一種治療腦血管疾病的注射乳劑及其製備工藝的製作方法

2023-12-05 18:28:56

專利名稱：一種治療腦血管疾病的注射乳劑及其製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種銀杏內酯，特別涉及一種用特殊方法製備的銀杏內酯；本發明的還涉及一種藥物製劑，特別涉及一種治療缺血性腦血管疾病的銀杏內酯所製成的注射乳劑及其製備工藝。
背景技術：
銀杏內酯是銀杏葉中的有效部位之一，主要由白果內酯(Bilobalid)、銀杏內酯A(Ginkgolides A)、銀杏內酯B(Ginkgolides B)、銀杏內酯C(Ginkgolides C)和銀杏內酯J(Ginkgolides J)等組成。銀杏內酯是很強的血小板活化因子(PAF)的抑制劑，可抑制因缺血所致的各類異常炎性反應及栓塞的形成，抑制自由基的釋放，從而保護腦組織免受損傷，其中的白果內酯可以加強神經細胞中多種神經生長因子的功能，從而保護神經細胞免受缺血性損傷。銀杏內酯可用於多種疾病的治療，特別是在治療缺血性腦血管疾病方面有很好的療效。
銀杏內酯屬於萜類內酯類成分，極性小，水溶性差，將其做成傳統的注射液過程中發現該注射液澄明度較差，放置一段時間後易析出晶體，穩定性不易達到注射劑的要求。目前銀杏內酯注射劑的製備工藝，以葡鉀胺為助溶劑，則銀杏內酯不是很穩定，內酯環容易開環；以羥丙基-β-環糊精做為注射劑增溶劑，它的安全性目前還沒有確切的結論。
乳劑是互不相溶的兩相液體混合形成的非均勻相液體分散體系。乳劑液滴大小一般小於1微米，分散度很大，藥物吸收和藥效的發揮很快，有利於提高生物利用度。脂溶性藥物製成乳劑能解決藥物溶解性問題，保證製劑質量，並能提供一定營養能量。

發明內容
本發明目的在於提供一種銀杏內酯及其製備方法；本發明另一目的在於提供該銀杏內酯的指紋圖譜質量檢測方法；本發明的另一目的還在於提供一種銀杏內酯注射乳劑及其製備方法。
本發明目的是通過如下技術方案實現的本發明銀杏內酯的製備方法可以是如下方法之一以銀杏葉為起始原料將銀杏葉粗粉用75～95％乙醇溶液回流提取3次，每次0.5～1小時，第一次乙醇溶液用量為原生藥量的8～12倍，第二次和第三次分別為6～10倍和4～8倍，合併提取液，濃縮至約每1ml含生藥0.5～1.5g，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用0.5～2％的碳酸鈉或碳酸氫鈉溶液洗滌1～3次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品；銀杏內酯粗品用40～60％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用30～50％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加1～5％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用25～45％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用20～40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用10～30％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V；將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯；或以常規銀杏葉提取物為起始原料將銀杏葉提取物用3～10倍量的水加熱溶解，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用0.5～2％的碳酸鈉或碳酸氫鈉溶液洗滌1～3次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品；銀杏內酯粗品用40～60％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用30～50％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加1～5％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用25～45％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用20～40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用10～30％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V；將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯。
