的碳原子一起形成C=O基；R6是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；X1是單鍵、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基團、N(C1-C3滷代烷基)基團或N(烯丙基)基團；R7是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、滷原子、S(O)2(C1-C6烷基)基團或C(=O)R40基；R8是氫原子、C1-C8烷基、C3-C8環烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8滷代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8滷代炔基、C3-C8滷代鏈烯基、C1-C8烷磺醯基、C1-C8滷代烷磺醯基、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基團、C(O)R41基或其苯環可以被R42取代的苄基；n和m獨立地為0、1、2或3且m+n為2、3或4；Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團；R9各自獨立地為氫原子、C1-C3烷基、滷原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷基、C1-C6滷代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6滷代烷基羰基氧基；R10各自獨立地為氫原子、C1-C3烷基、和羥基或滷原子；R11和R12獨立地為氫原子、滷原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C1-C6滷代烷基；R13是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6滷代鏈烯基、C3-C6炔基、C3-C6滷代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基團或NH2基；R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6滷代烷基或N(CH3)2基；W是氮原子或CR15；R15是氫原子、C1-C6烷基、滷原子、任意被C1-C6烷基或一個或兩個滷原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；
Q各自獨立地為氧原子或硫原子；Q1是氧原子或硫原子；Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團；R16各自獨立地為氫原子、滷原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷基、C1-C6滷代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6滷代烷基羰基氧基；R17各自獨立地為氫原子、羥基或滷原子；R18是C1-C6烷基、滷原子或C1-C6滷代烷基；R19和R20獨立地為氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或C1-C6滷代烷基；Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；R21和R22獨立地為C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6滷代鏈烯基、C3-C6炔基或C3-C6滷代炔基；R23是氫原子、滷原子或氰基；R24是C1-C6烷磺醯基、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷氧基或滷原子；R25是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R26是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基或任意被取代基取代的苯基，所述的取代基選自由C1-C6烷基，1-2個滷原子、1-2個硝基、C1-C6烷氧基和CF3基組成的組；W1是氮原子或CH基；T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基團之一
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12獨立地為氫原子或C1-C3烷基)；
R27是C1-C8烷基、C3-C8環烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8滷代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亞磺醯基烷基、C2-C8烷磺醯基烷基、C1-C8烷磺醯基、其苯環可以被至少一個選自由滷原子和C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯磺醯基、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8環烷基烷基、C6-C8環烷氧基烷基、C4-C8鏈烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8滷代烷氧基烷基、C4-C8滷代鏈烯基氧基烷基、C4-C8滷代炔基氧基烷基、C6-C8環烷硫基烷基、C4-C8鏈烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代、被苄氧基取代的C1-C4烷基；其中苄氧基的環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代、C4-C8三烷基甲矽烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8滷代環烷基、C3-C8滷代鏈烯基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8滷代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代鏈烯基、C3-C8滷代炔基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8滷代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代的苄基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；R28是C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基或四氫呋喃基；R29和R31獨立地為氫原子或C1-C4烷基；R30和R32獨立地為C1-C4烷基或其環可以被至少一個取代基取代的苯基，所述的取代基選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組；或R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的環可以被至少一個選自由C1-C3烷基、苯基和苄基組成的組的取代基取代；或R31和R32與連接它們的碳原子一起可以形成C3-C8環烷基；R33是C1-C4烷基、C1-C4滷代烷基或C3-C6鏈烯基；R34和R35獨立地為氫原子或C1-C4烷基；R36是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R37是氫原子、C1-C4烷基或滷原子；
R38是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6滷代烷基、其環可以被選自由滷原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基組成的組的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基團或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基團；R39是氫原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基團；R40是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基團；R41是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)基團、其環可以被選自由基團R42、苄基和C2-C8二烷氨基組成的組的一個取代基取代的苯基；且R42是C1-C6烷氧基、一個或兩個滷原子、C1-C6烷氧基或CF3基；(3)通式(Ⅱ)的化合物
或nipilacrofen，其中R43是C1-C4烷基；R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4滷代烷基、C1-C4滷代烷硫基和C1-C4滷代烷氧基；R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；R45是氫原子或滷原子；R46是氫原子或C1-C4烷基；R47是氫原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(X2)R52基；R48是氫原子、滷原子、氰基、被至少一個選自由滷原子和羥基組成的組的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一個選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和滷代C1-C4烷基組成的組的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、選自由C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基組成的組的一個基團，在該基團中至少插入一個氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一個基團-NR53R54
-OR58-S(O)fR59
-(CH2)a-A-(CH2)a-O(CH2)b-R64-(CH2)a-O-R65-COR66其中R49、R50和R52相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R50和R51與連接它們的氮原子一起可以形成飽和的脂環5或6節環；R52是氫原子、C1-C4烷基或被至少一個滷原子取代的C1-C4烷基；R53是氫原子、被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一個滷原子任意取代的苯基、C3-C8環烷基、氰甲基、或R63CO-基；
R54是氫原子、被至少一個滷原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一個滷原子任意取代的苯基、C3-C8環烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氫糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其環可以被選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和滷代-C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苄基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；R53和R54與連接它們的碳原子一起可以形成飽和3、5、6節脂環或芳香5或6節環，它的一個環碳原子可以被氧原子取代；R55是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；R56和R57獨立地為被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一個滷原子任意取代的苯基、氫原子、C3-C6環烷基、-XR60基或-NR61R62基；R58是氫原子、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、苄基、C1-C4烷氧基-C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；R59是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；R60是被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基；R61和R62相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R63是被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6環烷基、其環可以被至少一個選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和滷代--C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一個氧原子的C3-C6環烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；R66是羥基或-NR67R68基；A是-NR67R68基或-S(O)p-R69基；R67和R68相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R69是C1-C4烷基或C1-C4滷代烷基；R70是氫原子、羥基、滷原子、被至少一個C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一個氧原子的C3-C6環烷基、被一個或兩個甲基任意取代的C3-C6環烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R71和R72相同或不同、為C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；R73和R74相同或不同、為C1-C4烷基或苯基；R75是可以插入至少一個氧原子的C3-C6環烷基、被一個或兩個甲基任意取代的C3-C6環烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R76是C1-C4烷基；a、b和c獨立地為1、2或3；d是0或1；e是2或3；f是1或2；且X2是氧原子或硫原子。
在本發明的方法中，涉及雜草防治化合物的雜草防治活性的物質(下文稱作雜草防治物質)是構成生物體內代謝反應系統組成部分的那些物質，在將這些化合物施用於植物時，它們可產生雜草防治活性。其實例包括雜草防治化合物自身、衍生於植物的內源性物質等。特別是諸如衍生於植物的內源性物質，例如有在靶酶上起作用的底物、或當蓄積在植物細胞內時可導致細胞功能異常的前體或底物代謝物；由上述在植物細胞內導致細胞功能異常的物質產生的物質等。更具體地說，已經公知當將具有可抑制原卟啉原Ⅸ氧化酶(EC1.3.3.4，下文稱作PPO)活性的除草活性的化合物(下文稱作除草化合物)施用於植物時，作為PPO底物的原卟啉原蓄積在植物細胞內並且代謝成原卟啉X，隨後在細胞中在既有原卟啉X又有光存在的條件下形成活性氧，這一過程可破壞細胞功能[Jansh,MTYAMOTO編輯，AtarashiiNoyaku no Kagaku(《新農用化學品化學》(Chemistry of NewAgrochemicals))，第3章第3.3部分，p106(1993)Hirokawa Shoten,Tokyo]。因此，這些系統中的原卟啉原Ⅸ、原卟啉Ⅸ和活性氧等可作為這些物質的典型實例。
在本發明的方法中，雜草防治化合物包括具有除草活性、植物生長調節活性等的化合物。
除草化合物的實例包括抑制卟啉生物合成的化合物；抑制光合成中電子傳進的化合物；抑制類胡蘿蔔素生物合成的化合物、抑制胺基酸生物合成的化合物；抑制脂類生物合成的化合物；抑制細胞壁生物合成的化合物；影響蛋白質生物合成、核酸生物合成和細胞分裂的化合物；具有生長素拮抗活性的化合物等。更具體地說，作為抑制卟啉生物合成的化合物，例如有抑制PPO活性的化合物(PPO抑制型除草化合物)等。作為抑制光合成中電子傳遞的化合物，例如有抑制光化學系統Ⅰ或Ⅱ的電子傳遞的化合物、抑制可影響傳遞電子的質體醌的生物合成的4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶(EC1.13.11.27；下文稱作4-HPPD)的化合物等。作為抑制類胡蘿蔔素生物合成的化合物，例如有抑制八氫番茄紅素脫飽和酶(下文稱作PDS)的化合物等。作為抑制胺基酸生物合成的化合物，例如有抑制EPSPS、乙酸乳酸合酶(EC4.1.3.18；下文稱作ALS)、穀氨醯胺合成酶(EC6.3.1.2；下文稱作GS)、二氫蝶酸合酶(EC 2.5.1.15；下文稱作DHP)的化合物等。作為抑制脂類生物合成的化合物，例如有抑制乙醯CoA羧化酶(EC6.4.1.2；下文稱作ACC)的化合物等。作為抑制細胞壁生物合成的化合物，例如有抑制纖維素生物合成的化合物等。作為影響蛋白質生物合成、核酸生物合成或細胞分裂的化合物，例如有抑制微管形成的化合物等。
具有植物生長調節劑活性的化合物實例包括具有對促進細胞生長和分化的植物激素有拮抗活性的化合物等。特別地，例如有2,4-D、苯乙基烷烴羧酸、苯甲酸的衍生物、吡啶甲酸衍生物等。
作為上述PPO抑制型除草化合物，例如有Duke,S.O.,Rebeiz,C.A.在《ACS專題論文集系列559》、《殼苔酸殺蟲劑》、《化學》、《毒理學》、以及《藥物應用》、Washington DC的美國化學會(1994)中公開的化合物等。特別地，它們的實例包括下列化合物
(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚(CNP)、氟鎖草醚、5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基(nitoro)苯甲酸及其乙酯、氟鎖草醚鈉、氟硝草醚、2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-三氟苯、惡草靈、3-[2,4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1,1-二甲基乙基)-1,3,4-氧代二唑-2-(3H)-酮、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氫化-1H-異吲哚-1,3-二酮、N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基羥苯基)-3、4,5,6-四氫苯鄰二甲醯亞胺、chlorphthalim、N-(4-氯苯基)-3,4,5,6-四氫苯鄰二甲醯亞胺、TNPP乙基2-[1-(2,3,4-三氯苯基)-4-硝基吡唑基-5-氧基]丙酸乙酯、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)煙醯胺；(2)由一般通式J-G(Ⅰ)所代表的化合物，其中G是以下通式G-1至G-9之任一代表的基團，J是以下通式J-1至J-30之任一代表的基團
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虛線代表含有單鍵的左旋環；或環中的一個鍵是碳原子間的雙鍵；X是氧原子或硫原子；Y是氧原子或硫原子；R1是氫原子或滷原子；R2是氫原子、C1-C8烷基、C1-C8滷代烷基、滷原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一個或多個以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；p是0、1或2；R3是C1-C2烷基、C1-C2滷代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、滷原子、氰基或硝基；R4氫原子、C1-C3烷基、C1-C3滷代烷基或滷原子；R5是氫原子、C1-C3烷基、滷原子、C1-C3滷代烷基、環丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或當G是G-2或G-6時，R4和R5可以與連接它們的碳原子一起形成C=O基；R6是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；X1是單鍵、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基團、N(C1-C3滷代烷基)基團或N(烯丙基)基團；R7是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、滷原子、S(O)2(C1-C6烷基)基團或C(=O)R40基；R8是氫原子、C1-C8烷基、C3-C8環烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8滷代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8滷代炔基、C3-C8滷代鏈烯基、C1-C8烷磺醯基、C1-C8滷代烷磺醯基、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基團、C(O)R41基或其苯環可以被R42取代的苄基；n和m獨立地為0、1、2或3且m+n為2、3或4；Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團；R9各自獨立地為氫原子、C1-C3烷基、滷原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷基、C1-C6滷代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6滷代烷基羰基氧基；R10各自獨立地為氫原子、C1-C3烷基、和羥基或滷原子；R11和R12獨立地為氫原子、滷原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C1-C6滷代烷基；R13是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6滷代鏈烯基、C3-C6炔基、C3-C6滷代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基團或NH2基；R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6滷代烷基或N(CH3)2基；W是氮原子或CR15；R15是氫原子、C1-C6烷基、滷原子、任意被C1-C6烷基或一個或多個滷原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；
Q各自獨立地為氧原子或硫原子；Q1是氧原子或硫原子；Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團；R16各自獨立地為氫原子、滷原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷基、C1-C6滷代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6滷代烷基羰基氧基；R17各自獨立地為氫原子、羥基或滷原子；R18是C1-C6烷基、滷原子或C1-C6滷代烷基；R19和R20獨立地為氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環烷基或C1-C6滷代烷基；Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；R21和R22獨立地為C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6滷代鏈烯基、C3-C6炔基或C3-C6滷代炔基；R23是氫原子、滷原子或氰基；R24是C1-C6烷磺醯基、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷氧基或滷原子；R25是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R26是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基或任意被至少一個取代基取代的苯基，所述的取代基選自由C1-C6烷基1-2個滷原子、1-2個硝基、C1-C6烷氧基和CF3基組成的組；W1是氮原子或CH基；T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基團之一
