一類高抗氧化和熱穩定性的羥基酪醇聚合物及其製備方法與流程

2023-12-05 20:05:41

本發明涉及天然活性物的酶促氧化聚合技術領域，涉及的是一種抗氧化和熱穩定性的羥基酪醇聚合物的製備方法。

背景技術：

羥基酪醇(3,4-二羥基苯乙醇)，是一種天然小分子酚類化合物，廣泛存在於油橄欖果、葉、初榨橄欖油和尤其富含於油橄欖榨油廠的廢水中。1950年在狹葉松果菊中以松果菊苷的形式被發現，具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護心血管疾病和降血糖等活性功能。尤其被認為是最具有清除自由基的天然抗氧化劑之一，其自由基清除率是槲皮素的2倍，表兒茶酸的3倍之多，使其在保健品、藥品和化妝品領域均有極為廣泛的應用。然而，對羥基酪醇的應用研究發現，存在抗氧化性的熱穩定性較低，常溫存貯時容易發生氧化變質等問題。通常的解決辦法是對羥基酪醇結構中羥基進行酯化或醯基化等改性，雖然提高了穩定性，但卻降低了抗氧化性。如對羥基酪醇進行羥基醚化反應，結果證明羥基酪醇醚化產物的抗氧化性降低。

漆酶(p-diphenol:oxygenoxidoreductaseec1.10.3.2.)是一種含銅離子的多酚氧化酶，與植物抗壞血酸氧化酶和哺乳動物血漿銅藍蛋白同屬於銅藍蛋白家族。廣泛存在於日本紫膠漆樹(rhusvernicifera)、白腐菌中。漆酶可催化多酚、甲基替代單酚、芳香胺、苯硫醇等易氧化的底物，具有作用底物廣，專一性和穩定性高等特點。因1883年日本吉田首次從漆樹的汁液—生漆中發現而得名，後來的研究證實漆酶也廣泛分布於真菌和部分細菌之中。漆酶可催化氧化多酚物質，促進苯酚和二元胺的甲氧基取代；漆酶可催化底物氧化聚合或交聯，利用這個反應可以使有毒的酚或芳胺生成低毒或無毒的產物除去。漆酶的應用範圍非常廣泛，在很多方面都顯示出了很高的應用價值。很多研究表明，漆酶具有降解木素，可以與有毒的酚類物質作用，使苯氧基類除草劑、石油工業廢水去除毒性，近年來在造紙、飲料加工、環保等方面得到廣泛的應用。

技術實現要素：

本發明提供了一種高抗氧化和熱穩定性的羥基酪醇聚合物及其製備方法，解決了羥基酪醇穩定性差，抗氧化性較弱，及酚類聚合反應中工業常使用的強酸、強鹼作為催化劑，易造成工業設備的腐蝕和環境汙染等問題，而利用生物酶進行酚類氧化聚合不僅有利於工廠的綠色生產，而且有利於提高羥基酪醇的應用範圍。

本發明所採用的技術方案如下：一類高抗氧化和熱穩定性的羥基酪醇聚合物，為以下兩種結構式的混合物

其中，n＝4～12。

一類所述的高抗氧化和熱穩定性的羥基酪醇聚合物的製備方法，步驟為：

第一步，酶促聚合：將羥基酪醇溶解於乙酸-乙酸鈉緩衝液中，與漆酶溶液充分混合水浴反應；

第二步，沉澱、離心：經過酶促聚合的液體，立即放入高溫下使漆酶失活，並降溫使聚合物沉澱，再離心獲得粗製羥基酪醇聚合物；

第三步，洗滌、真空乾燥：將收集的粗製羥基酪醇聚合物，使用混合有機溶劑進行洗滌若干次，除去未反應的羥基酪醇和漆酶，並真空乾燥除去溶劑獲得最終的羥基酪醇聚合物。

第一步中的乙酸-乙酸鈉緩衝液為ph4～ph6，羥基酪醇的毫摩爾數mmol與漆酶酶活u比值範圍為1:1～7000。

第一步中的水浴的反應溫度為35～100℃，反應時間1～5h。

第二步中的高溫為60～120℃。

第二步中的降溫指降至-4～4℃。

第二步中的離心時間1～20min，離心轉速300～8000r/min。

第三步中的混合有機溶劑包括乙醇-水、乙酸乙酯-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮或丙酮-水中的任意一種。

