提高截短側耳素產量的方法
2023-11-12 07:09:12 5
提高截短側耳素產量的方法
【專利摘要】本發明提供了提高截短側耳素產量的方法。具體地，本發明提供了一種改良截短側耳素生產菌株的方法，該方法適用範圍廣，效率高。本發明還提供了一種經改良的截短側耳素生產菌株。由於採用新穎的經改良的截短側耳素生產菌，因此可大幅提高截短側耳素產量。此外，本發明還提供了一種截短側耳素的生產方法，由於該生產方法對現有生產工藝可不進行修改和調整，因此成本低。
【專利說明】提高截短側耳素產量的方法
【技術領域】
[0001] 本領域涉及生物【技術領域】，具體地，涉及了一種提高截短側耳素（Pleuromutilin) 產量的方法。
【背景技術】
[0002] 截短側耳素是化學合成泰妙菌素（Tiamulin)的前體，分子式為C22H 34O5，分子量為 378. 51，屬二廠類化合物，是高等真菌擔子菌側耳屬（Pleurotus mutilus)或其它真菌的次 級代謝產物，是一種天然的具有廣泛抗菌活性的二萜類化合物。
[0003] 雖然我國截短側耳素的產能大，雖然本領域已經有利用不同的生物體來生產截短 側耳素的技術，然而生產菌株的效價水平較低，增加了生產的成本。這大大限制了截短側耳 素的應用。
[0004] 綜上所述，本領域迫切需要開發有效的提高截短側耳素產量的方法。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種有效的提高截短側耳素產量的方法。
[0006] 本發明提供了通過輔酶因子再生從而提高截短側耳素產量的方法。
[0007] 在本發明的第一方面提供了一種雙酶偶聯的構建物，所述構建物包括：
[0008] (a)用於生產外源酮基還原酶（KR)的第一亞構建物，
[0009] 其中所述的第一亞構建物包括第一啟動子、與所述第一啟動子可操作地連接的酮 基還原酶的編碼序列、和終止密碼子；
[0010] (b)用於生產外源葡萄糖脫氫酶（⑶H)的第二亞構建物，
[0011] 其中所述的第二亞構建物包括第二啟動子、與所述第二啟動子可操作地連接的酮 基還原酶的編碼序列、和終止密碼子，
[0012] 其中所述的第一亞構建物和第二亞構建物是相互獨立的、或是一體的。
[0013] 在另一優選例中，所述的酮基還原酶（KR)來源於來源於釀酒酵母、黑麴黴、紫杉、 雙孢蘑菇、或腸膜明串珠菌。
[0014] 更佳地，所述的酮基還原酶選自下組：
[0015] 來源於釀酒酵母的HMGR(Y);
[0016] 來源於黑麴黴的HMGR(A);
[0017] 來源於紫杉的HMGR(T);
[0018] 來源於雙孢蘑菇的HMGR(B);
[0019] 來源於腸膜明串珠菌亞種 J18 (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Strain J18)的 HMGR(L)。
[0020] 在另一優選例中，所述的葡萄糖脫氫酶（GDH)來源於枯草芽孢桿菌、巨大枯草芽 孢桿菌的葡萄糖脫氫酶、釀酒酵母、黑麴黴、紫杉。
[0021] 更佳地，所述的葡萄糖脫氫酶（⑶H)選自下組：
[0022] 來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase GDH(B))；
[0023] 來源於巨大枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶H(M));
[0024] 來源於釀酒酵母的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶H(Y));
[0025] 來源於黑麴黴的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶H(A);
[0026] 來源於紫杉的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶H(T)。
[0027] 在另一優選例中，所述的酮基還原酶（KR)和葡萄糖脫氫酶（GDH)選自下列組合：
[0028] 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄 糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶H(B))組合成的 HMGR(Y)-GDH(B)偶聯組合；