本發明銀杏內酯的優選製備方法如下以銀杏葉為起始原料取銀杏葉粗粉用85％乙醇溶液回流提取3次，每次1小時，第一次乙醇溶液用量為原生藥量的10倍，第二次和第三次分別為8倍和6倍，合併提取液，濃縮至約每1ml含生藥1.0g，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用1.5％的碳酸鈉溶液洗滌2次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品；銀杏內酯粗品用50％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加3％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用35％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用30％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用20％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V，將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯；或以常規銀杏葉提取物為起始原料取銀杏葉提取物用5倍量的水加熱溶解，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用1％的碳酸氫鈉溶液洗滌2次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品，銀杏內酯粗品用42％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用45％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加1.5％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用25％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用25％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V；將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯。
本發明銀杏內酯中白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C加起來所佔的質量分數大於80％；銀杏內酯中主要活性成分白果內酯和銀杏內酯B所佔的質量分數分別大於25％和大於10％。用常規方法純化銀杏內酯時白果內酯損失很大。
本發明銀杏內酯的指紋圖譜的質量檢測方法包括如下步驟照高效液相色譜法測定，《中華人民共和國藥典》一部附錄VI D；色譜條件與系統適應性試驗，色譜柱美國Alltech Platinum ODS，4.6mm×250mm，5μm；流動相水-甲醇-四氫呋喃為65∶25∶10；流速1ml/min；進樣量20μl；ELSD2000檢測器，漂移管溫度105℃，載氣流速3.00L/min，柱溫40℃；參照物溶液的製備，精密稱取白果內酯對照品25mg，置50ml量瓶中，加甲醇10ml超聲溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取3.0ml於10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的製備，取銀杏內酯6mg精密稱定，加甲醇1ml使溶解，然後加流動相稀釋至10ml，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得；測定法，分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至1小時；本發明銀杏內酯供試品指紋圖譜應與銀杏內酯對照指紋圖譜有良好的相似性，相似度≥0.90；銀杏內酯含有萜類內酯≥80％，其HPLC高效液相色譜指紋圖譜包括5個共有峰，1號峰為銀杏內酯J、2號峰為銀杏內酯C、S峰為白果內酯、3號峰為銀杏內酯A、4號峰為銀杏內酯B，5個共有指紋峰的相對保留時間分別為1號峰0.73～0.89，2號峰0.80～0.98，S峰1.00，3號峰1.02～1.24，4號峰1.17～1.43；其中，5個共有指紋峰的優選相對保留時間分別為1號峰0.81，2號峰0.89，S號峰1.00，3號峰1.13，4號峰1.30；1號峰0.74，2號峰0.97，S號峰1.00，3號峰1.03，4號峰1.42或1號峰0.88，2號峰0.93，S號峰1.00，3號峰1.23，4號峰1.127；共有指紋峰的相對峰面積分別為2號峰0.194～0.323，S號峰1.000，3號峰0.719～1.078，4號峰0.229～0.382；其中，共有指紋峰的優選相對峰面積分別為2號峰0.258，S號峰1.000，3號峰0.898，4號峰0.305；2號峰0.195，S號峰1.000，3號峰1.077，4號峰0.230或2號峰0.322，S號峰1.000，3號峰0.720，4號峰0.381。