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12獨立地為氫原子或C1-C3烷基)；
R27是C1-C8烷基、C3-C8環烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8滷代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亞磺醯基烷基、C2-C8烷磺醯基烷基、C1-C8烷磺醯基、其苯環可以被至少一個選自由滷原子和C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯磺醯基、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8環烷基烷基、C6-C8環烷氧基烷基、C4-C8鏈烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8滷代烷氧基烷基、C4-C8滷代鏈烯基氧基烷基、C4-C8滷代炔基氧基烷基、C6-C8環烷硫基烷基、C4-C8鏈烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代、被苄氧基取代的C1-C4烷基；其中苄氧基的環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代、C4-C8三烷基甲烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8滷代環烷基、C3-C8滷代鏈烯基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8滷代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代鏈烯基、C3-C8滷代炔基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8滷代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代的苄基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；R28是C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基或四氫呋喃基；R29和R31獨立地為氫原子或C1-C4烷基；R30和R32獨立地為C1-C4烷基或其環可以被至少一個取代基取代的苯基，所述的取代基選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組；或R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的環可以被至少一個選自由C1-C3烷基、苯基和苄基組成的組的取代基取代；或R31和R32與連接它們的碳原子一起可以形成C3-C8環烷基；R33是C1-C4烷基、C1-C4滷代烷基或C3-C6鏈烯基；R34和R35獨立地為氫原子或C1-C4烷基；R36是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R37是氫原子、C1-C4烷基或滷原子；
R38是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6滷代烷基、其環可以被選自由滷原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基組成的組的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基團或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基團；R39是氫原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基團；R40是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基團；R41是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)基團、其環可以被選自由基團R42、苄基和C2-C8二烷氨基組成的組的一個取代基取代的苯基；且R42是C1-C6烷氧基、一個或兩個滷原子、C1-C6烷氧基或CF3基；(3)通式(Ⅱ)的化合物
或nipilacrofen，其中R43是C1-C4烷基；R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4滷代烷基、C1-C4滷代烷硫基和C1-C4滷代烷氧基；R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；R45是氫原子或滷原子；R46是氫原子或C1-C4烷基；R47是氫原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(X2)R52基；R48是氫原子、滷原子、氰基、被至少一個選自由滷原子和羥基組成的組的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一個選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和滷代C1-C4烷基組成的組的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、選自由C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基組成的組的一個基團，在該基團中至少插入一個氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一個基團-NR53R54
-OR58-S(O)fR59
-(CH2)a-A-(CH2)a-O-(CH2)b-R64-(CH2)a-O-R65-COR66其中R49、R50和R52相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R50和R51與連接它們的氮原子一起可以形成飽和的脂環5或6節環；R52是氫原子、C1-C4烷基或被至少一個滷原子取代的C1-C4烷基；R53是氫原子、被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一個滷原子任意取代的苯基、C3-C8環烷基、氰甲基、或R63CO-基；R54是氫原子、被至少一個滷原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一個滷原子任意取代的苯基、C3-C8環烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氫糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其環可以被選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和滷代-C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苄基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；R53和R54與連接它們的碳原子一起可以形成3、5或6節飽和脂環或芳香5或6節環，它的一個環碳原子可以被氧原子取代；R55是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；R56和R57獨立地為被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一個滷原子任意取代的苯基、氫原子、C3-C6環烷基、XR60基或-NR61R62基；R58是氫原子、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、苄基、C1-C4烷氧基-C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；R59是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；R60是被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基；R61和R62相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R63是被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6環烷基、其環可以被至少一個選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和滷代-C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一個氧原子的C3-C6環烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；
R66是羥基或-NR67R68基；A是-NR67R68基或-S(O)f-R69基；R67和R68相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R69是C1-C4烷基或C1-C4滷代烷基；R70是氫原子、羥基、滷原子、被至少一個C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一個氧原子的C3-C6環烷基、被一個或兩個甲基任意取代的C3-C6環烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R71和R72相同或不同、為C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；R73和R74相同或不同、為C1-C4烷基或苯基；R75是可以插入至少一個氧原子的C3-C6環烷基、被一個或兩個甲基任意取代的C3-C6環烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R76是C1-C4烷基；a、b和c獨立地為1、2或3；d是0或1；e是2或3；f是1或2；且X2是氧原子或硫原子。
此外，作為其它N-取代的吡唑，有Lyga等在《殺蟲劑科學》(Pesticide,Sci.)42:p29(1994)中記載的3-取代-2-芳基-4,5,6,7-四氫吲唑等。
作為抑制光化學系統Ⅰ中電子傳遞的化合物的特殊實例，例如有百草枯、殺草快等。作為抑制光化學系統Ⅱ中電子傳遞的化合物的特殊實例，例如有三嗪類化合物(例如阿特拉津等)、脲類化合物(例如敵草隆等)、腈類化合物(例如溴苯腈和4-羥基-3,5-二碘苯甲腈)等。作為抑制4-HPPD的化合物的特殊實例，例如有異噻唑isoxaflutole、吡唑類、三酮類等。作為抑制PDS的化合物的特殊實例，例如有達草滅、氟咯草酮(flurochloridone)、氟草同、呋草酮、吡氟草胺等。作為抑制EPSPS的化合物的特殊實例，例如有草甘膦等。作為抑制ALS的化合物的特殊實例，例如有磺醯脲類、咪唑啉酮、嘧啶基硫代苯甲酸酯、三唑並嘧啶等。作為抑制GS的化合物的特殊實例，例如有雙丙氨醯膦、草銨膦等。作為抑制DHP的化合物的特殊實例，例如有黃草靈等。作為抑制ACC的化合物的特殊實例，例如有環己二酮、芳氧基苯氧基丙酸酯等。作為抑制纖維素的化合物的特殊實例，例如有敵草腈等。
用於發明中的雜草防治化合物的各種實例由下列化學結構來表示結構1
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在本發明方法的第一個方面中，所用基因是可編碼具有至少下列(a)至(c)特徵之一的蛋白質(下文有時稱作目標蛋白質)的那些基因(a)對雜草防治物質具有特異性親和性；(b)對與所述蛋白質有親和性的物質基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白的可變區的構架區。
對於上述特徵(a)的雜草防治物質來說，術語「特異性親和性」指的是酶(目標蛋白質)與底物(雜草防治物質)、或酶(目標蛋白質)與抑制劑或酶活性的調節物(雜草防治物質)通過酶化學方式相互結合；或者指的是目標蛋白質和雜草防治物質基於親和性和特異性而相互結合，諸如用受體化學鍵、例如受體與配體間的一種鍵所表示的情況等。就具有的特異性結合雜草防治物質的結構來說，目標蛋白質可以是天然出現的蛋白質；通過胺基酸的取代、加成、缺失等而引入天然出現的蛋白質而獲得的其變體；以及具有在對除雜草防治物質親和性的引導下所選擇的隨機胺基酸序列的人工合成蛋白質。
在特徵(b)中術語「不具有修飾能力」指的是與所述蛋白質具有特異親和性的底物的酶化學反應是失活的(除特徵(a)中對雜草防治物質的特異性親和性之外)。這種情況的實例包括目標蛋白質不具有將與所述蛋白質具有特異親和性的物質例如一些雜草防治物質，以及基於對於所述蛋白質的特異性親和力，其有底物結構的轉化成具有不同於雜草防治物質化學結構物質的能力這樣一種情況「不具修飾能力」蛋白質可通過，例如檢測刪除了編碼所述蛋白的基因的微生物的生長的不可恢復性而鑑定，該微生物由於該基因的刪除因而不能在通常的，由於編碼所述蛋白的基因被導入微生物中並且表達的情況下生長。
特徵(c)中術語「基本上不含免疫球蛋白可變區的構架區」指的是目標蛋白質不形成對免疫球蛋白的可變區具有特異性的立體結構。術語「免疫球蛋白可變區的構架區」指的是在從作為免疫球蛋白分子的H鏈和L鏈可變區中除去高變區後剩餘的區。在這些區中，保持了相對較高的胺基酸序列且這些區對維持可變區較高的保守立體結構起作用。由於形成了上述立體結構，所以分別位於相應H鏈和L鏈上三個位點的高變區聚集於立體結構上的一個位點，從而形成抗原結合位點[Alberts,B.等編輯《細胞分子生物學》(Molecular Biology ofthe Cell),p979,Garland Publishing,Inc.,New York]。
具有上述特徵(c)的目標蛋白質可以根據、例如蛋白質的胺基酸序列來選擇。作為這種蛋白質的特殊實例，有不含有由大於或等於約30個胺基酸組成的任意胺基酸序列並與免疫球蛋白可變區構架區的公知胺基酸序列具有大約60％同源性的蛋白質等。例如，上述構架區的存在與否可以通過PCR來證實，在PCR中，使用編碼蛋白質的基因作為模板和具有編碼衍生於免疫球蛋白H鏈或L鏈可變區的核苷酸序列的DNAs作為擴增引物，例如Clackson,T.等在《自然》(Nature)352；p624(1991)中所述的引物VH1BACK與VH1FOR-2或VK2BACK與VK4FOR；用於克隆重組抗體基因的商購試劑盒中包含的引物、例如重組噬菌體抗體系統(Pharmacia Biotech)的重引物混合物或輕引物混合物，由此分析是否存在具有所得長度的擴增DNA。
與雜草防治物質具有特異性親和性的結合蛋白的例子也包括對雜草防治物質具有親和性的肽。
具有上述特徵(a)至(c)的目標蛋白質的特殊實例包括對原卟啉Ⅸ具有親和性的失活型結合蛋白質[例如底物是原卟啉Ⅸ(雜草防治物質)的失活型鎂螯合酶；失活型鐵螯合酶(正鐵血紅素鐵裂合酶；EC4.9.9.1)；可催化鈷離子與含有四吡咯環的化合物作為底物的配位反應的失活型鈷螯合酶；對原卟啉Ⅸ具有親和性的肽、即由4-100個胺基酸組成的蛋白質(例如，對原卟啉Ⅸ具有親和性的HASYS肽、例如含有SEQ ID NO:53胺基酸序列的蛋白質和含有SEQ ID NO:54胺基酸序列的蛋白質；對原卟啉Ⅸ具有親和性的肽RASSL、例如含有SEQ ID NO:55胺基酸序列的蛋白質和具有SEQ ID NO:56胺基酸序列的蛋白質；對卟啉化合物具有親和性的肽YAGA、例如含有SEQ IDNO:57胺基酸序列的蛋白質和具有SEQ ID NO:58胺基酸序列的蛋白質；對卟啉化合物具有親和性的肽YAGF、例如含有SEQ ID NO:59胺基酸序列的蛋白質和具有SEQ ID NO:60胺基酸序列的蛋白質等)]；對原卟啉原Ⅸ具有親和性的失活型結合蛋白質(例如，失活型PPO失活型糞卟啉原Ⅲ氧化酶)等。
上述失活型結合蛋白質包括它們的變體，其活性已經在天然或人工條件下通過天然出現的活性蛋白質的胺基酸取代、加成、缺失、修飾等而失去。
通過在植物細胞中將這些結合蛋白質與雜草防治物質進行結合可以防止由雜草防治物質導致的細胞功能異常，從而表現出所需的雜草防治化合物耐受性。
失活型鎂螯合酶是鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質、或對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的其變體，且它們的特殊實例包括來自其細胞器轉運信號序列已經缺失的亞單位蛋白質等。
失活型鐵螯合酶是不具有修飾原卟啉Ⅸ的能力而對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的其變體，且它們的特殊實例包括其中推定為鐵螯合酶的Fe離子結合位點的區已經被修飾的鐵螯合酶變體等。
失活型鈷螯合酶是鈷螯合酶的底物結合亞單位蛋白質、或不具有修飾原卟啉Ⅸ的能力而對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的其變體。
失活型PPO是不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的其變體，且它們的特殊實例包括其中推定為PPO的FAD結合位點的區(具有胺基酸序列GXGXXG、其中X是任意胺基酸的區，例如含有來自擬南芥菜(擬南芥)葉綠體固定PPO的N-末端的第63至第68個胺基酸並具有GGGISG胺基酸序列的區)已經缺失的PPO變體等。
失活型糞卟啉原Ⅲ氧化酶是不具有氧化原卟啉原的能力而對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的其變體。
編碼上述蛋白質的基因可以通過、例如下列方式獲得。
作為編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的基因，例如那些已經公知的基因，它們衍生於光合細菌莢膜紅球菌(基因庫登記號M74001)、擬南芥菜(基因庫登記號Z68495)、大麥(基因庫登記號U96216)、金魚草屬(金魚草)(基因庫登記號U26916)、集胞藻屬P.C.C.6803(基因庫登記號U29131)等。對於分離這類公知的基因(其核苷酸序列已經公知)來說，可以通過下列方式進行PCR使用具有所需基因有機體的基因組DNA或cDNA作為模板和基於相當於由該基因編碼的約蛋白質N-末端和C-末端的核苷酸序列產生的引物，從而擴增所需的基因。此外，編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的基因可以從光合有機體而不是上述物質獲得。例如，首先通過下列步驟來構建cDNA文庫從所需的光合有機體中獲得mRNA、通過使用mRNA作為模板與逆轉錄酶一起合成cDNA、並將cDNA整合入噬菌體載體、諸如ZAPⅡ等或質粒載體、諸如pUC等。為了擴增一種DNA片段、它含有至少部分可編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的基因，可以通過使用上述構建的cDNA文庫作為模板和基於公知基因、諸如上述基因中保持良好的核苷酸序列而設計併合成的引物來進行PCR。通過使用由此獲得的DNA片段作為探針對cDNA文庫進行篩選以便選擇陽性克隆。所需鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的基因可以通過所選克隆核苷酸序列的序列測定而得到確認。
為了獲得可編碼對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的變體的基因，例如通過引入核苷酸取代、加成、缺失、修飾等來誘變可編碼該亞單位蛋白質的基因，隨後按照Gibson,L.C.D.等在《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92；p1941(1995)中所述的方法等將所得基因引入大腸桿菌BL21(DE3)菌株以獲得轉化體，並在發生高表達由此引入的基因的條件下培養該轉化體。編碼對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的亞單位蛋白質變體的所需基因可以通過選擇一種菌株而獲得，該菌株的培養細胞已經變紅並具有表現出原卟啉Ⅸ蓄積的螢光吸收(激發波長為405nm，螢光波長為630nm)。
作為編碼鐵螯合酶的基因，例如是那些已經公知的基因，它們衍生於大腸桿菌(基因庫登記號D90259)、枯草芽孢桿菌(基因庫登記號M97208)、大豆慢生根瘤菌(基因庫登記號M92427)、酵母釀酒酵母(基因庫登記號J05395)、小鼠(基因庫登記號J05697)、人(基因庫登記號D00726)、大麥(基因庫登記號D26105)、黃瓜(基因庫登記號D26106)等。為了分離這樣一種公知的基因(其核苷酸序列已經公知)，可以通過下列方式進行PCR使用具有所需基因有機體的基因組DNA或cDNA作為模板和基於相當於由該基因編碼的約蛋白質N-末端和C-末端的核苷酸序列產生的引物，從而擴增所需的基因。此外，為了獲得其它可編碼鐵螯合酶的基因，例如首先通過下列步驟來構建cDNA文庫從所需的有機體中獲得mRNA、通過使用mRNA作為模板與逆轉錄酶一起合成cDNA、並將cDNA整合入噬菌體載體、諸如ZAPⅡ等或質粒載體、諸如pUC等。可以將cDNA文庫引入Miyamoto,K等在《植物生理學》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述的鐵螯合酶缺損的大腸桿菌菌株VS200，隨後進行互補測驗以選擇含有衍生於所需有機體的鐵螯合酶基因的克隆。此外，為了擴增DNA片段，可以通過使用上述構建的cDNA文庫作為模板和基於公知基因、諸如上述基因中保持良好的核苷酸序列而製備的引物來進行PCR。通過使用由此獲得的DNA片段作為探針對cDNA文庫進行篩選以便選擇陽性克隆。所需鐵螯合酶基因可以通過所選克隆核苷酸序列的序列測定而得到確認。
為了獲得可編碼不具有修飾原卟啉Ⅸ的能力而對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的鐵螯合酶變體的基因(例如，編碼鐵螯合酶變體的基因、其中推定為鐵螯合酶的Fe離子結合位點的區被修飾)，可以通過下列步驟進行PCR製備一種用於將突變引入基於核苷酸序列的區的誘變引物、所述的核苷酸序列可編碼與該區有關的胺基酸序列；並使用商購的定點誘變試劑盒(Mutan-Super Express,Takara Shuzo)，從而獲得可編碼上述變體的基因。特別地，將野生型鐵螯合酶基因插入質粒載體pKF19K的克隆位點並通過使用所得質粒DNA作為模板、上述誘變引物和用於位於pKF19K的耐卡那黴素基因上的反向琥珀突變的選擇引物來進行PCR。將通過PCR擴增的基因引入大腸桿菌MV1184菌株(不含抑制基因)並根據卡那黴素的耐受性來篩選轉化體以分離含有鐵螯合酶基因的大腸桿菌、其中相當於構成所需區的胺基酸序列的核苷酸序列已經被修飾。所分離的基因作為編碼所需蛋白質的基因可以通過分析大腸桿菌質粒DNA的核苷酸序列而得到確認。
編碼對原卟啉Ⅸ具有親和性的肽的基因、即由4-100個胺基酸組成的蛋白質可以通過下列步驟來獲得根據例如Sugimoto,N.,Nakano,S.在《化學通訊》(Chem.Lett.)p939(1997)中所述的方法等合成一種肽文庫；選擇對雜草防治物質基因親和性的肽；分析由此用一種肽測序儀選擇的肽的胺基酸序列；設計含有編碼胺基酸序列的核苷酸序列的基因；並用一種DNA合成儀或類似物來合成核苷酸序列。
此外，按照噬菌體展示法可以從噬菌體文庫中選擇可提供一種對雜草防治物質具有親和性的肽的噬菌體克隆。特別地，例如通過將可編碼具有隨機胺基酸序列的核苷酸序列插入來自可編碼M13噬菌體基因包被蛋白質pⅢ的區的上遊來構建提供在M13噬菌體顆粒表面上具有隨機胺基酸序列蛋白質的噬菌體文庫。另一方面，將用生物素標記的雜草防治物質與用親和素或鏈親和素包被的平板結合以製備一種用雜草防治物質包被的支持物。通過在用雜草防治物質包被的平板上篩選上述噬菌體文庫可以分離提供對雜草防治物質具有親和性的所需蛋白質的噬菌體且所需蛋白質的基因可以從分離的噬菌體中獲得。
例如通過下列步驟可以產生可編碼含有重複四次或八次由SEQ IDNO:53、55、57或59表示的胺基酸序列的蛋白質的基因選擇一種核苷酸序列、其中可編碼上述胺基酸序列的核苷酸序列在起始密碼子ATG後以給定次數重複；用一種DNA合成儀合成一種含有所選核苷酸序列的寡核苷酸和一種含有與所選核苷酸序列互補的核苷酸序列的寡核苷酸；且然後將它們進行退火。此外，通過下列步驟可以產生可編碼由SEQ ID NO:54、56、58或60表示的胺基酸序列的基因選擇一種可編碼胺基酸序列的核苷酸序列；用一種DNA合成儀合成一種含有所選核苷酸序列的寡核苷酸和另一種含有與所選核苷酸序列互補的核苷酸序列的寡核苷酸；且然後將它們進行退火。在這方面，例如為了選擇可編碼給定胺基酸序列的核苷酸序列，更好的情況是選擇頻繁用於衍生於植物的基因中的密碼子。