[0029] 來源於黑麴黴的HMGR(A)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖 脫氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶H(B))組合成的 HMGR(A)-GDH(B)偶聯組合；
[0030] 來源於紫杉的HMGR(T)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖脫 氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶H(B))組合成的 HMGR(T)-GDH(B)偶聯組合；
[0031] 來源於雙孢蘑菇的HMGR(B)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄 糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶H(B))組合成的 HMGR(B)-GDH(B)偶聯組合；
[0032] 來源於腸膜明串珠菌亞種 J18 (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Strain J18)的 HMGR(L)與來源於枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)的 葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶H(B))組合成的HMGR(L)-GDH(B)偶聯組合；
[0033] 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於巨大枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶 (Glucose Dehydrogenase GDH(M))組合成的 HMGR(Y)-GDH(M)偶聯組合；
[0034] 來源於釀酒酵母的HMGR (Y)與來源於釀酒酵母的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶H(Y))組合成的 HMGR(Y)-GDH(Y)偶聯組合；
[0035] 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於黑麴黴的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase GDH(A)組合成的 HMGR(Y)-GDH(A)偶聯組合；
[0036] 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於紫杉的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶H(T))組合成的 HMGR(Y)-GDH(T)偶聯組合。
[0037] 在本發明第二方面，提供了一種載體，所述表達載體攜帶本發明第一方面所述的 構建物。
[0038] 在本發明第三方面，提供了一種載體組合，所述載體組合包括第一載體和第二載 體，其中第一載體攜帶本發明第一方面所述的構建物的第一亞構建物，而第二載體攜帶本 發明第一方面所述的構建物的第二亞構建物。
[0039] 在本發明的第四方面，提供了一種基因工程的細胞，所述細胞含有本發明第三方 面所述的載體或第四方面所述的載體組合。
[0040] 在本發明的第五方面，提供了一種基因工程細胞，所述細胞的基因組中整合有本 發明第一方面所述的構建物；或者
[0041] 所述細胞的基因組中整合有（a)用於表達外源酮基還原酶（KR)的第一表達盒和 (b)用於表達外源葡萄糖脫氫酶（⑶H)的第二表達盒，
[0042] 其中所述的第一表達盒包括第一啟動子、與所述第一啟動子可操作地連接的酮基 還原酶的編碼序列、和終止密碼子；
[0043] 所述的第二表達盒包括第二啟動子、與所述第二啟動子可操作地連接的酮基還原 酶的編碼序列、和終止密碼子。
[0044] 在另一優選例中，所述的細胞是生產截短側耳素的工程菌。
[0045] 在另一優選例中，所述的細胞為底盤細胞；較佳地，所述細胞選自下組：斜蓋 燕（Clitopilus prunulus)、擔子菌側耳屬（Pleurotus mutilus)、截短側耳素產生斜 蓋 ? (Clitopilus passeckerianus)、猴頭 ? (Hericium erinaceus)、靈芝（Ganoderma lucidum)、雲芝（Coriolus versicolor)等高等真菌。