上述本發明銀杏內酯可以製成注射乳劑，該注射乳劑的組份為
銀杏內酯 0.04～25重量份 油 脂 100～300重量份乳 化 劑 5～30重量份 穩定劑 0.5～5重量份等滲調節劑20～50重量份助溶劑與增溶劑 3～25重量份。
上述原料優選重量配比如下銀杏內酯 24重量份 大豆油 200重量份大豆卵磷脂20重量份油酸 0.5重量份甘 油 25重量份；銀杏內酯 0.2重量份棉籽油 150重量份蛋黃卵磷脂12重量份膽酸 1重量份 甘 油 25重量份；銀杏內酯 20重量份 棉籽油 110重量份大豆卵磷脂10重量份油酸 1重量份 山梨醇 50重量份 丙二醇3重量份；銀杏內酯 7.5重量份大豆油 300重量份蛋黃卵磷脂15重量份油 酸 鈉 0.8重量份山梨醇 45重量份 丙二醇5重量份；銀杏內酯 0.05重量份 大豆油 290重量份大豆卵磷脂6重量份油酸 4.8重量份山梨醇 22重量份 丙二醇20重量份或銀杏內酯 24重量份 棉籽油 110重量份蛋黃卵磷脂28重量份膽酸 0.6重量份甘油 70重量份。
上述本發明銀杏內酯製成的注射乳劑原料中所述的油脂選自大豆油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油、茶油、菜子油或橄欖油，優選大豆油、棉籽油；乳化劑選自大豆磷脂、氫化大豆磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、卵磷脂、羥基卵磷脂、聚山梨酯、聚氧乙烯脂肪醇醚或泊洛沙姆，優選蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂；穩定劑選自膽酸、膽鹽、脫氧膽酸、脫氧膽鹽、油酸、油酸鈉、聚氧乙烯蓖麻油、聚乙二醇或泊洛沙姆，優選油酸、油酸鈉、膽酸；等滲調節劑選自甘油、丙二醇、山梨醇、氯化鈉或葡萄糖，優選甘油、山梨醇；助溶劑與增溶劑選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、聚氧乙烯蓖麻油或泊洛沙姆，優選甘油、丙二醇。
本發明銀杏內酯製成的注射乳劑的具體製備工藝如下取銀杏內酯、助溶和增溶劑，混勻，溶解，再加入油脂，混勻，加熱至55～85℃，作為油相；將乳化劑、穩定劑、等滲調節劑置高速攪拌機中，加入55～85℃注射用水800重量份，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌10～20分鐘，即得到初乳液；用pH調節劑將初乳液調pH為6.0～9.0，加注射用水至1000重量份，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3～6次，至滴粒粒徑小於5μm，且90％的滴粒粒徑為0.1～1μm，微孔濾膜濾過，灌裝，滅菌，即得本發明藥物組合物注射乳劑；上述pH調節劑選自鹽酸、磷酸、枸櫞酸、冰醋酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀，優選鹽酸、氫氧化鈉。
本發明銀杏內酯製成的注射乳劑的優選製備工藝如下取銀杏內酯、助溶和增溶劑，混勻，溶解，再加入油脂，混勻，加熱至70℃，作為油相；將乳化劑、穩定劑、等滲調節劑置高速攪拌機中，加入70℃注射用水800重量份，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌15分鐘，即得到初乳液；用1％氫氧化鈉溶液將初乳液調pH為7.0，加注射用水至1000重量份，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3次，至滴粒粒徑小於1微米，微孔濾膜濾過，灌裝，滅菌，即得。
本發明銀杏內酯注射乳劑中銀杏內酯的每次用量在10～50mg，製劑規格可以是2ml/支、5ml/支、10ml/支，也可以是100ml/瓶、250ml/瓶等，銀杏內酯的含量範圍是10mg/250ml～50mg/2ml，即0.04～25mg/ml。
銀杏內酯是以銀杏葉或銀杏葉提取物為原料精製而來，並建立了銀杏內酯的指紋圖譜，能很好的控制該藥品質量，保證臨床療效。本發明銀杏內酯製成的注射乳劑穩定性好，粒徑小。該乳劑具有活血化瘀通絡，拮抗PAF(血小板活化因子)、抗血小板聚集、溶栓等作用；用於缺血性腦血管疾病的治療，如腦缺血、腦血管痙攣、腦栓塞和血管性痴呆等。同時根據毒性實驗表明本發明銀杏內酯注射乳劑無明顯的不良反應，副作用少，使用安全。
下述實驗例和實施例用於進一步說明但不限於本發明。
實驗例1藥效學實驗1抗血小板聚集實驗取健康家兔24隻，體重2～3kg，隨機分成4組，即空白組、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg的本發明銀杏內酯注射乳劑組，每組6隻。以上各組均以5.3ml/kg體重經耳緣靜脈注射給藥。給藥前取血一次，給藥後10、30、60、90和120min分別取血，製備富血小板血漿和貧血小板血漿，觀察藥物靜脈注射後對抗血小板活化因子(PAF)誘導血小板聚集功能的影響。
