抗分泌因子對於治療高眼壓的應用的製作方法

2023-11-06 04:08:27

專利名稱：抗分泌因子對於治療高眼壓的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含抗分泌因子的藥物合成物對於治療和/或防止高眼壓的 應用，這種應用的優選特徵是，使導致眼內壓升高的體液外流受到抑制。本 發明提供用於治療和/或防止這種病症、調節眼內壓至可接受水平(任選等
於或小於21毫米汞柱)的新穎途徑。本發明還涉及通過給予包含抗分泌因 子的藥物合成物從而治療和/或防止高眼壓的方法。
背景技術：
眼內壓水平升高是由於眼內體液產生增多或外流受到抑制、或者這兩種 因素的組合導致的。多物種哺乳動物的眼內壓(IOP)類似，都為11-21毫 米汞柱左右，如10-20毫米汞柱、12-18毫米汞柱。對於人類，正常範圍約 為11-21毫米汞柱。如果較長時期地超過20毫米汞柱，如21毫米汞柱、21-24 毫米汞柱、或22-30毫米汞柱，則認為是高眼壓。通過形成體液(房水，AH) 可以調節IOP水平，房水來源於血液並經由睫狀突傳遞至眼後房中。AH通過 眼後房中的玻璃體和晶狀體，然後通過瞳孔進入眼前房中。大部分AH最終 流至虹膜-角膜角並經由Schlemm管、房水靜脈、鞏膜和鞏膜上靜脈通過小 梁網流出眼外。在AH和例如眼後房中的晶狀體與眼前房中的角膜之間存在 體液和代謝物的交換。 一小部分AH進入葡萄膜鞏膜途徑，即虹膜、睫狀肌 和鞏膜，最終與局部產生的組織液混合，然後流出眼外(Jermial， Hansson &Bill， 1990; Oyster, 1999)。 IOP主要通過體液外流調節，而人們認為成 人AH的形成不怎麼變化。IOP的主要調節因素是小梁網的內皮、管旁內皮網 (the juxtacanalicular endothelial meshwork)、禾口 Schle 管的內壁內 皮(Lutjen—Drecoll 1998; Sacca等，2005)。後者對於調整和調節由眼前房至血管系統的流動非常重要。在內皮細胞中形成有內陷(稱為"細胞膜穴
樣內陷")，其中充滿AH，然後主要作為巨液泡傳遞通過內皮細胞，最終清空 它們的內含物至Schlemm管中。IOP升高導致形成大量這樣的巨液泡，如果 IOP降低則反之(Jerndal， Hansson & Bill, 1990; Lutjen-Drecoll 1998)。 另外，這些細胞可以暫時地具有調節它們的細胞容積的能力，從而進一步影 響AH的細胞外洩(the paracellular leakage) (Starner等，2001)。圖la 顯示人眼的示意圖，圖lb是成人眼虹膜-角膜角的掃描電子顯微照片。
在醫療實踐中，使用術語"高眼壓"作為IOP超過20毫米汞柱(如21-24 毫米汞柱、22-30毫米滎柱)的慢性病的診斷。高眼壓病人可能患有該病症 而不產生任何後發病(如視野喪失)信號或其他視網膜信號和視神經異常。 IOP急劇升高會在例如咳嗽、高工作負荷、眼球外傷和咽鼓管充氣檢査 (Valsalva's manoeuvre)之後瞬時發作。IOP通常具有日夜變化，對於人類， 每日早間的IOP最高。成人每分鐘形成約2-3微升AH，所以眼中AH約每1. 5 小時更新一次。這意味著必須在很窄的時間限度內對AH的形成和外流進行 調節，從而將I0P保持在正常範圍內。IOP必須既不太高也不太低。AH的主 要功能是為例如晶狀體和角膜提供營養素、氧氣、離子和體液，並且排出代 謝物和廢物。而且，IOP和AH相互作用從而保持眼的光學性質和形狀。可以 通過幾種方法揭示AH的產生，例如通過確定AH的周轉量及其外流。通過例 如壓力測量法可以精確確定眼內壓。
可以證明一些青光眼病人存在不正常的IOP。不過並非所有青光眼病人 都顯出高眼壓信號。因此，必須不要將術語"高眼壓"與青光眼的醫療診斷 混淆起來。與高眼壓不同，確定青光眼作為一種疾病的特徵是，隨著時間的 流逝，因為視網膜神經細胞的持續損失和視神經的退化，導致惡化並且最終 失明。術語"青光眼"包括多種病症，它們的共同特點是最終都會導致視力 惡化(Ritch等，1996)。因此，青光眼的診斷與視覺損失相關，與IOP不正 常無關。
IOP主要通過AH從眼前房外流至通過虹膜角膜角的靜脈到達Schlemm 管進行調節。如果AH從眼流出受到抑制或甚至受到阻礙，IOP就會升高。對 外流的阻力(正常情況下導致IOP為10-20毫米汞柱，如12-18毫米汞柱) 主要位於小梁網和Schlemm管的內皮襯中。小梁網和Schlemm管中的內皮細胞相互作用，調節AH的外流(Alvarado等，2005; Jerndal等，1991)。在 眼前房和Schlemm管(包括鞏膜和鞏膜上靜脈)之間沒有直接聯繫。對於高 眼壓，小梁網的特徵是退化至不同程度，積聚源自鞘膜的斑樣物質，以及 增大對AH外流的阻力(Rohen等，1993)。而且，在某些情況下，色素和脫 落物質以及血細胞和凝塊的積聚也會增加阻力並進一步抑制外流，使IOP升 高。分泌過多(即AH形成過多)是高眼壓的唯一原因。因此，對AH的周轉 量進行改善的持續控制，特別是控制AH通過虹膜角膜角的外流，對於降低 IOP使其趨於正常從而控制高眼壓是非常重要的。
在臨床實踐中，治療高眼壓的現有療法的目的是優先增加AH的外流， 但是一些藥物(例如杜塞醯胺和布林佐胺)會減少AH產生。 一些目前使用 的藥物同時影響形成和外流途徑。需要強調的是，AH的組成和周轉量都很重 要，因為AH為例如晶狀體和角膜提供營養素、體液和氧氣，並且處理形成 的多種產物。目前使用的藥物很多都有副作用，經常會抑制治療的充分性。 另外，現有藥物還不能充分治療高眼壓。因此，需要提出降低IOP至正常水 平的治療方法。
抗分泌蛋白是41kDa蛋白，最初描述為能防止腹瀉和腸炎(綜述參見 Lange和Lonnroth， 2001)。已知抗分泌蛋白的序列，並且克隆了其cDNA。 抗分泌活性似乎主要由位於1-163之間(或者更具體地說，是位於抗分泌蛋 白胺基酸序列上35和50點位之間)的肽行使。免疫化學和免疫組織化學研 究顯示，抗分泌蛋白由體內大部分組織和器官呈現，並且也可以由它們合成。 已經表徵了包含抗腹瀉序列的合成肽(W0 97/08202; W0 05/030246)。已經 揭示抗分泌因子能夠使病態的體液傳輸和/或炎性反應正常化，例如用霍亂 菌毒素激發之後在腸管和中樞神經系統的脈絡叢中的情況(W0 97/08202)。 因此，在W0 97/08202中建議可以在食物和詞料中添加抗分泌因子來治療水 腫、腹瀉、脫水和炎症。W0 98/21978揭示具有酶活性的產物用於製造誘導 抗分泌蛋白形成的食物的應用。W0 00/038535進一步揭示富含這種抗分泌蛋 白的食品。
還顯示，在治療細胞損失和/或增益相關病症時，抗分泌蛋白及其片斷 能夠改善神經組織的修復以及幹細胞和祖細胞及其衍生細胞的增殖、凋亡、 分化和/或遷移(W0 05/030246)。本發明的發明人驚異地發現，抗分泌因子蛋白及其同系物和肽片斷能夠
降低對AH通過眼的虹膜角膜角外流至靜脈系統的阻力。這種發現提供了抗 分泌蛋白及其同系物和片斷的新的治療應用，即，這種蛋白和片斷在製備用 於治療和/或防止高眼壓的藥劑中的應用。

發明內容
本發明涉及包含抗分泌因子的藥物合成物對於治療和/或防止高眼壓的
