同工酶共催化合成2,3‑丁二醇的基因工程菌及其構建方法與應用與流程
2023-12-05 10:07:01 2
本發明屬於基因工程和生物催化
技術領域：
，具體涉及同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌及其構建方法與應用。
背景技術：
：2,3-丁二醇可以作為一種潛在的平臺化合物，替代傳統的平臺化合物——碳四烴，用於大規模的合成甲乙酮(優良溶劑)和1,3-丁二烯(廣泛應用於合成橡膠、聚酯和聚亞胺酯等領域)。生產2,3-丁二醇的方法可分為化學法和生物法。由於2,3-丁二醇結構特殊，化學法生產2,3-丁二醇主要是以石油裂解時產生的四碳類碳氫化合物在高溫高壓下水解得到，成本高、過程煩瑣、不易操作，所以一直很難實現大規模的工業化生產。生物法即通過微生物發酵或者酶催化的方法生產2,3-丁二醇。隨著傳統化學法所帶來的環境問題日益嚴重，各國政府對環境問題越來越關注的前提下，將可再生的生物質轉化為化工原料的研究得到廣泛的關注；相比於對環境破壞較為嚴重的化學方法生產2,3-丁二醇，生物法具有以下優點：1、生產成本較低，化學法的生產成本則很高；2、對環境友好，並不會像化學方法給環境保護帶來很大壓力，2,3-丁二醇作為有機合成中間體取代了許多的化合物和其它石化產品的市場，前景廣闊，社會、環境效益顯著，非常有利於該產品的廣泛應用；3、可再生性，擺脫了化學法對化石原料的依賴性，因此具有很好的應用前景。目前2,3-丁二醇的商業價格達100000元/噸。然而，生物法與化學法相比，亦存在很多不足之處，其中最為重要的就是生物催化劑合成2,3-丁二醇的濃度低、速率低，前體物質轉化不徹底，導致了產品後分離純化困難、碳原料收率低下等問題，其根本原因是生物催化過程中催化2,3-丁二醇合成的蛋白的催化性能不夠穩定。生物體內能夠催化2,3-丁二醇合成的蛋白種類眾多、催化性能各異，然而目前生物法合成2,3-丁二醇的研究中，無論是採用生物發酵還是酶催化的方式，其2,3-丁二醇合成過程均主要由單個2,3-丁二醇脫氫蛋白催化完成。比如cn201480068734.1中提到的乙偶姻向2,3-丁二醇轉化即是導入單個2,3-丁二醇脫氫蛋白編碼基因，從而增加2,3-丁二醇的產量；chiamyung等研究酵母產2,3-丁二醇的途徑時，也只是對單個基因進行操作(ngetal.,microbialcellfactories201211:68)；soojinlee等研究合成左型2,3-丁二醇是在大腸桿菌中對buda(乙醯乳酸脫羧反應蛋白編碼基因)和meso-budc(編碼內消旋型2,3-丁二醇合成基因)操作合成純的內消旋型2,3-丁二醇(soojinlee,borimkimetal.,synthesisofpuremeso-2,3-butanediolfromcrudeglycerolusinganengineeredmetabolicpathwayinescherichiacoli20121801-1813)。li等人在大腸桿菌中進行全細胞催化合成2,3-丁二醇也僅僅對單個2,3-丁二醇脫氫酶基因進行表達(lixianglietal.,biocatalyticproductionof(2s,3s)-2,3-butanediolfromdiacetylusingwholecellsofengineeredescherichiacoli2012111-116)。單獨採用一種蛋白進行2,3-丁二醇的合成往往導致催化合成效率低、前體物質利用不完全等問題的出現。技術實現要素：本發明要解決的問題是，提供一種同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法。為解決上述技術問題，本發明提供技術方案如下：同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌，其特徵在於，該菌株中含有兩種或兩種以上對2,3-丁二醇具有不同親和力的2,3-丁二醇脫氫酶同工酶。其中，所述對2,3-丁二醇具有不同親和力的2,3-丁二醇脫氫酶同工酶的基因序列包括seqidno.65～69所示的核苷酸序列。作為優選，所述2,3-丁二醇脫氫酶同工酶包括：(1)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的乙醯乳酸脫羧酶；(2)拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脫氫酶；(3)克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脫氫酶；(4)產乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脫氫酶；(5)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶。其中，所述枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶，其核苷酸序列如seqidno.65所示；所述拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脫氫酶，其核苷酸序列如seqidno.66所示；所述克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脫氫酶，其核苷酸序列如seqidno.67所示；所述產乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脫氫酶，其核苷酸序列如seqidno.68所示；所述枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的乙醯乳酸脫羧酶，其核苷酸序列如seqidno.69所示。同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：(1)將seqidno.1～5所示2,3-丁二醇脫氫酶同工酶基因序列中的一種或幾種串聯連接入表達載體，或者將seqidno.65～69所示基因序列中的一種或幾種分別連接入不同的表達載體中，得到重組質粒；(2)將步驟(1)得到的重組質粒導入宿主細胞中，既得到同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌。其中，所述的宿主細胞為丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumb3。其中，任意兩個2,3-丁二醇脫氫酶同工酶基因之間由一段rbs序列連接。其中，所述rbs序列如seqidno.70所示。作為優選，2,3-丁二醇脫氫酶同工酶基因串聯連接包括如下組合：(1)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdha+拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脫氫酶基因acr；(2)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdha+克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脫氫酶基因budc；(3)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdha+產乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdh；(4)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脫氫酶基因acr；(5)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脫氫酶基因budc；(6)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+產乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdh；(7)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdha。當任意兩個2,3-丁二醇脫氫酶同工酶基因之間由一段rbs序列連接，包括如下組合：(1)枯草芽孢桿菌b.subtilis168的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+rbs+拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)ncimb8052的2,3-丁二醇脫氫酶基因acr；(2)枯草芽孢桿菌b.subtilis168的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+rbs+克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脫氫酶基因budc；(3)枯草芽孢桿菌b.subtilis168的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+rbs+產乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdh；(4)枯草芽孢桿菌b.subtilis168的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+rbs+枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdha。(5)枯草芽孢桿菌b.subtilis168的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+rbs+枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdha+rbs+拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)的2,3-丁二醇脫氫酶基因acr；(6)枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+rbs+枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdha+rbs+克雷伯氏菌(k.pneumoniaekctc2242)的2,3-丁二醇脫氫酶基因budc；(7)枯草芽孢桿菌b.subtilis168)的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd+rbs+枯草芽孢桿菌(b.subtilis168)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdha+rbs+產乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdh。從催化反應動力學來講，酶的底物親和力以及轉換數是酶催化性能的重要表徵，而從反應機理上來講，具有高底物親和力的酶能夠將底物轉化的更為徹底，但是轉換數通常較低；轉換數高的酶具有較快的產物合成速率，但是通常無法將底物轉化徹底。本研究考察了多種2,3-丁二醇脫氫酶(又稱作乙偶姻還原酶)的催化性能，發現一些蛋白能夠高效率、高濃度地合成2,3-丁二醇，但存在前體物質轉化不完全的問題；而另一些蛋白雖然合成2,3-丁二醇的速率稍低，但能夠將前體物質徹底轉化為2,3-丁二醇，亦即此兩類酶具有互補性的催化優勢。因此，本發明提供的兩類同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法，既能實現2,3-丁二醇的高效合成，又能實現前體物質的徹底轉化。該方法能夠顯著提升2,3-丁二醇合成過程的經濟性以及相關生物過程的生產性能。本發明公開了一種同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌及其構建方法與應用，主要是通過將對2,3-丁二醇具有不同親和力的2,3-丁二醇脫氫酶同工酶同時構建到宿主細胞中，然後誘導表達，利用得到的重組菌進行發酵，附圖說明圖1是不同2,3-丁二醇脫氫蛋白的基因連接與表達方式示意。圖1中，r1為多個2,3-丁二醇脫氫蛋白基因分別、獨立地連接在表達載體上；r2為多個2,3-丁二醇脫氫蛋白基因通過基因融合表達的方式連接在同一表達載體上；r3為多個2,3-丁二醇脫氫蛋白基因共同連接在同一表達載體上，且各基因之間補充rbs序列(核糖體結合位點序列)，以利於各基因的表達；r4為多個2,3-丁二醇脫氫蛋白基因共同連接在同一表達載體上，並且與其他基因一起表達。bdha，來自於bacillussubtilis的2,3-丁二醇脫氫酶基因(又稱為2,3-丁二醇脫氫酶基因)；acr，來自於clostridiumacetobutylicum的2,3-丁二醇脫氫酶基因；p表示表達基因的啟動子；rbs表示核糖體結合位點。具體實施方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。下述實施例中如無特殊說明，所用方法均為常規方法，如《分子克隆：實驗室手冊》(newyork:coldspringhaborlaboratorypress,1989)中所述的方法。所用試劑均可從商業途徑獲得。下述實施例以丙酮丁醇梭菌為例闡明本發明的同工酶共催化合成2,3-丁二醇基因工程菌株的構建方法。本實驗所要用得到培養基如下表：lb培養基組分濃度(g/l)蛋白腖10酵母粉5nacl10p2種子培養基組分濃度(g/l)葡萄糖10蛋白腖5酵母粉3mgso4·7h2o3nacl2ch3coonh42k2hpo41kh2po41feso4·7h2o0.1p2發酵培養基各組分濃度(g/l)葡萄糖60ch3coonh42.2nacl0.01k2hpo40.5kh2po40.5mgso4·7h2o0.2mnso4·h2o0.01feso4·7h2o0.01對氨基苯酸硫胺0.001硫胺0.001生物素0.00012xytg培養基組分(ph5.2)濃度(g/l)蛋白腖16酵母粉10nacl5葡萄糖5實施例1：體外擴增所需2,3-丁二醇脫氫酶基因片段及乙醯乳酸脫羧反應蛋白編碼基因np_391481(seqidno:5)片段，如需進行多基因整合表達，可通過重疊pcr的方式將兩個或多個基因完成整合。採用細菌基因組試劑盒(takaracode：dv810a)提取對數生長中後期的枯草芽孢桿菌b.subtilis168基因組dna，用於合成乙醯乳酸脫羧反應蛋白編碼基因(對應蛋白編號為np_391481)和2,3-丁二醇脫氫酶基因(np_388505)。以下所述基因組提取均與枯草芽孢桿菌b.subtilis168基因組dna提取的方法相同，按照試劑盒說明進行此操作即可，拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)ncimb8052基因組dna，用於合成2,3-丁二醇脫氫酶基因(abr33642)；克雷伯氏菌k.pneumoniaekctc2242基因組dna，用於合成2,3-丁二醇脫氫酶基因(abr77284)；產乙醇梭菌c.autoethanogenum基因組dna，用於合成2,3-丁二醇脫氫酶基因(yp_001634733)。以上所提到的蛋白編號均為ncbi-proteinid。以下引物在設計時，其前端和後端引物都插入了相對應質粒上的酶切位點，為了更好地進行一步克隆連接反應，載體酶切位點前後15～20bp必須與引物上保持一致，一步克隆原理參見clonexpresstmiionestepcloningkit使用說明書。