預防和治療阿爾茨海默病(ad)的方法

2023-12-01 22:55:21

專利名稱：預防和治療阿爾茨海默病(ad)的方法
預防和治療阿爾茨海默病(AD)的方法本申請是申請日為2004年1月13日、中國申請號為200480002213. 2、發明名稱為 「預防和治療阿爾茨海默病(AD)的方法」的發明申請的分案申請。本發明涉及用於預防和治療阿爾茨海默病(AD)的方法。澱粉樣蛋白-β肽(AS)在阿爾茨海默病(AD)的神經病理學中起重要作用(Roher 等1993 " β -澱粉樣蛋白-(1-4 是腦血管澱粉樣蛋白沉積物的主要成分阿爾茨海默病的病理學實質"-PNAS 90:10836)。該病的家族型與澱粉樣蛋白前體蛋白(APP)和早老素基因中的突變有關。在這些基因中與疾病相關的突變導致作為阿爾茨海默病的澱粉樣蛋白斑中發現的主要形式的肽(Αβ42)的42-胺基酸形式的產生增加。該病的動物模型是商購的。超表達突變體人ΑΡΡ(其中第717位上的胺基酸是F而不是V)的PDAPP轉基因小鼠逐步發展成了年齡和腦依賴性形式的許多阿爾茨海默病的神經病理學標誌(Games等， 1995「超表達V717F S-澱粉樣蛋白前體蛋白的轉基因小鼠中的阿爾茨海默型神經病理學〃 -Nature 373 :523)。已經使用"正常的"、非基於模擬表位的疫苗進行了疫苗接種研究。在AD-型神經病理學情況發作前(6周)或在老齡時(11個月)給轉基因動物免疫接種聚集的A β 42， 給幼小的動物免疫接種可以預防發生蝕斑形成、神經炎性營養不良和星形神經膠質增生 (astrogliosis)。治療老齡動物明量減輕了 AD-樣神經病理學情況。這種實驗性疫苗接種手段誘導針對能夠通過血腦屏障並攻擊澱粉樣蛋白斑的Αβ 42的抗體產生(Schenk 等，1999:「用澱粉樣蛋白-β免疫接種弱化了 PDAPP小鼠中的阿爾茨海默病樣病理情況"-Nature 400:173)。斑塊隨後通過幾種機制除去，包括Fc-受體介導的吞噬作用 (Bard等，2000:「外周給藥的針對澱粉樣蛋白β _肽的抗體進入阿爾茨海默病小鼠模型的中樞神經系統並減輕病理情況〃 -Nature Med 6:916)。這種疫苗也能夠延緩記憶缺失 (Janus等，2000: 「 Αβ肽免疫接種減輕了阿爾茨海默病模型中的行為缺陷並減少了斑塊"-Nature 408 979)。自1999年後期以來很有前途的AD免疫接種療法已經用於臨床。推測免疫接種可以引起免疫系統攻擊斑塊並從受侵害的人腦中清除這些沉積物，不過，確切的機理仍需要更具體地表徵。這些臨床試驗由藥物公司Elan與其合伙人American Home Products (治療疫苗 AN-1792，QS21作為佐劑)共同進行。I期試驗成功地在2000年中完成。II期試驗於2001 年晚期開始以測試在患有輕度-中度AD的一組患者中的功效。目前這些II期試驗已經因在幾位患者中出現的神經炎症而永久地終止 (Editorial 2002〃無法解決的問題？ 「 -Nature Med 8:191)。症狀包括導致全世界範圍的試驗即刻終止的無菌性腦膜腦炎。在最惡化的病例情況中，證實受侵害的患者具有確定的自身免疫反應-在許多免疫療法中固有的危害。預計自身免疫併發症產生同時普遍存在的APP，它當然帶有與其蛋白水解產物相同的抗原決定簇。近來集中在聚集的Αβ 42免疫接種誘導的抗體(在人和小鼠中)性質上的其它研究揭示出大部分抗體識別Αβ42的第4和第10位胺基酸(Αβ 4-10)之間的小結構域。小鼠抗體能夠阻斷Αβ原纖維生成並破壞預先
4存在的Αβ纖維(McLaurin等，2002 「針對澱粉樣蛋白-肽靶澱粉樣蛋白-β殘基4_10並抑制細胞毒性和原纖維生成的治療有效抗體"-Nature Med 8:1沈；3)。顯然人抗體不與在細胞表面上接觸的APP或任意其它前體的非聚集的蛋白水解產物反應(Hock等，2002:「 對患有阿爾茨海默病的患者接種疫苗產生對澱粉樣蛋白具有特異性的抗體"-Nature Med 8:1270)。在人與小鼠血清之間觀察到明顯差異與人抗體相反，小鼠抗體檢出單體、 寡聚和纖維狀Αβ。這具有重要性且可能是治療功效的先決條件，因為積累的證據表明不由人抗-Αβ識別的Αβ小寡聚體是該病中的主要毒性參與者(Walsh等，2002:「天然分泌的澱粉樣蛋白β蛋白寡聚體有效抑制體內海馬長時程增強"-Nature 416:535)。因此， 潛在的新策略在於使用含有澱粉樣蛋白胺基酸4-10(而不是聚集的Αβ42)的疫苗進行免疫接種。儘管功效未知，這種策略也可能面對自身免疫問題，因為應對患者直接免疫接種(線性B細胞)"自身"表位。儘管近來在AD疫苗接種策略中的這些研發令人失望，但是仍然將A β疫苗視為抗 AD的最有希望的方法。