一種純化rHSA的方法
2023-12-05 18:22:06 3
專利名稱：一種純化rHSA的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質的純化方法，特別是涉及一種純化rHSA的方法。
背景技術：
人血白蛋白(Human Sorum Albuman，HSA)是血漿中最豐富的蛋白成分，有助於維持血液滲透壓，能結合小分子營養物質和藥物，起著運輸作用。臨床上用於治療低蛋白血症，蛋白缺乏綜合症，創傷及手術後休克及燒傷，肝硬化，腎病綜合症等。還作為其他藥物賦形劑、醫藥器械中管路的塗層、體外授精培養基等。
最早獲得的HSA一直通過血漿分離方法所得。然而該方法具有原材料供應不足，常出現周期性短缺以及攜帶肝炎病毒、HIV病毒的重大缺陷，不僅在生產過程中對操作人員帶來嚴重的危害，而且對廣大患者也存在潛在的危險。
利用重組DNA方法生產重組人血清白蛋白(rHSA)已經得到了開發應用。由於HSA臨床使用劑量高達10克，相對大多數毫克、微克和納克級生物藥物來說，其純度要求高得多，必須充分去除源於宿主細胞的組分。EP0612761、EP0570916和EP0699687均公開了純化rHSA的方法，但這些方法存在周期長，去除異源雜質能力差，收率低等缺陷。
中國發明專利申請(03123502.6)公開了一種純化rHSA的方法，該方法主要包括如下步驟1)將含rHSA的發酵上清在穩定劑或穩定劑、還原劑存在條件下加熱，調節溶液pH4.5；2)將上述溶液直接上樣高鹽陽離子柱吸附，洗脫，進行陽離子交換層析；3)將陽柱洗脫液加熱；4)將上述溶液進行疏水交換層析；5)將經過疏水交換層析的溶液進行弱陰離子交換層析；6)將陰柱洗脫液濃縮、分裝，得到rHSA產品。
其中，在上述方法中常用的高鹽陽離子柱為CST-II FF，疏水層析柱為PhenylSepharose FF，弱陰離子柱為Butyl Sepharose，這些介質均可以購於AMERSHAMBIOSCIENCES公司。與其他方法相比，該方法所純化的重組HSA特徵的顯色物質水平A350/280比值最低可降到0.02-0.04，但其他雜質水平偏高，需要進行進一步優化處理。
發明內容
本發明的目的是提供一種純化rHSA的方法。
本發明所提供的純化rHSA的方法，是將含rHSA的發酵上清依次經過高鹽陽離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其中，所述含rHSA的發酵上清在經過高鹽陽離子交換層析前還經過在穩定劑、脫色劑和蛋白酶抑制劑存在下在60-75℃加熱處理，然後將加熱處理後的溶液調節pH4.0-5.5的步驟；經過所述陽離子交換層析的溶液或經過所述疏水交換層析的溶液還經過硼酸鹽處理。
所述穩定劑為棕櫚酸或辛酸鈉；所述脫色劑為大孔樹脂、硅藻土或活性碳，優選為活性碳；所述蛋白酶抑制劑為PMF、EDTA或EGTA，優選為EDTA。在發酵上清液中，所述穩定劑的加入量為1-10mmol/L，所述脫色劑的加入量為0.1-10g/100ml，所述蛋白酶抑制劑的加入量為0.1-10mmol/L。
對發酵上清液進行加熱處理的時間為10-100分鐘。優選的加熱處理的溫度為72℃，加熱處理的時間為20分鐘。
對發酵液加熱處理結束後，為方便溶液在陽離子交換柱的吸附，加熱處理後的溶液調節pH4.5-5.3；優選為pH5.2。
所述硼酸鹽處理按如下過程進行在溶液中加入氯化鈣和硼酸鹽，調節pH9.0-10，處理5-40小時；所述硼酸鹽為原硼酸或四硼酸鈉，濃度為0.01-1mol/L。
其中，所述硼酸鹽為四硼酸鈉，濃度為0.1mol/L；所述處理時間為12-16小時。