實驗結果表明，銀杏內酯注射乳劑靜脈注射後，劑量為4.0mg/kg時，在注射後30min和60min明顯抑制PAF引起的血小板聚集；劑量為8.0mg/kg時，在注射後10min起效，於60min達到最大抑制作用，抗PAF作用持續至90min，結果見表1。
表1銀杏內酯注射乳劑對PAF誘導的血小板聚集功能的影響

2溶栓實驗血栓模型製備取雄性SD大鼠40隻，體重240～280g，隨機分為4組，每組，即空白組、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg的本發明銀杏內酯注射乳劑組，每組10隻，用改良Charlton等方法製備血栓模型，以血流量降低為刺激前的50％作為血栓形成。
血栓活性的測定根據Tomihisa等方法，以刺激結束後至血流量降低為刺激前的50％所需的時間定為血栓形成時間。形成血栓後20min，上述各組均經股靜脈一次性注射，觀察給藥後1小時內血管再通情況。
實驗結果表明，2.0mg/kg本發明銀杏內酯注射乳劑組的血栓血管與空白組相似，均無一再通；4.0mg/kg、8.0mg/kg本發明銀杏內酯注射乳劑組血管再通率分別為30％、60％；4.0mg/kg本發明銀杏內酯注射乳劑組的血管再栓率為66.7％，8.0mg/kg本發明銀杏內酯注射乳劑組的再栓率為50％。再通後1小時內，血管開放狀態表現為，空白組均持續栓塞；8.0mg/kg的本發明銀杏內酯注射乳劑組血管開放狀態良好，結果見表2。
表2銀杏內酯注射乳劑對動脈血栓的溶栓作用

實驗例2毒性實驗1急性毒性實驗取體重18~22克的昆明種小鼠20隻，體重100-120克的SD大鼠20隻，雄雌各半，尾靜脈注射本發明藥物組合物注射乳劑50mg/ml，給藥量分別為0.5ml/20g體重和1ml/100g體重，給藥後連續觀察兩周，測得本發明藥物組合物注射乳劑的LD50大於0.6g/kg，相當於臨床擬推薦劑量的600倍。
2長期毒性實驗取SD大鼠120隻隨機分成4組大劑量組、中劑量組、低劑量組、陰性對照組，每組30隻。給藥各組分別ip24mg/kg/day(低劑量組)、60mg/kg/day(中劑量組)、150mg/kg/day(高劑量組)，每天一次，連續8周。經血液、生化、病理組織檢查，動物未見明顯的毒副反應，表明本發明藥物組合物注射乳劑無明顯的不良反應，副作用少，使用安全。
實驗例3安全性實驗1、刺激性實驗取家兔採用肌內注射和耳緣靜脈滴注給藥的途徑，觀察銀杏內酯注射乳劑對其產生的刺激性作用。結果銀杏內注射乳劑經家兔肌內注射和耳緣靜脈滴注給藥，未見刺激性反應。
2、過敏性實驗取豚鼠進行銀杏內酯注射乳劑的全身過敏試驗，結果表明銀杏內酯注射乳劑重複給藥不引起豚鼠的全身過敏性反應。
3、溶血實驗取家兔心臟血進行銀杏內酯注射乳劑的溶血試驗，結果銀杏內酯注射乳劑溶血試驗合格，可供注射用。
實驗例4穩定性實驗取本發明銀杏內酯注射乳劑與銀杏內酯葡萄糖注射液進行穩定性的對比實驗。
將本發明銀杏內酯注射乳劑放置於20±2℃的恆溫中3個月，放置之前進行樣品檢測，銀杏內酯注射乳劑沒有分層現象，粒徑均沒有大於5μm，90％小於1μm，檢驗合格；銀杏內酯葡萄糖注射液為無色澄明液體，沒有可見異物，檢驗合格。放置3個月後再取樣檢測，結果後銀杏內酯注射乳劑沒有分層現象，粒徑檢查合格率為95.2％，質量穩定；銀杏內酯葡萄糖注射液為無色澄明液體，可見異物的燈檢合格率為65.8％，析出白點較多，不溶性微粒合格率為50.7％，質量不穩定。
實驗結果表明本發明銀杏內酯注射乳劑穩定性好。


圖1銀杏內酯對照指紋圖譜。
下述實施例均能實現上述實驗例所述的效果。
具體實施例方式實施例1銀杏內酯製備方法取銀杏葉粗粉用85％乙醇溶液回流提取3次，每次1小時，第一次乙醇溶液用量為原生藥量的10倍，第二次和第三次分別為8倍和6倍，合併提取液，濃縮至約每1ml含生藥1.0g，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用1.5％的碳酸鈉溶液洗滌2次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品；銀杏內酯粗品用50％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加3％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用35％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用30％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用20％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V，將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯。