然而，存在對AD疫苗接種中的改進和新策略的迫切需求。尤其是這類疫苗不應誘導自體反應的T和/或B細胞。因此，本發明提供了含有如下胺基酸序列的化合物在製備用於阿爾茨海默病(AD) 的疫苗中的用途X1X2X3X4X5X6其中&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；且其中X1X2X3X4X5X6不為DAEFRH，所述的化合物具有與天然N-末端Αβ 42序列 DAEFRH的特異性抗體結合的能力，且其5-鏈節具有與天然N-末端A β 42序列DAEFRH的所述特異性抗體結合的能力。本發明的Αβ 42模擬表位用於對AD的疫苗接種該模擬表位誘導針對Aβ 42、但不針對天然APP的抗體產生。使用(單克隆)抗體和(商購)肽文庫鑑定該模擬表位(例如按照Reineke等，2002 「由5520個隨機產生的序列的肽陣列鑑定不同的抗體表位和模擬表位"-J Immunol Methods沈7 :37)。使用不識別APP但僅檢測帶有氨基末端天冬氨酸的不同A β種類的(單克隆)抗體(這類抗體的實例描述在Johnson-Wood等，1997 「阿爾茨海默病轉基因小鼠模型中的澱粉樣蛋白前體蛋白加工和Αβ42沉積"-PNAS 94:1550)。 已經證實這類抗體為鑑定本發明過程中適合疫苗的模擬表位的理想工具。儘管證實當將這類單克隆抗體直接給藥於小鼠時在AD小鼠模型中具有有益作用(Bard等，2000:"外周給藥的針對澱粉樣蛋白肽的抗體進入阿爾茨海默病小鼠模型的中樞神經系統並減輕病理情況〃 -Nature Med 6 :916)，但是始終未提出將這些抗體用作分離AD疫苗化合物的模擬表位的研究工具。在現有技術中，所有的努力均集中在天然存在的A β肽。如上所述，因神經炎症事件而終止了 Aβ肽疫苗的臨床試驗。實際上，T細胞表位預測程序(用於I類限制表位的 BIMAS和用於II類限制表位的ΤΕΡΙΤ0ΡΕ)在序列中提示了高得分(自身)表位。這可能意味著神經炎症事件是因使得這類疫苗不適合於一般應用的自身免疫反應所致。與現有技術中提出的這類Αβ疫苗相反，預計在使用含有本發明模擬表位的疫苗治療過程中沒有自身免疫反應發生，因為用於本發明模擬表位鑑定的(單克隆)抗體不識別APP且模擬表位序列不同於迄今為止已經用於試驗或應用於未來試驗的Αβ 42-自身衍生的序列。用於本發明模擬表位鑑定的抗體檢測帶有游離氨基末端天冬氨酸的Αβ -衍生的胺基酸序列DAEFRH(=原始表位)，由此它不識別天然APP。該抗體可以為單克隆或多克隆抗體製品或其任意的抗體部分或衍生物，先決條件僅在於抗體分子特異性識別DAEFRH表位，即它不會結合澱粉樣蛋白前體蛋白的天然N-末端延長形式，這意味著與DAEFRH表位的結合能力至少高於APP分子100倍、優選至少1000倍、更優選至少IO5倍。該抗體可以為表現出與Johnson-Wood等(1997)所述抗體相同或較高的與DAEFRH序列的結合能力的抗體。當然，也可以使用具有較低結合能力的抗體(> 10%、> 50%或80^Wjohnson-Wood 等所述抗體的結合能力)，不過，更優選較高的結合能力。本發明的化合物結合那些對DAEFRH序列具有相似特異性的抗體。優選本發明所用的化合物含有肽或由肽組成，其中&為G或帶有羥基的胺基酸或帶負電荷的胺基酸，優選E、Y、S或D ；X2為疏水胺基酸或帶正電荷的胺基酸，優選I、L、V、K、W、R、Y、F或A ；X3為帶負電荷的胺基酸，優選D或E ；X4為芳族胺基酸或L，優選Y、F或L ；)(5為！1、1(、￥、？或1 ，優選!1、？或1 ;且X6 為 S、T、N、Q、D、E、R、I、K、Y 或 G，優選 Τ、N、D、R、I 或 G，尤其是EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、 DKELRI、DffELRI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、 EYEFRG、DWEFRDA、WEFRT、DKELR 或 SFEFRG。本發明的化合物(模擬表位)具有5-15個胺基酸的優選長度。該化合物可以以分離(肽)形式的疫苗提供或該化合物可以與其它分子，諸如藥物載體物質或多肽、脂質或碳水化合物結構偶聯或複合。優選本發明的模擬表位具有5-15、6和12個、特別是9-11個胺基酸殘基(最短)長度。然而，所述的模擬表位可以與非特異性接頭或載體，尤其是肽接頭或蛋白質載體偶聯(通過共價或非共價方式)。此外，所述的肽接頭或蛋白質載體可以由 T-細胞輔助表位組成或含有T-細胞輔助表位。