應用。本發明基於以下發現抗分泌因子(即抗分泌蛋白及其具有抗分泌活 性的肽、衍生物、同系物和片斷)能夠增加眼內體液的外流，從而降低眼內壓。
在第一方面，本發明涉及抗分泌蛋白，或其具有抗分泌活性的同系物、 衍生物或片斷，或其藥物學可接受鹽，對於製造用於防止和/或治療高眼壓 的藥物合成物的 應用。
在第二方面，本發明涉及治療和/或防止哺乳動物高眼壓的方法，其中， 該方法包括給予需要的哺乳動物有效量的藥物合成物，該合成物包含抗分泌 蛋白，或其具有抗分泌活性的同系物、衍生物或片斷，或其藥物學可接受鹽。
附圖簡要說明
圖la顯示人眼(1-1)的示意圖。在較高放大倍數下能看到Schwann管 (Sch)，通過小梁網(T) (1-2)與眼前房(AC)分開。還顯示出，各小梁 (Tr)被內皮細胞(EC) (1-3)包圍。房水在睫狀突形成，參見

圖1-1中加
框區域右側。！^晶狀體；C二角膜；1=虹膜；S二鞏膜；由R.V.Krstic， 1991修改。
圖lb是55歲老年男性的眼的虹膜-角膜角的掃描電子顯微照片，該男 性的眼因為眼球後腫瘤而摘除。可以看到，小梁網(標註為U)通過相當致 密的組織與Schlemm管分開。〔=角膜；Sp二鞏膜突；1=虹膜；Cp,走狀突; S二Schwalbe線。空氣位於右上方。來自Jerndal等，1991。
圖2分別顯示根據實施例7用AF-16 (倒三角形)、藥物Timolol (三 角形)和PBS載體(正方形)對兔眼進行局部治療時的眼內壓。
圖3分別顯示根據實施例7用AF-16 (倒三角形)、藥物Timolol (三角形)和PBS載體(正方形)對兔眼進行5天局部治療後的眼內壓。
圖4顯示根據本發明SEQ ID NO 6的抗分泌蛋白胺基酸序列。該序列對
應於US 6344440的SEQ ID NO 2。 定義
在本申請中，"眼前房"定義為虹膜前表面和角膜內皮表面之間的空間， 在虹膜角膜角處連接。
"眼後房"定義為玻璃體與晶狀體的前表面和虹膜後表面之間的空間。 眼後房和眼前房通過瞳孔連接。
本申請文本中的"抗分泌蛋白"指具有WO 97/08202和WO 00/38535中
所定義抗分泌性質的蛋白。
在本申請文本中，"抗分泌因子(AF)"指抗分泌蛋白或其具有抗分泌活 性的肽、同系物、衍生物和/或片斷。在本申請文本中，這種肽、同系物、 衍生物或片斷在治療和/或防止高眼壓時具有相似的生物活性。在例如WO 97/08202和WO 05/030246中揭示了抗分泌因子。在本申請文本中，術語"抗 分泌因子"、"抗分泌因子蛋白"、"抗分泌蛋白"、"抗分泌肽"、"抗分泌衍 生物"和"抗分泌片斷"可以交換使用。術語"抗分泌因子"還意指SE 900028-2 和WO 00/38535中揭示的富含抗分泌因子的蛋黃，以下將進一步描述。
"房水，AH"指由血液在睫狀突形成、流過眼後房和瞳孔進入眼前房、 然後主要經由小梁網和Schlemm管以及最終的靜脈血管離開眼前房的水樣體 液。
CNS是中樞神經系統，包括大腦和脊髓。
"水腫"指細胞、組織或漿膜腔中積聚過多量的水樣體液(參見例如 Stedman's Medical Dictionary,第五版，Lippincott， Williams & Wilkins， Philadelphia, 2005)。
"青光眼"指一類疾病，其特徵是，對視網膜和視神經的漸進性損傷導 致視野損失和變窄並最終喪失視力。
"眼內壓(IOP)"是由眼球內的房水產生的壓力。
"高眼壓"是清醒對象眼球內壓力超過20毫米汞柱(如21毫米汞柱、 22-30毫米汞柱)的病症。因此，在本申請文本中，"高眼壓"和"眼內壓不 正常"可以交換使用。"低眼壓"指清醒對象眼球內壓力小於11毫米汞柱，如10毫米汞柱。
"虹膜角膜角"是眼前房中、虹膜和角膜後部之間的連接處。
PBS是磷酸鹽緩衝鹽水。
在本申請文本中，術語"治療"或"處理"涉及為了治癒或減輕高眼壓 病症的醫療治療。在本申請文本中，還意指"防止"高眼壓，其與為了避免 發生高眼壓的預防性治療相關。
"小梁網"指襯有內皮細胞的小梁的網絡和膠原結締組織的片層，該片 層在位於眼前房和Schlemm管之間的虹膜角膜角處插入。
"Schlemm管"指位於眼的異組織邊緣區域處內鞏膜溝外部的環形靜脈 管，其經由房水管連接至眼的靜脈排出系統。Schlemm管是房水從眼前房外 流的主要系統。
蛋白(質)是由胺基酸殘基通過肽鍵連接在一起構成的生物大分子。蛋 白(質)(作為胺基酸的線形聚合物)也稱為多肽。蛋白(質)通常具有50-800 個胺基酸殘基，因此分子量約為6000至幾十萬道爾頓或以上。小型的蛋白 (質)稱為肽或寡肽。在本申請文本中，術語"蛋白(質)"和"肽"可以 交換使用。
在本申請文本中，"藥物合成物"指包含治療活性量的抗分泌蛋白、任 選組合有藥物學活性賦形劑(例如載劑或載體)的合成物。所述藥物合成物 為適當的給藥途徑配製，給藥途徑根據病人情況以及其他因素(如年齡或優 選選項)變化。包含抗分泌蛋白的藥物合成物作為藥物遞送系統發揮作用。 給予的藥物合成物為病人或動物體提供活性物質。以下進一步描述適用於本 發明的藥物合成物。
發明詳細說明
本發明基於以下驚異的發現，抗分泌因子(AF)(例如抗分泌蛋白及其 同系物、衍生物或片斷)能降低對房水通過眼的虹膜角膜角外流至靜脈系統 的阻力，這種降低作用增加了眼內異常積聚的體液的外流。從而增加房水外 流，導致眼內壓降低。這種發現為抗分泌蛋白及其片斷提供了一種新的治療 應用，即，這種蛋白和片斷對於製備用於治療和/或防止高眼壓的藥物合成 物的應用。根據本發明的藥物合成物的應用非常適合可能發生或已患有高眼 壓的病人。如上所述，房水外流主要通過虹膜角發生，通過形成小梁網的細胞調節。
大部分房水經由Schlemm管傳輸離開眼部。房水封閉在通過小梁網細胞的小 泡中傳輸至Schlemm管，從某種程度上說，這種傳輸是跨細胞的。另外，一 小部分AH通過虹膜和鞏膜的角結構離開眼。眼房水外流時，其中"一小部 分"液體是一次傳輸的，這與例如腸管中離子和水的傳輸有根本性的不同， 在腸管中，腸管上皮細胞的離子泵和水泵一次傳輸一個分子。因此，雖然以 前建議將抗分泌因子用於治療水腫、腹瀉、脫水、青光眼和炎症之類的病症 (W0 97/08202)，但是抗分泌因子在治療這些疾病中的作用機理不同於其根 據本發明的作用機理，在本發明中，抗分泌因子降低了房水通過眼的虹膜角 膜角外流至靜脈系統的阻力。不過，需要指出的是，高眼壓在後期可能導致 青光眼，也可能不導致青光眼。
因此，在第一方面，本發明涉及抗分泌因子(即，抗分泌蛋白和/或其 具有抗分泌活性的同系物、衍生物或片段)和/或其藥物學可接受鹽對於制 造用於防止和/或治療高眼壓的藥物合成物的應用。
抗分泌因子是體內自然產生的蛋白質。人抗分泌因子是41kDa蛋白，從 腦垂體分離時包含382個胺基酸。關於根據本發明的眼內壓降低效應的活性 位點似乎位於接近蛋白質N端的區域中，定位於SEQ IDN0 6的胺基酸1_163， 或者定位於該區域片段。
本發明的發明人已經指出，抗分泌因子在某種程度上類似於蛋白S5a， 也稱為Rpn 10，其構成所有脊椎細胞中佔主要成分的亞單位，26 S蛋白酶 體，更具體地說是位於19 S/PA 700 cap中。在本發明中，抗分泌蛋白定義 為一類具有相同功能性質的類似蛋白。蛋白酶體具有多種與剩餘蛋白以及短 壽蛋白、無用蛋白、變性蛋白、錯誤摺疊蛋白和異常蛋白的降解相關的功能。 而且，抗分泌因子/S5a/RpnlO參與細胞成分(最明顯的是指蛋白質)的細胞 分布和傳輸，常見教科書中有進一步的說明。