實施例2銀杏內酯製備方法取常規銀杏葉提取物用5倍量的水加熱溶解，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用1％的碳酸氫鈉溶液洗滌2次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品，銀杏內酯粗品用42％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用45％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加1.5％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用25％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用25％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V；將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯。
實施例3銀杏內酯的指紋圖譜的質量檢測方法取實施例1所製備的銀杏內酯，照高效液相色譜法測定，《中華人民共和國藥典》一部附錄VI D；色譜條件與系統適應性試驗，色譜柱美國Alltech Platinum ODS，4.6mm×250mm，5μm；流動相水-甲醇-四氫呋喃為65∶25∶10；流速1ml/min；進樣量20μl；ELSD2000檢測器，漂移管溫度105℃，載氣流速3.00L/min，柱溫40℃；參照物溶液的製備，精密稱取白果內酯對照品約25mg，置50ml量瓶中，加甲醇10ml超聲溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取3.0ml於10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的製備，取銀杏內酯6mg精密稱定，加甲醇1ml使溶解，然後加流動相稀釋至10ml，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得；測定法，分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至1小時。
銀杏內酯供試品指紋圖譜應與銀杏內酯對照指紋圖譜有良好的相似性，相似度≥0.90；銀杏內酯HPLC高效液相色譜指紋圖譜包括5個共有峰，1號峰為銀杏內酯J、2號峰為銀杏內酯C、S峰為白果內酯，3號峰為銀杏內酯A，4號峰為銀杏內酯B。實施例1所製備的銀杏內酯的5個共有指紋峰的相對保留時間分別為1號峰0.81，2號峰0.89，S號峰1.00，3號峰1.13，4號峰1.30；共有指紋峰的相對峰面積分別為2號峰0.258，S號峰1.000，3號峰0.898，4號峰0.305。
實施例4銀杏內酯的指紋圖譜的質量檢測方法取實施例2所製備的銀杏內酯，按照實施例3的檢測方法，測定其指紋峰保留時間及面積，其中5個共有指紋峰的相對保留時間分別為1號峰0.74，2號峰0.97，S號峰1.00，3號峰1.03，4號峰1.42；共有指紋峰的相對峰面積分別為2號峰0.195，S號峰1.000，3號峰1.077，4號峰0.230。
實施例5銀杏內酯注射乳劑製備方法取實施例1製成的銀杏內酯25g，並取大豆油200g，大豆卵磷脂20g，油酸0.5g，甘油25g。
製備方法取銀杏內酯、甘油，混勻，溶解，再加入大豆油，混勻，加熱至65℃，作為油相；將大豆卵磷脂、油酸置高速攪拌機中，加入65℃注射用水800ml，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌15分鐘，即得到初乳液；用1％氫氧化鈉溶液將初乳液調pH為8.0，加注射用水至1000ml，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3次，至滴粒粒徑小於1微米，微孔濾膜濾過，分裝，封口，121℃下滅菌15分鐘，即得。
實施例6銀杏內酯注射乳劑製備方法取實施例2製成的銀杏內酯0.2g，並取棉籽油150g，蛋黃卵磷脂12g，膽酸1g，甘油25g。
製備方法取銀杏內酯、膽酸、甘油，混勻，溶解，再加入棉籽油，混勻，加熱至80℃，作為油相；將蛋黃卵磷脂置高速攪拌機中，加入80℃注射用水800ml，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌12分鐘，即得到初乳液；用1％氫氧化鈉溶液將初乳液調pH為8.5，加注射用水至1000ml，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3次，至滴粒粒徑小於1微米，微孔濾膜濾過，取樣進行檢驗，合格後分裝於100ml輸液瓶中，扎蓋，121℃下滅菌15分鐘，即得。
