雷公藤減毒炮製方法及相關製劑的製作方法

2023-12-05 13:10:16

專利名稱：雷公藤減毒炮製方法及相關製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及天然藥物提取、純化和鑑定方法，特別涉及中藥雷公藤及其提取物的改性方法。
背景技術：
雷公藤泛指衛矛科雷公藤植物，中國產四種，其中有三種入藥，即雷公藤(Triptergium wilfordii Hook.f.)，產於浙江、安徽、湖南、福建等省區，主要在長江中下遊地區；昆明山海棠(T.hypoglaucum Hutch)，產於長江流域及西南；東北雷公藤(T.regelii Spragnc et Takcda)又稱黑蔓，主要產於東北和日本。雷公藤最早收載於《神農本草經》，多年來臨床廣泛用於治療類風溼性關節炎、慢性腎炎、肝炎、血小板減少性紫癜和各種皮膚病。目前在抗生育、抗腫瘤、抗器官移植後體內排斥等方面的研究也已取得較大進展，是一種很有發展前途的藥物。自1936年首次報導從雷公藤根部提取分離得萜類色素雷公藤紅以來，已從雷公藤屬植物中分離出100多種成分，其中二萜類和生物鹼類是主要的活性成分。
雷公藤全株都有毒，若使用不當，服藥期間常伴有毒副反應發生。動物實驗顯示雷公藤毒性最敏感的靶器官是胃腸系統，造血系統和生殖系統，以消化道反應最常見。環氧二萜類化合物雷公藤內酯醇(I)為治療類風溼關節炎的主要有效成分，也是主要毒性成分，且有效劑量與毒性劑量幾乎相當，這大大妨礙中藥雷公藤在臨床應用方面的進一步推廣。雷公藤中的另外一個重要的環氧二萜類化合物是雷公藤氯內酯醇(II)，藥理活性篩選結果表明，II具有I的抗炎、免疫抑制和抗生育活性，效價約為I的100～200倍，而且已被證實無致突變作用。基於化合物II和I之間有化學關聯，在實驗室內利用相對含量較高的I已經實現了II的半合成。但是化合物I在原植物中的含量也不高，這就大大限制了半合成方法的應用，再加上化合物II由原植物提取得率極低，其原料來源已成為一個至關重要的問題。
實驗研究顯示，雷公藤葉子中的有效成分含量高於根莖，但由於毒性大而無法直接入藥。目前雷公藤藥物劑型的研究主要集中在增加藥物穩定性、溶解度、降低毒副作用方面。但是在開發新劑型的時候既要降低該藥的毒性又要提高或保持療效就很困難。雖然文火長時間煎煮可以有效地降低雷公藤的毒性，但因許多有效成分被破壞，其療效也有所下降。本發明首先通過與以往不同的炮製方法降低雷公藤的毒性，在此基礎上開發雷公藤藥物的相關劑型，對充分利用該藥物資源，滿足臨床用藥以及擴大雷公藤製劑的適用人群和治療範圍具有重大的意義。

發明內容
本發明的目的在於彌補現有技術中存在的不足之處，而提供一種成本低、能有效降低中藥雷公藤毒性的炮製方法並在此基礎上製備低毒的相關製劑。雷公藤指雷公藤全草或部分。
本方法原理是直接通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液處理雷公藤，或雷公藤浸膏或雷公藤浸膏進一步純化的產物或雷公藤製劑，根據主要活性、毒性成分的理化特性，使其主要活性成分，也是主要毒性成分結構發生改變，這樣雷公藤的毒性降低，促進其作為抗炎、抗腫瘤等藥物開發的產業化。
本發明目的可以通過如下措施來實現通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液處理雷公藤，或者將雷公藤(全草或部分)或從雷公藤製得的浸膏，用中等極性有機溶劑抽提，抽提物先過層析純化，除去色素及小極性雜質部分，將收集到的活性部分，再通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液處理使其減毒。最後通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)或使用含氯離子的酸性溶液處理雷公藤或從雷公藤製得的浸膏及其中等極性有機溶劑提取物或雷公藤製劑。