作為PPO基因，例如已經公知那些衍生於大腸桿菌(基因庫登記號X68660)、枯草芽孢桿菌(基因庫登記號M97208)、流感嗜血菌(基因庫登記號L42023)、小鼠(基因庫登記號D45185)、人(基因庫登記號D38537)、擬南芥菜(基因庫登記號D83139)、菸草(基因庫登記號Y13465、Y13466)等的基團。為了分離這樣一種公知的基因(其核苷酸序列已經公知)，使用含有所需基因有機體的基因組DNA或cDNA作為模板和基於相當於由該基因編碼的約蛋白質N-和C-末端的核苷酸序列所產生的引物可以進行PCR，從而擴增所需的基因。此外，為了獲得其它PPO基因，例如首先根據上述方法由含有所需基因的有機體來構建cDNA文庫。將該cDNA文庫引入Narita,S.等在《基因》(Gene)182；p169(1996)中所述的大腸桿菌PPO缺損突變體菌株VSR800，隨後進行一種互補測驗以選擇含有衍生於所需有機體的PPO基因。此外，為了擴增DNA片段，可以通過使用上述構建的cDNA文庫作為模板和基於公知基因、諸如上述基因中保持良好的核苷酸序列製備的引物來進行PCR。通過使用由此獲得的DNA片段作為探針對cDNA文庫進行篩選以便選擇陽性克隆。所需PPO基因可以通過所選克隆核苷酸序列的序列測定而得到確認。
為了獲得可編碼不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的PPO變體的基因，例如通過引發核苷酸的取代、加成、缺失修飾等來誘變PPO基因並將所得修飾的基因引入上述大腸桿菌、其生長通過用PPO抑制型除草化合物處理而受到光依賴性抑制。通過在氯高鐵血紅素、氨基乙醯丙酸和PPO抑制型除草化合物存在的情況下培養如此獲得的大腸桿菌可以選擇編碼具有原卟啉原Ⅸ結合能力的蛋白質的基因，從而選擇一種甚至可在光下生長的克隆。編碼對原卟啉原沒有氧化能力的蛋白質的基因可以通過下列步驟來選擇在宿主、諸如大腸桿菌等中表達如此選擇的修飾基因以製備由該基因編碼的蛋白質；並按照Jacob,N.J.和Jacobs,J.M.在《酶》(Enzyme)(1982)28,206-219所述的方法等測定其氧化原卟啉原Ⅸ的能力。更具體地說，將上述修飾的基因插入用於大腸桿菌的表達載體並引入大腸桿菌PPO基因(hemG基因座)缺失突變體、諸如Yamamoto,F.等在《日本遺傳雜誌》(Japanese J.Genet.)63；p237(1988)中所述的大腸桿菌BT3菌株。將大腸桿菌在含有氯高鐵血紅素和氨基乙醯丙酸以及相當於引入大腸桿菌的載體選擇標記的細胞生長抑制劑的培養基中進行培養以獲得轉化體。由該轉化體可以產生由修飾基因編碼的蛋白質。此外，通過在基本上不含氯高鐵血紅素和氨基乙醯丙酸的培養基中培養轉化體可以獲得不補充宿主細胞PPO基因缺損的基因，從而鑑定未生長的菌株。也可以將後一種方法用於選擇可編碼對原卟啉原Ⅸ不具有氧化能力的蛋白質的基因。
此外，為了獲得可編碼PPO變體的基因、其中其中推定為PPO的FAD結合位點的區(該區具有的胺基酸序列為GXGXXG，其中X是任意的胺基酸)被缺失，首先基於可編碼與該區有關的胺基酸序列的核苷酸序列來製備用於引發該區缺失突變的誘變引物。然後通過使用該誘變引物和如上所述的商購定點誘變試劑盒(Mutan-Super Express,Takara Shuzo)來進行PCR，從而獲得可編碼上述變體的蛋白質的基因、其中該區已經被缺失。
可以通過對用一種DNA合成儀合成的寡核苷酸進行退火而獲得可編碼肽蛋白質、諸如對原卟啉Ⅸ具有親和性的肽HASYS和RASSL以及對卟啉化合物具有親和性的肽YAGA和YAGF的基因等。
另外，通過下列方法等可以產生可編碼對其它雜草防治物質具有親和性的未知肽蛋白質的基因。例如，按照例如Sugimoto,N.,Nakano,S.在《化學通訊》(Chem.,Lett.)p939(1997)中所述的組合化學法等可以構建各種肽文庫。從在對雜草防治物質親和性指導下如此構建的肽文庫中選擇肽，隨後用一種肽測序儀來分析該肽的胺基酸序列。由此，通過一種DNA合成儀可以合成編碼該肽的基因。可選擇的情況是，提供對雜草防治物質具有親和性的期限克隆(phase clone)可以通過按照噬菌體展示法選擇噬菌體文庫來獲得。特別地，例如通過將可編碼具有隨機胺基酸序列的蛋白質的核苷酸序列插入來自可編碼M13噬菌體基因包被蛋白質pⅢ的區的上遊而構建提供在M13噬菌體顆粒表面上具有隨機胺基酸序列的蛋白質的噬菌體文庫。另一方面，將用生物素標記的雜草防治物質與用親和素或鏈親和素包被的平板結合以製備一種用雜草防治物質包被的支持物。通過在用雜草防治物質包被的平板上篩選上述噬菌體文庫可以分離提供對雜草防治物質具有親和性的所需蛋白質的噬菌體且所需肽蛋白質的基因可以從分離的噬菌體中獲得。
作為可編碼糞卟啉原Ⅲ氧化酶的基因，例如已經公知那些衍生於大腸桿菌(基因庫登記號X75413)、鼠傷寒沙門氏菌(基因庫登記號L19503)、酵母釀酒酵母(基因庫登記號J03873)、小鼠(基因庫登記號D1633)、人(基因庫登記號D16333)、大豆(基因庫登記號X71083)、大麥(基因庫登記號X82830)、菸草(基因庫登記號X82831)等的基團。為了分離這樣一種公知的基因(其核苷酸序列已經公知)，通過使用含有所需基因有機體的基因組DNA或cDNA作為模板和基於相當於由該基因編碼的約蛋白質N-和C-末端的核苷酸序列所產生的引物可以進行PCR，從而擴增所需的基因。此外，為了獲得其它糞卟啉原Ⅲ氧化酶基因，例如首先通過下列步驟由含有所需基因的有機體來構建cDNA文庫由所需有機體製備mRNA；使用mRNA作為模板與一種逆轉錄酶一起合成cDNA；並將它整合入一種質粒載體、諸如Sikorski,R.S.等在《遺傳學》(Genetis)122；p19(1989)中所述的pRS313等。可以將該cDNA文庫引入Troup,B.等在《細菌學》(Bacteriol.)176；p673(1994)中所述的酵母糞卟啉原Ⅲ氧化酶缺損突變體菌株HEM13，隨後進行一種互補測驗以選擇含有衍生於所需有機體的糞卟啉原Ⅲ氧化酶的克隆。此外，為了擴增DNA片段，可以通過使用上述構建的cDNA文庫作為模板和基於公知基因、諸如上述基因中保持良好的核苷酸序列製備的引物來進行PCR。通過使用由此獲得的DNA片段作為探針對cDNA文庫進行篩選以便選擇陽性克隆。所需糞卟啉原Ⅲ氧化酶可以通過所選克隆核苷酸序列的序列測定而得到確認。
為了獲得可編碼不具有氧化原卟啉原Ⅸ的能力而對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的糞卟啉原(coporphyrinogen)Ⅲ氧化酶變體的基因，例如通過引發核苷酸的取代、加成、缺失修飾等來誘變糞卟啉原Ⅲ氧化酶基因並將所得修飾的基因引入上述大腸桿菌、其生長通過用PPO抑制型除草化合物處理而受到光依賴性抑制。通過在氯高鐵血紅素、氨基乙醯丙酸和PPO抑制型除草劑存在的情況下培養如此獲得的大腸桿菌可以選擇編碼具有酚卟啉原Ⅸ結合能力的蛋白質的基因，從而選擇一種甚至可在光下生長的克隆。編碼對原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力的基因可以通過下列步驟來選擇在宿主、諸如大腸桿菌等中表達如此選擇的修飾基因以製備由該基因編碼的蛋白質；並按照Jacob,N.J.和Jacobs,J.M.在《酶》(Enzyme)(1982)28,206-219中所述的方法等測定其氧化原卟啉原Ⅸ的能力。
用於本發明方法第二個方面的基因是那些可編碼具有下列特徵(a)至(c)的蛋白質的基因(a)對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性；(b)對原卟啉原Ⅸ基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白可變區的構架區。
特徵(a)中術語對原卟啉Ⅸ的「特異性親和性」基本上與上述本發明方法的第一個方面中所述的內容相同且指的是蛋白質與原卟啉Ⅸ通過酶學方式相互結合、或蛋白質與原卟啉Ⅸ基於如受體化學鍵中、諸如受體與配體間的一種鍵所示的親和性和特異性的相互結合等。就具有的特異性結合原卟啉Ⅸ的結構來說，蛋白質可以是天然出現的蛋白質；將胺基酸的取代、加成、缺失修飾等引入天然出現的蛋白質而獲得的其變體；以及具有在對原卟啉Ⅸ親和性的指導下所選擇的隨機胺基酸序列的人工合成蛋白質。
在特徵(b)中術語對原卟啉原Ⅸ「基本不具有修飾能力」指的是與蛋白質的原卟啉Ⅸ的酶化學反應是失活的或不存在。例如，這指的是蛋白質不具有將原卟啉原Ⅸ轉化成具有不同於原卟啉原Ⅸ化學結構的物質的能力。
特徵(c)中術語「基本上不含免疫球蛋白可變區的構架區」與上述本發明方法的第一個方面中所述的內容相同且如上文所述蛋白質不會形成對免疫球蛋白中的可變區具有特異性的立體結構。
作為具有上述特徵(a)至(c)的蛋白質的特殊實例，有對原卟啉Ⅸ具有親和性的活性或失活型結合蛋白質[例如底物是原卟啉Ⅸ的活性或失活型鎂螯合酶；活性或失活型鐵螯合酶；可催化與含有四吡咯環的化合物作為底物的鈷離子配位反應的活性或失活型鈷螯合酶；肽、即對原卟啉Ⅸ具有親和性的由4-100個胺基酸組成的蛋白質(例如，含有至少選自對原卟啉Ⅸ具有親和性的肽HASYS中一種肽的蛋白質、例如含有SEQ ID NO:53胺基酸序列的蛋白質和含有SEQ IDNO:54胺基酸序列的蛋白質；對原卟啉Ⅸ具有親和性的肽RASSL、即含有SEQ ID NO:55胺基酸序列的蛋白質和含有SEQ ID NO:56胺基酸序列的蛋白質；對卟啉化合物具有親和性的肽YAGA、例如含有SEQ ID NO:57胺基酸序列的蛋白質和含有SEQ ID NO:58胺基酸序列的蛋白質；對卟啉化合物具有親和性的肽YAGF、即含有SEQ IDNO:59胺基酸序列的蛋白質和含有SEQ ID NO:60胺基酸序列的蛋白質等)]；對原卟啉原Ⅸ具有親和性的失活型結合蛋白質(例如，失活型PPO)等。
編碼上述蛋白質的基因可以，例如，如下獲得活性型鎂螯合酶，由三種異源亞單位蛋白質，即，原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質(H亞單位蛋白質)，I亞單位蛋白質和D亞單位蛋白質，其都是催化活性所必需的。三種獨立的亞單位蛋白質由不同基因編碼。原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質基因可由PCR式篩選cDNA文庫獲得。
作用編碼鎂螯合酶的I亞單位蛋白質的基因，例如，那些衍生於光合細菌，類球紅細菌(基因庫編號AF017642)，類膜紅細菌(基因庫編號Z11165)。擬南芥(基因庫編號D49426)，大麥(基因庫編號U26545)，大豆(基因庫編號D45857)，菸草(基因庫編號AF14053),Synechocytis P.C.C.6803(基因庫編號U35144)等是公知的，使用具所需基因的生物體的基因組DNA式cDNA為模板，基於對應於所需基因編碼的蛋白的N式C端核苷酸序列而產生的模板PCR。此外，編碼鎂螯合酶的I亞單位蛋白質的基因可從上述以外的光合生物中獲得。例如，首先，從所需光合生物體中獲得mRNA，用反轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA，將cDNA整合到噬菌體載體如IAPⅡ等，或當質粒載體如PUC等構建cDNA庫。為了擴增含有編碼鎂螯合酶I亞單位蛋白質的編碼基因的至少一部分的DNA片段，使用上述構建的cDNA文庫做為模板，以及基於在上述基因中已知是保守的核苷酸序列設計和合成的引物進行PCR。通過使用如此獲得的DNA片段為探針來選擇陽性克隆而進行cDNA文庫篩選。鎂螯合酶的I亞單位蛋白質的所需基團可通過確定選定克隆的核苷酸序列而確認。
作為編碼鎂螯合酶的D亞單位蛋白的基因，例如，那些衍生自光合細菌，類球紅細菌(基因庫編號AJ001690)，類膜紅細菌(基因庫編號Z11165)，豌豆(基因庫編號AF014399)，菸草(基因庫編號Y10022)，Synechocystis P.C.C.6803(基因庫編號X95699)等是已知的。這樣已知基因(其核苷酸序列是已知的；或上述基因以外基因之分離，可以如編碼鎂螯合劑I亞單位蛋白質的同樣方式獲得。
用於本發明方法第三個方面的基因是那些可編碼具有至少下列特徵(a)至(c)的蛋白質的基因(a)對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性；(b)對糞卟啉原Ⅲ具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白可變區的構架區。
特徵(a)中術語對原卟啉原Ⅸ的「特異性親和性」基本上與上述本發明方法的第一個或第二個方面中所述的內容相同且指的是蛋白質與原卟啉原Ⅸ通過酶方式相互結合、或蛋白質與原卟啉原Ⅸ基於如受體化學鍵中、諸如受體與配體間的一種鍵所示的親和性和特異性的相互結合等。就具有的特異性結合原卟啉原Ⅸ的結構來說，蛋白質可以是天然出現的蛋白質；將胺基酸的取代、加成、缺失、修飾等引入天然出現的蛋白質而獲得的其變體；以及具有在對原卟啉原Ⅸ親和性的指導下所選擇的隨機胺基酸序列的人工合成蛋白質。
在特徵(b)中術語「對糞卟啉原Ⅲ具有修飾能力」指的是與蛋白質的糞卟啉原Ⅲ的酶化學反應是失活的。例如，這指的是蛋白質具有將糞卟啉原Ⅲ轉化成具有不同於糞卟啉原Ⅲ化學結構的物質的能力。
術語「基本上不含免疫球蛋白可變區的構架區」與上述本發明方法的第一個或第二個方面中所述的內容相同且如上文所述蛋白質不會形成對免疫球蛋白中的可變區具有特異性的立體結構。
作為具有至少上述特徵(a)至(c)之一的蛋白質的特殊實例，有對原卟啉原Ⅸ具有親和性的活性或失活型結合蛋白質，例如底物是原卟啉原Ⅸ的活性類糞卟啉原Ⅲ氧化酶等。
作為參考，鎂螯合酶，鐵螯合酶，鐵螯合酶或糞卟啉原Ⅲ氧化酶的活性可通過下列方法測量。
(1)鎂螯合酶編碼獨立三個亞基蛋白質的基因被用於按Gibson.L.C.D等的方法檢測鎂螯合酶(美國國立科學院院報92；p1941(1995))等。
(2)鐵螯合酶鐵螯合酶活性可以例如按Porra.R.J(分析生物化學68；p289(1975))等檢測。
(3)糞卟啉原Ⅲ氧化酶糞卟啉原Ⅲ氧化酶活性可以例如按Yoshinaga,J.,Sano.S.，等方法檢測(生物化學雜誌255；p4722(1980))。
在本發明的方法(包括上述第一至第三個方面)中，為了將編碼具有特徵(a)至(c)的蛋白質的基因引入植物細胞，可以引入可編碼一種蛋白質的基因。此外，可以將編碼不同蛋白質的多個基因引入植物細胞。可以通過常規的基因工程技術來進行這類將基因引入植物細胞的過程，例如農桿菌屬感染法(JP-B2-58917和JP-A60-70070)、進入原生質體的電穿孔法(JP-A60-251887和JP-A5-68575)、基因槍法(JP-A5-508316和JP-A63-258525)等。優選的情況是，將引入植物細胞的基因整合入含有選擇標記基因的載體，所述含有選擇標記的基因諸如可以使植物細胞對細胞生長抑制劑產生耐受性的基因。
為了要植物細胞中表達該基因，可以通過同源重組將基因引入植物細胞的染色體[Fraley,R.T.等，《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acd.Sci.USA),80；p4803(1983)]以選擇表達該基因的植物細胞。可選擇的情況是，以這樣一種形式將基因引入植物細胞、即以可操作的方式將它與均可以在植物細胞中起作用啟動子和終止子連接。
本文所用的術語「可操作地連接」指的是上述啟動子和終止子以這樣一種形式連接、即在植物細胞中將引入的基因在該啟動子和該終止子的控制下進行表達的方式。
作為可以在植物細胞中起作用的啟動子，例如有衍生於T-DNA的組成型啟動子，諸如胭脂氨酸合酶基因啟動子、章魚氨酸合酶基因啟動子等；衍生於植物病毒的啟動子，諸如衍生於花椰菜花葉病毒的19S和35S啟動子等；誘導型啟動子，諸如苯丙氨酸脫氨酶基因啟動子、抑素合酶基因啟動子、與病理相關的蛋白質基因啟動子等；以及類似的啟動子。啟動子不限於這些啟動子且可以使用其它的啟動子。
作為可以在植物細胞中起作用的終止子，例如由有衍生於T-DNA的終止子，諸如胭脂氨酸合酶終止子等；衍生於植物病毒的終止子，諸如衍生於大蒜病毒GV1、GV2等的終止子等。終止子不限於這些終止子且可以使用其它的終止子。
作為引入基因的植物細胞，例如有植物組織、完整植物體、培養的細胞、種子等。引入基因的植物物種的實例包括諸如菸草、棉花、油菜子、製糖甜菜、擬南芥菜、canola、亞麻、向日葵、馬鈴薯、苜蓿、萵苣屬、香蕉、大豆、豌豆、莢果、松屬、楊樹、蘋果、葡萄、桔果、堅果等這樣的雙子葉植物以及諸如玉米、稻、小麥、大麥、黑麥、燕麥、高粱屬、甘蔗、菌苔等這樣的單子葉植物。
表達基因的轉化體植物細胞可以通過下列步驟獲得、其中所述的基因可編碼具有(a)至(c)特徵之一的結合蛋白質在相當於與基因上基因座連接的選擇標記的選擇培養基(例如，含有細胞生長抑制劑的培養基等)中培養轉入了基因的細胞；並分離能夠在該培養基中生長的克隆。可選擇的情況是，通過下列步驟可以選擇上述轉化體植物細胞在含有產生耐受性雜草防治化合物的培養基中培養引入了基因的植物細胞並分離能夠在該培養基中生長的克隆。所需耐雜草防治化合物植物可以由轉化體細胞獲得，所述的轉化體細胞通過按照(例如)《用於生產轉基因植物的方法》(Method for Producing TransgenicPlants)的「植物基因操作說明」(Plant Gene Manipulation Manual)(UCHIMIYA，Kodansha Scientmc(1996))中所述的常規植物細胞培養法使植物體再生而獲得。因此，可以獲得轉化的植物，轉入植物組織、植物個體、培養的細胞、種子等。
例如，按照《模型植物的實驗方案》(Experimental Protocol of ModelPlants)-《稻米和擬南芥菜》版(Rice and Mouse-Ear Cress Edition)(監製人Koh SHIMAMOTO和Kiyotaka OKADA,Shuzun-sha,1996)第4章所述的方法可以獲得表達可編碼上述蛋白質的基因的稻米和擬南芥菜。此外，按照JP-A3-291501中所述的方法，通過用一種基因槍將基因引入大豆無定形胚而獲得表達可編碼結合蛋白質的基因的大豆。同樣，按照Fromm,M.E.等在《生物/技術》(Bio/Tchnology)8；p838(1990)中所述的方法，通過用一種基因槍將基因引入無定形胚可以獲得表達可編碼上述蛋白質的基因的棉花。按照TAKUMI等在《繁殖協會雜誌》(Journal of Breeding Society)(1995)44附卷1,p57中所述的常規方法，通過用一種基因槍將基因引入無菌培養的小麥未成熟鱗片可以獲得表達可編碼上述蛋白質的基因的小麥。同樣，按照HAGIO等在《繁殖協會雜誌》(Journal of Breeding Society)(1995)44附卷1,p67中所述的常規方法，通過用一種基因槍將基因引入大麥的未成熟鱗片可以獲得表達可編碼上述蛋白質的基因的大麥。
為了證實表達可編碼上述蛋白質的基因的植物對雜草防治化合物的耐受性，優選通過施用產生耐受性的雜草防治化合物以評價植物生殖的程度而使植物再生。為了更加定量地進行證實，例如就具有PPO抑制型除草活性的化合物的耐受性來說，優選將植物的葉片浸入不同濃度的含有具有PPO抑制型除草活性的化合物的水溶液中、或將含有具有除草活性的化合物的水溶液噴在植物的葉片上，隨後在室溫和光下使之維持在瓊脂培養基上。幾天後，按照Mackenney,G.在《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)140,p315(1941)中所述的方法從植物的葉中提取葉綠素以測定葉綠素的含量。
由於通過本發明方法(包括第一至第三個方面)獲得的耐雜草防治化合物植物(例如植物組織、植物個體、培養的細胞、種子等)表現出對雜草防治化合物的耐受性，所以甚至在將雜草防治化合物施用於生長區(例如栽培區、繁殖區等)的情況下，該植物仍可以生長。由此，當將雜草防治化合物施用於所需耐雜草防治化合物植物的生長區時，可使所需植物避免對雜草防治植物沒有耐受性的不利影響。例如，通過在對雜草防治化合物具有耐受性的植物的生長區噴灑雜草防治化合物可以有效地控制雜草。
此外，通過對用本發明方法(包括第一至第三個方面)獲得的耐雜草防治化合物植物和其它植物(例如那些對雜草防治化合物沒有或具有弱耐受性的植物)的生長區施用雜草防治化合物，可以根據生長中的差異來選擇這些植物之一。例如，通過對用本發明方法獲得的耐雜草防治化合物植物和其它植物(例如那些對雜草防治化合物沒有或具有弱耐受性的植物)的栽培區施用(添加)雜草防治化合物，可以根據生長中的差異來有效地選擇這些植物細胞之一。
下面的實施例更進一步來解釋本發明，但它們不用來限定本發明的範圍。
實施例1鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質基因的分離使用用於基因組DNA製備的ISOPLANT試劑盒(由Nippon Gene生產)來製備光合細菌類球紅細菌ATCC17023的基因組DNA。然後，按照Gibson,L.C.D.等在《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.USA)92；p1951(1995)中所述，通過使用約1μg所述基因組DNA作為模板以及10pmol由SEQ ID NO:1代表的核苷酸序列組成的寡核苷酸和10pmol由SEQ ID NO:2代表的核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物來進行PCR，從而擴增含有鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質基因bchH的DNA片段。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來製備寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它進行純化。通過下列步驟來進行PCR反應在94℃下維持2分鐘、在96℃下維持40秒且然後在68℃下維持7分鐘；將在96℃下維持40秒且然後在68℃維持7分鐘的一個循環重複28次；且最後在96℃下維持40秒、在68℃下維持7分鐘且然後在72℃下維持10分鐘。
實施例2大腸桿菌(下文縮寫為E.coli)中鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質基因的表達按照Gibson,L.C.D.等在《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.USA)92；p1941(1995)中所述，用限制酶NdeⅠ和BglⅡ來消化實施例1中製備的含有bchH基因的DNA片段。將所得DNA片段插入表達載體pET11a(由Stratagene生產)的NdeⅠ限制位點與BamHⅠ限制位點之間以獲得質粒pETBCH(附圖1)。按照與感受態細胞相關的操作指南將這種質粒pETBCH引入大腸桿菌BL21(DE3)菌株感受態細胞(由Stratagene生產)，從而獲得大腸桿菌BL21(DE3)/pETBCH菌株。將該菌株接種入試管(14×10mm)內含有100μg/ml氨苄青黴素的1.5ml LB液體培養基(1％胰化蛋白腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)，將該試管用鋁箔覆蓋(下文稱作在黑暗條件下)，在37℃、螢光燈(約8000勒)的光下通過振搖進行培養。當液體培養基在600nm處的吸收度變為約0.6時，將異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加入到液體培養基中，使得最終的濃度為0.4mM，並將該培養過程另外持續約20小時。此後，大腸桿菌變紅並且觀察到表現原卟啉Ⅸ在大腸桿菌中蓄積的螢光吸收(激發波長405nm，螢光波長630nm)。除不加入IPTG外，當按照相同的方式培養大腸桿菌BL21(DE3)/pETBCH菌株時，大腸桿菌沒有變紅並且沒有檢測到上述螢光吸收。與此相反，除不用鋁箔覆蓋(下文稱作光條件)外，當按照相同的方式(含有IPTG)培養大腸桿菌BL21(DE3)/pETBCH菌株時，大腸桿菌生長並且如上所述變紅。