根據本發明的抗分泌蛋白的同系物、衍生物和片段和/或肽都具有類似 的、能夠降低眼內壓的生物活性。在本申請文本中，抗分泌同系物、衍生物 和片段包含天然產生的抗分泌蛋白的至少4個胺基酸，通過改變一個或多個 胺基酸可以進一步改性，從而優化治療和/或防止高眼壓的抗分泌因子的生 物活性。抗分泌蛋白的片段一般包含製備的肽/胺基酸序列或其片段，其中，該
製備中超過90% (如95%、 96%、 97%、 98%或99%)的蛋白是本發明的蛋白、 肽和/或其片段。
而且，對於與根據本發明的抗分泌蛋白、肽、同系物、衍生物和/或片 段的胺基酸序列有至少70% (如至少72%、 75%、 77%、 80%、 82%、 85%、 87%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%)相同的任何胺基酸 序列，也認為落在本發明範圍之內。在本申請文本中，術語"類似"和"相 同"可以交換使用，即，與另一種胺基酸序列具有指定程度相同性的胺基酸 序列相對於指定的胺基酸序列具有相同程度的類似性。
本申請文本中的"衍生物"意指這樣一種蛋白，其具有本文所定義的抗 分泌活性，直接或通過改性或部分取代衍生自另一種物質，其中一種或多種 胺基酸被另一種胺基酸取代，所述另一種胺基酸可以是改性的胺基酸或非天 然的胺基酸。這種改性的胺基酸和/或非天然的胺基酸是本領域技術人員眾 所周知的。例如，根據本發明的抗分泌因子衍生物可以包含N端和/或C端 保護基團。N端保護基團的一個例子包括乙醯基。C端保護基團的一個例子 包括醯胺。
"相對於參比胺基酸序列具有至少例如95%相同性的胺基酸序列的蛋 白、同系物、衍生物、肽和/或其片段"意指例如這種肽的胺基酸序列與參 比序列類似，區別在於，該胺基酸序列在參比胺基酸序列的每100個胺基酸 中可以包括最多5個點突變。換言之，要獲得相對於參比胺基酸序列具有至 少95%相同性的胺基酸序列的多肽，可以刪除參比序列中最多5%的胺基酸或 者用另一種胺基酸取代，或者可以在參比序列中插入佔參比序列中胺基酸總 數最多5%的胺基酸。
這些參比序列的突變可以在參比胺基酸序列的氨基或羧基端位置或者 這些端位之間的任何位置發生，獨立地插入參比序列中的胺基酸之間或者作 為一個或多個鄰接的基團插入參比序列中。
在本發明中，最適宜使用一種局部算法程序來確定類似性。局部算法程 序(例如Smith-Waterman)對一個序列中的子序列與另一個序列中的子序列 進行比較，找出子序列的組合以及那些子序列的隊列，產生最高整體類似性 評分。允許時對內部空隙進行罰分。局部算法在比較具有共同的單個域或僅只一個結合位點的兩個多域蛋白時能很好地工作。
確定相同性和類似性的方法編碼成公開可用的程序。確定兩個序列之間
的相同性和類似性的優選電腦程式方法包括但並不限於GCG程序包 (Devereux， J等(1994)) BLASTP， BLASTN和FASTA (Altschul， S. F.等 (1990))。 BLASTX程序由NCBI和其他來源公開(BLAST Manual, Altschul,
S.F.等，Altschul, S.F.等(1990))。各序列分析程序具有默認的評分矩陣
和默認的空隙罰分。 一般來說，分子學生物學家期望使用所選軟體程序建立
的默認設置。
根據本發明的抗分泌蛋白、肽、或其具有抗分泌活性的同系物、衍生物 或片段可以具有4個或更多個胺基酸，例如具有5-16個胺基酸，6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20個胺基酸或更多。在其 他優選實施方式中，抗分泌因子由42、 43、 45、 46、 51、 80、 128、 129或 163個胺基酸組成。在優選實施方式中，抗分泌因子由5、 6、 7、 8或16個 胺基酸組成。
在另一個優選實施方式中，根據本發明的抗分泌蛋白、肽和/或其具有 抗分泌活性的同系物、衍生物或片段由根據下式的序列組成 XI-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5
其中XI是I、 SEQ ID NO 6的胺基酸1-35、或預設，X2是H、 R或K， X3是S或L， X4是T或A， X5是SEQ ID NO 6的胺基酸43-46、 43-51、 43-80 或43-163、或預設。
根據本發明的抗分泌因子可以體內產生或體外產生，例如通過重組產 生、化學合成、和/或從抗分泌因子的天然產生來源(如豬腦垂體或鳥卵) 分離。形成之後，可以對抗分泌因子作進一步處理，例如通過化學或酶解成 較小的抗分泌活性片斷、或通過胺基酸改性作進一步處理。目前無法通過純 化獲得純淨形式的抗分泌因子。不過可以如W0 97/08202和W0 05/030246 中所述通過重組產生生物活性的抗分泌因子蛋白。W0 05/030246和W0 97/08202還揭示了這種蛋白的生物活性片斷的產生。
根據本發明的抗分泌因子可以進一步包含N端和/或C端保護基團。N 端保護基團的一個例子包括乙醯基。C端保護基團的一個例子包括醯胺。
術語"藥物學活性鹽"指抗分泌蛋白的鹽，其可以為基於所謂Hofmeiser系列的、由抗分泌蛋白衍生的任何鹽。由於蛋白質和肽是兩性的，因此，術 語"藥物學可接受鹽"作為例如三氟乙酸鹽或乙酸鹽進行貯存，該術語還指 根據本發明的抗分泌因子的更穩定形式，這並非是對本發明範圍的限制。
本發明的藥物合成物或藥劑可以另外包含一種或多種藥物學可接受載
體、接受體(recipient)或稀釋劑，如本領域中已知的那些。
所述合成物或藥劑可以為例如流體、半流體、半固體或固體合成物的形 式，例如但並不限於溶解的輸液，例如滅菌鹽水、各種鹽溶液、葡萄糖溶液、 磷酸鹽緩衝鹽水、血液、血漿或水、粉末、微囊、微球體、納米顆粒、噴霧 劑、氣溶膠、吸入裝置、溶液、分散體、懸浮體、乳劑、和它們的混合物。 所述合成物可以考慮肽或蛋白質的穩定性和反應性。
本發明的藥物合成物可以根據傳統製藥實踐進行配製，例如根據 "Remington- The science and practice of pharmacy", 第21版，ISBN 0_7817_4673-6或"Encyclopedia of pharmaceutical technology", 第2 版，Swarbrick J.編，ISBN: 0-8247-2152-7。
在本發明的一個優選實施方式中，抗分泌因子是具有如SEQ ID NO 6所 示胺基酸序列的抗分泌蛋白或其包含SEQ ID NO 6的胺基酸38-42的同系物、 衍生物和/或片斷。