第三步中的混合有機溶劑間的比例為1～5:1～5。

第三步中的真空乾燥的溫度為25～100℃，真空度為0.02～0.1mpa。

有益效果：

1、本發明採用在漆酶作用下，對油羥基酪醇進行酶促氧化聚合，不僅減少了強酸、強鹼等催化劑的使用，而且生成的聚合具有更高的抗氧化性和熱穩定性。清除dpph自由基能力約是羥基酪醇的2.2倍，雖然峰值溫度接近，但從最後的殘餘質量所佔比例結果發現，熱穩定性顯著提高了51％，此外，較強酸、強鹼催化劑，不僅綠色循環經濟上表現更好，且專一性更強，獲得的聚合產物較化學催化劑更集中。明顯提高了羥基酪醇聚合物的生產效率。

2、減少了設備腐蝕維護，僅使用生物漆酶即可，獲得得的羥基酪醇聚合物純度更高。

3、在溫和的溫度及弱酸條件下，對羥基酪醇進行酶促聚合。

4、酶促聚合過程無需使用其他易腐蝕和易氧化硫酸、鹽酸和對苯二甲酸等試劑，工藝方法重現性好，產品品質好，本發明工藝穩定，收率高，適合工業化生產。

5、本發明特別篩選後，使用的是毛絨革蓋菌產的漆酶，反應時間短，反應活化能較低，催化活性更高，更有利於聚合度高的產物形成。

附圖說明

圖1為本發明的提供的工藝流程圖。

圖2羥基酪醇和羥基酪醇聚合物的uv-vis。

圖3羥基酪醇和羥基酪醇聚合物的ft-ir。

圖4羥基酪醇和羥基酪醇聚合物的dpph自由基清除能力。

圖5羥基酪醇和羥基酪醇聚合物的tg-dtg圖。

具體實施方式

一種高抗氧化和熱穩定性的羥基酪醇聚合物的製備方法：

一種高抗氧化和熱穩定性的羥基酪醇聚合物的製備方法，步驟為：

第一步，酶促聚合：稱取適量羥基酪醇溶解於乙酸-乙酸鈉緩衝液中，與適量的漆酶溶液，充分混合，置於燒瓶中並放入一定溫度的水浴中，磁力攪拌數小時。

第二步，沉澱、離心：經過酶促反應的液體，立即放入高溫下使漆酶失活，並置於冰箱一定溫度下若干小時，使其聚合物沉澱。再在一定的轉速和時間條件下，經過離心機離心獲得粗製羥基酪醇聚合物。

第三步，洗滌、真空乾燥：將收集的粗製羥基酪醇聚合物，使用一定比例的混合有機溶劑進行洗滌若干次，除去未反應的羥基酪醇和漆酶，並最終置於真空乾燥箱中在一定的真空溫度、真空度和時間條件下除去溶劑獲得最終的羥基酪醇聚合物。

第一步所述的乙酸-乙酸鈉緩衝液為ph4～ph6，羥基酪醇的毫摩爾數(mmol)與漆酶酶活(u)比值範圍為1:1～1:1000。

第一步所述的所述的放入一定溫度的水浴中的反應溫度範圍為10～100℃，磁力攪拌數小時的反應時間範圍為1～10h。

第二步所述的立即放入高溫下使漆酶失活中的溫度範圍為60～120℃。

第二步所述的置於冰箱一定溫度下若干小時，其溫度範圍為-4～4℃，時間範圍為12～72h。

第二步所述的離心時間1～20min，離心轉速300～8000r/min。

第三步所述的混合有機溶劑為乙醇-水、乙酸乙酯-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮和丙酮-水中的一種。