例如，當選用pimpi-ptb載體進行外源基因表達時，即可選擇限制性內切酶ndei進行酶切，然後進行前後端各含有15～20bp相同序列的引物設計(不僅限於此種表達載體)。下面將以表格的形式列舉擴增目的基因的引物。f代表前端引物，r代表後端引物，均為5'到3'。表1單個2,3-丁二醇脫氫酶基因體外擴增引物表2np_391481(乙醯乳酸脫羧反應蛋白編碼基因，下文出現時不再標示)與上述四種2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因體外組裝引物表3np_391481與單個2,3-丁二醇脫氫酶基因之間加入一個rbs序列：aggaggttagttaga的擴增引物表4用於體外擴增三基因之間含有兩個rbs序列的np_391481與兩個2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因整合片段的引物：表5pcr反應體系(100ul)pcr反應組分體積(ul)5×psbuffer20dntpmix10primer11primer21模板dna1primestar(高保真酶)0.5ddh2o67.5表6pcr擴增反應程序設計通過以上方法即可得到目的基因，使用膠回收試劑盒進行膠回收。具體步驟參見takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0試劑盒。實施例2：將擴增的2,3-丁二醇脫氫酶基因與表達載體連接，通過熱擊轉化或電轉化的方法導入細胞中，獲得具有催化活力的2,3-丁二醇脫氫酶蛋白。(1)一步克隆法進行基因片段與載體連接：實施例1中所設計的引物，其兩端都是含有ndei酶切位點的，並且都人為的加上了一段與載體ndei酶切位點兩端相同的15-20bp的鹼基序列。因此，可以直接用一步克隆試劑盒，具體操作步驟詳見clonexpresstmiionestepcloningkit使用說明書；表7一步克隆反應體系：反應體系組分體積ddh2oupto20ul5×ceiibuffer4ul線性化克隆載體1ul(50-200ng)插入片段擴增產物1ul(20-200ng)exnasetmii2ul(2)將一步克隆反應液導入細胞中，從而使上述組裝的基因獲得表達，合成出催化2,3丁二醇合成的蛋白，以下以熱擊轉化大腸桿菌和電擊轉化丙酮丁醇梭菌為例來說明。表8大腸桿菌熱擊轉化步驟(3)丙酮丁醇梭菌電擊轉化：將一步克隆反應液與e.colitop10混合，e.colitop10購自北京天根生化科技有限公司(目錄號cb104)。pan2為甲基化質粒(heap,j.t.,pennington,o.j.,cartman,s.t.,carter,g.p.,minton,n.p.,2007.theclostron:auniversalgeneknock-outsystemforthegenusclostridium.jmicrobiolmethods70,452-464)。並將轉化後細胞塗布於含有氨苄青黴素和四環素素的lb平板上，挑取單菌落富集培養後提取質粒，提取到的質粒即是甲基化後的質粒。(4)厭氧條件下，取2xytg培養基培養的生長至對數中期的c.acetobutylicumb3(保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，cgmccno.5234；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，該菌株的信息在申請號為201210075094.x的中國專利中詳細公開)培養液60ml，4℃、4000rpm離心10min棄去上清，加入足量預冷的電轉緩衝液epb(270mm蔗糖，5mmnah2po4，ph7.4)，洗滌兩次，並用2.3mlepb重懸。然後取570ul加入0.4cm電轉杯放置在冰浴中冷卻，並加入20ul甲基化的構建質粒，冰浴放置2min。2.0kv電壓，25uf電容進行電轉化。隨後將電轉液加入到1ml37℃的2xytg培養基中復甦培養4h，離心收集細胞100ul並將細胞塗布於含有20ug/ml甲碸黴素的p2平板中。厭氧培養24-36h後，獲得含有構建質粒的重組丙酮丁醇梭菌。實施例3：為了更好的展示同工酶催化合成2,3-丁二醇這一方法的應用，在此以丙酮丁醇梭菌為同工酶表達的宿主、以葡萄糖為發酵底物催化合成2,3-丁二醇。培養條件：丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicumb3(cgmcc5234),以下簡稱b3)基因工程菌在平板上(加入1.5g/l瓊脂粉的p2液體培養基)進行活化後，轉接入種子液靜止培養12-16h後，以10％(v/v)的接種量接入到含有50-60g/l的葡萄糖培養基中發酵120h。發酵液組分用氣相色譜檢測，氣相色譜檢測條件如下：火焰離子檢測器(fid)，agilenthp-innowax19091n-236毛細管色譜柱(60m×0.25mm×0.25um)，n2為載氣，流速2ml/min，分流比10：1，h2流速30ml/min，空氣流速300ml/min，進樣口溫度240℃，檢測器250℃，柱溫(程序升溫)：70℃保留0.5min，然後以20℃/min的速率升溫到190℃，保留4min。