在本發明的一個優選實施方式中，抗分泌因子選自SEQ ID NO 6或是根 據SEQ ID NO 6的抗分泌蛋白的胺基酸序列(同樣顯示在圖4中)，艮口 VCHSKTRSNPE麗GL (SEQIDNOl，在本申請文本中也稱為AF-16)、 IVCHSKTR (SEQ ID NO 2)、 VCHSKTR (SEQ ID NO 3)、 CHSKTR (SEQ ID NO 4)、 HSKTR (SEQ ID NO 5)，這些序列中使用共同的單字母縮寫表示胺基酸。在例如WO 05/030246中已經揭示了 SEQ ID NO 1、 2和3，在US 6344440中揭示了 SEQ ID NO 6。如所附序列表中指出的，可以用其他胺基酸代替以上列出的序列 中的一些胺基酸。在本段落的以下部分中，對特定胺基酸序列中的特定氨基 酸的位置進行計算，從左開始，將該特定序列中最靠近N端的胺基酸表示為 位置1。對於該序列中的任何其他胺基酸取代都可以獨立地進行如下所示的 任何胺基酸取代。在SEQ ID NO 1中，位置2的C可以被S取代，位置3的 H可以被R或K取代，位置4的S可以被L取代，並且/或者位置6的T可以 被A取代。在SEQ ID NO 2中，位置3的C可以被S取代，位置4的H可以被R或K取代，位置5的S可以被L取代，並且/或者位置7的T可以被A 取代。在SEQ ID NO 3中，位置2的C可以被S取代，位置3的H可以被R 或K取代，位置4的S可以被L取代，並且/或者位置6的T可以被A取代。 在SEQ ID N0 4中，位置1的C可以被S取代，位置2的H可以被R或K取 代，位置3的S可以被L取代，並且/或者位置5的T可以被A取代。在SEQ ID NO 5中，位置l的H可以被R或K取代，位置2的S可以被L取代，並 且/或者位置4的T可以被A取代。
在本發明的一個優選實施方式中，所述片斷包含如SEQ ID NO 1中所示 的胺基酸序列。
在本發明的一個優選實施方式中，所述片斷包含如SEQ ID NO 2中所示 的胺基酸序列。
在本發明的一個優選實施方式中，所述片斷包含如SEQ ID NO 3中所示 的胺基酸序列。
在本發明的一個優選實施方式中，所述片斷包含如SEQ ID NO 4中所示 的胺基酸序列。
在本發明的一個優選實施方式中，所述片斷包含如SEQ ID NO 5中所示 的胺基酸序列。
本發明還預期了根據本發明的任何抗分泌因子中的兩種或更多種的組 合，任選還組合有富含有抗分泌因子的蛋黃。
在本發明的一個優選實施方式中，抗分泌因子用於製造一種藥物合成 物，該合成物用於治療和/或防止高眼壓、或者該合成物用於治療和/或防止 高眼壓的方法中，其中，眼內壓等於或大於21毫米汞柱，例如等於或大於 22毫米汞柱。在本發明的另一個優選實施方式中，眼內壓為正常或甚至較低， 即小於21-24毫米汞柱，優選小於10-12毫米汞柱，例如為11-21毫米滎柱。 人們認為小於11毫米汞柱(如小於10毫米汞柱、小於10-12毫米滎柱)的 IOP低於正常值，即I0P較低。對於眼內壓正常或甚至低於正常值的哺乳動 物，如果其眼內壓在一天內具有峰值，則也可以給予根據本發明的藥物合成 物，該合成物的有益效果是可以治療和/或防止這種出現峰值的病症。在另 一個優選實施方式中，眼內壓超過21毫米汞柱，例如為21-24毫米滎柱、 22-30毫米汞柱。本發明還預期了使用富含抗分泌因子的蛋黃來治療和/或防止高眼壓、
和/或來製備藥物合成物的可能性。SE 9000028-2揭示了可以刺激在鳥的體 內形成抗分泌因子，然後通過蛋黃的消化回收或濃縮抗分泌因子。W0 00/38535進一步揭示了通過食物或詞料、或者作為配製成藥品的或多或少的 獨立產品的形式給予動物或人這種回收或濃縮的抗分泌因子。因此，本發明 還預期了富含抗分泌因子的蛋黃對於製備產品(例如藥物合成物)、對於治 療和/或防止高眼壓的應用，或者這種蛋黃在治療方法中的應用。在一個優 選實施方式中，所述抗分泌蛋白以所述蛋黃中的至少1000FIL單位/毫升的 濃縮劑形式提供。在本申請文本中，FIL單位等於(相較於不提供抗分泌因 子的對照)腸液流的50%減少量，如W0 00/38535和SE 9000028-2中所揭示 的。因此，根據本發明的抗分泌因子也可以以"醫療食品"的形式給予。在 本申請文本中，"醫療食品"指用含有抗分泌蛋白的合成物製造的食品。所 述食品可以是任何合適的食品，為流體或固體形式，例如液體或粉末，或者 為任何其他合適的食品。這些物質的例子參見WO 00/38535。
在本發明的一個優選實施方式中，要治療和/或防止的高眼壓是由來自 眼前房的房水外流受到阻力引起的。
在另一個優選實施方式中，根據本發明使用的藥物合成物，降低了來自 眼前房的房水通過小梁網和Schlemm管外流時的阻力。
在本發明的一個實施方式中，根據本發明的藥物合成物進一步包含藥物 學可接受賦形劑。本領域技術人員通過試驗可以輕易地確定藥物學可接受賦 形劑的選擇及其根據本發明使用的最佳濃度。根據本發明使用的藥物學可接 受賦形劑包括溶劑、緩衝劑、防腐劑、螯合劑、抗氧化劑、穩定劑、乳化劑、 懸浮劑和/或稀釋劑。
藥物學可接受賦形劑是對給予該合成物的個體基本無害的物質。這種賦 形劑通常滿足國家藥品管理署的要求。官方藥典如美國藥典和歐洲藥典為眾 所周知的藥物學可接受賦形劑制定的標準。
以下是根據本發明使用的相關藥物合成物的回顧。回顧的內容以特定給 藥途徑為基準。但是，應當理解，對於其中的藥物學可接受賦形劑以不同劑 型或不同合成物的情況中，特定藥物學可接受賦形劑的應用並不限於特定劑 型，也不限於特定的賦形劑功能。腸外合成物
對於全身性應用，根據本發明的合成物可以包含傳統的非毒性藥物學可 接受載體和賦形劑，包括微球體和脂質體。
根據本發明使用的合成物可以包括所有種類的固體、半固體和流體合成物。
藥物學可接受賦形劑可以包括溶劑、緩衝劑、防腐劑、螯合劑、抗氧化 劑、穩定劑、乳化劑、懸浮劑和/或稀釋劑。以下給出具體試劑的例子。 各種試劑的例子
溶劑的例子包括但並不限於水、醇類、血液、血漿、脊髓液、腹水和淋 巴液。
緩衝劑的例子包括但並不限於檸檬酸、乙酸、酒石酸、乳酸、磷酸氫鹽 (hydrogenphosphoric acid)、碳酸氫鹽、磷酸鹽、二乙胺等。 螯合劑的例子包括但並不限於EDTA鈉和擰檬酸。
抗氧化劑的例子包括但並不限於丁基化的羥基苯甲醚(BHA)、抗壞血酸 及其衍生物、維生素E及其衍生物、半胱氨酸、以及它們的混合物。
稀釋劑和崩解劑的例子包括但並不限於乳糖、蔗糖、EMDEX聚合糖、磷 酸鈣、碳酸鈣、硫酸鈣、甘露醇、澱粉和微晶纖維素。
粘結劑的例子包括但並不限於蔗糖、山梨糖醇、金合歡膠、藻酸鈉、明 膠、澱粉、纖維素、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯 基吡咯垸酮和聚乙二醇。
根據本發明使用的藥物合成物或物質優選經由靜脈內末梢注射或經由 肌肉內或皮下注射給藥至病人體內，或者經由口腔、肺部、鼻、皮膚或口服 途徑。而且，還可以通過外科插入病人腦室中的分流器給予藥物合成物或藥 物學活性物質。
在一個實施方式中，根據本發明的藥物合成物是為眼內、鼻內、口服、 皮下和/或全身性給藥而配製的。藥物合成物可以每天給予一次或多次。在 本發明的一個優選實施方式中，針對作為噴霧劑、氣溶膠通過噴霧器或吸入 器給藥的目的配製藥物合成物。在另一個優選實施方式中，本發明的合成物 作為懸浮體、或甚至更優選作為噴霧吸入粉末、氣溶膠或鼻腔噴霧劑和/或 通過呼吸道給予。噴霧器是以氣霧形式向氣道遞送液體藥劑的醫療裝置。噴霧壓縮器迫使空氣通過管道進入充滿液體藥劑的藥劑杯。空氣的壓力使液體 分散成微小的氣霧樣顆粒，可以深深吸入氣道中。在本申請文本中，術語"氣 溶膠"指細小固體或液體顆粒的氣相懸浮體。包含抗分泌因子的粉末形式藥 物合成物在穩定性和劑型方面具有額外優勢，並且乾粉末可以用吸入器給 予。藥物合成物還可以局部施用於眼、眼內、鼻內、口服、皮下和/或經由 血管全身性施用。在一個優選實施方式中，針對局部施用於眼的目的配製藥 物組合物。通常，將本發明合成物局部施用於眼時，每天的施用濃度為每次