[0046] 在本發明的第六方面，提供了一種生產截短側耳素的方法，包括步驟：
[0047] 培養截短側耳素的生產菌，從而產生截短側耳素；
[0048] 其中所述的生產菌的基因組中整合有本發明第一方面所述的構建物；或者
[0049] 所述生產菌的基因組中整合有（a)用於表達外源酮基還原酶（KR)的第一表達盒 和（b)用於表達外源葡萄糖脫氫酶（GDH)的第二表達盒，
[0050] 其中所述的第一表達盒包括第一啟動子、與所述第一啟動子可操作地連接的酮基 還原酶的編碼序列、和終止密碼子；
[0051] 所述的第二表達盒包括第二啟動子、與所述第二啟動子可操作地連接的酮基還原 酶的編碼序列、和終止密碼子；
[0052] 以及從培養物中分離出截短側耳素。
[0053] 在本發明的第七方面，提供了一種對截短側耳素的生產菌進行改造的方法，包括 步驟：
[0054] (i)將本發明第一方面所述的構建物引入所述的截短側耳素的生產菌，從而獲得 經轉化的生產菌，其中所述的經轉化的生產菌的基因組中整合入本發明第一方面所述的構 建物。
[0055] 在另一優選例中，所述方法還包括步驟：
[0056] (ii)對經轉化的生產菌進行NADPH生產能力或截短側耳素的生產能力的篩選，從 而選出生廣能力提商的生廣菌。
[0057] 在另一優選例中，在步驟（i)中，通過根癌農桿菌轉化法進行轉化，從而將所述的 構建物引入所述的截短側耳素的生產菌。
[0058] 在另一優選例中，所述方法包括步驟：
[0059] 通過根癌農桿菌轉化系統，將外源HMGR基因和⑶H基因先後或同時轉入 Clitopilus prunulus。
[0060] 在另一優選例中，所述方法包括步驟：
[0061] 通過根癌農桿菌表達系統將將不同來源葡萄糖脫氫酶基因轉入到根癌農桿菌中， 即將⑶H基因與根癌農桿菌的表達載體PBI121構建重組載體（PBI-GDH)，然後轉入到根癌 農桿菌中；
[0062] 通過攜帶有重組載體PBI-GDH的根癌農桿菌與Clitopilus prunulus共培 養轉化⑶H至受體細胞Clitopilus prunulus中，獲得攜帶有外源⑶H的Clitopilus prunulus-GDH 菌株。
[0063] 在另一優選例中，所述方法包括步驟：
[0064] 通過根癌農桿菌表達系統將不同來源HMGR基因轉入到根癌農桿菌中，即將HMGR 基因與根癌農桿菌的表達載體PCAMBIA1301構建重組載體（pCAMBIA-HMGR)，然後轉入到根 癌農桿菌中；
[0065] 通過攜帶有重組載體pCAMBIA-HMGR的根癌農桿菌與攜帶有外源⑶H的 Clitopilus prunulus-GDH 共培養轉化 HMGR 至受體細胞 Clitopilus prunulus-GDH 中，獲 得攜帶有外源⑶H和HMGR的Clitopilus prunulus-GDH-HMGR工程菌株。
[0066] 在本發明的第八方面，提供了用本發明上述方法改造所獲得的經改良的工程菌。
[0067] 應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在 此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0068] 圖1顯示了 PBI121載體的電泳檢測圖。
[0069] 圖2顯示了枯草芽孢桿菌基因組電泳檢測圖。
[0070] 圖3顯示了⑶H基因擴增產物的電泳檢測圖，泳道1的條帶為得到的⑶H(B)基因。
[0071] 圖4顯示了⑶H⑶菌落PCR鑑定。
[0072] 圖5顯示了 PMD18T-GDH(B)質粒的電泳檢測圖。
[0073] 圖6顯示了⑶H⑶和PBI121雙酶切後的圖譜。各泳道如下：1為⑶H(B)，2為 PBI121。
[0074] 圖7顯示了 PBI-GDH(B)菌落PCR鑑定結果。泳道1-8對應於克隆管號。
[0075] 圖8顯示了 PGH-HMGR菌落PCR鑑定結果。泳道1-10對應於克隆管編號。
[0076] 圖9顯示了 PGH-HMGR質粒（左）和PGH-HMGR質粒PCR (右）電泳檢測圖。
[0077] 圖10顯示了 pCAMBIA1301載體與HMGR(L)酶切圖譜。各泳道如下：1為 PCAMBIA1301 載體，2 為 HMGR(L)。
[0078] 圖 11 顯示了 pCAMBIA1301-HMGR(L)菌落 PCR 鑑定。
[0079] 圖12顯示了載體PBI121-GDH的構建。
[0080] 圖 13 顯示了載體 pCMBIA1301-HMGR 的構建。
【具體實施方式】