實施例3衍生於大豆的PPO基因在hemG基因缺損大腸桿菌中的表達將大豆(甘氨酸最大變種Williams82)種植且在25℃下培養20天並收集綠葉。用液氮冷凍收集的綠葉並用研杵和研缽研磨冷凍的綠葉。通過使用RNA提取試劑ISOGEN(由Nippon Gene生產)、按照附於其中的操作指南從磨碎的葉中提取RNA。將所得RNA液體提取物進行乙醇沉澱以收集總RNA，然後通過使用聚腺苷酸RNA分級分離試劑盒即BIOMAG mRNA純化試劑盒(由Perceptive Bio System生產)、按照附於其中的操作指南來對總RNA進行分級分離以收集聚腺苷酸RNA級分。使用1μg這種聚腺苷酸RNA級分作為模板，用MarathoncDNA擴增試劑盒(由Clothech生產)中含有的cDNA合成試劑、按照附於其中的操作指南來合成cDNA。通過使用所得cDNA作為模板和由SEQ ID NO:3核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:4核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物來進行PCR以擴增含有葉綠體類原卟啉原Ⅸ氧化酶基因的DNA片段。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)製備上述寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC注)對其進行純化。通過下列步驟來進行PCR反應在94℃下維持1分鐘且然後在65℃下維持5分鐘；將在94℃下維持15秒且然後在65℃維持5分鐘的一個循環重複29次。PCR反應後，通過用MicroSpin S-400HR(由Pharmacia Biotech生產)過濾反應混合物而對擴增的DNA片段進行純化，並將該DNA片段與由限制酶SalⅠ切割的質粒pCR2.1(由Invitrogen生產)連接以獲得質粒pSPPO-P。然後，將該質粒引入大腸桿菌INVαF』菌株(由Invitrogen生產)的感受態細胞並選擇耐氨苄青黴素菌株。接著，通過使用染料終止子循環測序試劑盒(由PE應用生物系統生產)和DNA測序儀373S(由PE應用生物系統生產)來對所選耐氨苄青黴素菌株中含有的質粒進行測序。結果顯示出了SEQ ID NO:5的核苷酸序列，由此證實質粒pSPPO-P含有大豆的葉綠體類原卟啉原Ⅸ氧化酶基因。
用限制酶PshBⅠ消化質粒pSPPO-P，通過使用T4DNA聚合酶使所得DNA片段鈍端化並進一步用SphⅠ消化以分離含有大豆的葉綠體類PPO基因和lac啟動子的DNA片段。然後，用限制酶NruⅠ和SphⅠ來消化質粒pACYC184(由Nippon Gene生產)以除去410bp的片段而代之插入上述DNA片段以獲得質粒pACYCSP(附圖2)。接著，按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，將質粒pACYCSP引入PPO基因(hemG基因的基因座)缺損突變體大腸桿菌BT3菌株(Yamamoto,F.等在《日本遺傳學雜誌》(Japanese J.Genet.)63；p237(1988)等)。在含有15μg/ml氯黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基(5g/升酵母(east)提取物、5g/升胰化蛋白腖、5g/升腖、10g/升NaCl,pH7.0)中培養所得大腸桿菌以選擇對氯黴素和卡那黴素具有耐受性的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株，通過衍生於大豆的PPO基因對其hemG基因缺損進行了補充。
實施例4產生雜草防治混合物耐受性能力的鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的試驗將實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株接種入YPT培養基，該培養基含有10或1ppm的由上述結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、10μg/ml氯高鐵血紅素、50μg/ml氨基乙醯丙酸、15μg/ml氯黴素和10μg/ml卡那黴素；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。作為對照組，在同樣條件下，在與上述不含除草化合物的相同培養基中培養大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表1中所示。
表1
通過下列步驟來構建質粒pTVBCH(附圖3)使用由SEQ ID NO:1核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:2核苷酸序列組成的寡核苷酸、按照與實施例1中相同的方式來擴增含有衍生於光合細菌類球紅細菌的bchH基因的DNA片段；用限制酶NcoⅠ和BglⅡ來消化所得DNA片段並將消化的DNA片段引入質粒pTV118N(由Takara ShuzoCo.,Ltd.生產)的NcoⅠ限制位點與BamHⅠ限制位點之間。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法將質粒pTVBCH和pTV118N引入實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。在含有100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養所得大腸桿菌以獲得具有質粒pACYCSP和pTVBCH的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVBCH菌株以及具有質粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養基，該培養基含有10或1ppm的由上述結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始後18小時，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表2中所示。
表2
此外，將運些菌株接種入YPT培養基，該培養基含有分別由上述結構1、14、15、18-22、29、32、33、34和36所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表3中所示。
表3
實施例5將編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的基因引入菸草通過農桿菌屬感染法構建用於將bchH基因引入植物的質粒。首先，用限制酶SacⅠ消化二元載體pBI121(由Clonetech生產)，並插入KpnⅠ接頭(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)以製備質粒pBIK，其中除去pBI121的SacⅠ識別位點而添加KpnⅠ識別位點。另一方面，按照與實施例1中所述相同的方式，通過使用光合細菌類球紅細菌作為模板以及由SEQ ID NO:7核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ IDNO:8核苷酸序列組成的寡核苷酸引物來進行PCR，從而擴增含有bchH基因的DNA片段。然後，用限制酶XbaⅠ和KpnⅠ消化上述質粒pBIK以除去β-葡糖苷酸酶基因、並替換，將通過用限制酶XbaⅠ和KpnⅠ消化上述含有bchH基因的DNA片段而獲得的DNA片段插入以產生質粒pBIBCH(附圖4)，其中bchH基因與來自35S啟動子的下遊連接。還用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化二元載體pBI121(由Clonetech生產)以除去β-葡糖苷酸酶基因，通過使用T4 DNA聚合酶使所得DNA片段鈍端化，隨後用TADNA連接酶自環化以構建質粒pNO(附圖5)。將該質粒用作bchH表達質粒pBIBCH的載體對照。
分別將質粒pBIBCH和pNO引入根癌土壤桿菌LBA4404。通過在含有300μg/ml鏈黴素、100μg/ml利福黴素和25μg/ml卡那黴素的培養基中培養所得轉化體並選擇所需轉化體而將具有pBIBCH的土壤桿菌屬菌株和具有pNO的土壤桿菌屬菌株進行分離。
然後，按照「植物基因的基因操作說明」(Manual for Plant Gene ofGene Manipulation)(Hirofumi UCHIMIYA,Kodan-sha Scientific,1992)中所述的方法，將基因引入菸草。在28℃下將具有質粒pBIBCH的土壤桿菌屬(Abrobacterium)菌株在LB培養基(0.5％酵母提取物、1.0％細菌培養用胰化蛋白腖、0.5％NaCl)培養過夜且然後將無菌培養的菸草葉片浸入液體培養基中。在室溫下將葉片在含有0.8％瓊脂、0.1mg/升萘乙酸和0.1mg/ml苄基氨基嘌呤的Murashige-Skoog培養基(MS培養基，Murashige T.和Skoog F.在《植物生理學》(Physiol.Plant.)(1962)15,p473中所述)培養2天。接著，將葉片用無菌水洗滌並在含有0.8％瓊脂、0.1mg/升萘乙酸、0.1mg/升苄基氨基嘌呤和500μg/ml頭孢氨噻的MS培養基上培養7天。將該葉片移植到含有0.8％μg/ml頭孢氨噻的MS培養基上培養7天。將該葉片移植到含有0.8％瓊脂、0.1mg/升萘乙酸、0.1％mg/升苄基氨基嘌呤、500μg/ml頭孢氨噻和100μg/ml卡那黴素的MS培養基(下文稱作選擇性MS培養基)上並通過每1個月將菸草葉片移植到新鮮選擇性MS培養基上的方式在培養基上連續培養4個月。在培養期間，從菸草葉片中出現莖-葉分化的嫩枝，將這些嫩枝移植到含有0.8％瓊脂、300μg/ml頭孢氨噻和50μg/ml卡那黴素的MS培養基上並將根製成再生的個體。將所得再生的個體移植到含有0.8％瓊脂和50μg/ml卡那黴素的MS培養基上並培養以獲得引入了bchH基因的菸草個體。類似地，用具有pNO的農桿菌屬菌株感染菸草葉片以由菸草葉片和菸草個體獲得再生的個體(下文稱作對照重組菸草)。
實施例6具有可編碼鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的引入基因的菸草對除草化合物的耐受性的試驗分別收集引入了bchH基因的菸草葉和實施例5中獲得的重組菸草葉並沿主脈將葉各自分成左右相等的片。對一片施用含有0.3ppm的結構8的PPO抑制型除草化合物的水溶液，而對另一片不施用該化合物。將這些葉片放在含有0.8％瓊脂的MS培養基上並使之在光處、室溫下維持7天。然後，用研杵和研缽將每一葉片在5ml 80％的丙酮水溶液中研磨以提取葉綠素。按照Macknney G.在《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)(1941)140,p315中所述的方法用80％的丙酮水溶液稀釋該提取液並在750nm、663nm和645nm處測定吸收度以計算總葉綠素含量。將從引入了bchH基因菸草的4個克隆中獲得的結果(BCH1-4)和對照重組菸草的結果列在表4中。在該表中，對除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總葉綠素含量與未處理葉片的總葉綠素含量之比的百分數來表示。
表4
按照相同的方式用含有由上述結構3、7、10、11、13、17、23、24、25、27、28、30或35所代表的PPO抑制型除草化合物的溶液處理引入了bchH基因的菸草克隆和對照重組菸草，並測定對每一除草化合物的耐受程度。結果如表5中所示。在該表中，對除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總葉綠素含量與未處理葉片的總葉綠素含量之比的百分數來表示。
表5
實施例7分離可編碼菸草鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的蛋白質變體的基因使用Rneasy植物試劑盒(由QIAGEN生產)、按照附於其中的操作指南由菸草的葉組織(菸草變種(Nicotiana tabacum cv.SR1)製備總RNAs。通過使用RNALAPCR試劑盒(AMV)Ver1.1(Taraka ShuzoCo.,Ltd.生產)、按照附於其中的操作指南來獲得DNA片段，它含有可編碼葉綠體轉運信號已經缺失的菸草鎂螯合酶原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白質的基因(下文稱作菸草螯合酶亞單位變體)。首先，通過使用菸草總RNAs作為模板和上述試劑盒中含有的寡核苷酸dT-銜接頭引物作為引物與上述試劑盒中含有的逆轉錄酶一起來合成第一鏈cDNA。然後，通過使用第一鏈cDNA作為模板和上述試劑盒中含有的LA Taq聚合酶來進行PCR以擴增DNA片段，它含有可編碼菸草螯合酶亞單位變體的基因。在這種PCR中，使用的是由SEQ ID NO:9的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:10的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物。通過使用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸並用移植寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對其進行純化。通過下列步驟來進行PCR反應在94℃下維持2分鐘且然後將在94℃下維持30秒、在50℃下維持30秒且然後在72℃維持7分鐘的一個循環重複30次。PCR反應後，通過使用TA克隆試劑盒(Invitrogen生產)、按照附於其中的操作指南將PCR反應擴增的DNA片段克隆入質粒pCR2.1。用限制酶KpnⅠ消化所得質粒並通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。將來自所檢測的8.0kbDNA片段的質粒稱作pTCHLH。該質粒具有這樣一種結構、即在lac啟動子控制下已經以定向表達的方式插入了可編碼菸草螯合酶亞單位的基因。用限制酶KpnⅠ消化質粒pTCHLH，隨後進行自身連接，從而獲得質粒pTCHLH1(附圖6)，其中由約60個核苷酸組成的DNA片段已經從質粒pTCHLH中缺失。
實施例8對除草化合物生產耐受性能力的菸草螯合酶亞單位變體的試驗按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分別將實施例7中製備的質粒pTCHLH1和pCR2.1引入實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100Pg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和50μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養上述菌株而分別獲得具有質粒pACYCSP和pTCHLH1的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTCHLH1菌株以及具有質粒pACYCSP和pCR2.1的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pCR2.1菌株。
將這些菌株接種入YPT培養基，該培養基含有10或1ppm的由上述結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、50μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表6中所示。
表6
實施例9將可編碼菸草鎂螯合酶亞單位變體的基因引入菸草構建通過農桿菌屬感染法將可編碼菸草鎂螯合酶亞單位蛋白質的基因引入菸草的質粒。首先，通過用限制酶KpnⅠ和SalⅠ消化實施例7中製備的質粒pTVBCH1來製備DNA片段，它含有可編碼菸草鎂螯合酶亞單位蛋白質變體的基因。另一方面，用限制酶SamⅠ消化二元載體pBI121(由Clonetech生產)並將KpnⅠ接頭(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)插入這部分以製備質粒pBI121K，其中除去pBI121的SmaⅠ識別位點而添加KpnⅠ識別位點。用限制酶SacⅠ消化質粒pBI121K，隨後通過用DNA聚合酶Ⅰ將核苷酸添加到雙鏈DNA缺口上而使DNA鈍端化。然後，用衍生於牛腸的鹼性磷酸酶使DNA去磷酸化並通過插入磷酸化SalⅠ接頭(4680P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)而使之環化，從而構建質粒pBI121KS。用限制酶KpnⅠ和SalⅠ消化二元載體pBI121KS以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因並將編碼菸草螯合酶亞單位的基因插入這部分以製備質粒pBITCHLH(附圖7)。
將質粒pBITCHLH引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈黴素、100μg/ml利福黴素和25μg/ml卡那黴素的培養基中培養所得的轉化體，隨後選擇所需的轉化體以分離具有pBITCHLH的農桿菌屬菌株。
用農桿菌屬菌株感染無菌培養的菸草葉片並按照與實施例5中相同的方式獲得引入了可編碼菸草鎂螯合酶亞單位蛋白質變體的基因的菸草。
實施例10具有可編碼菸草鎂螯合酶亞單位蛋白質變體的引入基因的菸草對除草化合物耐受性的確認按照與實施例6中相同的方式、通過檢測實施例9中製備的引入了可編碼菸草鎂螯合酶亞單位蛋白質變體的基因的菸草而定量地確定對除草化合物的耐受程度。
實施例11分離編碼對原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力而對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的大豆PPO蛋白質變體的基因通過下列方式進行PCR使用實施例3中製備的質粒pSPPO-P作為模板和由SEQ ID NO:11的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:12的核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物，從而擴增DNA片段，它可編碼葉綠體轉運信號和FAD結合序列已經缺失的大豆PPO(下文稱作大豆PPO變體)。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來製備寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它進行純化。通過將在94℃下維持1分鐘、在55℃下維持2分鐘且然後在72℃下維持3分鐘的一個循環重複30次來進行PCR反應。用限制酶NcoⅠ和SalⅠ消化擴增的DNA片段並引入質粒pTV118N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)的NcoⅠ限制位點和SalⅠ限制位點，從而構建質粒pTVGMP(附圖8)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，將質粒pTVGMP引入大腸桿菌PPO基因缺損突變體系BT3菌株。當在含有100μg/ml氨苄青黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養所得的大腸桿菌時，互補克隆沒有生長。
實施例12大豆PPO變體對除草化合物產生耐受性作用的試驗按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分別將實施例11中製備的質粒pTVGMP和pTV118N引入實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和50μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養上述菌株而獲得具有質粒pACYCSP和pTVGMP的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVGMP菌株以及具有質粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養基，該培養基含有10或1ppm的由結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表7中所示。
表7
實施例13將可編碼大豆PPO變體的基因引入菸草構建通過農桿菌屬感染法將可編碼大豆PPO變體的基因引入植物的質粒。通過使用實施例3中製備的質粒pSPPO-P作為模板、由SEQ IDNO:13的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:14的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物來進行PCR，從而擴增可編碼大豆PPO變體的基因的DNA片段。然後，用限制酶KpnⅠ和SacⅠ消化實施例9中製備的質粒pBI121K以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因，並將通過用限制酶KpnⅠ和SacⅠ消化含有可編碼大豆PPO變體的上述基因的DNA片段而獲得的DNA片段插入這部分以製備質粒pBIGMP(附圖)，其中基因與35S啟動子的下遊連接。
將質粒pBIGMP引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈黴素、100μg/ml利福黴素和25μg/ml卡那黴素的培養基中培養所得的轉化體，隨後選擇所需的轉化體以分離具有pBIGMP的農桿菌屬菌株。
用農桿菌屬菌株感染無菌培養的菸草葉片並按照與實施例5中相同的方式獲得引入了可編碼大豆PPO變體的基因的菸草。
實施例14具有可編碼大豆PPO變體的引入基因的菸草對除草化合物耐受性的確認通過檢測按照與實施例6中相同的方式引入了實施例13中製備的可編碼大豆PPO變體的基因的菸草而定量地確定對由結構8代表的抑制型除草化合物的耐受程度。將從引入了可編碼大豆PPO變體的基因的菸草4個克隆(GMP1-4)和對照重組菸草獲得的結果列在表8中。在該表中，對除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總葉綠素含量與未處理葉片的葉綠素含量之比的百分數來表示。
表8
實施例15分離衣藻屬的PPO基因從衣藻屬遺傳中心(地址DCMB小組，植物系，91000信箱，Duke大學，Durham,NC2708-1000,USA)獲得雷氏衣藻CC407菌株，在200μE/m2/s光合有效光下將該菌株在含有7mM NH4Cl、0.4mMMgSO4·7H2O、0.34mM CaCl2·2H2O、25 mM磷酸鉀、0.5mM Tris(pH7.5)、1ml/升Hatner痕量元素和1ml/升冰醋酸的TAP液體培養基(E.H.Harris，《衣藻屬參考資料》(The Chlamydomonas Sourcebook),Academic Press,San Diego,1989,p576-577)中培養5天，從而獲得200ml(1.0×106細胞/ml)含有早期穩定生長期細胞的液體培養基。
通過使用ISOGEN(Nippon Gene)、按照附於其中的操作指南，由這些細胞製備總RNAs。此外，使用BioMag mRNA純化試劑盒(Perceptive Bio System)、按照附於其中的操作指南對聚腺苷酸RNA進行分級分離。通過使用Marathon cDNA擴增試劑盒(Clonetech)、按照附於其中的操作指南從所得聚腺苷酸RNA合成cDNA並將cDNA用作PCR的模板。
作為PCR引物，製備由SEQ ID NO:15的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:16的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來製備寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。
通過下列步驟來進行PCR使用有效cDNA PCR試劑盒(Clonetech)、按照附於其中的操作指南來製備反應液；接著在94℃下維持1分鐘和在65℃下維持5分鐘後，將在94℃下維持15秒且然後在65℃維持5分鐘的一個循環重複29次。在PCR反應後，通過用MicroSpin S-400HR(由Pharmacia Biotech生產)過濾反應液而對擴增的DNA片段進行純化，並通過使用TA克隆試劑盒(由Invitrogen生產)、按照附於其中的操作指南而將DNA片段克隆入質粒pCR2.1以構建質粒pCPPO。
通過使用染料終止子循環測序試劑盒(由PE應用生物系統生產)和DNA測序儀373S(由PE應用生物系統生產)來測定所得質粒pCPPO中含有的DNA片段的核苷酸序列。結果顯示出SEQ ID NO:17的核苷酸序列，由此證實質粒pCPPO含有雷氏衣藻的全長PPO cDNA。