1微克至10毫克，例如每次1微克至1毫克，優選每天50-1000微克，例如 每天50-500微克、50-250微克、100-250微克、500-250微克、500-750微 克、或50-100微克，每天每隻眼睛施用單劑量或重複多次施用。對血液進 行全身性給藥時，其劑量通常為每次每千克體重每天0. 1微克至10毫克， 例如每次每千克體重每天0. 1微克至1毫克，優選每千克體重1-1000微克， 較優選每千克體重1-100微克，每天施用單劑量或重複多次施用。根據本發 明使用富含抗分泌因子的蛋黃時，優選口服給藥。AF蛋白、肽、其片斷和/ 或衍生物的重要特徵是，即使在高劑量情況下，也不會發生局部或全身性副 作用，能夠在不產生己知風險的情況下進行強效治療。
本發明還涉及抗分泌蛋白、或其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/ 或片斷、和/或其藥物學可接受鹽對於製造用於眼內給藥的藥物合成物的應 用。
本發明還涉及如SEQ ID NO 4中所示肽、其同系物、衍生物和/或片斷 本身。本發明進一步涉及根據SEQ ID NO 4的肽的醫療應用。
本發明還涉及如SEQ ID NO 5中所示肽、其同系物、衍生物和/或片斷 本身。本發明進一步涉及根據SEQ ID NO 5的肽的醫療應用。在相同申請人 的共同待審査申請中還揭示了這種肽對於製備用於治療和/或防止間室綜合 症的藥物合成物的應用。
本發明還涉及用於治療和/或防止哺乳動物高眼壓的方法，所述方法包 括給予有效量的藥物合成物，該合成物包含抗分泌蛋白、其具有抗分泌活性 的同系物、衍生物和/或片斷、和/或其藥物學可接受鹽。用於這種方法的藥 物合成物如上所述。
因此，本發明涉及用於治療和/或防止哺乳動物高眼壓的方法，所述方法包括給予有效量的藥物合成物，該合成物包含抗分泌蛋白、其具有抗分泌 活性的同系物、衍生物和/或片斷、和/或其藥物學可接受鹽。
在一個優選實施方式中，根據本發明的方法包括眼內給予所述藥物合成物。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，所述藥物合成物包含一種或
多種片斷，該片斷包含如SEQ ID NO l-6中所示的胺基酸序列。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，所述抗分泌蛋白由根據下式
的序列組成
XI-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5
其中XI是I、 SEQ ID NO 6的胺基酸1-35、或預設，X2是H、 R或K， X3是S或L， X4是T或A， X5是SEQ ID NO 6的胺基酸43-46、 43-51、 43-80 或43-163、或預設。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，抗分泌蛋白是具有如SEQ ID NO 6中所示胺基酸序列的蛋白、或其包含SEQ ID NO 6的胺基酸38-42的同 系物、衍生物和/或片斷。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，所述抗分泌蛋白的片斷包含 如SEQ ID NO 1中所示的胺基酸序列。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，所述抗分泌蛋白的片斷包含 如SEQ ID NO 2中所示的胺基酸序列。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，所述抗分泌蛋白的片斷包含 如SEQ ID NO 3中所示的胺基酸序列。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，所述抗分泌蛋白的片斷包含 如SEQ ID NO 4中所示的胺基酸序列。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，所述抗分泌蛋白的片斷包含 如SEQ ID NO 5中所示的胺基酸序列。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，所述藥物合成物包含任何根 據本發明的抗分泌因子中的兩種或更多種，任選還組合有富含抗分泌因子的 蛋黃。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，哺乳動物的眼內壓等於或大 於21毫米汞柱。在根據本發明方法的一個優選實施方式中，眼內壓為正常或低於正常值。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，抗分泌蛋白以富含這種抗分 泌蛋白的蛋黃提供，所述蛋黃中提供的所述抗分泌蛋白的濃度優選至少為
1000FIL單位/毫升。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，高眼壓由來自眼前房的房水 外流受到阻力引起。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，藥物合成物降低了來自眼前 房的房水通過小梁網和Schlemm管外流的阻力。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，藥物合成物進一步包含藥物 學可接受賦形劑。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，藥物合成物針對眼內、鼻內、 口服、皮下和/或全身性給藥的目的配製。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，藥物合成物針對噴霧劑、氣 溶膠，和/或通過噴霧器或吸入器給藥的目的配製。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，藥物合成物向血液全身性給 予的劑量為每次每千克體重每天0. 1微克至10毫克，優選為每次每千克體 重1-IOOO微克。AF蛋白、肽、其片斷和/或衍生物的重要特徵是，甚至在大 劑量情況下也不會產生局部或全身性副作用，能夠在沒有已知風險的情況下 進行強效治療。
在根據本發明方法的一個同樣優選的實施方式中，藥物合成物向血液全 身性給予的劑量為每次每千克體重每天0. 1微克至10毫克，例如每次每千 克體重每天0. 1微克至1毫克，優選為每次每千克體重1-100微克。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，藥物合成物針對眼的局部給 藥目的配製。
在根據本發明方法的一個優選實施方式中，局部性給予藥物合成物的劑 量為每次每天1微克至10毫克，優選為50-1000微克。
在根據本發明方法的一個同樣優選的實施方式中，給予藥物合成物的劑 量為每次每千克體重每天0. 1微克至10毫克，例如劑量為每次每天1微克 至1毫克，優選為50-250微克。在根據本發明方法的一個優選實施方式中，每天給予藥物合成物一次或 多次。
具體實施例方式
本發明優選實施方式 實施例1