本發明中常用高鹽陽離子交換層析介質為CST-II FF；疏水交換層析介質為PhenylSepharose FF或藍膠Blue Sepharose FF；弱陰離子交換層析介質為AminobutylSepharose FF。這些介質均為Amersham Biosciences公司產品，可以從該公司購買得到。
本發明方法在對rHSA發酵上清液進行加熱處理過程中加入穩定劑、脫色介質和蛋白酶抑制劑，能有效脫除色素，使得純化產品的色素比值(A350/A280)大幅降低，低於0.0015，並保證蛋白在純化過程中的穩定性；在純化過程中增加硼酸鹽脫糖處理步驟，使異源雜質水平降低，產品內毒素水平以鱟試劑檢測低於1.5EU(產品濃度為200mg/ml時)，宿主蛋白含量低於1ng/ml。本發明方法實驗周期短，產品純度高，具有良好的應用前景。
圖1為本發明方法與對照方法各個分離步驟樣品的電泳圖；圖2為純化rHSA的TSK 3000柱純度分析圖譜；
圖3為本發明方法各步分離樣品的SDS-PAGE梯度電泳圖；圖4為血源HSA和rHSA的ES-MS圖譜；圖5為發酵上清液的Superdex 200(XK26/700)分析圖譜。
具體實施例方式
本發明rHSA的純化過程如下為減少熱原物質產生，將rHSA發酵液採用0.22um膜(MILLIPORE公司生產)過濾，然後對其及時加熱以滅活蛋白酶。為了抑制外源色素與目標蛋白的結合，保證蛋白的穩定性，並抑制耐高溫蛋白酶的活性，加熱時加入脫色介質、穩定劑以及酶抑制劑，脫色介質如大孔樹脂、硅藻土、活性炭等，優選活性炭；穩定劑如棕櫚酸、辛酸鈉等，酶抑制劑如PMF、EDTA、EGTA等，優選EDTA。在穩定劑、脫色介質和酶抑制劑同時存在下，調發酵上清液pH 6.0-7.0，然後開始加熱，加熱溫度60-75℃，時間10-100分鐘，優選為72℃、20分鐘，在此過程中蛋白酶被滅活或被抑制。經過加熱的樣品，快速冷卻後，調pH 4.0-5.5，優選4.5-5.3，更優為5.2。
上述樣品無需稀釋可以直接進入高鹽陽離子(HSL型)介質CST-II FF(AMERSHAM BIOSCIENCES公司)進行純化。為更好地去除異源雜質，在進行洗脫前採用高濃度氯化鈉洗滌，鹽濃度為0.5-3mol/L，優選採用含2mol/L氯化鈉的25mol/L的醋酸鈉溶液，然後採用洗脫劑洗脫得到經過陽柱分離的溶液。採用該步CST-II FF純化，可以從上清液中去除了大量的游離色素、糖、核酸、宿主蛋白等外源雜質。
經過陽柱分離的溶液加入穩定劑如辛酸鹽和還原劑如半胱氨酸、谷光肝肽等，在50-80℃加熱處理10-100分鐘，優選為60分鐘。冷卻後用於疏水交換層析。
將上述經過處理的溶液採用Phenyl Sepharose FF或藍膠Blue Sepharose FF(發瑪西亞公司產品)進行疏水交換層析，目標蛋白在層析柱上流穿，而外源色素的45kd降解片段被吸附，從而得到分離。
為了進一步降低糖含量，對上述經過疏水交換層析分離的溶液用硼酸鹽處理可採用原硼酸或四硼酸鈉，優選四硼酸鈉和氯化鈣，濃度在0.01-1mol/L，優選0.1mol/L，pH9.0-10，作用時間為5-40小時，優選為12-16小時。該步硼酸鹽處理也可以用於處理經過陽柱分離的溶液，從而提前到疏水交換層析之前進行，也能達到相同的效果。
將經過疏水交換層析的樣品經0.22um膜過濾後進入一種弱陰離子介質Aminobutyl Sepharose FF(AMERSHAM BIOSCIENCES公司)中進行精製分離，可使外源雜質成分得到更大幅度減少。
最後，弱陰離子層析的洗脫組分用已知方法，如超濾濃縮方法、冷凍乾燥方法等製成各種成品。