優選所述的藥物上可接受的載體為KLH、破傷風毒素、白蛋白結合蛋白、牛血清白蛋白、樹枝狀聚合物(MAP ；Biol. Chem. 358 :581)以及 Singh 等在 Nat. Biotech. 17(1999)， 1075-1081中(特別是在該文件中的表1中的那些)和0' Hagan等在Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003)，727-735 (特別是其中所述固有的強化免疫的化合物和遞送系統)所述的佐劑物質或其混合物。此外，所述的疫苗組合物可以含有氫氧化鋁。可以通過任何合適的施用方式、例如靜脈內、腹膜內、肌內、鼻內、口服、皮下等和任意合適的遞藥裝置給藥包括本發明化合物(模擬表位)和藥物上可接受載體的疫苗(0' Hagan 等，Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003)，727-735)。一般來說，該疫苗含有如下用量的本發明化合物0，lng-10mg、優選lOng-lmg，尤其是IOOng-IOO μ g ；或者例如 IOOfmole-IO μ mole,優選 IOpmole-I μ mole,尤其是 lOOpmole-lOOnmole。該疫苗還可以包括典型的輔助物質，例如緩衝劑、穩定劑等。本發明的另一個方面進一步涉及分離與天然N-末端A β 42序列DAEFRH的特異性抗體結合的化合物的方法，包括下列步驟-提供包括肽的肽化合物文庫，所述的肽含有如下胺基酸序列X1X2X3X4X5X6其中&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；&為除C以外的胺基酸；且其中1^ 不為 DAEFRH ；-使所述的肽文庫與所述的抗體接觸；和-分離與所述抗體結合的肽文庫中那些成員。根據本發明該方面的具體實施方案，本發明涉及分離與天然N-末端A β 42序列 DAEFRH的特異性抗體結合的化合物的方法，包括下列步驟-提供包括肽的肽化合物文庫，所述的肽含有如下胺基酸序列X1X2X3X4X5X6其中&為除K和C以外的天然胺基酸；&為除C以外的天然胺基酸；&為除K和C以外的天然胺基酸；&為除K和C以外的天然胺基酸；&為除C以外的天然胺基酸；&為除P和C以外的天然胺基酸；且其中1^ 不為 DAEFRH ；-使所述的肽文庫與所述的抗體接觸；和-分離與所述抗體結合的肽文庫中那些成員。可以按照上述適合於具有5個胺基酸變體的文庫的方法對本發明的合適的5-鏈節進行分離且可以優選通過篩選具有如本文所述的具有胺基酸變體χ「χ5的文庫或通過鑑定6-鏈節-文庫中篩選的陽性成員中的合適的5-鏈節來進行(參見上文)。因此，用相同的方法還可以應用7-鏈節、8-鏈節、9-鏈節、10-鏈節、...文庫以篩選與本發明抗體類型結合的合適的序列。例如，可以通過測試這些具有5、6、7、8、9、...個胺基酸殘基長度的用於結合本發明抗體的片段找到這類較長序列的合適的抗體結合片段。已經證實這類方法可以成功地用於提供本發明的Αβ模擬表位。
優選以在所述文庫中的個體化形式，尤其是固定在固體表面的形式提供所述的肽，諸如能夠使用MULTIPIN肽技術進行。可以將文庫以肽混合物提供且可以在抗體結合後分離抗體肽複合物。另一方面，可以將抗體固定且然後使肽文庫(混懸液或溶液形式)與固定化抗體接觸。優選篩選的抗體(或肽文庫中的成員)包括合適的標記，這種標記允許在與文庫中的肽結合時檢測或分離抗體或抗體肽複合物。合適的標記體系(即生物素化、螢光、放射性、磁性標記、顯色標記、二次抗體)易於由本領域技術人員得到。必須構建文庫以排除天然存在的Αβ序列(例如DAEFRH)，因為顯然將使用該序列進行疫苗接種排除在本發明外。用於分離本發明表位的其它合適的技術為例如如WO 03/020750中所述在噬菌體-肽文庫中篩選。本發明還涉及包括如本文所定義的抗N-末端A β 42-抗體-結合肽(或在某些優選的情況中為包括這類肽的較大分子(例如與載體或遞送分子連接的肽))(任選為單一有效成分)的組合物；本發明優選涉及針對阿爾茨海默病的疫苗，包括這類抗原，尤其是包括至少一種肽的抗原，所述的肽選自如下的組EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、 DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、DKELRI、DffELRI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、 DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、EYEFRG, DffEFRDA, SffEFRT, DKELR 或 SFEFRG。