第三步所述的混合有機溶劑間的比例為1:1、1:3、1:5、3:1和5:1中之一。

第三步所述的真空乾燥條件中溫度範圍25～100℃，真空度範圍0.02～0.1mpa，時間範圍12～96h。

本發明的漆酶購於sigma公司。

實施例1

配置1mm的羥基酪醇溶解於30ml乙酸緩衝液(0.05m，ph4.7)。該酶促聚合反應初始添加漆酶溶液(1.0mg/ml，酶活300u)。將載有不同試劑的燒瓶置於35℃磁力攪拌反應3h，再在90℃下使漆酶失活。在酶促反應過程中，該反應的媒介顏色逐漸加深可用於指示聚合反應的大體進程，聚合反應結束後，將反應容器置於4℃冰箱20h，使其聚合產物沉澱。然後沉澱物通過轉速3500r/min，離心6min獲得，並用丙酮與去離子水(1:1,v/v)的混合溶劑洗滌若干次以去除未反應的羥基酪醇與漆酶。生成的聚合物置於溫度範圍60℃，真空度範圍0.1mpa，時間範圍18h真空乾燥箱中除去溶劑，再置於玻璃乾燥器中備用。所獲乾燥的羥基酪醇聚合物質量0.86g。

實施例2

配置1.5mm的羥基酪醇溶解於50ml乙酸緩衝液(0.1m，ph5)。該酶促聚合反應初始添加漆酶溶液(2.2mg/ml，酶活660u)。將載有不同試劑的燒瓶置於40℃磁力攪拌反應3.5h，再在90℃高溫使漆酶失活。在酶促反應過程中，該反應的媒介顏色逐漸加深可用於指示聚合反應的大體進程，聚合反應結束後，將反應容器置於0℃冰箱16h，使其聚合產物沉澱。然後沉澱物通過轉速4000r/min，離心15min獲得，並用丙酮與氯仿(5:1,v/v)的混合溶劑洗滌若干次以去除未反應的羥基酪醇與漆酶。生成的聚合物置於溫度範圍50℃，真空度範圍0.07mpa，時間範圍72h真空乾燥箱中除去溶劑，再置於玻璃乾燥器中備用。所獲乾燥的羥基酪醇聚合物質量0.93g。

實施例3

配置2.0mm的羥基酪醇溶解於50ml乙酸緩衝液(0.1m，ph5)。該酶促聚合反應初始添加漆酶溶液(3.0mg/ml，酶活900u)。將載有不同試劑的燒瓶置於45℃磁力攪拌反應4h，再在100℃下使漆酶失活。在酶促反應過程中，該反應的媒介顏色逐漸加深可用於指示聚合反應的大體進程，聚合反應結束後，將反應容器置於-3℃冰箱22h，使其聚合產物沉澱。然後沉澱物通過轉速3000r/min，離心10min獲得，並用丙酮與去離子水(1:3,v/v)的混合溶劑洗滌若干次以去除未反應的羥基酪醇與漆酶。生成的聚合物置於溫度60℃，真空度範圍0.08mpa，時間範圍48h真空乾燥箱中除去溶劑，再置於玻璃乾燥器中備用。所獲乾燥的羥基酪醇聚合物質量1.36g。

實施例4

配置3.0mm的羥基酪醇溶解於50ml乙酸緩衝液(0.1m，ph5)。該酶促聚合反應初始添加漆酶溶液(3.3mg/ml，酶活990u)。將載有不同試劑的燒瓶置於50℃磁力攪拌反應4.5h，再在100℃下使漆酶失活。在酶促反應過程中，該反應的媒介顏色逐漸加深可用於指示聚合反應的大體進程，聚合反應結束後，將反應容器置於-4℃冰箱20h，使其聚合產物沉澱。然後沉澱物通過轉速7000r/min，離心20min獲得，並用正丁醇與去離子水(3:1,v/v)的混合溶劑洗滌若干次以去除未反應的羥基酪醇與漆酶。生成的聚合物置於溫度範圍50℃，真空度範圍0.09mpa，時間範圍24h真空乾燥箱中除去溶劑，再置於玻璃乾燥器中備用。所獲乾燥的羥基酪醇聚合物質量2.59g。