具體的，rHSA的生產和純化操作如下一、rHSA的發酵生產所用的培養菌株為巴斯德畢式酵母HSA75-10(菌種保藏號CGMCC NO.1360)所用培養基的組成1、種子培養基含有2％的細菌腖、1％的酵母抽提物、2％的甘油，其餘為水。
2、批次發酵培養基成分/L甘油50.0gH3PO4(85％) 14.0mlCaSO4.2H2O 0.6gK2SO49.5gMgSO4.7H2O 7.8gKOH 2.6g0.2g/l生物素(Biotin)溶液1.6mlYTB溶液 2ml(YTB溶液每升中含FeSO4.7H2O 65.0g，CuSO4.5H2O 6.0g，ZnSO4.7H2O 20.0g，MnSO4.5H2O 3.0g，H2SO45.0ml)所用補料甘油或甲醇(甲醇作為誘導劑)，補加補料用量根據發酵過程中溶氧情況確定。
1)種子培養從冷凍管中取出1ml含生產細胞的菌液HSA75-10(菌種保藏號CGMCCNO.1360)，接入含200ml種子培養基的1000ml帶擋板的搖瓶中，在30℃條件下，搖床培養24小時。培養24小時後，取全部培養液接入5L批次發酵培養基中。
2)發酵培養把200ml種子培養液接入含5L批次發酵培養基的10L發酵罐中，通氣攪拌培養，通氣量為0.5-0.8WWM。發酵第一階段為菌體生長期，於30℃下進行培養，攪拌轉速的低限與高限分別為200與1000rpm，該階段通過溶氧電極監控溶氧量，控制溶養量在飽和溶氧的50％左右，當溶氧值迅速升到100％時，說明批次發酵培養基中的甘油消耗完，此時開始補料過程，流加補料甘油，補加速度以溶氧值控制，溶氧值控制在35-25％之間，同時檢測發酵液中細胞濃度，取發酵液用分光光度計在600納米下測吸光值即OD600值(如果發酵液的細胞濃度超過儀器測定範圍，則精密稀釋發酵液後再用儀器測定)，當得到的發酵液的OD600值約為200時降低培養溫度，同時停止補加甘油；第二階段誘導期在21℃進行，當發酵罐的溫度降低至設定溫度時，監控溶氧值，當溶氧值回升至100％時，開始流加甲醇(濃度100％)，起始流速5ml/h，持續恆速流加直至溶氧值下降至80％，然後增加甲醇流加速度，通過調節流加甲醇的速度，使溶氧值控制在30％，直至發酵過程結束。在整個發酵培養過程中，發酵液的pH控制在5.5，當發酵液泡沫過大的時候加入泡敵消泡，總發酵培養360小時。
將所得發酵液採用壓濾方法得發酵上清(簡稱CCS)，發酵上清液在Superdex 200(XK26/700)的分析圖譜如圖5所示。
二、rHSA的純化在純化過程中所用的各種緩衝液如表1所示。
表1.緩衝液一覽表
1、發酵液的加熱處理取上面得到的發酵上清液60L用0.22um膜(MILLIPORE公司生產)過濾，然後加入1.2kg活性碳，在5mM辛酸鈉、5mM EDTA存在下，調pH值5.8-7.0，在72℃下加熱20分鐘，快速冷卻，然後用乙酸調pH值4.5。
2、高鹽陽離子層析分離將上述經過處理的樣品經膜過濾後直接以150cm/h流速上樣高鹽陽離子CST-IIFF柱(XK50/60，Vt＝300ml，Amersham Biosciences公司，預先用溶液A平衡)。上樣結束後，用溶液A洗滌2柱體積；然後用pH值4.5，含2M氯化鈉的25mM乙酸鈉溶液洗滌2柱體積；再用溶液A洗滌2柱體積；最後用溶液B洗脫，得CST-II BD組分。
3、加熱處理向所得CST-II BD組分中加入辛酸鈉和半胱氨酸，至最終濃度分別為5mM和10mM，在60℃加熱60分鐘，迅速冷卻。
4、疏水層析分離和濃縮加熱後樣品經0.45和0.22um的膜過濾，進入Phenyl SepharoseTMFast Flow(highsub)介質(XK50/60，Vt＝500ml，Amersham Biosciences公司，預先用溶液C平衡)。在此條件下，rHSA未被吸附，在流出部分，收集上樣流出液，用截留分子量3萬的濃縮膜包(Millipore公司生產)進行濃縮至rHSA 100mg/ml左右。