表9表達不同2,3-丁二醇脫氫酶基因的發酵數據a表示abr33642和yp_001634733各自單獨連接在表達載體上於細胞中共表達；b表示abr33642和yp_001634733兩個基因一起連接在表達載體於細胞中共表達；由表9數據可知，通過將2,3-丁二醇脫氫酶蛋白的合成基因導入細胞中，能夠表達出催化2,3-丁二醇合成的蛋白進而成功生產出2,3-丁二醇。然而，各種基因編碼出來的2,3-丁二醇合成蛋白的催化性能有所差異。如上表中abr33642、yp_001634733表達出來的蛋白催化2,3-丁二醇合成的能力相對降低，但是能夠將前體物質乙偶姻轉化完全。np_388505、abr77284表達出來的蛋白催化2,3-丁二醇合成的能力較強，但是乙偶姻的轉化不完全。因此，本研究以這些催化性能能夠優勢互補的2,3-丁二醇脫氫酶蛋白進行共同催化合成2,3-丁二醇，結果表明既能提高2,3-丁二醇產量又能實現前體物質轉化的徹底性，是一種創新而有應用價值的方法。表10np_391481與2,3-丁二醇脫氫酶基因共表達的工程菌發酵數據催化乙偶姻合成2,3-丁二醇的主要蛋白是2,3-丁二醇脫氫酶，但是為了提高2,3-丁二醇的合成效率，可以將2,3-丁二醇脫氫酶基因與其他相關基因進行共表達，從而實現合成通量的提高。比如本研究除了2,3-丁二醇脫氫酶基因之外，還同時表達了用於乙偶姻合成的乙醯乳酸脫羧反應蛋白編碼基因，與只有2,3-丁二醇脫氫酶基因表達的實施例(表9)相比，2,3-丁二醇的產量明顯提高。表11np_391481與2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因之間加入rbs序列進行表達的發酵數據菌株名稱乙偶姻(g/l)2,3-丁二醇(g/l)b3(np_391481-rbs-np_388505)0.97.9b3(np_391481-rbs-abr33642)0.015.0b3(np_391481-rbs-abr77284)1.36.5b3(np_391481-rbs-yp_001634733)0.024.3當多個基因連接在同一個表達載體上進行表達時，為了提高各基因的表達，可以通過在基因之間加入核糖體結合位點rbs的方式提高基因的表達強度。本例在兩個基因之間加入rbs序列(aggaggttagttaga)後，質粒上的基因得到更好地表達，2,3-丁二醇的產量進一步提升。表12np_391481及多個2,3-丁二醇脫氫酶基因共表達的數據通過將多個不同來源的2,3-丁二醇脫氫酶基因與單個乙醯乳酸脫羧反應編碼基因共表達，以b3(np_391481-rbs-np_388505-rbs-abr33642)工程菌株為例，發酵終產物中乙偶姻的含量僅為0.01g/l，幾乎可以忽略。而b3(np_391481-rbs-np_388505-rbs-abr33642)工程菌株2,3丁二醇的產量則達到7.2g/l。在非目的產物的濃度極低甚至可以忽略的情況下，進行目的產物的分離與純化將變得更加簡單。若將此種方法應用於工業化發酵生產中，不僅可以降低勞動強度，更可以節約經濟成本，同時也降低了分離過程中各種化學物質殘留對環境產生的影響。實施例4：同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法，不但能應用於以葡萄糖為底物進行細胞發酵合成2,3-丁二醇，也能應用於以2,3-丁二醇合成前體乙偶姻為底物的細胞催化過程中。將實施例3表十二中的b3(np_391481-rbs-np_388505-rbs-yp_001634733)菌株在含有15g/l的葡萄糖的p2培養基中37℃培養12h後，加入10g/l的乙偶姻進行細胞催化反應，反應時間24h，最終能獲得2,3-丁二醇17g/l(主要產量由前體物質乙偶姻轉化而來，部分來自於以葡萄糖為底物的細胞代謝)，乙偶姻殘留不足0.1g/l，可見乙偶姻轉化率接近100％。因此，本發明同工酶共催化的方法能用於酶催化或者含有酶的細胞的催化過程中。實施例5：在本發明的應用方面，本發明同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法不但能用於2,3-丁二醇的高效生產過程中，還能用於涉及2,3-丁二醇的其他生物過程中，這些生物過程可能並非以2,3-丁二醇的合成為目標，但是通過採用本發明同工酶共催化合成2,3-丁二醇的方法能夠有效地調控這些生物過程，使其有更好的性能。如表十三所示，以生物丁醇發酵為例，丁醇發酵過程產生大約30％(w/w)的廉價副產物丙酮，濃度達到5g/l以上。通過在丁醇發酵中構建同工酶共催化合成2,3-丁二醇的過程，如以實施例3表十二中的b3(np_391481-rbs-np_388505-rbs-yp_001634733)用於生物丁醇發酵，幾乎能夠徹底消除丁醇發酵過程中大量的廉價副產物丙酮，使其濃度不足0.3g/l，從而整體提升丁醇發酵過程的總產品價值，同時讓發酵產物更純更易於後續的分離。