實施例16分離可編碼沒有能力氧化原卟啉原Ⅸ而對原卟啉原Ⅸ基因特異性親和性的雷氏衣藻PPO蛋白質變體的基因通過下列方式進行PCR；使用實施例15中製備的質粒pSPPO作為模板和由SEQ ID NO:19的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:20的核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物，從而擴增DNA片段，它可編碼葉綠體轉運信號和FAD結合序列已經缺失的雷氏衣藻PPO(下文稱作雷氏農藻PPO變體)。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來製備寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它進行純化。通過將在94℃下維持1分鐘、在55℃下維持2分鐘且然後在72℃下維持3分鐘的一個循環重複30次來進行PCR反應。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化擴增的DNA片段並將其插入質粒pTV118N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)的BamHⅠ限制位點與SacⅠ限制位點之間，從而構建質粒pTVCRP(附圖10)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，將質粒pTVCRP引入大腸桿菌PPO基因缺損突變體系BT3菌株。當在含有100μg/ml氨苄青黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養所得的大腸桿菌時，互補克隆沒有生長。
實施例17對除草化合物產生耐受性能力的修飾的雷氏衣藻PPO變體的試驗按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將實施例16中製備的質粒pTVCRP和pTV118N引入實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養上述菌株而獲得具有質粒pACYCSP和pTVCRP的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVCRP菌株以及具有質粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養基，該培養基含有10或1ppm的由結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表9中所示。
表9<
實施例18將可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因引入菸草構建通過農桿菌屬感染法將可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因引入植物的質粒。通過用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化實施例16中製備的質粒pTVCRP來製備DNA片段，它含有可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因。用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化二元載體pBI121(由Clonetech生產)以除去β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因並將上述編碼雷氏衣藻PPO變體的基因插入這部分以製備質粒pBICRP(附圖11)。
將質粒pBICRP引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈黴素、100μg/ml利福黴素和25μg/ml卡那黴素的培養基中培養所得的轉化體，隨後選擇所需的轉化體以分離具有pBICRP的農桿菌屬菌株。
用農桿菌屬菌株感染無菌培養的菸草葉片並按照與實施例5中相同的方式獲得引入了可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因的菸草。
實施例19具有可編碼雷氏衣藻PPO變體(varian)的引入基因的菸草對除草化合物耐受性的確認通過檢測按照與實施例6中相同的方式引入了實施例18中製備的可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因的菸草而定量地確定對由結構8代表的抑制型除草化合物的耐受程度。將從引入了可編碼雷氏衣藻PPO變體的基因的菸草4個克隆(CRP1-4)和對照重組菸草獲得的結果列在表10中。在該表中，對除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總葉綠素含量與未處理葉片的葉綠素含量之比的百分數來表示。
表10
實施例20對原卟啉原Ⅸ具有親和性的大麥鐵螯合酶蛋白質變體特別對除草化合物產生耐受能力的試驗通過Miyamoto,K等在《植物生理學》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述的方法來製備具有大麥鐵螯合酶基因的質粒。用限制酶NspⅠ和EcoRⅠ消化所得的質粒以獲得DNA片段，它含有可編碼信號序列已經缺失的大麥鐵螯合酶的基因(下文稱作大麥鐵螯合酶變體)。將這種DNA片段插入質粒pTV119N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)的SphⅠ限制位點與EcoRⅠ限制位點之間，從而構建質粒pTVHVF1(附圖12)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將質粒pTVHVF1和pTV118N引入實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養上述菌株而獲得具有質粒pACYCSP和pTVHVF1的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVHVF1菌株以及具有質粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養基，該培養基含有10或1ppm的由結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表11中所示。
表11
實施例21將可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因引入菸草構建通過農桿菌屬感染法將可編碼大麥鐵螯合酶的基因引入菸草的質粒。用限制酶NcoⅠ消化實施例20中所述的質粒pTVHVF1，隨後用DNA聚合酶Ⅰ、通過將核苷酸添加到雙鏈DNA缺口上而使DNA鈍端化。然後，用衍生於牛腸的鹼性磷酸酶使DNA去磷酸化並通過插入磷酸化BamHⅠ接頭(4610P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)而使之環化，從而構建質粒pTVHVF2。用限制酶EcoRⅠ消化pTVHVF2，隨後用DNA聚合酶Ⅰ、通過將核苷酸添加到雙鏈DNA缺口上而使DNA鈍端化。此外，用衍生於牛腸的鹼性磷酸酶使DNA去磷酸化並通過插入磷酸化SalⅠ接頭(4680P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)而使之環化，從而構建質粒pTVHVF3。用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化實施例9中製備的質粒pBI121KS以除去β-葡糖苷酸酶基因。通過用限制酶BamHⅠ和SalⅠ消化上述pTVHVF3來製備DNA片段，它含有可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因。通過置換β-葡糖醛酸酶(β-glucronidase)基因的方式將所得DNA片段插入質粒pBI121KS以製備質粒pBIHVF(附圖13)，其中bchH基因連接在35S啟動子的下遊。
將質粒pBIHVF引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈黴素、100μg/ml利福黴素和25μg/ml卡那黴素的培養基中培養所得的轉化體，隨後選擇所需的轉化體以分離具有pBIHVF的農桿菌屬菌株。
用所述的農桿菌屬菌株感染無菌培養的菸草葉片並按照與實施例5中相同的方式獲得引入了可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因的菸草。
實施例22具有可編碼大麥鐵螯合酶變體的引入基因的菸草對除草化合物耐受性的確認通過檢測按照與實施例6中相同的方式引入了實施例21中製備的可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因的菸草而定量地確定對由結構8代表的PPO抑制型除草化合物的耐受程度。將從引入了可編碼大麥鐵螯合酶變體的基因的菸草4個克隆(HVF1-4)和對照重組菸草獲得的結果列在表12中。在該表中，對除草化合物的耐受程度通過用除草化合物處理葉片的總葉綠素含量與未處理葉片的葉綠素含量之比的百分數來表示。
表12
實施例23對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的黃瓜鐵螯合酶的蛋白質變體對除草化合物產生耐受能力的試驗通過下列方式來進行PCR通過使用由Miyamoto,K等在《植物生理學》(Plant Physiol.)105；p769(1994)中所述方法分離的黃瓜鐵螯合酶cDNA克隆作為模板、由SEQ ID NO:21的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:22的核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物，從而擴增DNA片段，它可編碼信號序列已經缺失的黃瓜鐵螯合酶(下文稱作黃瓜鐵螯合酶變體)。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394 DNA/RNA合成儀)來製備寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。通過將在94℃下維持1分鐘、在55℃下維持2分鐘且然後在72℃下維持3分鐘的一個循環重複30次來進行PCR反應。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化擴增的DNA片段並將其插入質粒pTV119N(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)的BamHⅠ限制位點與之間SacⅠ限制位點，從而構建質粒pTVCSF(附圖14)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法，分別將質粒pTVCSF和pTV118N引入大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和50μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養上述菌株而獲得具有質粒pACYCSP和pTVCSF的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTVCSF菌株以及具有質粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些菌株接種入YPT培養基，該培養基含有10或1ppm的由結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表13中所示。
表13
實施例24將可編碼黃瓜鐵螯合酶的基因引入菸草構建通過農桿菌屬感染法將可編碼本修飾的黃瓜鐵螯合酶的基因引入菸草的質粒。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化質粒pBI121(由Clonetech生產)以除去β-葡糖苷酸酶基因。通過用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化實施例23中所述的質粒pTVHCSF來製備DNA片段，它含有可編碼黃瓜鐵螯合酶變體的基因。通過置換β-葡糖苷酸酶基因的方式將所得DNA片段插入質粒pBI121KS以製備質粒pBICSF(附圖13)，其中黃瓜鐵螯合酶基因與35S啟動子的下遊連接。
將質粒pBICSF引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈黴素、100μg/ml利福黴素和25μg/ml卡那黴素的培養基中培養所得的轉化體，隨後選擇所需的轉化體以分離具有pBICSF的農桿菌屬菌株。
按照與實施例5中相同的方式用所述的農桿菌屬菌株感染無菌培養的菸草葉片以獲得引入了可編碼本修飾的黃瓜鐵螯合酶的基因的菸草。
實施例25具有可編碼黃瓜鐵螯合酶變體的引入基因的菸草對除草化合物耐受性的確認通過檢測按照與實施例6中相同的方式引入了實施例24中製備的可編碼本修飾的黃瓜鐵螯合酶的基因的菸草而定量地確定對PPO抑制型除草化合物的耐受程度。
實施例26大腸桿菌糞卟啉原Ⅲ氧化酶(hemF)基因的分離使用用於基因組DNA製備的試劑盒ISOPLANT(由Nippon Gene生產)由大腸桿菌LE392菌株製備基因組DNA。由SEQ ID NO:23的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:24的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物根據在基因庫登記的大腸桿菌hemF基因(登記號X75413)及其5』和3』區的核苷酸序列來合成。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來製備寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。通過使用約1μg大腸桿菌LE392菌株基因組DNA作為模板和上述寡核苷酸(各10pmol)為引物來進行PCR以擴增含有大腸桿菌hemF基因的DNA片段。通過將在96℃下維持1分鐘、在55℃下維持2分鐘且然後在72℃下維持1分鐘的一個循環重複30次來進行PCR反應。
實施例27對除草化合物產生耐受能力的大腸桿菌hemF蛋白質的試驗用限制酶FbaⅠ和PstⅠ消化含有由實施例26中所述方法擴增hemF基因的DNA片段，並將其插入商購質粒pUC118(由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)的BamHⅠ限制位點與PstⅠ限制位點之間以構建質粒pHEMF(附圖16)。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將質粒pHEMF和pTV118N引入實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養上述菌株而獲得具有質粒pACYCSP和pHEMF的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pHEMF菌株以及具有質粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些大腸桿菌菌株接種入YPT培養基，該培養基含有10或1ppm的由結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表14中所示。
表14
實施例28將大腸桿菌hemF基因引入菸草構建通過農桿菌屬感染法將大腸桿菌hemF基因引入植物的質粒。首先，為了獲得大腸桿菌hemF基因，用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來合成由SEQ ID NO:25的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物和由SEQ ID NO:26的核苷酸序列組成的寡核苷酸引物並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對其進行純化。通過使用這些寡核苷酸、按照與實施例26中相同的方式來進行PCR以擴增含有大腸桿菌hemF基因的DNA片段。
用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化質粒pBI121(由Clonetech生產)以除去β-葡糖苷酸酶基因。將通過用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化上述PCR擴增的DNA片段而製備含有可編碼大腸桿菌hemH基因的DNA片段。通過置換β-葡糖苷酸酶基因的方式將所得DNA片段引入質粒pBI121以製備質粒pBIHEMF(附圖17)，其中大腸桿菌hemF基因連接於35S啟動子的下遊。
將質粒pBIHEMF引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈黴素、100μg/ml利福黴素和25μg/ml卡那黴素的培養基中培養所得的轉化體，隨後選擇所需的轉化體以分離具有pBIHEMF的農桿菌屬(Abrobacterium)菌株。
按照與實施例5中相同的方式用農桿菌屬(Abrobacterium)菌株感染無菌培養的菸草葉片以獲得製備的引入了大腸桿菌hemF基因的菸草。
實施例29引入大腸桿菌hemF基因的菸草對除草化合物耐受性的確認按照與實施例6中相同的方式、通過檢測引入了大腸桿菌hemF基因的菸草而定量地確定對PPO抑制型除草化合物的耐受程度。
實施例30卟啉化合物結合蛋白質與原卟啉原Ⅸ的結合測試按照KITANO等在Nihon Kagakukai(日本化學協會)1998年第74屆春季會議預出版年報的報告Ⅱ中的摘要p1353,4G511中所述的方法來製備可提供含有由5個隨機胺基酸組成的胺基酸序列的蛋白質的噬菌體文庫和可提供含有胺基酸序列HASYS或RASSL(其中H是組氨酸、A是丙氨酸、S是絲氨酸、R是精氨酸、Y是酪氨酸、L是亮氨酸)的蛋白質的噬菌體文庫，它們可以特異性地結合卟啉化合物5,10,15,20-四(N-甲基吡啶鎓-4-基)-21H,23H-卟吩(H2TMpyP)。
首先，構建可提供含有由5個隨機胺基酸組成的胺基酸序列的蛋白質的噬菌體文庫。合成由SEQ ID NO:27的核苷酸序列組成的混合的寡核苷酸和由SEQ ID NO:28的核苷酸序列組成的混合的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394 DNA/RNA合成儀)來合成混合的寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對其進行純化。通過用T4DNA激酶處理而分別使上述混合的寡核苷酸(各50pmol)在5』端磷酸化。將它們混合併且在70℃下加熱10分鐘後通過以0.5℃/分鐘的速率緩慢冷卻至室溫而將它們退火。用限制酶SfiⅠ和NotⅠ消化質粒pCANTAB5E(由Pharmacia Biotech生產)以除去重組抗體基因ScFv。將上述磷酸化並退火的寡核苷酸對插入上述重組抗體基因ScFv的部分以製備一種質粒，它含有可編碼由5個隨機胺基酸序列和與之連接的M13噬菌體表面蛋白質的胺基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列。按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法將該質粒引入大腸桿菌TG-1菌株並在含有100μg/ml氨苄青黴素的2×YT培養基(10g/升酵母(east)提取物、15g/升胰化蛋白腖和5g/升NaCl，pH7.2)中培養以獲得重組大腸桿菌TG-1菌株。將重組大腸桿菌TG-1菌株接種入含有100μg/ml氨苄青黴素的2×YT培養基並通過振搖的方式進行培養。然後，在培養開始1小時後，將6×1010pfu輔助噬菌體M13K07(由Pharmacia Biotech生產)接種入該培養基並通過振搖的方式將培養再持續18個小時。接著，以1,000×g將液體培養基離心20分鐘以收集可提供含有由5個隨機胺基酸組成的胺基酸序列的蛋白質的噬菌體文庫。
為了製備可提供含有胺基酸序列HASYS(SEQ ID NO:53)的蛋白質的噬菌體克隆，合成由SEQ ID NO:29的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:30的核苷酸序列組成的寡核苷酸。並且，為了製備可提供含有胺基酸序列RASSL(SEQ ID NO:55)的蛋白質的噬菌體克隆，合成由SEQ ID NO:31的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:32的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。通過與上述獲得可提供含有由5個隨機胺基酸組成的胺基酸序列的蛋白質的噬菌體文庫相同的操作方式來獲得可提供含有胺基酸序列HASYS或RASSL的蛋白質的噬菌體克隆。
將可提供含有胺基酸序列HASYS的蛋白質的噬菌體克隆、可提供含有胺基酸序列RASSL的蛋白質的噬菌體克隆或可提供含有由5個隨機胺基酸組成的胺基酸序列的蛋白質的噬菌體文庫製成噬菌體懸浮液，將這些懸浮液(滴度105pfu)點滴在硝酸纖維素膜(由Schleicher Schuell生產)上，然後通過將它們在含有1％牛血清白蛋白的PBT緩衝液(137mM NaCl,8.10mM Na2HPO4,2.68mM Kcl,1.47mMKH2PO4,0.05％ Tween20,pH7.2)中振搖而將硝酸纖維素膜阻塞。用PBT緩中液洗滌該硝酸纖維素膜並將它們在含有10μM原卟啉Ⅸ的2×SSC緩中液(0.3M NaCl,0.03M檸檬酸鈉)中振搖18小時。此外，用2×SSC緩中液洗滌所述的硝酸纖維素膜、乾燥並在紫外光(365nm)下檢測衍生於原卟啉Ⅸ的螢光。
噬菌體文庫的斑點沒有顯現出螢光，而可提供含有胺基酸序列HASYS的蛋白質的噬菌體克隆和可提供含有胺基酸序列RASSL的蛋白質的噬菌體克隆顯現出清楚的螢光。
實施例31對除草化合物產生耐受性能力的原卟啉Ⅸ結合蛋白質的試驗首先，製備一種質粒，它可以表達可編碼含有胺基酸序列HASYS(SEQ ID NO:53)、或胺基酸序列RASSL(SEQ ID NO:55)的蛋白質的基因。為了製備能夠表達可編碼由SEQ ID NO:54胺基酸序列組成的蛋白質(下文稱作蛋白質MGHASYS)的基因，合成由SEQ IDNO:33的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:34的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。通過用T4 DNA激酶處理而分別使上述寡核苷酸(各50pmol)在5』端磷酸化。將它們混合併且在70℃下加熱10分鐘後通過以0.5℃/分鐘的速率緩慢冷卻至室溫而將它們退火。用限制酶NotⅠ和NcoⅠ消化質粒pTV118N以除去由16個鹼基對組成的基因片段。通過將上述磷酸化並退火的寡核苷酸對插入上述16個鹼基對的位置來製備能夠表達可編碼蛋白質MGHASYS的基因的質粒pHASYS。
然後，為了製備能夠表達可編碼由SEQID NO:54胺基酸序列組成的蛋白質(下文稱作蛋白質MGRASSL)的基因的質粒，合成由SEQID NO:35的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:34的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394 DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。通過與製備質粒pHASYS相同的過程來製備能夠表達可編碼蛋白質MGRASSL的基因的質粒pRASSL。
製備能夠表達可編碼含有胺基酸序列YAGY或YAGF(其中Y是酪氨酸、A是丙氨酸、G是甘氨酸、F是苯丙氨酸)(Sugimoto,N.,Nakano.S.,《化學通訊》(Chem.Lett.)p939,1997)的蛋白質的基因的質粒，其中所述的胺基酸序列YAGY或YAGF能夠結合卟啉化合物H2TMpyP。為了製備能夠表達可編碼由SEQ ID NO:58胺基酸序列組成的蛋白質(下文稱作蛋白質MGYAGF)的基因的質粒，合成由SEQ IDNO:37的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:38的核苷酸序列組成的寡核苷酸。為了製備能夠表達可編碼由SEQ ID NO:60胺基酸序列組成的蛋白質(下文稱作蛋白質MGYAGF)的基因的質粒，合成由SEQ ID NO:39的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:40的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394 DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。通過與製備質粒pHASYS相同的過程來製備能夠表達可編碼蛋白質MGYAGY的基因的質粒pYAGY和能夠表達可編碼蛋白質MGYAGF的基因的質粒pYAGF。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將上述質粒pHASYS、pRASSL、pYAGY、pYAGF和pTV118N引入實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養上述菌株而獲得具有質粒pACYCSP和pHASYS的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pHASYS菌株、具有質粒pACYCSP和pRASSL的大腸桿菌BT/pACYCSP+pYAGY株，其載有質粒pACYCSP和pYAGY大腸桿菌BT3/pACYCSP+pRASSL菌株、具有質粒pACYCSP和pYAGF的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pYAGF菌株以及具有質粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些大腸桿菌菌株接種入YPT培養基，該培養基含有1ppm的由結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10βg/ml卡那黴素、10lμg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表15中所示。