5、硼酸/硼酸鹽脫糖處理向濃縮組分中加入四硼酸鈉和氯化鈣，使最終濃度為50-100Mm，調pH值9.0，靜置過夜。離心分離，用截留分子量30000的超濾膜濃縮，然後用溶液C換液。
6、弱陰離子層析分離將上述濃縮組分直接進入Aminobutyl SepharoseTMFast Flow柱(XK50/60，Vt＝500ml，Amersham Biosciences公司，用溶液C預平衡)，上樣結束後，用溶液C洗滌2柱體積，然後用溶液D進行洗脫，得Amino-BD組分。
7、濃縮換液將Amino-BD組分用截留分子量30000的超濾膜濃縮，然後用含辛酸鈉的氯化鈉溶液換液，得到最終含rHSA 20％的終產品。
三、產品的比較與鑑定1、加熱方法比較以中國發明專利申請(03123502.6)純化方法作為對照，該方法純化各步驟和本發明方法純化各步驟樣品的還原SDS-PAGE和非還原SDS-PAGE電泳圖如圖1所示，圖中1-4依次為對照方法上柱前樣品、經陽柱分離的樣品、經疏水柱分離的樣品和經陰柱分離的樣品，5-8依次為本發明方法的上柱前樣品、經陽柱分離的樣品、經疏水柱分離的樣品和經陰柱分離的樣品。
在酵母表達系統中，除目的蛋白外，同時表達各種各樣的蛋白酶，其中含有耐高溫的蛋白酶。圖1結果表明，採用本發明的上清液處理方法能夠更好抑制蛋白酶活性。
2、本發明各步純化rHSA顯色程度、產率和收率採用本發明方法進行純化rHSA時，各個分離步驟樣品中rHSA濃度、產率、糖含量以及顯色程度結果如表2所示。其中，用bradford方法測定蛋白濃度，計算總蛋白量，從而計算各步收率；糖含量用苯酚-硫酸法測定；顯色程度A350/A280比值採用紫外分光光度計測定(UltrospecTM3300pro，發瑪西亞公司生產)。
表2.本發明各步rHSA濃度、產率、糖含量以及顯色程度
3、純化rHSA產品性質分析1)TSK 3000柱純度分析將含rHSA的溶液注入用0.3％氯化鈉的50mM磷酸鹽緩衝液(pH6.5)平衡的TSK3000柱(日本Tosol公司生產)，然後用此平衡液洗脫，流速1ml/min，通過A280進行檢測，結果如圖2所示，呈單峰，純度為99.71％。
2)Native-PAGE和SDS-PAGE電泳分析採用Phastsystem電泳系統(安瑪西亞公司)，用8-25％梯度膠進行Native-PAGE電泳分析，考瑪斯亮藍染色，10ug呈單帶。10-15％的梯度膠進行SDS非還原和還原電泳分析，考瑪斯亮藍染色，上樣量2ug呈單帶。電泳結果如圖3所示，圖中泳道1為發酵上清液樣品，2為經陽柱分離樣品，3為經疏水柱分離樣品，4為經陰柱分離樣品10μg，5為商品HSA 10μg，6為經陰柱分離樣品(非還原電泳)2μg，7為經陰柱分離樣品(還原電泳)2μg，8為商品HAS(還原電泳)2μg。
3)用ES-MS測定分子量對血源白蛋白產品(pHSA)和重組白蛋白(rHSA)產品用G-25柱(5ml，Pharmacia公司產品)進行脫鹽處理，然後用電噴霧質譜方法測定分子量，發現所分離得到的rHSA分子量為66503Da，血源白蛋白產品分子量為66606Da，所得rHSA與人血清白蛋白的理論分子量66472Da更接近，結果如圖4所示。
4)等電點測定用聚丙烯醯氨凝膠IEF3-9測定rHSA等電點為4.7-5.2，與血源白蛋白相同。
5)內毒素水平檢測將產品用內毒素檢測用水稀釋至40mg/ml，按照內毒素檢測方法，0.25EU鱟試劑檢測(中國湛江海洋生物製品廠生產)，呈陰性。
6)其他測試rHSA蛋白濃度20％，宿主蛋白含量低於1ng/ml，多糖含量測定低於血源產品。