[0081] 本發明人經過廣泛而深入的研究，首次將外源的酮基還原酶（KR)和外源的葡萄 糖脫氫酶（GDH)基因轉入截短側耳素生產菌株，從而大幅提高了截短側耳素的產量。在此 基礎上完成了本發明。
[0082] 本發明的實驗表明，將不同來源的外源酮基還原酶（KR)和葡萄糖脫氫酶（GDH)基 因轉化到目標底盤細胞（如Clitopilus prunulus)，經改良後的基因工程菌株，其截短側 耳素的產量可顯著提高（如18%或更高）。
[0083] 定義
[0084] 如本文所用，"酮基還原酶（KR) "指催化酮基發生還原反應的酶。酮基還原酶是氧 化還原酶的一種，在手性藥物合成中的具有廣泛的應用，如胺基酸的生產，羥基酸的合成， 醇類，醛類和酮基修飾，留體轉化等。
[0085] -種代表性的酮基還原酶是戊二醯單醯輔酶A還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl_CoA reductase，HMGR)。其發揮活性依賴於輔酶因子 NADPH0
[0086] 如本文所用，"葡萄糖脫氫酶（GDH) "指催化葡萄糖進行脫氫反應的酶。
[0087] 構建物和載體
[0088] 本發明提供了一種雙酶偶聯的構建物，所述構建物可用於生產（或輔助生產）輔 酶因子NADPH，並可用於顯著提高截短側耳素的產量。
[0089] 本發明的構建物包括：
[0090] (a)用於生產外源酮基還原酶（KR)的第一亞構建物，
[0091] 其中所述的第一亞構建物包括第一啟動子、與所述第一啟動子可操作地連接的酮 基還原酶的編碼序列、和終止密碼子；
[0092] (b)用於生產外源葡萄糖脫氫酶（GDH)的第二亞構建物，
[0093] 其中所述的第二亞構建物包括第二啟動子、與所述第二啟動子可操作地連接的酮 基還原酶的編碼序列、和終止密碼子，
[0094] 其中所述的第一亞構建物和第二亞構建物是相互獨立的、或是一體的。
[0095] 在本發明的一個實例中，將第一亞構建物克隆入一個載體，形成第一載體如 PCMBIA1301-HMGR ;將第二亞構建物克隆入另一載體，形成第二載體如pBI121-GDH。
[0096] 在另一優選例中，將二個亞構建物（串聯方式連接）克隆入同一載體。
[0097] 改良方法
[0098] 本發明還提供了一種對截短側耳素生產菌株進行改造或改良的方法。包括將本發 明所述的構建物引入底盤細胞，從而改善其生產截短側耳素的能力。
[0099] 一種優選的方法是通過T-DNA進行轉化。T-DNA是根癌農桿菌Ti (tumor- inducing)質粒的一部分，它能夠通過根癌農桿菌作用將插入其兩邊界之間的任何DNA序 列整合進基因組中.在沒有同源序列的情況下，T-DNA能夠進行非同源重組，而產生隨機插 入。本發明的實驗表明，即使對於非植物細胞，也可利用根癌農桿菌轉化系統，實現外源輔 酶因子雙酶偶聯組合的轉入。
[0100] 本發明的試驗證實，將外源酮基還原酶（KR)和葡萄糖脫氫酶（⑶H)基因轉入截短 側耳素生產菌株，得到改良後的基因工程菌株，提高截短側耳素的產量。
[0101] 截短側耳素的生產
[0102] 在本發明中，可採用常規的生產方法，採用常規的培養條件，進行截短側耳素的生 產。
[0103] 在本發明中，可根據所使用的生產菌，採用本領域常規的培養基、培養條件進行生 產。這些培養基等原料可以通過市售方式獲得，也可按常規方法進行製備。
[0104] 在本發明中，對於來源於真菌的底盤細胞，常用的培養基包括（但並不限於）：
[0105] 斜面培養基（g/L) :土豆180,葡萄糖25,瓊脂15,水餘量，pH7. 0。
[0106] 種子培養基（g/L):葡萄糖 45,酵母提取物 20,MgSO4O. 3,Ca(NO3) 2,0· LKH2PO4O. 5， 水餘量，ρΗ5. 0。
[0107] 發酵基本培養基（g/L):葡萄糖45,玉米漿粉25, MgSO4O. 2, CaC032,豆油3,水餘量， pHl. 0。
[0108] 一種常規的培養方法包括：
[0109] 將菌種接種到斜面培養基上,在35°C培養5天，對菌種進行活化；將活化的菌種接 種到種子培養基中，35°C、lOOr/min下進行一級種子培養，振搖培養5天，然後以5%的接種 量將一級種子液在相同的種子培養基、相同條件下進行二級種子培養，培養3天，得二級種 子液。按1%接種量轉入發酵培養基中，在35°C、500r/min、溼度60%、ρΗ1. 0、溶氧為100%的 條件下振搖培養l〇d，得發酵液；將發酵液用甲醇浸提、離心分離得浸提液，浸提液經濃縮、 結晶得截短側耳素。