表15
此外，在一種能夠表達可編碼含有胺基酸序列的蛋白質的基因的質粒中，一個單位的胺基酸序列HASYS或RASSL相互重複連接。為了製備能夠表達可編碼由SEQ ID NO:61胺基酸序列組成的蛋白質(下文稱作蛋白質MG(HASYS)4,(HASYS)n稱作肽HASYS相互重複連接n次的序列)的基因的質粒，合成由SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394 DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。首先，通過用T4 DNA激酶處理而分別使由SEQ ID NO:42的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:43的核苷酸序列組成的寡核苷酸在5＇端磷酸化。此後，將由SEQ ID NO:41的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:42的核苷酸序列組成的寡核苷酸或由SEQ ID NO:43以及由SEQ ID NO:44的核苷酸序列組成的寡核苷酸的磷酸化的核苷酸組成的寡核苷酸混合(各300pmol)，並且在70℃下加熱5分鐘後通過以0.5℃/分鐘的速率緩慢冷卻至室溫而將它們退火。將上述兩種退火的寡核苷酸對混合併用T4DNA連接酶將它們偶聯，然後用T4DNA激酶使所得DNA片段在5』端磷酸化。另一方面，用限制酶NotⅠ和EcoRⅠ消化載體pTV118N以除去由16個鹼基對的DNA片段並將上述磷酸化的DNA片段插入這部分以獲得表達可編碼蛋白質MG(HASYS)4的基因的質粒pHASYS4。
此外，為了製備能夠表達可編碼由SEQ ID NO:62胺基酸序列組成的蛋白質(下文稱作蛋白質MG(HASYS)8)的基因的質粒，合成由SEQ ID NO:45的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:46的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。首先，通過用T4 DNA激酶處理而使上述寡核苷酸在5』端磷酸化。此後，將由SEQ ID NO:41的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:42的磷酸化的核苷酸序列組成的寡核苷酸混合(各300pmol)，將由SEQ IDNO:43的磷酸化的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:44的核苷酸序列組成的寡核苷酸混合(各300pmol)，且進一步將由SEQID NO:45的磷酸化的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:46的磷酸化的核苷酸序列組成的寡核苷酸混合(各600pmol)。將這三種混合物在70℃下加熱5分鐘並通過以0.5℃/分鐘的速率緩慢冷卻至室溫而將它們退火。將上述三種退火的寡核苷酸對混合、用T4DNA連接酶將它們偶聯、且然後用T4DNA激酶使所得DNA片段在5』端磷酸化。按照與製備上述質粒pHASYS4相同的方式來製備能夠表達蛋白質MG(HASYS)8的質粒pHASYS8。
然後，為了製備能夠表達可編碼由SEQ ID NO:63胺基酸序列組成的蛋白質(下文稱作蛋白質MG(RASSL)4,(RASSL)n稱作肽RASSL相互重複連接n次的序列)的基因的質粒，合成由SEQ ID NO:47、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的核苷酸序列組成的寡核苷酸。此外，為了製備能夠表達可編碼由SEQ ID NO:64胺基酸序列組成的蛋白質(下文稱作蛋白質MG(RASSL)8)的基因的質粒，合成由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的核苷酸序列組成的寡核苷酸。用一種DNA合成儀(PE應用生物系統；型號394DNA/RNA合成儀)來合成這些寡核苷酸並用一種寡核苷酸純化柱(PE應用生物系統；OPC柱)來對它們進行純化。
按照與製備上述質粒pHASYS4相同的方式來製備能夠表達蛋白質MG(RASSL)4的質粒pRASSL4。還按照與製備上述質粒pHASYS8相同的方式來製備能夠表達蛋白質MG(RASSL)8的質粒pRASSL8。
按照Hanahan,D.J.在《分子生物學》(Mol.Biol.)166；p557(1983)中所述的方法分別將上述質粒pHASYS4、pRASSL4、pRASSL8和pTV118N引入實施例3中製備的大腸桿菌BT3/pACYCSP菌株。通過在含有100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素和10μg/ml卡那黴素的YPT培養基中培養上述菌株而獲得具有質粒pACYCSP和pHASYS4的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pHASYS4菌株、具有質粒pACYCSP和pRASSL4的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pRASSL4菌株、具有質粒pACYCSP和pRASSL8的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pRASSL8菌株以及具有質粒pACYCSP和pTV118N的大腸桿菌BT3/pACYCSP+pTV118N菌株。
將這些大腸桿菌菌株接種入YPT培養基，該培養基含有1ppm的由結構8所代表的PPO抑制型除草化合物、100μg/ml氨苄青黴素、15μg/ml氯黴素、10μg/ml卡那黴素、10μg/ml氯高鐵血紅素和50μg/ml氨基乙醯丙酸；按照與實施例2中相同的方式在黑暗條件或光條件下進行培養。然後，在培養開始18小時後，在600nm處測定液體培養基的吸收度。將不含除草化合物的培養基的吸收度看作1，計算含有除草化合物培養基的吸收度的相應值。結果如表16中所示。
表16<
實施例32將可編碼原卟啉Ⅸ結合肽的基因引入菸草構建通過農桿菌屬感染法將可編碼原卟啉Ⅸ結合肽的基因引入菸草的質粒。用限制酶NcoⅠ消化實施例31中製備的質粒pHASYS8，隨後通過用DNA聚合酶將核苷酸加入到雙鏈DNA缺口上而使DNA鈍端化。然後，用衍生於牛腸的鹼性磷酸酶使DNA去磷酸化並通過插入磷酸化的BamHⅠ接頭(4610P，由Takara Shuzo Co.,Ltd.生產)而使之環化，從而構建質粒pHASYS8B。用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化質粒pBI121(由Clonetech生產)以除去β-葡糖苷酸酶基因。另一方面，用限制酶BamHⅠ和SacⅠ消化質粒pHASYS8B以製備含有可編碼蛋白質MG(HASYS)8的基因的DNA片段，通過置換β-葡糖苷酸酶基因的方式將所得DNA片段插入質粒pBI121以製備質粒pHASYS8(附圖18)，其中可編碼原卟啉Ⅸ結合蛋白質MG(HASYS)8的基因與35S啟動子的下遊連接。
構建通過農桿菌屬感染法將可編碼原卟啉Ⅸ結合肽MG(HASYS)8的基因引入植物的質粒。按照與製備pBIHASYS8相同的方式，由pRASSL8來製備質粒pBRASSL8(附圖19)，其中可編碼原卟啉Ⅸ結合蛋白質MG(RASSL)8的基因與35S啟動子的下遊連接。
分別將質粒pBIHASYS8和pBIHASYS8引入根癌土壤桿菌LBA4404。在含有300μg/ml鏈黴素、100μg/ml利福黴素和25μg/ml卡那黴素的培養基中培養所需轉化體、隨後選擇所需轉化體，從而分離分別具有pBIHASYS8和pBIRASSL8的土壤桿菌屬(Abrobacterium)菌株。
按照與實施例2中相同的方式，用所述的農桿菌屬(Abrobacterium)菌株感染無菌培養的菸草葉片以獲得引入了可編碼原卟啉Ⅸ結合蛋白質MG(HASYS)8的基因的菸草以及引入了可編碼原卟啉Ⅸ結合蛋白質MG(RASSL)8的基因的菸草。
實施例33具有可編碼原卟啉Ⅸ結合肽的引入基因的菸草對除草混合物耐受性的確認按照與實施例14中相同的方式、通過檢測引入了實施例32中製備的可編碼原卟啉Ⅸ結合肽的基因的菸草而定量地確定對除草化合物的耐受程度。
正如本文所述的，根據本發明，可以產生耐雜草防治化合物的植物。
不含序列表的內容SEQ ID NO:1為擴增bchH基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:2為擴增bchH基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:3為擴增大豆PPO基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:4為擴增大豆PPO基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:7為擴增bchH基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:8為擴增bchH基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:9為擴增具有菸草chlH基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:10為擴增具有菸草chlH基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:11為擴增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:12為擴增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:13為擴增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:14為擴增具有大豆PPO基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:15為擴增衣藻屬PPO基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:16為擴增衣藻屬PPO基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:19為擴增具有衣藻屬PPO基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:20為擴增具有衣藻屬PPO基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:21為擴增具有黃瓜鐵螯合酶基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:22為擴增具有黃瓜鐵螯合酶基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:23為擴增大腸桿菌hemF基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:24為擴增大腸桿菌hemF基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:25為擴增大腸桿菌hemF基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:26為擴增大腸桿菌hemF基因而設計的寡核苷酸引物SEQ ID NO:27為合成可編碼含有5個胺基酸的隨機肽的基因而設計的寡核苷酸SEQ ID NO:28為合成可編碼含有5個胺基酸的隨機肽的基因而設計的寡核苷酸
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SEQ ID NO:47為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設計的寡核苷酸SEQ ID NO:48為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設計的寡核苷酸SEQ ID NO:49為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設計的寡核苷酸SEQ ID NO:50為合成可編碼肽MG(RASSL)4的基因而設計的寡核苷酸SEQ ID NO:51為合成可編碼肽MG(RASSL)8的基因而設計的寡核苷酸SEQ ID NO:52為合成可編碼肽MG(RASSL)8的基因而設計的寡核苷酸SEQ ID NO:53原卟啉Ⅸ結合蛋白質HASYSSEQ ID NO:54原卟啉Ⅸ結合蛋白質MGHASYSSEQ ID NO:55原卟啉Ⅸ結合蛋白質RASSLSEQ ID NO:56原卟啉Ⅸ結合蛋白質MGRASSLSEQ ID NO:57H2TmpyP結合蛋白YAGYSEQ ID NO:58H2TmpyP結合蛋白MGYAGYSEQ ID NO:59H2TmpyP結合蛋白YAGFSEQ ID NO:60H2TmpyP結合蛋白MGYAGFSEQ ID NO:61原卟啉Ⅸ結合蛋白質MG(HASYS)4SEQ ID NO:62原卟啉Ⅸ結合蛋白質MG(HASYS)8SEQ ID NO:63原卟啉Ⅸ結合蛋白質MG(RASSL)4SEQ ID NO:64原卟啉Ⅸ結合蛋白質MG(RASSL)8
序列表110Hiroki NAKAJIMA等人；Sumitomo Chemical Company Limited120使植物產生對雜草控制化合物的耐受性的方法130150JP 10/1205531511998-04-30150JP 10/2811271511998-10-02150JP 10/3309811511998-11-20150JP 11/0547301511999-03-0216064210121139212DNA213人工序列220223為擴增bchH基因設計的寡核苷酸引物4001gacatctaga ggagacgacc atatgcacgg tgaagtctc 39210221131212DNA213人工序列220223為擴增bchH基因設計的寡核苷酸引物4002acggaagctt agatcttcac tcggcggcaa t 31210321139212DNA213人工序列220223為擴增大豆PPO基因設計的寡核苷酸引物4003tcgagctcca tggtttccgt cttcaacgag atcctattc 39210421139212DNA213人工序列220223為擴增大豆PPO基因設計的寡核苷酸引物4004ttgtcgacaa ctgctactat ttgtacactc tatttg 3621052111632212DNA213甘氨酸最大變種Williams82220221CDS222(1)…(1632)4005atg gtt tcc gtc ttc aac gag atc cta ttc ccg ccg aac caa acc ctt 48Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu1 5 10 15ctt cgc ccc tcc ctc cat tcc cca acc tct ttc ttc acc tct ccc act 96Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr20 25 30cga aaa ttc cct cgc tct cgc cct aac cct att cta cgc tgc tcc att144Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile35 40 45gcg gag gaa tcc acc gcg tct ccg ccc aaa acc aga gac tcc gcc ccc192Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro50 55 60gtg gac tgc gtc gtc gtc ggc gga ggc gtc agc ggc ctc tgc atc gcc240Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala65 70 75 80cag gcc ctc gcc acc aaa cac gcc aat gcc aac gtc gtc gtc acg gag288Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu85 90 95gcc cga gac cgc gtc ggc ggc aac atc acc acg atg gag agg gac gga336Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly100 105 110tac ctc tgg gaa gaa ggc ccc aac agc ttc cag cct tct gat cca atg384Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met
115 120 125ctc acc atg gtg gtg gac agt ggt tta aag gat gag ctt gtt ttg ggg432Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly130 135 140gat cct gat gca cct cgg ttt gtg ttg tgg aac agg aag ttg agg ccg480Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro145 150 155 160gtg ccc ggg aag ctg act gat ttg cct ttc ttt gac ttg atg agc att528Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile165 170 175ggt ggc aaa atc agg gct ggc ttt ggt gcg ctt gga att cgg cct cct576Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro180 185 190cct cca ggt cat gag gaa tcg gtt gaa gag ttt gtt cgt cgg aac ctt624Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu195 200 205ggt gat gag gtt ttt gaa cgg ttg ata gag cct ttt tgt tca ggg gtc672Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val210 215 220tat gca ggc gat cct tca aaa tta agt atg aaa gca gca ttc ggg aaa720Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys225 230 235 240gtt tgg aag ctg gaa aaa aat ggt ggt agc att att ggt gga act ttc768Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe245 250 255aaa gca ata caa gag aga aat gga gct tca aaa cca cct cga gat ccg816Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro260 265 270cgt ctg cca aaa cca aaa ggt cag act gtt gga tct ttc cgg aag gga864Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly275 280 285ctt acc atg ttg cct gat gca att tct gcc aga cta ggc aac aaa gta912Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val290 295 300aag tta tct tgg aag ctt tca agt att agt aaa ctg gat agt gga gag960Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu305 310 315 320tac agt ttg aca tat gaa aca cca gaa gga gtg gtt tct ttg cag tgc 1008Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys325 330 335aaa act gtt gtc ctg acc att cct tcc tat gtt gct agt aca ttg ctg 1056Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu340 345 350cgt cct ctg tct gct gct gct gca gat gca ctt tca aag ttt tat tac 1104Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr355 360 365cct cca gtt gct gca gtt tcc ata tcc tat cca aaa gaa gct att aga 1152Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg370 375 380tca gaa tgc ttg ata gat ggt gag ttg aag ggg ttt ggt caa ttg cat 1200Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His385 390 395 400cca cgt agc caa gga gtg gaa aca tta gga act ata tac agc tca tca 1248Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser405 410 415cta ttc ccc aac cga gca cca cct gga agg gtt cta ctc ttg aat tac 1296Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr420 425 430att gga gga gca act aat act gga att tta tcg aag acg gac agt gaa 1344Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu435 440 445ctt gtg gaa aca gtt gat cga gat ttg agg aaa atc ctt ata aac cca 1392Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro450 455 460aat gcc cag gat cca ttt gta gtg ggg gtg aga ctg tgg cct caa gct 1440Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala465 470 475 480att cca cag ttc tta gtt ggc cat ctt gat ctt cta gat gtt gct aaa 1488Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys485 490 495gct tct atc aga aat act ggg ttt gaa ggg ctc ttc ctt ggg ggt aat 1536Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn500 505 510tat gtg tct ggt gtt gcc ttg gga cga tgc gtt gag gga gcc tat gag 1584Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu
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135 140agc atg ctg cag att gcg gtg gac tct ggc tgc gag aag gac ctt gtg478Ser Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val145 150 155ttc ggt gac ccc acg gct ccc cgc ttc gtg tgg tgg gag ggc aag ctg526Phe Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu160 165 170 175cgc ccc gtg ccc tcg ggc ctg gac gcc ttc acc ttc gac ctc atg tcc574Arg Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser180 185 190atc ccc ggc aag atc cgc gcc ggg ctg ggc gcc atc ggc ctc atc aac622Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn195 200 205gga gcc atg ccc tcc ttc gag gag agt gtg gag cag ttc atc cgc cgc670Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg
210 215 220aac ctg ggc gat gag gtg ttc ttc cgc ctg atc gag ccc ttc tgc tcc718Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser225 230 235ggc gtg tac gcg ggc gac ccc tcc aag ctg tcc atg aag gcg gcc ttc766Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe240 245 250 255aac agg atc tgg att ctg gag aag aac ggc ggc agc ctg gtg gga ggt814Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly260 265 270gcc atc aag ctg ttc cag gaa cgc cag tcc aac ccg gcc ccg ccg cgg862Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg275 280 285gac ccg cgc ctg ccg ccc aag ccc aag ggc cag acg gtg ggc tcg ttc910Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe290 295 300cgc aag ggc ctg aag atg ctg ccg gac gcc att gag cgc aac atc ccc958Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro305310 315gac aag atc cgc gtg aac tgg aag ctg gtg tct ctg ggc cgc gag gcg 1006Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala320 325 330 335gac ggg cgg tac ggg ctg gtg tac gac acg ccc gag ggc cgt gtc aag 1054Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys340 345 350gtg ttt gcc cgc gcc gtg gct ctg acc gcg ccc agc tac gtg gtg gcg 1102Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala355 360 365gac ctg gtc aag gag cag gcg ccc gcc gcc gcc gag gcc ctg ggc tcc 1150Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser370 375 380ttc gac tac ccg ccg gtg ggc gcc gtg acg ctg tcg tac ccg ctg agc 1198Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser385 390 395gcc gtg cgg gag gag cgc aag gcc tcg gac ggg tcc gtg ccg ggc ttc 1246Ala Val Arg Glu Glu Arg Lys Ala Ser Asp Gly Ser Val Pro Gly Phe400 405 410 415ggt cag ctg cac ccg cgc acg cag ggc atc acc act ctg ggc acc atc 1294Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Ile Thr Thr Leu Gly Thr Ile420 425 430tac agc tcc agc ctg ttc ccc ggc cgc gcg ccc gag ggc cac atg ctg 1342Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Glu Gly His Met Leu435 440 445ctg ctc aac tac atc ggc ggc acc acc aac cgc ggc atc gtc aac cag 1390Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Gly Ile Val Asn Gln450 455 460acc acc gag cag ctg gtg gag cag gtg gac aag gac ctg cgc aac atg 1438Thr Thr Glu Gln Leu Val Glu Gln Val Asp Lys Asp Leu Arg Asn Met465 470 475gtc atc aag ccc gac gcg ccc aag ccc cgt gtg gtg ggc gtg cgc gtg 1486Val Ile Lys Pro Asp Ala Pro Lys Pro Arg Val Val Gly Val Arg Val480 485490 495tgg ccg cgc gcc atc ccg cag ttc aac ctg ggc cac ctg gag cag ctg1534Trp Pro Arg Ala Ile Pro Gln Phe Asn Leu Gly His Leu Glu Gln Leu500 505 510gac aag gcg cgc aag gcg ctg gac gcg gcg ggg ctg cag ggc gtg cac1582Asp Lys Ala Arg Lys Ala Leu Asp Ala Ala Gly Leu Gln Gly Val His515 520 525ctg ggg ggc aac tac gtc agc ggt gtg gcc ctg ggc aag gtg gtg gag1630Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Lys Val Val Glu530 535 540cac ggc tac gag tcc gca gcc aac ctg gcc aag agc gtg tcc aag gcc1678His Gly Tyr Glu Ser Ala Ala Asn Leu Ala Lys Ser Val Ser Lys Ala545 550 555gca gtc aag gcc taa gcggctgcag cagtagcagc agcagcatcg ggctgtagct1733Ala Val Lys Ala560 563ggtaaatgcc gcagtggcac cggcagcagc aattggcaag cacttggggc aagcggagtg 1793gaggcgaggg gggggctacc attggcgctt gctgggatgt gtagt 18382101821l563212PRT213雷氏衣藻CC40740018Met Met Leu Thr Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ala Ser Ser Arg1 5 10 15Arg Ser Gln Ile Arg Ser Ala Ala His Val Ser Ala Lys Val Ala Pro20 25 30Arg Pro Thr Pro Phe Ser Val Ala Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ser Pro35 40 45Ala Thr Ala Ala Ala Arg Arg Thr Leu His Arg Thr Ala Ala Ala Ala50 55 60Thr Gly Ala Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Val Ala Lys Thr Leu Asp65 70 75Asn Val Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Val80 85 90 95Thr Gly Gln Ala Leu Ala Ala Gln His Lys Ile Gln Asn Phe Leu Val100 105 110Thr Glu Ala Arg Glu Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Ser Met Ser Gly115 120 125Asp Gly Tyr Val Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Asn Asp130 135 140Ser Met Leu Gln Ile Ala Val Asp Ser Gly Cys Glu Lys Asp Leu Val145 150 155Phe Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Trp Trp Glu Gly Lys Leu160 165 170 175Arg Pro Val Pro Ser Gly Leu Asp Ala Phe Thr Phe Asp Leu Met Ser
180 185 190Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Gly Leu Gly Ala Ile Gly Leu Ile Asn195 200 205Gly Ala Met Pro Ser Phe Glu Glu Ser Val Glu Gln Phe Ile Arg Arg210 215 220Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Phe Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser225 230 235Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe240 245 250 255Asn Arg Ile Trp Ile Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Leu Val Gly Gly260 265 270Ala Ile Lys Leu Phe Gln Glu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Pro Pro Arg275 280 285Asp Pro Arg Leu Pro Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe290 295 300Arg Lys Gly Leu Lys Met Leu Pro Asp Ala Ile Glu Arg Asn Ile Pro305 310 315Asp Lys Ile Arg Val Asn Trp Lys Leu Val Ser Leu Gly Arg Glu Ala320 325 330 335Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Pro Glu Gly Arg Val Lys340 345 350Val Phe Ala Arg Ala Val Ala Leu Thr Ala Pro Ser Tyr Val Val Ala355 360 365Asp Leu Val Lys Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ser370 375 380Phe Asp Tyr Pro Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Ser385 390 395Ala Val Arg Glu Glu 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gc322102121133212DNA213人工序列220223為擴增具有黃瓜鐵螯合酶基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物40021gctttagaat cggatcctat ggcagtggat gac332102221136212DNA213Artificial Sequence220223為擴增具有黃瓜鐵螯合酶基因部分序列的DNA片段而設計的寡核苷酸引物40022ggtgaacttc tatttgagct ctcaggtaaa tataag 362102321125212DNA213人工序列220223為擴增大腸桿菌hemF基因設計的寡核苷酸引物40023gctgaaggcg tgatcagtta tttcc 252102421124212DNA213人工序列220223為擴增大腸桿菌hemF基因設計的寡核苷酸引物40024catcagcctg cagtgcgaaa agtg 242102521126212DNA213人工序列220223為擴增大腸桿菌hemF基因設計的寡核苷酸引物40025cgaaaaaggg atccgttatg aaaccc 262102621123212DNA213人工序列220223為擴增大腸桿菌hemF基因設計的寡核苷酸引物40026gctgttttcc gagctcccgt cac232102721122212DNA213人工序列220223為合成可編碼含有5個胺基酸的無規則肽的基因而設計的寡核苷酸40027tggccnnknn knnknnknnk gc222102821129212DNA213人工序列220223為合成可編碼含有5個胺基酸的無規則肽的基因而設計的寡核苷酸40028ggccgcmnnm nnmnnmnnmn nggccagct 292102921122212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽HASYS的基因而設計的寡核苷酸40029tggcccatgc tagttagtcg gc222103021129212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽HASYS的基因而設計的寡核苷酸40030tggcgccgac taactagcat gggccagct 292103121122212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽RASSL的基因而設計的寡核苷酸40031tggcccgggc gtcgtcgttg gc222103221129212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽RASSL的基因而設計的寡核苷酸40032ggccgccaac gacgacgccc gggccagct 292103321126212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MGHASYS的基因而設計的寡核苷酸40033catgggtcac gcttcttact cctaag 262103421126212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MGHASYS的基因而設計的寡核苷酸40034aattcttagg agtaagaagc gtgacc 262103521126212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MGRASYS的基因而設計的寡核苷酸40035catgggtcgt gcttcttccc tgtaag 262103621126212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MGRASSL的基因而設計的寡核苷酸40036aattcttaca gggaagaagc acgacc 262103721123212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MGYAGY的基因而設計的寡核苷酸40037catgggttac gctggctact aag232103821123212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MGYAGY的基因而設計的寡核苷酸40038aattcttagt agccagcgta acc232103921123212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MGYAGF的基因而設計的寡核苷酸40039catgggttac gctggcttct aag 232104021123212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MGYAGF的基因而設計的寡核苷酸40040aattcttaga agccagcgta acc 232104121134212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MG(HASYS)4的基因而設計的寡核苷酸40041catgggtcac gcttcttact cccatgcatc ttac 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cttccctgcg cgcatcttcc 302105221130212DNA213人工序列220223為合成可編碼肽MG(RASSL)8的基因而設計的寡核苷酸peptide MG(RASSL)840052acgcagggaa gatgcgcgca gggaagaagc 30210532115212PRT213人工序列220223原卟啉 Ⅸ結合蛋白 HASYS40053His Ala Ser Tyr Ser1 5210542117212PRT213人工序列220223原卟啉 Ⅸ結合蛋白 MGHASYS40054Met Gly His Ala Ser Tyr Ser1 5210552115212PRT213人工序列220223原卟啉phyrin Ⅸ結合蛋白 RASSL40055Arg Ala Ser Ser Leu1 5210562117212PRT213人工序列220223原卟啉Ⅸ結合蛋白MGRASSL40056Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu15210572114212PRT213人工序列220223H2TMpyP 結合蛋白 YAGY.40057Tyr Ala Gly Tyr 4210582116212PRT213人工序列220223HzTMpyP 結合蛋白 MGYAGY40058Met Gly Tyr Ala Gly Tyr1 5210592114212PRT213人工序列220223H2TMpyP結合蛋白YAGF40059Tyr Ala Gly Phe1210602116212PRT213人工序列220223H2TMpyP結合蛋白MGYAGF40060Met Gly Tyr Ala Gly Phe1 52106121122212PRT213人工序列220223原卟啉Ⅸ結合蛋白MG(HASYS)440061Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr1 5 10 15Ser His Ala Ser Tyr Ser202106221142212PRT213人工序列220223原卟啉Ⅸ結合蛋白MG(HASYS)840062Met Gly His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr1 5 10 15Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser20 25 30His Ala Ser Tyr Ser His Ala Ser Tyr Ser35 402106321122212PRT213人工序列220223原卟啉Ⅸ結合蛋白MG(RASSL)440063Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser1 5 10 15Leu Arg Ala Ser Ser Leu202106421142212PRT213人工序列220223原卟啉 Ⅸ結合蛋MG(RASSL)8.40064Met Gly Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser1 5 10 15Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu20 25 30Arg Ala Ser Ser Leu Arg Ala Ser Ser Leu35 40
權利要求
1．一種使植物產生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質的基因引入植物細胞並且表達該基因，所述的蛋白質具有下列(a)至(c)特徵(a)對可導致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質具有特異性親和性；(b)對與所述蛋白質有特異性親和性的物質基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區的構架區。
2．根據權利要求1的方法，其中以這樣一種方式將基因引入植物細胞、即以可操作的方式將它與均可在植物細胞中起作用的啟動子和終止子進行連接。
3．根據權利要求1或2的方法，其中可導致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是雜草防治化合物自身。
4．根據權利要求1的方法，其中可導致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是衍生於一種植物的內源性物質。
5．根據權利要求1的方法，其中雜草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物質。
6．根據權利要求1的方法，其中雜草防治化合物是原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