本發明的具體炮製方法及相關製劑的製備按以下步驟進行直接通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)或使用含氯離子的酸性溶液處理中藥雷公藤，使其減毒，並製備煎劑、酊劑、糖漿劑、膠囊劑、合劑、丸劑(滴丸、注塑丸等)、衝劑、緩釋(微囊)片和醇(水)浸膏；或按以下步驟進行；第一步將雷公藤用溶劑提取，抽濾，回收溶劑，得浸膏；
第二步將第一步所得雷公藤浸膏，用有機溶劑提取，濃縮；濃縮物經層析純化，方法包括柱色譜，薄層色譜，液相色譜等方法的一種或幾種，得二萜類化合物；第三步雷公藤浸膏及其純化過程中得到的中間產物或純化後的萜類化合物通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液使其減毒，並製備煎劑、酊劑、糖漿劑、膠囊劑、合劑、丸劑(滴丸、注塑丸等)、衝劑、緩釋(微囊)片和醇(水)浸膏；或雷公藤製劑通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液處理使其減毒，再用有機溶劑萃取、水洗，得濃縮改性物，並製備煎劑、酊劑、糖漿劑、膠囊劑、合劑、丸劑(滴丸、注塑丸等)、衝劑、緩釋(微囊)片和醇(水)浸膏；或雷公藤製劑先用溶劑提取，再通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液處理，再用有機溶劑萃取、水洗，得濃縮改性物，並製備煎劑、酊劑、糖漿劑、膠囊劑、合劑、丸劑(滴丸、注塑丸等)、衝劑、緩釋(微囊)片和醇(水)浸膏。
本發明的改性方法和現有技術相比具有如下優點本發明方法操作簡便，成本低廉，經藥理實驗證明，雷公藤(全草或部分)、雷公藤製得的浸膏，雷公藤或浸膏純化後的產物，雷公藤製劑經鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液使其毒性明顯下降，而且藥效仍然顯著。
具體實施實例下面列舉7個實施例，對本發明加以進一步說明，但本發明不只限於這些實施例。本發明以我國豐富的雷公藤屬植物—雷公藤、昆明山海棠和東北雷公藤等為材料，根據其主要活性、毒性成分的基本理化特性，通過特殊的改性方法，最後降低其毒性。
實施例1稱取雷公藤200g，用NaCl飽和溶液浸泡2小時後加入醋酸調節pH 1-2，同時在10℃冰箱內放置48小時。取出後用氯仿提取3次，每次300ml，提取液用水洗至中性，再用無水Na2SO4乾燥，減壓濃縮後得到濃縮物3.68g。加20mL水溶解，過濾後加入山梨酸鉀2g，製備煎劑、合劑。
實施例2稱取雷公藤200g，用10％NaCl-檸檬酸溶液浸泡，同時在0℃冰箱內放置48小時。取出後用氯仿提取3次，每次300ml，提取液用水洗至中性，再用無水Na2SO4乾燥，減壓濃縮後得到濃縮物5.12g。加50mL水溶解，過濾後加入山梨酸鉀2g，製備煎劑、合劑。
實施例3第一步稱取雷公藤650g，加入800ml 95％乙醇，回流提取3次，每次6小時，過濾，合併乙醇液，減壓回收乙醇，得總成分浸膏12.0g。
第二步稱取雷公藤130g，加入300ml乙酸乙酯，回流提取3次，每次6小時，過濾，合併乙酸乙酯液，減壓回收乙酸乙酯，得主要為中等極性化合物的浸膏1.56g。將第一步得到的浸膏6.0g，加入25ml乙酸乙酯，超聲提取3次，每次45min，過濾，合併乙酸乙酯液，減壓回收乙酸乙酯，得浸膏1.31g。將1.56g浸膏，用少量乙酸乙酯溶解後，拌入4.4g中性氧化鋁，過氧化鋁柱，棄去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脫液250ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脫液450ml，減壓濃縮得樣品A。將1.31g浸膏用少量乙酸乙酯溶解後，拌入3.2g中性氧化鋁，過氧化鋁柱，棄去乙酸乙酯∶石油醚(1∶9)洗脫液250ml，收集乙酸乙酯∶石油醚(1∶1)的洗脫液450ml，減壓濃縮得樣品B。