[0110] 在本發明中，由於採用新穎的經改良的截短側耳素生產菌，因此可大幅提高截短 側耳素產量。
[0111] 本發明的主要優點包括：
[0112] (a)截短側耳素的產量高；
[0113] (b)對於生產工藝可不進行修改和調整，因此成本低；
[0114] (C)工程菌株改造和遺傳操作簡便，對底盤細胞無不利影響。
[0115] ⑷本發明方法的可適用於不同的生產菌株，適用範圍廣，效率高。
[0116] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本 發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0117] 囷株、質粒和基因
[0118] 根癌農桿菌 LBA4404,載體 pBI 121 (購自 Invitrogen)，載體 pCAMBIA1301，枯草芽 孢桿菌，大腸桿菌（E. coli)DH5a、TGl系中國科學院上海生物工程研究中心保藏；克隆載 體PMD-18T和PGH購自英俊生物公司，斜蓋菇細胞（Clitopilus prunulus)購自ATCC(保 藏號 ATCC34646)。
[0119] 目的基因：3-羥基-3-甲基戊二醯CoA還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl_CoA reductase，HMGR(L) (NC_016805. 1))基因在上海英俊 生物技術有限公司合成（PGH-HMGR)，華大基因測序驗證。
[0120] 主要試劑及試劑盒
【權利要求】
1. 一種雙酶偶聯的構建物，其特徵在於，所述構建物包括： (a) 用於生產外源酮基還原酶（KR)的第一亞構建物， 其中所述的第一亞構建物包括第一啟動子、與所述第一啟動子可操作地連接的酮基還 原酶的編碼序列、和終止密碼子； (b) 用於生產外源葡萄糖脫氫酶（GDH)的第二亞構建物， 其中所述的第二亞構建物包括第二啟動子、與所述第二啟動子可操作地連接的酮基還 原酶的編碼序列、和終止密碼子， 其中所述的第一亞構建物和第二亞構建物是相互獨立的、或是一體的。
2. 如權利要求1所述的構建物，其特徵在於，所述的酮基還原酶（KR)來源於來源於釀 酒酵母、黑麴黴、紫杉、雙孢蘑菇、或腸膜明串珠菌； 更佳地，所述的酮基還原酶選自下組： 來源於釀酒酵母的HMGR(Y); 來源於黑麴黴的HMGR(A); 來源於紫杉的HMGR(T); 來源於雙孢蘑菇的HMGR(B); 來源於腸膜明串珠菌亞種 J18(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides Strain J18)的 HMGR(L)。
3. 如權利要求1所述的構建物，其特徵在於，所述的葡萄糖脫氫酶（GDH)來源於枯草芽 孢桿菌、巨大枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶、釀酒酵母、黑麴黴、紫杉； 更佳地，所述的葡萄糖脫氫酶（GDH)選自下組： 來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase GDH(B))； 來源於巨大枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶Η (Μ)); 來源於釀酒酵母的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶Η(Υ)); 來源於黑麴黴的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶H(A); 來源於紫杉的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase⑶H(T)。
4. 如權利要求1所述的構建物，其特徵在於，所述的酮基還原酶和葡萄糖脫氫酶選自 下列組合： 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖脫 氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶Η(B))組合成的 HMGR(Y)_GDH(B)偶聯組合； 來源於黑麴黴的HMGR(A)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖脫氫 酶（Glucose Dehydrogenase ⑶Η(B))組合成的 HMGR(A)_GDH(B)偶聯組合； 