實施例7銀杏內酯注射乳劑製備方法取實施例2製成的銀杏內酯20g，並取棉籽油110g，大豆卵磷脂15g，油酸1g，山梨醇50g，丙二醇3g。
製備方法取銀杏內酯、山梨醇、丙二醇，混勻，再加入棉籽油，混勻，溶解，加熱至60℃，作為油相；將大豆卵磷脂、油酸置高速攪拌機中，加入60℃注射用水800ml，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌18分鐘，即得到初乳液；用1％鹽酸溶液將初乳液調pH為6.0，加注射用水至1000ml，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3次，至滴粒粒徑小於1微米，微孔濾膜濾過，分裝於1ml安培中，封口，121℃下滅菌15分鐘，即得。
實施例8銀杏內酯注射乳劑製備方法取實施例1製成的銀杏內酯7.5g，並取大豆油200g，蛋黃卵磷脂15g，油酸鈉0.8g，山梨醇45g，丙二醇5g。
製備方法取銀杏內酯、油酸鈉，混勻，溶解，再加入大豆油，混勻，加熱至70℃，作為油相；將蛋黃卵磷脂、山梨醇、丙二醇置高速攪拌機中，加入70℃注射用水800ml，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌15分鐘，即得到初乳液；用1％氫氧化鈉溶液將初乳液調pH為7.0，加注射用水至1000ml，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3次，至滴粒粒徑小於1微米，微孔濾膜濾過，分裝於2ml安培中，封口，121℃下滅菌15分鐘，即得。
實施例9銀杏內酯注射乳劑製備方法取實施例1製成的銀杏內酯0.05g，並取大豆油290g，大豆卵磷脂6g，油酸4.8g，山梨醇22g，丙二醇20g。
製備方法取銀杏內酯、甘油，混勻，溶解，再加入大豆油，混勻，加熱至65℃，作為油相；將大豆卵磷脂、油酸置高速攪拌機中，加入65℃注射用水800ml，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌15分鐘，即得到初乳液；用1％氫氧化鈉溶液將初乳液調pH為8.0，加注射用水至1000ml，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3次，至滴粒粒徑小於1微米，微孔濾膜濾過，分裝，封口，121℃下滅菌15分鐘，即得。
實施例10銀杏內酯注射乳劑製備方法取實施例2製成的銀杏內酯24g，並取棉籽油110g，蛋黃卵磷脂28g，膽酸0.6g，甘油70g。
製備方法取銀杏內酯、山梨醇、丙二醇，混勻，再加入棉籽油，混勻，溶解，加熱至60℃，作為油相；將大豆卵磷脂、油酸置高速攪拌機中，加入60℃注射用水800ml，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌18分鐘，即得到初乳液；用1％鹽酸溶液將初乳液調pH為6.0，加注射用水至1000ml，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3次，至滴粒粒徑小於1微米，微孔濾膜濾過，分裝於1ml安培中，封口，121℃下滅菌15分鐘，即得。
權利要求
1.一種銀杏內酯，其特徵在於該銀杏內酯由如下方法製成以銀杏葉為起始原料將銀杏葉粗粉用75～95％乙醇溶液回流提取3次，每次0.5～1小時，第一次乙醇溶液用量為原生藥量的8～12倍，第二次和第三次分別為6～10倍和4～8倍，合併提取液，濃縮至約每1ml含生藥0.5～1.5g，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用0.5～2％的碳酸鈉或碳酸氫鈉溶液洗滌1～3次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品；銀杏內酯粗品用40～60％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用30～50％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加1～5％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用25～45％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用20～40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用10～30％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V；將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯；或以常規銀杏葉提取物為起始原料將銀杏葉提取物用3～10倍量的水加熱溶解，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用0.5～2％的碳酸