第三步將樣品A和樣品B分別用食鹽飽和溶液浸泡2小時後加入食醋調節pH 1-2，在4℃處理36小時，室溫下用乙酸乙酯提取3次，每次200ml，提取液用水洗至中性，再用無水Na2SO4乾燥，減壓濃縮後加入10倍量乙醇，攪拌均勻，調至pH 5-6，靜置，待沉澱完全吸取上清液，在65℃減壓回收乙醇後濃縮至稠膏狀，加入85％乙醇100mL，靜置，過濾，製備酊劑。
實施例4稱取雷公藤600g，加入700ml95％乙醇，方法同實施例2第一步，減壓回收乙醇得浸膏9.0g。用飽和NaCl溶液浸泡2小時後加入食醋，在4℃處理36小時，取出後用乙酸乙酯提取3次，(20mL×3)，合併提取液後用水洗至中性，再用無水Na2SO4乾燥，減壓濃縮至200mL，加入21g硬脂酸鈉，蟲臘8g，水浴加熱並振搖使成均勻溶液，移入儲液罐內。藥液保持65℃由滴管滴出，滴速約80丸/min，用二甲基矽油作冷凝液，製備滴丸。
實施例5雷公藤葉總酯片10片，研碎後用乙酸乙酯索氏提取三次(50mL×3)，提取液濃縮後用飽和NaCl溶液浸泡2小時後加入醋酸調節pH1-2，在4℃處理36小時，室溫下用乙酸乙酯提取3次，每次200ml，提取液用水洗至中性，再用無水Na2SO4乾燥，減壓濃縮後加入600mg羥丙甲纖維素(HPMC)混合均勻，40mg檸檬酸溶於15ml乙醇中作潤溼劑製成軟材，制粒，乾燥，整粒，加8mg硬脂酸鎂混勻，壓片。
實施例6雷公藤膠囊劑15粒，去掉空膠囊殼後，用飽和NH4Cl溶液浸泡3小時後加入食醋，在4℃處理36小時，室溫下用氯仿提取3次，每次20ml，提取液用水洗至中性，再用無水Na2SO4乾燥，減壓濃縮後，乾燥，研磨後過400目篩，取40mg與10mg蔗糖混合均勻後加入0.8mg硬脂酸，裝入5號空膠囊封口，製備膠囊劑。
實施例7雷公藤糖漿劑500mL，用氯仿萃取三次(3×200mL)，合併提取液後減壓濃縮，濃縮物用飽和NaCl溶液浸泡3小時後加入醋酸，在0℃處理36小時，室溫下用氯仿提取三次(3×100mL)，提取液用水洗至中性，再用無水Na2SO4乾燥，減壓濃縮後加水45mL，加入單糖漿50mL，加入甘油10mL助溶，製備糖漿劑。
下面列舉急性毒性實驗和抗炎實驗，對本發明的效果加以進一步說明，但本發明不只限於這些實施例。
一、急性毒性實驗1實驗材料1.1藥物 未炮製雷公藤浸膏製備的散劑；新方法炮製的低毒雷公藤浸膏製備的散劑，加0.5％CMC-Na溶液配成混懸液，pH 6.0。
1.2動物 清潔級昆明小鼠(體重18～22g)♂♀兼用，由河北省實驗動物中心提供。動物飼養在潔淨無塵的環境中，溫度18～22℃，相對溼度55％，光照12h，飼料及墊料由河北省實驗動物中心提供。
2方法口服LD50由預試驗確定口服給藥的劑量範圍，劑間比為1∶0.75-0.85，給藥容積為0.2ml/10g。小鼠110隻，雌雄各半，按體重隨機分為11組，每組10隻生理鹽水組，未炮製雷公藤和炮製雷公藤各5個不同劑量組，實驗前禁食一夜，自由飲水。1次灌胃給藥，按《新藥臨床前研究指南》測定口服的LD50，給藥後禁食4h，嚴密觀察小鼠給藥後的反應及死亡情況，並逐日觀察小鼠活動、步態、進食、二便等情況，記錄死亡動物數，觀察死亡小鼠重要臟器變化，連續觀察7天。