7．根據權利要求5或6的方法，其中可導致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是原卟啉Ⅸ。
8．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質是鎂螯合酶的原卟啉Ⅸ結合亞單位蛋白、或對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的蛋白質變體。
9．根據權利要求8的方法，其中蛋白質是衍生於光合微生物的鎂螯合酶。
10．根據權利要求8的方法，其中蛋白質是衍生於一種植物的鎂螯合酶。
11．根據權利要求8的方法，其中蛋白質是衍生於菸草的鎂螯合酶。
12．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:53的胺基酸序列。
13．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質具有SEQ ID NO:54的胺基酸序列。
14．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:55的胺基酸序列。
15．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質具有SEQ ID NO:56的胺基酸序列。
16．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:57的胺基酸序列。
17．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質含有SEQ ID NO:58的胺基酸序列。
18．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質具有SEQ ID NO:59的胺基酸序列。
19．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質具有SEQ ID NO:60的胺基酸序列。
20．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質由4-100個胺基酸組成。
21．根據權利要求5或6的方法，其中可導致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是原卟啉原Ⅸ。
22．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質是一種對原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力、而對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
23．根據權利要求5或6的方法，其中蛋白質是一種對原卟啉原Ⅸ沒有氧化能力、而對原卟啉Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物具有特異性親和性的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
24．根據權利要求22或23的方法，其中蛋白質是一種衍生於植物的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
25．根據權利要求22或23的方法，其中蛋白質是一種衍生於大豆的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
26．根據權利要求22或23的方法，其中蛋白質是一種衍生於藻類的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
27．根據權利要求22或23的方法，其中蛋白質是一種衍生於衣藻屬的原卟啉原Ⅸ氧化酶的變體。
28．一種使植物產生雜草控制化合物抗性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質的基因引入植物細胞並且表達該基因，所述的蛋白質具有下列(a)至(c)特徵(a)對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性；(b)對原卟啉原Ⅸ基本不具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區的構架區。
29．根據權利要求28的方法，其中在植物細胞中以這樣一種方式將基因引入植物細胞、即以可操作的方式將該基因與均可在植物細胞內起作用的啟動子和終止子進行連接。
30．根據權利要求28的方法，其中雜草防治化合物是可抑制植物卟啉的生物合成的物質。
31．根據權利要求28的方法，其中雜草防治化合物是一種原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物。
32．根據權利要求30或31的方法，其中蛋白質是鎂螯合酶或對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的所述蛋白質的變體。
33．根據權利要求30或31的方法，其中蛋白質是鐵螯合酶或對原卟啉Ⅸ具有特異性親和性的所述蛋白質的變體。
34．根據權利要求30或31的方法，其中蛋白質是衍生於一種植物鐵螯合酶。
35．根據權利要求30或31的方法，其中蛋白質是衍生於大麥屬的鐵螯合酶。
36．根據權利要求30或31的方法，其中蛋白質是來自黃瓜的鐵螯合酶。
37．根據權利要求30或31的方法，其中蛋白質是一種由4-100個胺基酸組成的肽。
38．一種使植物產生雜草防治化合物耐受性的方法，包括下列步驟將一種可編碼一種蛋白質的基因引入植物細胞並且表達該基因，所述的蛋白質具有下列(a)至(c)特徵(a)對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性；(b)對糞卟啉原Ⅲ具有修飾能力；(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區的構架區。
39．根據權利要求38的方法，其中以這樣一種方式將基因引入植物細胞、即以可操作的方式將該基因與均可在植物細胞內起作用的啟動子和終止子進行連接。
40．根據權利要求38的方法，其中蛋白質是糞卟啉原Ⅲ或對原卟啉原Ⅸ具有特異性親和性的所述蛋白質的變體。
41．根據權利要求38的方法，其中蛋白質是衍生於一種微生物的糞卟啉原Ⅲ氧化酶。
42．根據權利要求38的方法，其中蛋白質是衍生於大腸桿菌的糞卟啉原Ⅲ氧化酶。
43．一種耐雜草防治化合物的植物，其耐受性按照權利要求1或28的方法而產生。
44．一種耐雜草防治化合物的植物，其耐受性按照權利要求38的方法而產生。
45．一種用於保護植物的方法，包括給所述權利要求43的植物的生長區施用所述的雜草防治化合物。
46．一種用於保護植物的方法，包括給所述權利要求44的植物的生長區施用所述的雜草防治化合物。
47．一種用於選擇植物的方法，包括給權利要求43的植物和其它植物的生長區施用對權利要求43植物來說是耐受性的雜草防治化合物、並且根據植物間的生長差異來選擇植物。
48．一種用於選擇植物的方法，包括給權利要求44的植物和其它植物的生長區施用對權利要求44植物來說是耐受性的雜草防治化合物、並且根據植物間的生長差異來選擇植物。
49．根據權利要求47的方法，其中植物是植物細胞。
50．根據權利要求48的方法，其中植物是植物細胞。
51．根據權利要求1或2的方法，其中雜草防治化合物是選自下列(1)至(3)化合物的原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物；並且可導致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質是原卟啉Ⅸ、原卟啉原Ⅸ或一種原卟啉原Ⅸ氧化酶抑制型除草化合物(1)氯硝醚、治草醚、草枯醚、氟鎖草醚及其乙酯、氟鎖草醚鈉、氟硝草醚、惡草靈、2-[4-氯-2-氟-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-2,3,4,5,6,7-六氫化-1H-異吲哚-1,3-二酮、chlorphthalim、乙基TNPP、或N3-(1-苯乙基)-2,6-二甲基-5-丙炔基(propyonyl)煙醯胺；(2)由一般通式J-G(1)任意一個所代表的化合物，其中G是由通式G-1至G-9之任一，J是由通式J-1至J-30之任一代表的基團
其中通式J-5、J-6、J-12和J-24中的虛線代表含有單鍵的左旋環；或環中的一個鍵是碳原子間的雙鍵；X是氧原子或硫原子；Y是氧原子或硫原子；R1是氫原子或滷原子；R2是氫原子、C1-C8烷基、C1-C8滷代烷基、滷原子、OH基、OR27基、SH基、S(O)pR27基、COR27基、CO2R27基、C(O)SR27基、C(O)NR29R30基、CHO基、CR27=NOR36基、CH=CR37CO2R27基、CH2CHR37CO2R27基、CO2N=CR31R32基、硝基、氰基、NHSO2R33基、NHSO2NHR33基、NR27R38基、NH2基或任意用一個或多個以及相同或不同的C1-C44烷基取代的苯基；P是0、1或2；R3是C1-C2烷基、C1-C2滷代烷基、OCH3基、SCH3基、OCHF2基、滷原子、氰基或硝基；R4氫原子、C1-C3烷基、C1-C3滷代烷基或滷原子；R5是氫原子、C1-C3烷基、滷原子、C1-C3滷代烷基、環丙基、乙烯基、C2炔基、氰基、C(O)R38基、CO2R38基、C(O)NR38R39基、CR34R35CN基、CR34R35C(O)R38基、CR34R35CO2R38基、CR34R35C(O)NR38R39基、CHR34OH基、CHR34OC(O)R38基或OCHR34OC(O)NR38R39基；或當G是G-2或G-6時，R4和R5可以與連接它們的碳原子一起形成C=O基；R6是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C2-C6烷氧基烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；X1是單鍵、氧原子、硫原子、NH基、N(C1-C3烷基)基團、N(C1-C3滷代烷基)基團或N(烯丙基)基團；R7是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、滷原子、S(O)2(C1-C6烷基)基團或C(=O)R40基；R8是氫原子、C1-C8烷基、C3-C8環烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8滷代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C3-C8烷氧基烷氧基烷基、C3-C8滷代炔基、C3-C8滷代鏈烯基、C1-C8烷磺醯基、C1-C8滷代烷磺醯基、C3-C8烷氧基羰基烷基、S(O)2NH(C1-C8烷基)基團、C(O)R41基或其苯環可以被R42取代的苄基；n和m獨立地為0、1、2或3且m+n為2或3；Z是CR9R10基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團；R9各自獨立地為氫原子、C1-C3烷基、滷原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷基、C1-C6滷代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6滷代烷基羰基氧基；R10各自獨立地為氫原子、C1-C3烷基、和羥基或滷原子；R11和R12獨立地為氫原子、滷原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C1-C6滷代烷基；R13是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6滷代鏈烯基、C3-C6炔基、C3-C6滷代炔基、HC(=O)基、(C1-C4烷基)C(=O)基團或NH2基；R14是C1-C6烷基、C1-C6烷硫基、C1-C6滷代烷基或N(CH3)2基；W是氮原子或CR15；R15是氫原子、C1-C6烷基、滷原子、任意被C1-C6烷基或一個或多個滷原子取代的苯基、C1-C6烷氧基或CF3基；Q各自獨立地為氧原子或硫原子；Q1是氧原子或硫原子；Z1是CR16R17基、氧原子、硫原子、S(O)基、S(O)2基或N(C1-C4烷基)基團；R16各自獨立地為氫原子、滷原子、羥基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷基、C1-C6滷代烷氧基、C2-C6烷基羰基氧基或C2-C6滷代烷基羰基氧基；R17各自獨立地為氫原子、羥基或滷原子；R18是C1-C6烷基、滷原子或C1-C6滷代烷基；R19和R20獨立地為氫原子、C1-C6烷基或C1-C6滷代烷基；Z2是氧原子、硫原子、NR9基或CR9R10基；R21和R22獨立地為C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6滷代鏈烯基、C3-C6炔基或C3-C6滷代炔基；R23是氫原子、滷原子或氰基；R24是C1-C6烷磺醯基、C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C1-C6滷代烷氧基或滷原子；R25是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R26是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基或任意被取代基取代的苯基，所述的取代基選自由1-2個滷原子、1-2個硝基、C1-C6烷氧基和CF3基組成的組；W1是氮原子或CH基；T是由下列一般通式T-1、T-2和T-3所代表的任意基團之一
(其中E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11和E12獨立地為氫原子或C1-C3烷基)；R27是C1-C8烷基、C3-C8環烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C1-C8滷代烷基、C2-C8烷氧基烷基、C2-C8烷硫基烷基、C2-C8烷亞磺醯基烷基、C2-C8烷磺醯基烷基、C1-C8烷磺醯基、其苯環可以被至少一個選自由滷原子和C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯磺醯基、C4-C8烷氧基烷氧基烷基、C4-C8環烷基烷基、C6-C8環烷氧基烷基、C4-C8鏈烯基氧基烷基、C4-C8炔基氧基烷基、C3-C8滷代烷氧基烷基、C4-C8滷代鏈烯基氧基烷基、C4-C8滷代炔基氧基烷基、C6-C8環烷硫基烷基、C4-C8鏈烯基硫代烷基、C4-C8炔基硫代烷基、被苯氧基取代的C1-C4烷基；其中苯氧基的苯環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代、被苄氧基取代的C1-C4烷基；其中苄氧基的環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代、C4-C8三烷基甲矽烷基烷基、C3-C8氰基烷基、C3-C8滷代環烷基、C3-C8滷代鏈烯基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8滷代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代鏈烯基、C3-C8滷代炔基、C5-C8烷氧基鏈烯基、C5-C8滷代烷氧基鏈烯基、C5-C8烷基硫代炔基、C2-C8烷基羰基、其苯環被至少一個選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組的取代基取代的苄基、CHR34COR28基、CHR34COOR28基、CHR34P(O)(OR28)2基、CHR34P(S)(OR28)2基、CHR34C(O)NR29R30基或CHR34C(O)NH2基；R28是C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基或四氫呋喃基；R29和R31獨立地為氫原子或C1-C4烷基；R30和R32獨立地為C1-C4烷基或其環可以被至少一個取代基取代的苯基，所述的取代基選自由滷原子、C1-C3烷基和C1-C3滷代烷基組成的組；或R29和R30一起可以形成-(CH2)5-、-(CH2)4-或-CH2CH2OCH2CH2-，或由此形成的環可以被至少一個選自由C1-C3烷基、苯基和苄基組成的組的取代基取代；或R31和R32與連接它們的碳原子一起可以形成C3-C8環烷基；R33是C1-C4烷基、C1-C4滷代烷基或C3-C6鏈烯基；R34和R35獨立地為氫原子或C1-C4烷基；R36是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6鏈烯基或C3-C6炔基；R37是氫原子、C1-C4烷基或滷原子；R38是氫原子、C1-C6烷基、C3-C6環烷基、C3-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C2-C6烷氧基烷基、C1-C6滷代烷基、其環可以被選自由滷原子、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基組成的組的取代基取代的苯基、-CH2CO2(C1-C4烷基)基團或-CH(CH3)CO2(C1-C4烷基)基團；R39是氫原子、C1-C2烷基或C(O)O(C1-C4烷基)基團；R40是氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或NH(C1-C4烷基)基團；R41是C1-C6烷基、C1-C6滷代烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C4烷基)基團、其環可以被選自由基團R42、苄基和C2-C8二烷氨基組成的組的一個取代基取代的苯基；且R42是C1-C6烷氧基、一個或兩個滷原子、C1-C6烷氧基或CF3基；(3)通式(Ⅱ)的化合物
或nipilacrofen，其中R43是C1-C4烷基；R44是C1-C4烷基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷氧基、C1-C4滷代烷基、C1-C4滷代烷硫基和C1-C4滷代烷氧基；R43和R44一起可以形成-(CH2)3-或-(CH2)4-；R45是氫原子或滷原子；R46是氫原子或C1-C4烷基；R47是氫原子、硝基、氰基、-COOR49、-C(=X)NR50R51基或-C(=X2)R52基；R48是氫原子、滷原子、氰基、被至少一個選自由滷原子和羥基組成的組的取代基任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、被至少一個選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和滷代C1-C4烷基組成的組的取代基任意取代的苯基、吡咯基、C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基、C3-C8烷氧基、選自由C2-C8烷基、C3-C8鏈烯基、C3-C8炔基和C3-C8烷氧基組成的組的一個基團，在該基團中至少插入一個氧原子；或R48是由下列通式所代表的任意一個基團-NR53R54
-OR58-S(O)fR59
-(CH2)a-A-(CH2)a-O-(CH2)b-R64-(CH2)a-O-R65-COR66其中R49、R50和R52相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R50和R51與連接它們的氯原子一起可以形成飽和的脂環5或6節環；R52是氫原子、C1-C4烷基或被至少一個滷原子取代的C1-C4烷基；R53是氫原子、被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6的炔基、被至少一個滷原子任意取代的苯基、C3-C8環烷基、氰甲基、或R63CO-基；R54是氫原子、被至少一個滷原子任意取代的C1-C6烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6炔基、被至少一個滷原子任意取代的苯基、C3-C8環烷基、氰甲基、C1-C4烷氧基-C1-C6烷基、二-C1-C4烷氨基-C1-C4烷基、四氫糠基甲基、C3-C6炔基氧基-C1-C4烷基、其環可以被選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷氧基和滷代-C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苄基、-C(=X2)R63基、-(CH2)a-(O)d-R70基、-(CH2)a-(O)b-R70基、-(CH2)a-X2-R76基；R53和R54與連接它們的碳原子一起可以形成飽和脂環3、5或6節環或芳香5或6節環，它的一個環碳原子可以被氧原子取代；R55是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基或C3-C6炔基；或R55和R56一起可以形成-(CH2)e-；R56和R57獨立地為被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、被至少一個滷原子任意取代的C2-C6鏈烯基、被至少一個滷原子任意取代的C3-C6炔基或被至少一個滷原子任意取代的苯基、氫原子、C3-C6環烷基、XR60基或-NR61R62基；R58是氫原子、C1-C6烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、C1-C4烷基羰基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、二C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基、苄基、C1-C4烷氧基--C1-C4炔基、-(CH2)a-R75基、-(CH2)a-X2-R72基、-(CH2)a-X2-(CH2)b-R72基或-(CH2)a-X2-(CH2)b-X2-(CH2)c-R72基；R59是氫原子、C1-C4烷基、C2-C6鏈烯基、C3-C6炔基、氰基-C1-C3烷基、C1-C4烷基羰基-C1-C3烷基或苯基；R60是被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基；R61和R62相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R63是被至少一個滷原子任意取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基、C1-C4烷硫基-C1-C4烷基、C3-C6環烷基、其環可以被至少一個選自由滷原子、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和滷代--C1-C4烷基組成的組的取代基取代的苯基、-NR73R74基或-(CH2)a-(O)d-R75基；R64是C1-C4烷氧基羰基或羧基；R65是氯甲基、氰甲基、至少可以插入一個氧原子的C3-C6環烷基、或C1-C4烷氧基羰基-C1-C4烷基；R66是羥基或-NR67R68基；A是-NR67R68基或-S(O)f-R69基；R67和R68相同或不同、為氫原子或C1-C4烷基；R69是C1-C4烷基或C1-C4滷代烷基；R70是氫原子、羥基、滷原子、被至少一個C1-C4烷氧基任意取代的C1-C4烷基、至少可以插入一個氧原子的C3-C6環烷基、被一個或兩個甲基任意取代的C3-C6環烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R71和R72相同或不同、為C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；R73和R74相同或不同、為C1-C4烷基或苯基；R75是可以插入至少一個氧原子的C3-C6環烷基、被一個或兩個甲基任意取代的C3-C6環烷基、呋喃基、噻吩基或-C(=O)R71基；R76是C1-C4烷基；a、b和c獨立地為1、2或3；d是0或1；e是2或3；f是1或2；且X2是氧原子或硫原子。
全文摘要
通過將一種可編碼一種蛋白質的基因引入植物細胞並且表達該基因而產生耐雜草防治化合物的植物,所述的蛋白質具有至少下列(a)至(c)特徵:(a)對可導致雜草防治化合物的雜草防治活性的物質具有特異性親和性;(b)對與所述蛋白質有特異性親合性的物質不具有修飾能力;(c)基本上不含免疫球蛋白中可變區的構架區。
文檔編號C12N9/00GK1236010SQ99105300
公開日1999年11月24日 申請日期1999年4月30日 優先權日1998年4月30日
發明者中島寬樹, 長澤秋都 申請人:住友化學工業株式會社