鈉或碳酸氫鈉溶液洗滌1～3次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品；銀杏內酯粗品用40～60％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用30～50％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加1～5％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用25～45％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用20～40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用10～30％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V；將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯。
2.如權利要求1所述的銀杏內酯的製備方法，其特徵在於該方法為以銀杏葉為起始原料取銀杏葉粗粉用85％乙醇溶液回流提取3次，每次1小時，第一次乙醇溶液用量為原生藥量的10倍，第二次和第三次分別為8倍和6倍，合併提取液，濃縮至約每1ml含生藥1.0g，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用1.5％的碳酸鈉溶液洗滌2次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品；銀杏內酯粗品用50％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加3％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用35％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用30％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用20％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V，將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯；或以常規銀杏葉提取物為起始原料取銀杏葉提取物用5倍量的水加熱溶解，用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，萃取液用1％的碳酸氫鈉溶液洗滌2次，合併乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，蒸乾，得到銀杏內酯粗品，銀杏內酯粗品用42％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體I；濾液蒸乾，殘渣用45％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體II；濾液加1.5％的活性炭煮沸30分鐘脫色，過濾，濾液蒸乾，殘渣用40％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體III；濾液蒸乾，殘渣用25％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體IV；濾液蒸乾，殘渣用25％乙醇加熱溶解，過濾，冷卻，讓其結晶，過濾，將結晶用乙醇洗滌，真空乾燥，得到晶體V；將晶體I～V合併，研細，混勻，即得銀杏內酯。
3.如權利要求1所述的銀杏內酯的指紋圖譜的質量檢測方法，其特徵在於該方法為照高效液相色譜法測定，色譜條件與系統適應性試驗，色譜柱美國Alltech Platinum ODS，4.6mm×250mm，5μm；流動相水-甲醇-四氫呋喃為65∶25∶10；流速1ml/min；進樣量20μl；ELSD2000檢測器，漂移管溫度105℃，載氣流速3.00L/min，柱溫40℃；參照物溶液的製備，精密稱取白果內酯對照品25mg，置50ml量瓶中，加甲醇10ml超聲溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取3.0ml於10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得；供試品溶液的製備，取銀杏內酯6mg精密稱定，加甲醇1ml使溶解，然後加流動相稀釋至10ml，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得；測定法，分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至1小時；本發明銀杏內酯供試品指紋圖譜應與銀杏內酯對照指紋圖譜有良好的相似性，相似度≥0.90；銀杏內酯含有萜類內酯≥80％，其HPLC高效液相色譜指紋圖譜包括5個共有峰，1號峰為銀杏內酯J、2號峰為銀杏內酯C、S峰為白果內酯、3號峰為銀杏內酯A、4號峰為銀杏內酯B，5個共有指紋峰的相對保留時間分別為1號峰0.73～0.89，2號峰0.80～0.98，S峰1.00，3號峰1.02～1.24，4號峰1.17～1.43；共有指紋峰的相對峰面積分別為2號峰0.194～0.323，S號峰1.000，3號峰0.719～1.078，4號峰0.229～0.382。