包括本發明提供的其它肽在內的這些肽特別適用於製備藥物組合物，尤其是用於製備AD疫苗。這些序列是純人工的Αβ-模擬表位。用於疫苗接種目的的肽與合適的載體偶聯(通過共價或非共價方式)且可以將它們以肽化合物或與其它化合物或部分、例如佐劑、肽或蛋白質載體等的複合物提供且按照合適的方式給藥(例如如0' Hagan等在Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003)，727-735 中所述)。在下列實施例和附圖中進一步描述本發明，當然，它們不用來限定本發明。附

圖1A、1B和IC表示用於本發明篩選方法的文庫4中的個體化肽成員。附圖2表示使用用於DAEFRH的模擬表位進行的抑制試驗。附圖3表示使用其它用於DAEFRH的模擬表位進行的抑制試驗。附圖4和5描述了使用本發明的模擬表位肽進行的抑制試驗。實施例1 用於檢測帶有游離N-末端(在N-末端上的游離天冬氨酸)的Αβ42_衍生的肽種類的單克隆抗體(mAb)的製備給小鼠接種在CFA(第一次注射)和IFA(加強注射)中乳化的與蛋白質牛血清白蛋白BSA連接的6鏈節肽DAEFRH(天然N-末端Αβ42序列)疫苗(以便利用半抗原-載體-作用)。通過ELISA (DAEFRH-肽-包被的ELISA平板)檢測產生DAEFRH-肽-特異性抗體的雜交瘤。將肽SEVKMDAEFRH(APP-衍生的含有A β 42-衍生的序列DAEFRH的天然N-末端延長的序列)用作陰性對照肽排除識別延長肽的雜交瘤，因為它們無法在帶有N-末端上游離天冬氨酸的A β 42-衍生的肽與不含游離天冬氨酸的APP-衍生的肽DAEFRH之間進行區分。2.肽文庫的構建已經通過改進Reinke等Q000)的方法，通過篩選用於結合對帶有氨基末端天冬氨酸的Αβ種類具有特異性的抗體(優選單克隆抗體)而找到了本發明的模擬表位。另一種方法是以MULTIP-INTM肽技術市場上可以得到的。MultipinTM肽技術包括在以與用於許多生物試驗的標準8x12微量滴定板相容的方式固定在塊上的特別製備的聚乙烯大頭針(pin)上合成肽。可以通過這種方法製備大頭針結合的肽(保持與大頭針共價結合的不可裂解的肽)和溶液相肽(已經從大頭針表面裂解下)。基於Multipin合成系的P^^ets允許同時合成和篩選大量的肽。PepSets由96個各自合成的肽的模塊組成，它們中的兩個為謹慎選擇的控制序列。通過反相HPLC確定裂解的控制序列的純度且通過胺基酸分析對肽含量進行定量。通過標準ELISA技術確定陽性和陰性不可裂解的控制序列。使用各種化學修飾獲得P印Set肽，包括乙醯化、生物素化、磷酸化和環化。將溶液相(裂解的)肽以凍乾粉運送。為了製備溶液相肽，存在對C-末端的選擇，包括酸和醯胺，這取決於預計的肽應用。將可裂解的鍵作為預製的C-末端胺基酸的酯衍生物引入到大頭針表面上或"Rink" 醯胺接頭上。然後通過用強酸處理大頭針-結合的肽釋放含有酸或醯胺端基的肽。對合成規模的選擇為標稱的1微摩爾或5微摩爾等級。諸如疏水性和裂解效率的因素影響肽的回收，使得當以標稱1微摩爾規模合成肽時的預計肽產量為0.5-1微摩爾(接近Img 15鏈節肽)，或在以標稱5微摩爾規模合成肽的產量為2. 5-5微摩爾。不可裂解的肽保持與大頭針共價結合且可以用於使用ELISA技術快速篩選有意義的肽。這類肽用於抗體表位掃描和結構-活性關係(SAR)研究的目的。除去結合抗體或其它蛋白重新產生了所述肽且將其再用於進一步的試驗中。Pepkts用於各種應用，包括根據經蛋白質序列的掃描鑑定生物學上有意義的肽接頭、使肽接頭最優化和研發類似物的新的製備方法。通過使用各種合成設計顯著強化在用於篩選步驟的總體策略上的靈活性，所述的合成設計共同提供完全表徵所述首位候選物的系統性方法。從系統性肽類中獲得的綜合結果不僅鑑定了有意義的肽、而且表明了關鍵殘基， 其可交換性和最佳肽長度。因此，作為該發現的結果可以分類相關肽的範圍。用D-胺基酸和其它不常用殘基取代L-胺基酸是控制肽結構和構象的強有力手段。這種方法也是快速發現具有不同藥理學特性的新類似物的方法，所述的新類似物諸如具有增加的穩定性的拮抗劑和肽。以已知的蛋白質序列開始，可以使用Multipin方法對所有序列抗體表位作圖。用於對序列B-細胞表位作圖的幾種可選方法目前是可行的。它們包括大頭針-結合的肽、直接包被在微量滴定板上的溶液相肽和俘獲在預先包被了抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素的微量滴定板上的生物素化肽。就本發明的實施例而言，實施例1中所述的抗體用於篩選肽文庫，然而，例如，如 Johnson-Wood等(1997)所述，任何抗體製品特異性識別DAEFRH-序列、但不識別A β分子天然N-末端延長的序列(例如MDAEFRH、KMDAEFRH、SEVKMDAEFRH或完整的澱粉樣蛋白(前體)蛋白APP)。為該目的構建了 4個文庫2. 1.文庫1 這種6鏈節文庫含有具有如下序列(胺基酸位置1-6)的肽1位所有天然的aa，除D、K和C外(17種可能性)