權利要求
1.一種純化rHSA的方法，是將含rHSA的發酵上清依次經過高鹽陽離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其特徵在於所述含rHSA的發酵上清在經過高鹽陽離子交換層析前還經過在穩定劑、脫色劑和蛋白酶抑制劑存在下在60-75℃加熱處理，然後將加熱處理後的溶液調節pH4.0-5.5的步驟；經過所述陽離子交換層析的溶液或經過所述疏水交換層析的溶液還經過硼酸鹽處理。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述穩定劑為棕櫚酸或辛酸鈉；所述脫色劑為大孔樹脂、硅藻土或活性碳；所述蛋白酶抑制劑為PMF、EDTA或EGTA。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述脫色劑為活性碳；所述蛋白酶抑制劑為EDTA。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述穩定劑的加入量為1-10mmol/L，所述脫色劑的加入量為0.1-10g/100ml，所述蛋白酶抑制劑的加入量為0.1-10mmol/L。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於所述加熱處理的時間為10-100分鐘。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述加熱處理的溫度為72℃，加熱處理的時間為20分鐘。
7.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於所述加熱處理後的溶液調節pH4.5-5.3；優選為pH5.2。
8.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於所述硼酸鹽處理按如下過程進行在溶液中加入氯化鈣和硼酸鹽，調節pH9.0-10，處理5-40小時；所述硼酸鹽為原硼酸或四硼酸鈉，濃度為0.01-1mol/L。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述硼酸鹽為四硼酸鈉，濃度為0.1mol/L；所述處理時間為12-16小時。
10.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於所述高鹽陽離子交換層析介質為CST-II FF；所述疏水交換層析介質為Phenyl Sepharose FF或藍膠BlueSepharose FF；所述弱陰離子交換層析介質為Aminobutyl Sepharose FF。
全文摘要
本發明公開了一種純化rHAS的方法。本發明所提供的純化rHSA的方法，是將含rHSA的發酵上清依次經過高鹽陽離子交換層析、疏水交換層析和弱陰離子交換層析，得到純化rHSA，其中，所述含rHSA的發酵上清在經過高鹽陽離子交換層析前還經過在穩定劑、脫色劑和蛋白酶抑制劑存在下在60－75℃加熱處理，然後將加熱處理後的溶液調節pH4.0－5.5的步驟；經過所述陽離子交換層析的溶液或經過所述疏水交換層析的溶液還經過硼酸鹽處理。本發明方法實驗周期短，產品純度高，具有良好的應用前景。
文檔編號C07K1/00GK1854155SQ20051006818
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月29日 優先權日2005年4月29日
發明者李梅彥, 賈茜, 張煒, 董愛華, 任力偉, 沈旭東, 高健, 鄧建慧 申請人:華北製藥集團新藥研究開發有限責任公司