來源於紫杉的HMGR(T)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖脫氫酶 (Glucose Dehydrogenase ⑶Η(B))組合成的 HMGR(T)_GDH(B)偶聯組合； 來源於雙孢蘑菇的HMGR(B)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖脫 氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶Η(B))組合成的 HMGR(B)_GDH(B)偶聯組合； 來源於腸膜明串珠菌亞種 J18(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides Strain J18)的HMGR(L)與來源於枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的葡萄糖脫氫酶 (Glucose Dehydrogenase ⑶H(B))組合成的 HMGR(L)-⑶H(B)偶聯組合； 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於巨大枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶（Glucose 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於釀酒酵母的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶Η(Y))組合成的 HMGR(Y)-GDH(Y)偶聯組合； 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於黑麴黴的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase (^㈧組合成的^^^⑴^^㈧偶聯組合； 來源於釀酒酵母的HMGR(Y)與來源於紫杉的葡萄糖脫氫酶（Glucose Dehydrogenase ⑶Η (T))組合成的HMGR (Y) -GDH (T)偶聯組合。
5. -種載體，其特徵在於，所述表達載體攜帶權利要求1所述的構建物。
6. -種載體組合，其特徵在於，所述載體組合包括第一載體和第二載體，其中第一載體 攜帶權利要求1所述的構建物的第一亞構建物，而第二載體攜帶權利要求1所述的構建物 的第二亞構建物。
7. -種基因工程的細胞，其特徵在於，所述細胞含有權利要求5中所述的載體或權利 要求6所述的載體組合。
8. -種基因工程細胞，其特徵在於，所述細胞的基因組中整合有權利要求1所述的構 建物；或者 所述細胞的基因組中整合有（a)用於表達外源酮基還原酶（KR)的第一表達盒和（b) 用於表達外源葡萄糖脫氫酶（GDH)的第二表達盒， 其中所述的第一表達盒包括第一啟動子、與所述第一啟動子可操作地連接的酮基還原 酶的編碼序列、和終止密碼子； 所述的第二表達盒包括第二啟動子、與所述第二啟動子可操作地連接的酮基還原酶的 編碼序列、和終止密碼子。
9. 一種生產截短側耳素的方法，其特徵在於，包括步驟： 培養截短側耳素的生產菌，從而產生截短側耳素； 其中所述的生產菌的基因組中整合有權利要求1所述的構建物；或者 所述生產菌的基因組中整合有（a)用於表達外源酮基還原酶（KR)的第一表達盒和（b) 用於表達外源葡萄糖脫氫酶（GDH)的第二表達盒， 其中所述的第一表達盒包括第一啟動子、與所述第一啟動子可操作地連接的酮基還原 酶的編碼序列、和終止密碼子； 所述的第二表達盒包括第二啟動子、與所述第二啟動子可操作地連接的酮基還原酶的 編碼序列、和終止密碼子； 以及從培養物中分離出截短側耳素。
10. -種對截短側耳素的生產菌進行改造的方法，其特徵在於，包括步驟： (i)將權利要求1所述的構建物引入所述的截短側耳素的生產菌，從而獲得經轉化的 生產菌，其中所述的經轉化的生產菌的基因組中整合入權利要求1所述的構建物； 較佳地，在步驟（i)中，通過根癌農桿菌轉化法進行轉化，從而將所述的構建物引入所 述的截短側耳素的生產菌。
【文檔編號】C12N15/63GK104278044SQ201310294509
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2013年7月12日
【發明者】李平作, 王莉, 郅曉樂, 葉晴, 趙國屏 申請人:中國科學院上海生命科學研究院