2位所有天然的aa,除A、K和C外(17種可能性)3位所有天然的aa，除E、K和C外(17種可能性)4位所有天然的aa，除F、K和C外(17種可能性)5位所有天然的aa，除R、K和C外(17種可能性)6位所有天然的aa，除H、K、C和P外(16種可能性)文庫1是六肽的混合物。理論上包括含有17種不同胺基酸(參見下文)的所有可能的肽。該混合物中不含任何賴氨酸和半胱氨酸殘基。此外，該混合物中不含特定1位上的天冬氨酸；特定2位上的丙氨酸；特定3位上的穀氨酸；特定4位上的苯丙氨酸；特定5位上的精氨酸；和特定6位上的組氨酸。按照!^stMoc方案，使用Applied BiOSyStemS431A-合成儀進行合成，合成規模為 0. 25mmolο使用重量為Immol所有所需胺基酸(被保護的氨基和側鏈)開始合成。然後產生 Asn、Gin、Gly、lie、Leu,Met, Pro, Ser、Thr、Trp、Tyr、Val 的混合物。加入下列位置特異性
胺基酸Ala, Glu, Phe, Arg, His (位置 / 混合物 1)；Asp, Glu, Phe, Arg, His (位置 / 混合物 2)；Asp, Ala, Phe，Arg, His (位置 / 混合物 3)；Asp, Ala, Glu, Arg, His (位置 / 混合物 4)；Asp, Ala, Glu, Phe, His (位置 / 混合物 5)；和Asp, Ala, Glu, Phe, Arg (位置 / 混合物 6，不含 Pro)。混合物6用於加載樹脂(2-氯-三苯甲基氯樹脂，1.49mm0l/g，AleXiS Germany)Immol胺基酸殘基混合物6611mg 樹月旨(=0. 91mmol 反應基團)15ml 二氯甲烷5. 5 當量=5mmol 二異丙基乙胺(871 μ 1)。將該混合物在燒瓶中振搖1小時。然後加入Iml甲醇並將該混合物再振搖10分鐘。通過frit提取加載的樹脂並用二甲基甲醯胺、二氯甲烷、異丙醇、甲醇和乙醚(各30ml) 洗滌兩次。在高度真空中乾燥過夜。稱出的量為737mg。用Iml 20%在DMF中的哌啶將5. 66mg等分試樣處理30分鐘以確定樹脂的密度。 然後離心該混合物。通過光度測定法測定上清液中的游離Fmoc保護基(301nm，吸光係數= 7800M(e-l))。因此，樹脂的密度為0. 49mmol/g。下列所有步驟均使用其它混合物(放入5個不同的筒)在合成儀上進行。使用 515mg加載的樹脂(相當於0. 25mmol 使用4倍過量的胺基酸混合物)。在合成結束時裂解N-末端Fmoc保護基。在用乙醇洗滌並乾燥過夜後，用TFA/H20(95 5, ν ν)從樹脂上裂解肽。在Speed Vac上將TFA溶液濃縮至1/5體積並沉澱且用乙醚洗滌並凍幹。
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6鏈節肽EIDYHR、ELDYHR和EVDYHR是可以用按照上述實施例1製備的單克隆抗體檢測的模擬表位的實例。2. 2.:文庫 2:該6鏈節文庫含有帶有下列序列(胺基酸位置1-6)的肽1位D (固定的)2位所有天然aa,除A、K和C外(17種可能性)3位所有天然aa，除E、K和C外(17種可能性)4位所有天然aa，除F、K和C外(17種可能性)5位所有天然aa，除R、K和C外(17種可能性)6位所有天然aa,除H、K、C和P外(16種可能性)。按照上述文庫1所述的方法(2. 1項下)構建肽文庫2。6鏈節肽DIDYHR、DLDYHR和DVDYHR是可以用按照上述1製備的單克隆抗體檢測的模擬表位的實例。2. 3.文庫3 第3個肽文庫用於另一種確定模擬表位序列的其他方法。該文庫含有原始序列且使模擬表位的檢測與原始表位更為密切相關。這種6鏈節文庫含有帶有如下序列(胺基酸位置1-6)的肽1位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)2位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)3位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)4位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)5位均為天然的aa，除K和C外(18種可能性)6位均為天然的aa,除K、C和P外(17種可能性)按照上述文庫1所述的方法(2. 