實施例5

配置3.5mm的羥基酪醇溶解於50ml乙酸緩衝液(0.1m，ph5)。該酶促聚合反應初始添加漆酶溶液(1.5mg/ml，酶活450u)。將載有不同試劑的燒瓶置於55℃磁力攪拌反應5h，再高溫使漆酶失活。在酶促反應過程中，該反應的媒介顏色逐漸加深可用於指示聚合反應的大體進程，聚合反應結束後，將反應容器置於0℃冰箱18h，使其聚合產物沉澱。然後沉澱物通過轉速6000r/min，離心10min獲得，並用丙酮與去離子水(1:3,v/v)的混合溶劑洗滌若干次以去除未反應的羥基酪醇與漆酶。生成的聚合物置於溫度範圍45℃，真空度範圍0.06mpa，時間範圍18h真空乾燥箱中除去溶劑，再置於玻璃乾燥器中備用。所獲乾燥的羥基酪醇聚合物質量1.75g。

實施例6

配置4.0mm的羥基酪醇溶解於50ml乙酸緩衝液(0.1m，ph5)。該酶促聚合反應初始添加漆酶溶液(1.3mg/ml，酶活390u)。將載有不同試劑的燒瓶置於50℃磁力攪拌反應5.5h，再高溫使漆酶失活。在酶促反應過程中，該反應的媒介顏色逐漸加深可用於指示聚合反應的大體進程，聚合反應結束後，將反應容器置於-4℃冰箱24h，使其聚合產物沉澱。然後沉澱物通過轉速5000r/min，離心15min獲得，並用丙酮與去離子水(1:1,v/v)的混合溶劑洗滌若干次以去除未反應的羥基酪醇與漆酶。生成的聚合物置於溫度範圍35℃，真空度範圍0.05mpa，時間範圍16h的真空乾燥箱中除去溶劑，再置於玻璃乾燥器中備用。所獲乾燥的羥基酪醇聚合物質量2.01g。

實施例7-對比例

配置3.5mm的羥基酪醇溶解於50ml乙酸緩衝液(0.1m，ph5)。該酶促聚合反應初始添加辣根過氧化物酶溶液(2.0mg/ml，酶活800u)。將載有不同試劑的燒瓶置於50℃磁力攪拌反應4.5h，再高溫使辣根過氧化物酶失活。在酶促反應過程中，該反應的媒介顏色逐漸加深可用於指示聚合反應的大體進程，聚合反應結束後，將反應容器置於-1℃冰箱22h，使其聚合產物沉澱。然後沉澱物通過轉速7000r/min，離心15min獲得，並用丙酮與去離子水(1:1,v/v)的混合溶劑洗滌若干次以去除未反應的羥基酪醇與辣根過氧化合物酶。生成的聚合物置於溫度範圍50℃，真空度範圍0.08mpa，時間範圍20h真空乾燥箱中除去溶劑，再置於玻璃乾燥器中備用。所獲乾燥的羥基酪醇聚合物質量1.23g。且通過gpc測定得到的羥基酪醇聚合度n為2～6，該聚合物的dpph自由基清除能力的ic50為40.31×10-3mg/ml，大於使用漆酶清除dpph自由基能力的ic50為25.06×10-3mg/ml(見圖4)，也即清除dpph自由基能力小於。tg的峰值溫度為310.5℃小於漆酶催化羥基酪醇聚合產物的峰值溫度315℃，且其殘渣所佔比例35.68％遠小於漆酶催化的羥基酪醇聚合產物66.09％(見圖5)，說明辣根超氧化物酶也不如漆酶催化羥基酪醇的聚合產物的熱穩定性高。

本發明採用在漆酶作用下，對油羥基酪醇進行酶促氧化聚合，不僅減少了強酸、強鹼等催化劑的使用，而且生成的聚合具有更高的抗氧化性和熱穩定性。由圖4可以看出，清除dpph自由基能力約是羥基酪醇的2.2倍。從附圖5可以看出，雖然峰值溫度接近，但從最後的殘餘質量所佔比例結果發現，熱穩定性顯著提高了51％。

上述所有實施例一個漆酶活力單位(u)是指：在25℃條件下，1min氧化轉化1μmolabts時所需的酶量。一個漆酶活力單位(u)是指在25℃條件下，在1min內能轉化1μmolh2o2所需的酶量。