表13本發明在生物丁醇發酵過程中的應用效果sequencelisting南京工業大學同工酶共催化合成2,3-丁二醇的基因工程菌及其構建方法與應用sg2017012400169patentinversion3.5140dnaartificialsequencenp_388505-f1aaaagggagtgtcgacatatgaaggcagcaagatggcata40246dnaartificialseque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0atggagcaaggtcagatccgcggccgtatggttatcgatctgcgtagctaa1011681047dna來源於產乙醇梭菌(c.autoethanogenum)的2,3-丁二醇脫氫酶基因bdh68atgcgcgccgtctattatgaagcgtttggtcagatgccatggatcgccacgctgcccgat60ccagccccaacgccagatggtgtcgtgctcgcagtacgcgctaccggcctgtgtcgtagc120gactggcatggctggatggggcatgatcccgatattaagctgccgcatgtgccaggccac180gaactggccggcgagattgttgccgtcggatcacaggttcggcgctggcgaatcggtgat240cgggtcactgttcccttcgtgtgtgcctgtggtttttgccctcagtgtcaggccggtcag300caacaggtgtgtgacaaccagtttcaaccgggattcacgcattggggatcgtttgctgaa360tacgttgccattgatcgcgccgatctgaatctggtgcgcttgcctgccgatatgagcttc420acgactgccgccagtctggggtgtcgttttgcaactgcctttcgcgccgtcgttgatttg480ggccaggtacgtggaggcgagtgggtggcggtttacgggtgtggtggcgttggtctctcg540gcgattatgttagcctctgccctcggtggacaggtgatcggaatcgatattaacctggaa600cggctggcactggctcgggcggtaggggcaacggcggtgattgatgccactaccgaaccg660gatgtggtaagcgtggttcgcgatctcagccgcggtggggtacacctcgcgattgatgcg720ttgggtagtcctatgacctgcgccaatgccattgccagtctgcggaagcgcgggcgccat780gtgcaggttggtctgctgctggccgaccaacggatgcctccgttgccgatggatatcgtg840gttgcgcgtgagttgacgattatgggaagccatgggatgcaggcttaccgctatgatgcg900atgctcgacctcatccagtctggcaaagtacaaccgcagcgcctgattggccgcacgatt960agcctgagtgaagcaccggcggcgctggtcgatctcgatagtttccgtggttctggggtg1020acggtgattacagagtttcagggttag104769768dna來源於枯草芽孢桿菌（b.subtilis168）的乙醯乳酸脫羧酶基因alsd69atgaaacgagaaagcaacattcaagtgctcagccgtggtcaaaaagatcagcctgtgagc60cagatttatcaagtatcaacaatgacttctctattagacggagtatatgacggagatttt120gaactgtcagagattccgaaatatggagacttcggtatcggaacctttaacaagcttgac180ggagagctgattgggtttgacggcgaattttaccgtcttcgctcagacggaaccgcgaca240ccggtccaaaatggagaccgttcaccgttctgttcatttacgttctttacaccggacatg300acgcacaaaattgatgcgaaaatgacacgcgaagactttgaaaaagagatcaacagcatg360ctgccaagcagaaacttattttatgcaattcgcattgacggattgtttaaaaaggtgcag420acaagaacagtagaacttcaagaaaaaccttacgtgccaatggttgaagcggtcaaaaca480cagccgattttcaacttcgacaacgtgagaggaacgattgtaggtttcttgacaccagct540tatgcaaacggaatcgccgtttctggctatcacctgcacttcattgacgaaggacgcaat600tcaggcggacacgtttttgactatgtgcttgaggattgcacggttacgatttctcaaaaa660atgaacatgaatctcagacttccgaacacagcggatttctttaatgcgaatctggataac720cctgattttgcgaaagatatcgaaacaactgaaggaagccctgaataa7687015dnarbs序列70aggaggttagttaga15當前第1頁12