1項下)構建肽文庫3。6鏈節肽DIDYRR、DLDYRR和DVDYRR是可以用按照上述1製備的單克隆抗體檢測的模擬表位的實例(1位上的D和5位上的R與原始表位相同)。2.4.文庫4:該肽文庫4由切18 = 90個肽組成、商購自Mimotopes Ltd. (Paris, France ；參見製造商的指南)且按照天然N-末端A β 42序列DAEFRH設計。1位D (固定的)2位均為天然胺基酸，除K和C外(18種不同的肽)3位均為天然胺基酸，除K和C外(18種不同的肽)4位均為天然胺基酸，除K和C外(18種不同的肽)5位均為天然胺基酸，除K和C外(18種不同的肽)6位均為天然胺基酸，除K和C外(18種不同的肽)。文庫4中的個體化肽成員描述在圖1中。1、Μ、48、56和80號肽帶有Αβ42Ν_末端序列的原始序列。所有其它肽均為對其與DAEFRH-結合抗體的結合能力測試的候選肽。2.5.使用肽文庫的ELISA 如上所述，使用Applied Biosystems 431A肽合成儀、按照經典的Fmoc-化學製備肽文庫1、2和3。按照製造商的描述得到商購的肽文庫4 (參見上文和誦.mimotopes. com)。使90個肽的C-末端與大頭針連接。
按照如下方案，使用各肽文庫進行ELISA 將肽文庫溶於100% DMSO (終濃度10mg/ml)。用PBS進一步稀釋肽溶液。將肽混合物在ELISA平板(Nunc Maxi sorp, Germany)上包被過夜G °C )，以 500 μ g/孔開始並滴定至IOOng/孔。用PBS/Tween 20 (0. 1 % ν/ν)將平板洗滌 3χ 次。用PBS/BSA封閉平板(室溫下2小時)。用PBS/Tween將平板洗滌3x次。在室溫下將平板與生物素化DAEFRH-特異性mAb (在PBS中10 μ g/ml) 一起保溫 4小時。用PBS/Tween將平板洗滌3x次。將平板與鏈黴抗生物素-辣根過氧化物酶一起保溫(在室溫下30分鐘)。用PBS/Tween將平板洗滌切次。將平板與ABTS+H2& —起保溫(0. 1 % w/v ； 10-45分鐘)並用檸檬酸終止反應，隨後進行光度測定評價(波長405nm)。3.通過抑制試驗驗證模擬表位3. 1.其它文庫除上述4個文庫(參見2. 1.、2.2.、2. 3.、和2. 4.)外，還將第5個文庫用於確定模擬表位序列。這種6鏈節文庫在EMC microcollections (Tubingen Germany)商購且它含有114個不同的六肽混合物，通過所有除C以外的天然aa(19種可能性)中的一個確定每種混合物中的一個位置，剩餘的5個位置為可變的混合物01-06(1個位置固定，丙氨酸A，剩餘的5個位置可變，X)混合物01:AXXXXX混合物02:XAXXXX混合物03:XXAXXX混合物04:XXXAXX混合物05:XXXXAX混合物06:XXXXXA混合物07-12(1個位置固定，精氨酸R，剩餘的5個位置可變，X)混合物07:RXXXXX混合物08:XRXXXX混合物09:XXRXXX混合物10 :XXXRXX混合物11:XXXXRX混合物12 :XXXXXR因此，使用除C以外的所有天然aa設計混合物13和114。3. 2.抑制試驗圖2和3描述了用包括在和獲自5個文庫(如上所述的)中的模擬表位肽進行的抑制試驗結果。模擬表位肽與原始表位競爭單由克隆抗體識別。原始表位和模擬表位肽在C-末端上含有用於與蛋白質載體偶聯的另一個C(如果需要)。使用下列肽肽1737DAEFRH月太3001DKELRI月太3002DWELRI月太3003YREFFI月太3004YREFRI月太3005YAEFRG月太3006EAEFRG月太3007DYEFRG月太3008ELEFRGIi 3009SFEFRGIi 30IODISFRGIi 301 IDIGffRG步驟以0. 1 μ g/ml肽-BSA的濃度給ELISA平板(Nunc Maxisorp)包被原始肽表位 DAEFRH(C-末端被C延長且與牛血清白蛋白BSA偶聯)(100 μ 1/孔，12小時，4°C )。在用 1% PBS/BSA封閉QOO μ 1/孔，12小時，4°C )後，用PBS/Tween將平板洗滌3x次。然後加入生物素化單克隆抗體(1 2000，50 μ /孔)和濃度50,5,0. 5,0. 