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對年輕成年兔(New Zealand White, NZW)的晝夜節律進行調節。從而了解 IOP動態，正常兔的IOP在黑暗期開始時增大。在眼球和Tenon囊之間單側 沉積10-50微克AF-16 (SEQ ID NO 1)(溶解在PBS中，添加10%或50%乙醇)， 導致麻醉兔的IOP在2小時內瞬時降低2. 5毫米汞柱，該值藉助TonoPen (Medtronic Inc. ， Minneapolis麗，USA)測得。靜脈內注射染料螢光素 (Sigma-Aldrich， Inc., St. Louis, M0， USA;鈉鹽，溶解在PBS中)，用 手術顯微鏡(配備有裂隙燈裝置)確定示蹤劑的出現。在經過AF-16處理的 眼和只用載劑處理的對照眼之間，對於染料螢光素出現的時間沒有差別。重 復所述過程，證明了相同的結果。用更高劑量(100微克)的AF-16獲得類 似的IOP降低效果。因此得出以下結論AF-16處理顯然不能明顯影響AH 的產生，事實是，對於分別經過AF-16處理和載劑處理的眼，證明所用示蹤 劑螢光素幾乎同時出現。 實施例2
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9顏期間進行光照， 對年輕成年NZW兔的晝夜節律進行調節。從而了解I0P動態。在兩隻麻醉兔 的眼球和Tenon囊之間臨時性地通過注射單側沉積10-50微克AF-16 (溶解 在50或100微升PBS中，添加10%或50%乙醇)，導致I0P在2小時內降低 約2. 5毫米汞柱，該值藉助TonoPer^測得。然後通過睫狀體扁平部在兩兔眼 中注射20或50微升含有3% Evans藍(Merck， Sigma)和2%牛血清蛋白(Sigma) 的PBS溶液，注射位置在眼後房和玻璃體之間的邊界處。用眼科縫線封閉注 射位置以防止回流和漏出。觀察到藍色染料進入眼前房並通過鞏膜上靜脈離 開眼，在經過AF-16預先處理的眼中的速度大於在只經過載劑預先處理的對照眼中的速度。第二天再次重複該試驗，得到相同結果。因此，由通過虹膜
角膜角進入Schlemm管及其連接靜脈的白蛋白-染料-絡合物發現，施用肽 AF-16似乎促進了 AH的外流。 實施例3
根據角膜緣周的(perilimbal)吸杯技術(一種確立和再三公開的方法) 確定麻醉成年兔的AH流動和外流阻力。可以採用其他方法確定這些參數。 從而獲得關於AF-16對AH動態、以及正常動物和試驗性升高了 IOP的動物 的IOP動態的影響的定量值和定性值。對於患有先天性高眼壓的動物，也獲 得這些定量值和定性值。
實施例4
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對年輕成年NZW兔的晝夜節律進行調節。因此，在黑暗期的前幾個小時內， IOP升高若干毫米汞柱。在麻醉兔Tenon囊下方單側注射50-250微升最高為 100微克的AF-16 (溶解在PBS中，添加10%乙醇)，導致I0P在1小時內顯 著降低，降低值最多為5毫米汞柱(相較於對照眼的IOP，對照眼只沉積了 載劑(PBS和10%乙醇))。用AF-16處理之後，IOP的降低持續了至少4個小 時，然後與第二天測得的對照眼的值相等。連續三天對三隻兔子進行重複試 驗，都獲得這些結果。得出以下結論AF-16能使正常眼的IOP有效降低幾 個毫米汞柱，這種效果與目的，對於能夠降低IOP的其他所報導過的藥物獲 得的效果相當。
實施例5
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對年輕成年NZW兔的晝夜節律進行調節。從而了解IOP的晝夜動態。在麻醉 兔的結膜下穹(cul-de-sac)以2分鐘間隔兩次單側沉積25微克AF-16 (共 50微克，溶解在25微升磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中)，導致I0P在1小時後 降低1. 5-2. 5毫米汞柱(相較於對照眼的IOP，對照眼只沉積了載劑PBS)。 用AF-16處理之後，10P的降低持續了至少4個小時，然後與第二天測得的 對照眼的值相等。連續兩天對兩隻兔子進行重複試驗，都獲得這些結果。得 出以下結論在盲管(cul-de-sac)局部沉積AF-16能使正常兔的IOP瞬時降 低。實施例6
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對年輕成年NZW兔的晝夜節律進行調節。從而了解IOP的晝夜動態。在麻醉 兔的下部盲管(cul-de-sac)(結膜下穹)以2分鐘間隔兩次單側沉積50微 克AF-16 (共100微克，溶解在50微升PBS中)，導致I0P在1小時後降低 2-4毫米汞柱(相較於對照眼的IOP，對照眼只沉積了載劑)。用AF-16處理 之後，10P的降低持續了至少4個小時，然後與第二天測得的對照眼的值相 等。連續三天對兩隻兔子進行重複試驗，都獲得這些結果。得出以下結論 用為實施例5中所述劑量兩倍的AF-16局部處理正常眼同樣能瞬時降低IOP， 不會產生明顯的局部或全身性副作用。
實施例7
由Visionar AB， Uppsala, Sweden代表本申請人進行的本實驗的目標 是研究用AF-16局部處理之後，兔眼IOP的動態，並將獲得的效果與使用 藥物Timolol (2.5毫克/毫升；Alcon Sweden AB， Stockholm, Sweden, 已知其能降低高眼壓)的效果、使用載劑PBS的效果進行比較。購買20隻 白化(Albino)雌性NZW兔(體重2. 1-2.4千克)，單籠餵養，隨意進食(Kl， Lactamin， Stockholm, Sweden)和飲水。通過從9 AM至9 PM期間進行光 照，調節日間循環。在長達3周的適應期間，每天都在對兔子角膜施行局部 麻醉之後測量I0P的試驗條件下對兔子進行訓練。
將兔子隨機分成兩組
組l (n=10)。這些兔子的一隻眼中施用兩滴AF-16 (共50微克，在50 微升PBS中)，在對照眼中施用相同體積、2X25微升的載劑PBS。
組2 (n=10)。這些兔子的一隻眼中施用一滴Timolol (50微升；125 微克)，在另一隻眼中施用相同體積的PBS。己知Timolol⑧能降低兔的眼內 壓，從而作為參比用來校驗模型。對各角膜施用一滴Tetrakain Chauvin (Novartis 0phthalmics， Taby， Sweden)施行局部麻醉之後利用TonoPen XL (Medtronic)測量IOP。在最終確定的程序中，安排計劃了這樣的兩個 系列測量。 一個系列是用AF-16和載劑進行局部處理5天之後，另一個系列 是用Timolol⑧或載劑進行局部處理之後。
在第一天的測量中，預計在第五次和第六次測量時能觀察到Timolol 的IOP降低效果，因為估計IOP會因為晝夜循環而升高。在延長期內(兔籠 開始黑暗期之後1、 2、 3.25、 4.25、 5.5、 6.5、 7.75、 9和10小時)進行 最後一天的IOP測量，以確定能夠在延長期內獲得數據。結果列於附圖3中。 5天處理時期開始時的I0P如圖2中所示。在用AF-16進行處理時，沒有觀 察到局部或全身性的副作用或併發症。