二、抗炎實驗1材料1.1動物與分組清潔級昆明小鼠(體重18～22g)和Wistar大鼠(體重150±20g)，♂♀兼用，均由河北省實驗動物中心提供。動物飼養在潔淨無塵的環境中，溫度18～22℃，相對溼度55％，光照12h，飼料及墊料由河北省實驗動物中心提供。隨機分為6組生理鹽水對照組(模型組)、潑尼松陽性對照組、未炮製雷公藤組、炮製雷公藤高、中、低劑量三個劑量組，每組10隻。由河北省實驗動物中心提供。
1.2藥物未炮製雷公藤浸膏製備的散劑；新方法炮製的低毒雷公藤浸膏製備的散劑，加0.5％CMC-Na溶液配成混懸液，pH 6.0。
1.3試劑二甲苯(分析純，天津市鼎盛化工材料廠)；0.9％NaCl注射液(石家莊四藥股份有限公司)；Evans Blue(美國Sigma，E-2129)；注射用青黴素(華北製藥有限公司，批號00408040)。
2方法2.1二甲苯所致小鼠耳部炎症實驗將60隻昆明小鼠隨機分為6組，採用等容積不等濃度藥液灌胃給藥，0.2ml/10g體重，每日1次，連續3天，末次給藥後1小時，將二甲苯0.1ml均勻塗於小鼠右耳耳廓，左耳為空白對照，2h後拉頸處死，用手術剪齊耳根將左右耳剪下，用直徑為8mm打孔器在左右1.3試劑耳同一部位打下耳片，分析天平上稱重，以左右耳片重量之差作為腫脹度，並計算抑制率。
2.2小鼠腹腔毛細血管通透性實驗取60隻雌雄各半的昆明小鼠，分組、給藥均同2.1。第三天灌胃30min後給鼠尾iV1％伊文思藍0.1ml/10g，並立即ip 1％醋酸0.2mL/只。20min後拉頸處死，用6ml生理鹽水分次衝洗腹腔，用吸管吸出衝洗液於離心管中，調整終體積至10mL，4000rpm離心5min。取上清液於22PC分光光度計590nm處測定光密度(OD)值，並計算抑制率。
2.3棉球誘發小鼠肉芽腫實驗製作70個50mg棉球，體積儘量一致，以免影響肉芽腫增生。將棉球放入試管中121℃滅菌30min。取60隻昆明小鼠分為6組。將小鼠放入超淨臺內，用乙醚球淺麻醉，用大頭針固定其四肢於鼠板上，用碘酊從中心至外周消毒兩次，用75％酒精脫碘，待酒精幹後，用手術剪自腹中線剪1cm小口，用眼科鑷輕輕分離皮膚。用另一把眼科鑷將棉球植入小鼠一側的腹股溝處，然後縫合。術後小鼠腹腔注射青黴素以防感染。術後當日灌胃，連續給藥7天。第8天再給藥1次，處死小鼠，並剝離出肉芽腫球，剔除脂肪組織，於70℃烘乾12小時，稱重，其重量減去原棉球重量即為肉芽腫重，以每g體重之肉芽腫重量作統計分析。
2.4角叉菜膠誘導大鼠足踝腫脹實驗取體重(150±20)g健康雄性Wistar大鼠60隻，隨機分成6組，每組10隻，採用等容積不等濃度藥液灌胃給藥，每日1次，連續給藥7d。於末次給藥後40min，在大鼠右後足墊部皮下注射10g/L角叉菜膠0.1ml致炎，分別在致炎前和致炎後0.5、1、2、4、6h，用毛細管容積法測量大鼠致炎肢踝關節下方0.5cm處體積，用致炎前後差值作為腫脹度。
2.5大鼠佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)模型2.5.1模型製備 將滅活的卡介苗(80℃水浴1h)加入無菌的液體石蠟中，乳化製成Freund完全佐劑。卡介苗的濃度為10g/L，於每鼠左後足趾皮內注射Freund完全佐劑0.1ml致炎。
2.5.2觀察指標取Wistar大鼠60隻，♂，分組同前。致炎前3d ig給藥，分別於致炎前，致炎後6h，12h，18h及24h，用毛細管容積法檢測致炎前、後大鼠致炎側足腫脹，以觀察AA大鼠原發性病變；致炎後12d開始ig給藥，並檢測非致炎側足腫脹，每4天1次，以致炎前後差為腫脹度。同時進行關節評分(0～4)0無紅腫，1足小趾關節紅腫，2趾關節紅腫、足蹠均紅腫，3踝關節以下均紅腫，4包括踝關節，全部紅腫；除致炎側外，三足的積分之和為關節總積分，最高為12分，以評分值對AA大鼠多發性關節炎進行評估，以觀察AA大鼠繼發性病變。