4.如權利要求3所述的銀杏內酯的指紋圖譜的質量檢測方法，其特徵在於該方法中的HPLC高效液相色譜指紋圖譜包括5個共有峰，1號峰為銀杏內酯J、2號峰為銀杏內酯C、S峰為白果內酯、3號峰為銀杏內酯A、4號峰為銀杏內酯B，5個共有指紋峰的相對保留時間分別為1號峰0.81，2號峰0.89，S號峰1.00，3號峰1.13，4號峰1.30；共有指紋峰的相對峰面積分別為2號峰0.258，S號峰1.000，3號峰0.898，4號峰0.305。
5.如權利要求1所述的銀杏內酯製成的注射乳劑，其特徵在於該注射乳劑的組份為銀杏內酯0.04～25重量份油 脂100～300重量份乳化劑5～30重量份 穩定劑0.5～5重量份等滲調節劑20～50重量份 助溶劑與增溶劑3～25重量份。
6.如權利要求5所述的銀杏內酯製成的注射劑，其特徵在於該注射乳劑中所述的油脂為大豆油或棉子油；乳化劑為大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂；穩定劑為油酸、膽酸或油酸鈉；等滲調節劑為甘油或山梨醇；助溶劑與增溶劑為甘油或丙二醇。
7.如權利要求5所述的銀杏內酯製成的注射乳劑，其特徵在於該注射乳劑的組份為銀杏內酯24重量份 大豆油200重量份 大豆卵磷脂20重量份油酸0.5重量份甘 油25重量份。
8.如權利要求5所述的銀杏內酯製成的注射乳劑，其特徵在於該注射乳劑的組份為銀杏內酯0.05重量份 大豆油290重量份 大豆卵磷脂6重量份油酸4.8重量份山梨醇22重量份 丙二醇20重量份。
9.如權利要求5所述的銀杏內酯製成的注射乳劑，其特徵在於該注射乳劑的組份為銀杏內酯24重量份 棉籽油110重量份 蛋黃卵磷脂28重量份膽酸0.6重量份甘 油70重量份。
10.如權利要求5所述的銀杏內酯製成的注射乳劑，其特徵在於該注射乳劑的組份為銀杏內酯7.5重量份 大豆油300重量份 蛋黃卵磷脂15重量份油 酸 鈉0.8重量份 山梨醇45重量份 丙二醇5重量份。
11.如權利要求5、6、7、8、9或10所述的銀杏內酯製成的注射乳劑的製備方法，其特徵在於該方法為取銀杏內酯、助溶和增溶劑，混勻，溶解，再加入油脂，混勻，加熱至55～85℃，作為油相；將乳化劑、穩定劑、等滲調節劑置高速攪拌機中，加入55～85℃注射用水800重量份，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌10～20分鐘，即得到初乳液；用pH調節劑將初乳液調pH為6.0～9.0，加注射用水至1000重量份，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3～6次，至滴粒粒徑小於5μm，且90％的滴粒粒徑為0.1～1μm，微孔濾膜濾過，灌裝，滅菌，即得。
12.如權利要求11所述的銀杏內酯製成的注射乳劑的製備方法，其特徵在於該方法為取銀杏內酯、助溶和增溶劑，混勻，溶解，再加入油脂，混勻，加熱至70℃，作為油相；將乳化劑、穩定劑、等滲調節劑置高速攪拌機中，加入70℃注射用水800重量份，高速攪拌，使溶解，作為水相；在高速攪拌下將油相加入到水相中，繼續攪拌15分鐘，即得到初乳液；用1％氫氧化鈉溶液將初乳液調pH為7.0，加注射用水至1000重量份，轉移至高壓乳勻機中，循環乳化3次，至滴粒粒徑小於1微米，微孔濾膜濾過，灌裝，滅菌，即得。
13.如權利要求11或12所述的銀杏內酯製成的注射乳劑的製備方法，其特徵在於該方法中所述的pH調節劑為鹽酸或氫氧化鈉。
全文摘要
本發明公開一種用特殊方法製備的銀杏內酯及其所製成的注射乳劑及其製備工藝。銀杏內酯可通過銀杏葉或其提取物為原料製備而成；銀杏內酯指紋圖譜的質量檢測方法為以水－甲醇－四氫呋喃為流動相，照高效液相色譜法，進行檢測。該銀杏內酯所製成的注射乳劑以銀杏內酯、油脂、乳化劑、穩定劑、等滲調節劑、助溶劑與增溶劑等組成。其製備工藝為取銀杏內酯、助溶和增溶劑，混勻，溶解，再加入油脂，作為油相；將乳化劑、穩定劑、等滲調節劑攪拌，溶解，作為水相；將油相加入到水相中，攪拌得到初乳液；將初乳液調pH值，加注射用水，循環乳化，濾過，灌裝。本發明還提供該銀杏內酯及其所製成的注射乳劑在製備治療缺血性腦血管疾病藥物中的用途。
文檔編號A61K9/107GK1830981SQ20061006665
公開日2006年9月13日 申請日期2006年4月17日 優先權日2006年4月17日
發明者譚興根, 李轉花, 鮮林, 謝莉, 梁隆, 程志鵬 申請人:四川科倫藥業股份有限公司