由數據可知，AF-16對I0P有降低效果，與只用載劑PBS處理之後測得 的IOP明顯不同。AF-16產生的明顯效果與Timolo^產生的效果相當(圖3)。 得出以下結論這些數據顯示AF-16在降低兔的IOP方面與己知具有這種效 果的常用藥(Timolol )同樣有效。因此，AF-16可能適用於治療人高眼壓。
實施例8
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對兩隻年輕正常成年NZW兔(2.4-2.9千克，雌性)的晝夜節律進行調節。 從而了解I0P的晝夜動態。在麻醉兔的盲管下部(結膜下穹)以2分鐘間隔 兩次單側沉積50或100微克合成六肽CHSKTR (共100-200微克，每次都在 50微升PBS中)，導致IOP在1小時後降低2-3毫米汞柱(相較於對照眼的 IOP，對照眼只沉積了載劑)。用六肽處理之後，10P的降低持續了至少2個 小時，然後與第二天測得的對照眼的值相等。對兩隻兔子進行的試驗都獲得 這些結果。得出以下結論用合成肽(沉積在下部淚囊，具有SEQ ID NO 6 的抗分泌蛋白的部分活性序列CHSKTR (SEQ ID NO 4))局部處理正常眼能降 低I0P。
實施例9
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對兩隻正常年輕成年NZW兔(2.4-2.9千克，雌性)的晝夜節律進行調節。 從而了解IOP的晝夜動態。在麻醉兔Tenon囊下的顳區位置單側注射50或 100微克合成六肽CHSKTR (溶解在100微升PBS中，含有10%乙醇)，導致 IOP在30分鐘後降低2-4毫米汞柱(相較於對照眼的IOP，對照眼只類似地 沉積了載劑)。用六肽處理之後，10P的降低持續了至少2個小時。兩隻兔的 IOP與第二天測得的對照眼的值相等。在之後的兩天進行的試驗都獲得這些 結果。得出以下結論在眼球外部注射試驗物質(合成肽，具有SEQIDN0 6 的抗分泌蛋白的部分活性序列CHSKTR (SEQ ID NO 4))局部處理正常眼能降低I0P，而不會引發任何局部或全身性的副作用。 實施例10
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對年輕成年NZW兔的晝夜節律進行調節。從而了解IOP的晝夜動態。對麻醉 兔靜脈內注射AF-16 (劑量水平為每千克體重50或100或1000微克，溶解 在PBS中，添加有10%乙醇)，導致任一眼的IOP在1小時後降低2-3毫米汞 柱(相較於注射AF-16之前測得的I0P)。用AF-16處理之後，IOP的降低持 續了至少2個小時。這些兔子的左眼和右眼的IOP之間沒有明顯區別。第二 天對任一眼再次測量IOP，測得的值回到接近於前一天進行AF-16處理之前 的值的水平。沒有觀察到明顯的副作用。得出以下結論經過驗證，以每千 克體重50、 100或(更有效的)1000微克的劑量靜脈內注射AF-16導致1 個小時後IOP降低，並且持續幾個小時， 一天時間後IOP回到先前水平。 經過處理的兔子的兩隻眼睛都顯示了相同的AF降低IOP的動態效果。結論 是靜脈內(即全身性地)給予肽AF-16能夠以可接受的程度有效降低IOP， 而不至於引起異常的低IOP。
實施例11
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對年輕成年NZW兔的晝夜節律進行調節。從而了解IOP的晝夜動態。對三隻 麻醉兔鼻內沉積AF-16 (劑量水平為每千克體重50或100或1000微克，溶 解在PBS中)，導致任一眼的IOP在1小時後降低至少2毫米汞柱(相較於 在鼻孔中沉積AF-16之前測得的IOP)。用高劑量AF-16處理之後，IOP的降 低持續了 2和3個小時(進行研究的期間)。同一兔子的左眼和右眼的IOP 之間沒有明顯區別。第二天對任一眼再次測量IOP，證明測得的值回到接近 於前一天進行AF-16處理之前的值的水平。沒有觀察到明顯的副作用。得出 以下結論經過驗證，以每千克體重高達1000微克的劑量鼻內注射AF-16 導致1個小時後IOP降低，並且持續至少3個小時， 一天時間後IOP回到 先前水平。每隻兔子的每隻眼睛都顯示了相同的眼內壓動態效果。沒有觀察 到局部或全身性的副作用。
實施例12
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9細期間進行光照，對年輕成年NZW兔的晝夜節律進行調節。從而了解IOP的晝夜動態。在一般 麻醉的兔的胃中沉積10克富含AF-蛋白的凍幹蛋黃(Salovum ，溶解在稀 釋的市售橘汁中)。這樣胃內沉積AF蛋白導致任一眼的IOP在1小時後發生 降低(相較於沉積Salovum 之前測得的IOP)。兔子的左眼和右眼的I0P之 間沒有區別。第二天對任一眼再次測量IOP，測得的值回到接近於前一天進 行AF-16處理之前的值的水平。沒有明顯觀察到可能存在的副作用。得出以 下結論經過驗證，口服攝入富含抗分泌蛋白的蛋黃(例如Salovum )導 致約1個小時後IOP降低，並且持續幾個小時， 一天時間後IOP回到先前水 平。兩隻眼睛都顯示了相同的IOP動態效果。 實施例13
麻醉一隻單側輕微牛眼病(左眼球腫大)的年輕成年NZW兔，藉助 TonoPei^眼壓計測量IOP。重複測得，患有牛眼病的眼的IOP為30-32毫米 汞柱，而正常對照眼為11-12毫米汞柱。在麻醉兔的Tenon囊下部臨時性地 單側注射50微克AF-16 (在100微升PBS中，含有10%乙醇)，導致I0P在1 小時內降低14-16毫米汞柱。向對照眼注射相同量AF-16導致僅降低約2毫 米汞柱(用TonoPei^測得)。左側患有牛眼病的眼的I0P在第二天增加到略 高於30毫米汞柱，即回到其初始水平。再次注射AF-16導致2小時後IOP 再次降至15-16毫米滎柱，而相同劑量的AF-16僅使右眼IOP降低1-2毫米 汞柱。沒有觀察到負面反應。因此得出以下結論在患有牛眼病的眼中通過 在眼球處注射進行局部沉積能夠瞬時降低高眼內壓值至正常水平。
實施例14
通過從9 AM至9 PM期間暴露於黑暗中、從9 PM至9 AM期間進行光照， 對年輕成年NZW兔的晝夜節律進行調節。使IOP的動態與IOP的晝夜變化同 步。如科學醫療國際期刊的近期出版物中所述(KraveU， Ho jer S & Hansson H.A.， European J Neuroscience， 21， 2867-2882， 2005)，目前的研究已 經揭示，使這些兔子接觸弧矢光旋轉加速脈衝會傷害眼睛還會導致瀰漫性腦 損傷。使麻醉兔的頭部接觸強度高達200krad/s2的、從眼前房到眼後房或從 眼後房到眼前房的弧矢光旋轉加速脈衝導致對眼睛施加機械變形和作用力 負荷。在以後的30分鐘期間，麻醉兔的IOP增大至35-40毫米汞柱(用 TonoPen⑧眼壓計測得)並保持該升高水平長達幾個小時。在Tenon囊和眼顳區鞏膜之間通過注射AF-16溶液(100微升PBS，含有10%乙醇)以每千克體 重100微克的劑量沉積AF-16,在進行弧矢光旋轉加速衝擊10-30分鐘之後， l個小時之內，IOP大致回到正常水平。對照眼(沒有接受任何AF-16處理) 的I0P保持升高的水平。