05,0. 005和0. 0005 μ g/ ml的肽(50 μ 1/孔)，在37°C下20分鐘。用PBS/Tween將平板洗滌3x次並與辣根過氧化物酶(HRP)-標記的鏈黴抗生物素一起保溫(100 μ 1/孔，30分鐘，RT)。用PBS/Tween將平板洗滌切次並與ABTS+H2& —起保溫(0. l%w/v； 10-45分鐘)且用檸檬酸終止反應，隨後進行光度測定評價(波長405nm)。正如圖2中預計和觀察到的，肽1737DAEFRH可以與BSA-偶聯的平板結合的肽 DAEFRH競爭且由此抑制單克隆抗體的識別。此外，證實肽3003不能抑制單克隆抗體與原始表位結合。相反，肽3001、3002、3004、3005、3006和3007(不同程度)阻斷表位識別。而肽 3004僅在高濃度(50 μ g/ml)下具有抑制作用，肽3001、3006和3007具有強烈抑制作用， IC5。低於 0.5 μ g/ml。肽 3002 和 3005 是〃中等〃抑制劑，IC5。大於 0. 5 μ g/ml。正如圖3中預計和觀察到的，肽1737DAEFRH可以成功地與BSA-偶聯的平板結合的肽DAEFRH競爭另外進行的單克隆抗體識而不依賴於實驗。此外，表明肽3010和3011在測試濃度下沒有抑制作用，而肽3008和3009為(相對)弱的抑制劑，IC5tl低於5 μ g/ml。表1簡單概括了包括在和獲自文庫(如所述的)中的模擬表位的抑制能力表1 模擬表位抑制能力肽3001DKELRI 強肽3002DTOLRI 中等肽3003YREFFI 無肽3004YREFRI 弱肽3005YAEFRG 中等肽3006EAEFRG 強
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肽3007DYEFRG 強肽3008ELEFRG 弱肽3009SFEFRG 弱月太30IODISFRG 無月太3011DIGWRG 無4.按照本發明篩選的其它模擬表位的抑制試驗抑制試驗圖4和5描述了用包括在和獲自5個文庫(如所述的)中的模擬表位肽進行的抑制試驗結果。模擬表位肽與原始表位競爭單克隆抗體識別。原始表位和模擬表位肽在C-末端上(7位)含有用於與蛋白質載體偶聯的另一個C(如果需要)。使用下列肽肽I737DAEFRH (原始表位 +C)肽1234KKELRI月太1235DRELRI月太1236DKELKI月太1237DRELKI月太1238DKELR肽1239EYEFRG肽1241DWEFRDA肽4002SWEFRT肽4003GREFRN肽4004WHWSWR步驟以0. 1 μ g/ml肽-BSA的濃度給ELISA平板(Nunc Maxisorp)包被原始肽表位 DAEFRH(C-末端被C延長且與牛血清白蛋白BSA偶聯)(100 μ 1/孔，12小時，4°C )。在用 1% PBS/BSA封閉QOO μ 1/孔，12小時，4°C )後，用PBS/Tween將平板洗滌3x次。然後加入生物素化單克隆抗體(1 2000，50 μ 1/孔)和不同濃度的肽(50 μ 1/孔)，在37°C下20 分鐘。用PBS/Tween將平板洗滌3x次並與辣根過氧化物酶(HRP)-標記的鏈黴抗生物素一起保溫(100 μ 1/孔，30分鐘，RT)。用PBS/Tween將平板洗滌切次並與ABTS+H2& —起保溫(0. 1% w/v ； 10-45分鐘)且用檸檬酸終止反應，隨後進行光度測定評價(波長405nm)。正如圖4中預計和觀察到的，肽1737DAEFRH可以與BSA-偶聯的平板結合的肽 DAEFRH競爭且由此抑制單克隆抗體的識別。此外，表明肽4004不能抑制單克隆抗體與原始表位結合。相反，肽4002和4003 (不同程度)阻斷表位識別。而肽4003僅在相對高濃度 (10 μ g/ml)下具有抑制作用，肽4002具有強抑制作用，IC50低於0. 4 μ g/ml。正如附圖5中預計和觀察到的，肽1737DAEFRH可以成功地與BSA-偶聯的平板結合的肽DAEFRH競爭另外進行的單克隆抗體識別而不依賴於實驗。此外，表明肽1234在測試濃度下幾乎沒有抑制作用，而肽1235、1236、1237、1238、1239和1241 (不同程度)阻斷表位識別。肽1235，1238和1241是強抑制劑，IC50小於0. 5 μ g/ml，而肽1236和1237是(相對)弱的抑制劑，IC50大於5 μ g/ml。肽1239是中等抑制劑，IC50大於0. 5 μ g/ml。