綜合評價通過藥理實驗表明，與未經炮製的雷公藤或雷公藤浸膏或雷公藤純化後的產物或雷公藤製劑相比，用新方法炮製過的雷公藤或雷公藤浸膏或雷公藤純化後的產物或雷公藤製劑，其毒性明顯下降，LD50由分別由原來的(279.4±0.02)mg/kg、(252.0±0.02)mg/kg變為(931.10±0.02)mg/kg、(840.10±0.02)mg/kg。本發明產品用於治療類風溼性關節炎療效顯著。目前在治療慢性腎炎、肝炎、血小板減少性紫癜和各種皮膚病關節炎等方面的研究，也已取得較大進展。
權利要求
1.雷公藤減毒炮製方法及相關製劑，其特徵在於(1)、通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)中藥雷公藤，或使用含氯離子的酸性溶液浸泡處理使其減毒，並製備煎劑、酊劑、糖漿劑、膠囊劑、合劑、丸劑(滴丸、注塑丸等)、衝劑、緩釋(微囊)片和醇(水)浸膏；或(2)、按以下步驟進行第一步將雷公藤用溶劑提取，抽濾，回收溶劑，得浸膏；第二步將第一步所得雷公藤浸膏，用有機溶劑提取，濃縮；濃縮物經層析純化，可得萜類化合物；第三步雷公藤浸膏及其純化過程中得到的中間產物或純化後的萜類化合物通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液浸泡處理使其減毒，並製成煎劑、酊劑、糖漿劑、膠囊劑、合劑、丸劑(滴丸、注塑丸等)、衝劑、緩釋(微囊)片和醇(水)浸膏；或(3)、雷公藤製劑的炮製雷公藤製劑通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液浸泡處理使其減毒，再用溶劑萃取、水洗，得濃縮改性物，並製備煎劑、酊劑、糖漿劑、膠囊劑、合劑、丸劑(滴丸、注塑丸等)、衝劑、緩釋(微囊)片和醇(水)浸膏；或雷公藤製劑先用溶劑提取，再通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，或使用含氯離子的酸性溶液使其減毒，再用有機溶劑萃取、水洗，得濃縮改性物，並製備煎劑、酊劑、糖漿劑、膠囊劑、合劑、丸劑(滴丸、注塑丸等)、衝劑、緩釋(微囊)片和醇(水)浸膏。
2.根據權利要求1所述的炮製方法，其特徵在於所述雷公藤是指雷公藤全草或部分。
3.根據權利要求1所述的炮製方法，其特徵在於所述鹽為食鹽和其他鹽酸鹽，所述酸包括食醋、硫酸、硝酸、乙酸、鹽酸、碳酸、磷酸、草酸、氫氟酸、檸檬酸等。
4.由權利要求1所述新方法炮製的低毒雷公藤全草或部分製備的相關製劑用於治療類風溼性關節炎、慢性腎炎、肝炎、血小板減少性紫癜和各種皮膚病關節炎，以及抗生育、抗腫瘤、抗器官移植後體內排斥的藥物或保健產品，以及其他控速緩釋藥物如固體分散藥劑，環糊精包合藥劑等藥品和保健品。
全文摘要
本發明涉及雷公藤減毒炮製方法及相關製劑，方法(1)通過鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)中藥雷公藤，或使用含氯離子的酸性溶液使其減毒；或方法(2)按以下步驟進行雷公藤浸膏，或者雷公藤浸膏進一步純化後的產物，或者雷公藤製劑，經鹽制(或酸制)和酸制(或鹽制)，使其毒性降低。本發明優點是通過本炮製方法，製得毒性較低的雷公藤及相關製劑，可使雷公藤的全草、根皮、莖葉等部位毒性較大的藥用資源得以更好地利用，增強雷公藤製劑的療效。同時本發明方法操作簡單、成本低廉，易於推廣。本發明相關製劑用於治療類風溼性關節炎、慢性腎炎、肝炎、血小板減少性紫癜和各種皮膚病關節炎，亦可用於抗生育、抗腫瘤、抗器官移植後體內排斥等。
文檔編號A61P19/00GK101062083SQ20061007591
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月24日 優先權日2006年4月24日
發明者楊更亮, 李保芝, 劉智勤, 尹俊發 申請人:楊更亮