使兔子接觸這種弧矢光旋轉加速脈衝導致例如神經細胞和血管細胞發 生廣泛的細胞骨架變化(Hamberger等，2003)。以前使豬腦接觸高能負荷的 試驗也證明了相同的情況(Suneson等，1990)。因此得出以下結論旋轉加 速傷害引起小梁網和Schlemm管中細胞的膜和細胞骨架發生變化，導致對來 自眼前房的AH的外流產生瞬時削弱影響，使I0P瞬時升高。用肽AF-16進 行局部處理似乎能改善這種升高的IOP。
實施例15
單側切除鼠的4條鞏膜上靜脈中的3條。這樣，來自手術眼前房部分的 靜脈血只能通過一條靜脈流出。這種處理會在幾周內導致手術眼的IOP升高。 用AF-16的PBS溶液對IOP升高的眼進行局部處理和/或全身性處理，確定 這種用AF-16進行的處理是否能使IOP正常化。由這些結果可以計算AH形 成速率以及外流性質，從而可以使AF-16的作用位置定位於AH流過眼睛的 路徑中。
實施例16
在其他鼠的顳區鞏膜上靜脈中注射高滲鹽水，瞬時切斷其他3條鞏膜上 靜脈中的血流。這種處理會在幾周內導致經過處理的眼的IOP升高，依據 Morrison等人在文獻中已經描述了的情況。用AF-16的PBS溶液對IOP升高 的眼進行局部和/或全身性處理，以確定這種用AF-16進行的處理是否使IOP 正常化。由這些結果可以計算AH的形成速率和外流性質，從而可以使AF-16 的作用位置定位於AH流過眼睛的路徑中。
實施例17
培養一些高眼壓發病率較高的嚙齒類動物，其中一些是轉基因的。評價 局部和/或全身性施用AF-16對IOP的效果。由這些結果可以計算AH的形成 速率和外流性質，從而可以使AF-16的作用位置定位於AH流過眼睛的路徑 中。通過使用這些動物進行的試驗建立評價以治療高眼壓為目的的藥物的標 準方法。總結和結論
所述實驗以不同程度揭示用抗分泌因子進行處理可以使哺乳動物眼睛 的升高的眼內壓降低並且甚至正常化。這顯示了包含抗分泌因子、蛋白、肽、 同系物和片段的實用藥物在控制高眼壓病人的升高的IOP的醫療實踐中的應
用。通過實驗揭示抗分泌因子AF-16能有效地使I0P升高的眼的眼壓正常 化。AF-16的主要效果通過其促進房水外流的能力而產生。因此得出以下結 論已經揭示AF-16能夠通過促進AH流過小梁網和Schlemm管中的細胞而 使高眼壓降低並正常化。參考文獻
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19. WO 97/08202 20: WO 98/21978 21. US 6344440
權利要求
1. 抗分泌蛋白，其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/或片段，和/或其藥物學可接受鹽，對於製造用於防止和/或治療高眼壓的藥物合成物的應用。
2. 如權利要求1所述的應用，其所述抗分泌蛋白由根據下式的序列組成XI-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5其中，X1是I、 SEQ ID N0 6的胺基酸1-35、或預設，X2是H、 R或K， X3是S或L， X4是T或A， X5是SEQIDN0 6的胺基酸43-46、 43-51、 43-80 或43-163、或預設。
3. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述抗分泌蛋白是具有如 SEQ ID NO 6中所示胺基酸序列的蛋白質、其包含SEQ ID NO 6的胺基酸38_42 的同系物、衍生物和/或片段。
4. 如權利要求l所述的應用，其特徵在於，所述片段包含如SEQ ID NO 1中所示胺基酸序列。
5. 如權利要求l所述的應用，其特徵在於，所述片段包含如SEQ ID NO 2中所示胺基酸序列。
6. 如權利要求l所述的應用，其特徵在於，所述片段包含如SEQ ID NO 3中所示胺基酸序列。
7. 如權利要求l所述的應用，其特徵在於，所述片段包含如SEQ ID NO 4中所示胺基酸序列。
8. 如權利要求l所述的應用，其特徵在於，所述片段包含如SEQ ID NO 5中所示胺基酸序列。
9. 如以上任一項權利要求所述的應用，其特徵在於，所述藥物合成物 包含如權利要求1-8中所述片段中的兩種或更多種。
10. 如權利要求l-9中所述的應用，其特徵在於，所述眼內壓等於或大 於22毫米汞柱。
11. 如權利要求l-9中所述的應用，其特徵在於，所述眼內壓為22-30毫米汞柱。
12. 如權利要求l-9中所述的應用，其特徵在於，所述眼內壓力為正常 或較低。
13. 如權利要求1-12中所述的應用，其特徵在於，所述抗分泌蛋白在 富含這種抗分泌蛋白的蛋黃中提供，在所述蛋黃中提供的所述抗分泌蛋白的 濃度優選至少為1000FIL單位/毫升。
14. 如以上任一項權利要求所述的應用，其特徵在於，所述高眼壓由來 自眼前房的房水外流受到阻力引起。
15. 如權利要求14所述的應用，其特徵在於，所述藥物合成物降低了 來自眼前房的房水外流通過小梁網和Schlemm管時的阻力。
16. 如以上任一項權利要求所述的應用，其特徵在於，所述不正常的眼 內壓由眼中房水的形成受到擾動而引起。
17. 如以上任一項權利要求所述的應用，其特徵在於，所述藥物合成物 進一步包含藥物學可接受的賦形劑。
18. 如以上任一項權利要求所述的應用，其特徵在於，所述藥物合成物 針對局部、眼內、鼻內、口服、皮下、經皮、黏膜和/或全身性給藥的目的 配製。
19. 如以上任一項權利要求所述的應用，其特徵在於，所述藥物合成物 針對作為噴霧、氣溶膠通過噴霧器或通過吸入器給藥的目的配製。
20. 如權利要求1-19中所述的應用，其特徵在於，所述藥物合成物全 身性給藥至血液的劑量為每次每千克體重每天0. 1微克至10毫克，優選為 1-1000微克。
21. 如權利要求1-20中所述的應用，其藥物合成物針對局部給藥至眼 睛的目的配製。
22. 如權利要求21所述的應用，其藥物合成物給藥劑量為每次每天1 微克至10毫克，優選為50-1000微克。
23. 如以上任一項權利要求所述的應用，其特徵在於，所述藥物合成物 每天一次或多次給藥。
24. 抗分泌蛋白，其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/或片段，和/ 或其藥物學可接受鹽，對於製造用於眼內給藥的藥物合成物的應用。
25. 如SEQ ID NO 4中所示的肽或其同系物、衍生物和/或片段。
26. 如權利要求25所述的肽的醫療應用。
27. 如SEQ ID NO 5中所示的肽或其同系物、衍生物和/或片段。
28. 如權利要求27所述的肽的醫療應用。
全文摘要
本發明涉及抗分泌因子(如抗分泌蛋白，其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/或片斷)對於製造用於治療和/或防止高眼壓的藥物合成物的應用。因此，本發明涉及包含抗分泌因子的藥物合成物對於治療和/或防止高眼壓的應用，這種應用的優選特徵是，導致眼內壓升高的體液外流受到抑制。本發明提供了用於治療和/或防止這種病症、調節眼內壓至可接受水平(任選等於或小於21毫米汞柱)的新穎途徑。
文檔編號A61K38/17GK101432013SQ200780014996
公開日2009年5月13日 申請日期2007年4月27日 優先權日2006年4月27日
發明者埃娃·延尼斯歇, 斯特凡·朗厄, 漢斯阿爾內·漢松 申請人:蘭特門內阿斯-法克託爾公司