表2簡單概括了包括在和獲自文庫(如所述的)中的模擬表位的抑制能力表2 模擬表位抑制能力肽12;34KKELRI 無肽12!35DRELRI 強肽1236DKELKI 弱肽1237DRELKI 弱肽1238DKELR 強肽1239EYEFRG 中等肽1241DTOFRDA 強肽4002SWEFRT 強肽4003GREFRN 弱肽4004WHWSWR 無圖4和5中所示的結果表明除各種6鏈節肽(如此處和上文所述)外，5鏈節肽 (即肽1238DKELR)和7鏈節肽(即肽1241DWEFRDA)也可以用作基於模擬表位的阿爾茨海默病疫苗中的表位。
權利要求
1.含有如下胺基酸序列的化合物在製備用於阿爾茨海默病(AD)的疫苗中的用途X1X2X3X4X5X6 其中&為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸；且其中不為DAEFRH，所述的化合物具有與天然N-末端A β 42序列DAEFRH 的特異性抗體結合的能力，且其5-鏈節具有與天然N-末端A β 42序列DAEFRH的所述特異性抗體結合的能力。
2.權利要求1的用途，其特徵在於所述的化合物含有肽或由肽組成，其中 &為G或帶有羥基的胺基酸或帶負電荷的胺基酸，優選E、Y、S或D ；X2為疏水胺基酸或帶正電荷的胺基酸，優選I、L、V、K、W、R、Y、F或A ；X3為帶負電荷的胺基酸，優選D或E ；X4為芳族胺基酸或L，優選Y、F或L ；X5為H、K、Y、F或R，優選H、F或R ；且X6 為 S、T、N、Q、D、E、R、1、1(、丫或6，優選1\10、1 、I 或 G，尤其是 EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、 DKELRI、DffELRI、YREFFI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、 GREFRN、EYEFRG, DffEFRDA, SffEFRT, DKELR 或 SFEFRG。
3.權利要求1或2的用途，其特徵在於所述的化合物為含有5-15個胺基酸殘基的多肽。
4.權利要求1-3中任意一項的用途，其特徵在於所述的化合物與藥物上可接受的載體、優選KLH且任選氫氧化鋁偶聯。
5.權利要求1-4中任意一項的用途，其特徵在於它含有用量為0，Ing-lOmg，優選 lOng-lmg，尤其是IOOng-IOO μ g的化合物。
6.分離與天然N-末端Aβ 42序列DAEFRH的特異性抗體結合的化合物的方法，包括下列步驟-提供含有肽的肽化合物文庫，所述的肽含有如下胺基酸序列X1X2X3X4X5X6 其中&為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸； &為除C以外的胺基酸；且其中 &)(2Χ3Χ4)(5)(6 不為 DAEFRH ； -使所述的肽文庫與所述的抗體接觸；和 -分離與所述抗體結合的肽文庫中那些成員。
7.權利要求6的方法，其特徵在於在所述的文庫中提供個體化的所述肽，尤其是固定在固體表面的所述肽。
8.權利要求6或7的方法，其特徵在於所述的抗體包括合適的標記，該標記在與所述庫中的肽結合時能夠得到檢測或分離。
9.抗阿爾茨海默病的疫苗，含有包括至少一種選自下列組中的肽的抗原EIDYHR、 ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、DKELRI、DffELRI、YREFRI、 YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG, DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN, EYEFRG, DffEFRDA, SWEFRT、DKELR 或 SFEFRG。
全文摘要
本申請涉及預防和治療阿爾茨海默病(AD)的方法。本發明涉及含有如下胺基酸序列X1X2X3X4X5X6的化合物在製備用於阿爾茨海默病的疫苗中的用途，其中X1為除C以外的胺基酸，X2為除C以外的胺基酸，X3為除C以外的胺基酸，X4為除C以外的胺基酸，X5為除C以外的胺基酸，X6為除C以外的胺基酸，且其中X1X2X3X4X5X6不為DAEFRH，所述的化合物具有與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特異性抗體的結合能力且其5-鏈節具有與天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特異性所述抗體的結合能力。
文檔編號C07K7/06GK102526699SQ201110311038
公開日2012年7月4日 申請日期2004年1月13日 優先權日2003年1月14日
發明者弗蘭克.馬特納 申請人:阿費裡斯股份公司