Dna晶片組合延伸檢測鹼基連續突變的方法

2023-11-09 22:50:07 2

專利名稱：Dna晶片組合延伸檢測鹼基連續突變的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種低成本單鹼基核酸序列變化DNA晶片檢測方法，尤其涉及一種多樣本、多位點的準確性高，成本低，通量高的核酸序列單鹼基變化檢測方法。
背景技術：
隨著人類基因組計劃和 各種模式生物基因組計劃的開展和完成，使人類步入了後基因時代，對當代的生物學研究和醫學研究產生了巨大的影響，分子生物學相關學科得到了迅猛的發展。從基因水平上認識生命的差異，疾病發生、發展的規律，以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。就基因序列分析而言，後基因時代的重點已由全基因組序列測定轉移到了對基因組中個體遺傳差異及物種間遺傳差異的比較。在諸多基因變異中，SNP是研究基因遺傳與變異時一種高效的量化標誌。SNP既與單基因遺傳病相關，也可能與多基因遺傳病相關。目前已經確定4000多種遺傳疾病是由單鹼基突變引起的，而一些重大疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病、抑鬱症、哮喘等，是受眾多基因以及環境因子共同作用，通過對於某一特定疾病的基因組樣本中大量突變基因型進行大規模鑑定和檢測，可以獲得有關與該疾病相關基因型的信息。SNP分析，除對疾病預防、用藥選擇、新藥研發、疾病預後等諸多個體化醫藥學領域具有十分關鍵的影響，還對製藥業、乃至整個生物學的廣泛領域和最基本的遺傳與變異等重大課題，具有極大的促進作用。人類基因組單體型圖計劃(HapMapProject)的實施啟動了在整個基因組範圍內尋找SNP位點的計劃。國際上十大製藥巨頭公司和Wellcome Trust聯合組成了 SNP協作組，我國南方基因組中心和北方(華大)基因中心均在開展各民族SNP基因位點的篩查工作。我國國家高技術研究發展計劃(「十一五」863計劃)生物和醫藥技術領域第二批重大項目申請指南中提供了上億資金實施「重大疾病的分子分型和個體化診療」重大項目，將以腫瘤(肺癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、白血病)、心血管疾病(動脈粥樣硬化)、老年神經變性病(老年性痴呆、帕金森病)、精神系統疾病(抑鬱症和精神分裂症)、糖尿病和慢性肝病等作為研究對象，建立重大疾病臨床標本庫和資料庫以及臨床試驗網絡，研究開發出針對上述疾病的易感人群篩選、臨床前期發現、早期病人診斷及指導個體化治療相關的特異性分子標記物，建立各種疾病的分子分型標準。這些公用數據的不斷結累和豐富，無疑將會建立起疾病和基因間的緊密關係。在這種狀況下，就某種疾病而言，需要檢測的SNP位點可能從百萬級的數量下降至數千個或數百個不等。當可以從數千個甚至數百個SNP位點不需要在從數十億個鹼基序列得到特定研究目的必要信息時，其巨大的科學與經濟價值已不言而喻。因此，生物科技緊接著面臨如何快速、可靠地對已知SNP位點進行檢測的問題，因此，這將標記著巨大的商業機會蘊涵在其中，並成為為眾多商家看好的潛在的巨大市場。與為數有限的蛋白質測序和DNA序列分析方法相比，基因突變(包括SNP)分析的基本方法在數量上已達20餘種。種類繁多的分析方法，既反映了研究基因突變(包括SNP)分析方法在生物學和醫學領域所受到的重視程度，也反映出任一單個方法尚無法滿足後基因時代對基因突變(包括SNP)分析的要求。目前基於PCR產物微陣列晶片的檢測方法，主要包括雙突光標記的特異性探針雜交(Ji，et al. Mutation Research-fundamentaland Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2004, 548 (1-2), 97-105)、雙突光標記的探針連接(Tang, et al. Human mutation, 2009, 30 (10) : 1460-1468)、以及單喊基延伸(Shan,al. Clinica Chimica Acta,2009, (1-2),11-17)這三類方法來實現基因型的高通量檢測的。然而，這三類方法都只針對檢測序列中一個位置的一種鹼基(如鹼基A)變化成另外一種鹼基(如鹼基T)的形式。在這種情況下，所有的樣本只有三類模板即純合子A、純合子T和雜合子A/T。而當檢測序列的變化一個位置的一種鹼基(如鹼基A)變化成其它三個鹼基(如個G、C、T)，或者二個鹼基，其所有的樣本的模板就大大增加，比如人類KRAS基因12、13密碼子上的突變則與結直腸癌患者的個體化用藥相關，但因其有7種突變(G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D)，就沒有辦法採用上述這三類微陣列晶片方法來實現對樣本 的有效檢測。高通量DNA測序技術是近年來發展起來的高技術之一，通過一次合成反應實現對合成核苷酸類型或者數目的有效判讀實現未知DNA序列的測定。在高通量合成測序方法中，一種是通過限制加入核苷酸的種類，即是簡單地每次只加一種核苷酸的方法，要麼通過檢測反應實時釋放出可識別的分子(焦磷酸測序技術、離子半導體測序技術、螢光焦磷酸測序技術等)，或者識別摻入合成鏈中的標記分子確定鹼基個數；另一種是通過3』端羥基可逆封閉核苷酸單體(Illumina公司測序技術等)，或者採用虛擬可逆終止核苷酸單體(Helicos BioSciences公司測序技術等)一次將四種核苷酸加入測序反應,但只發生合成一個核苷酸的方法來實現鹼基種類的確定。而當多個自由3端羥基的核苷酸進行合成測序時，即使用不同標記物標記不同的核苷酸種類，也無法知道那種核苷酸發生合成反應在前，那種核苷酸發生合成反應在後，而無法判斷具體的序列。而當測定序列為只有可能的幾種方式之一的情況下，採用多個自由3端羥基的核苷酸進行合成時，是可以確定具體的序列的。

發明內容
技術問題本發明提出一種多核苷組合延伸的、單鹼基核酸序列變化DNA晶片檢測方法，將樣本一段已知核酸序列中的單鹼基的各種可能變化的確定是通過雜交到固定的樣本核酸序列上的至少一個鹼基延伸的組合檢測來確定。技術方案一種DNA晶片組合延伸檢測鹼基連續突變的方法，已知一段核酸序列的待檢樣本中的至少一個單鹼基的各種可能變化的確定是通過一個雜交到固定的樣本核酸序列上的至少一個鹼基延伸的組合檢測來確定的，具體步驟為步驟I)擴增利用包含一個5』端修飾活性基團的PCR引物，對待檢樣本進行平行擴增；步驟2) DNA晶片及微陣列的製備將不同待檢樣本的擴增產物經過濃縮後點樣於能與上述PCR引物5』端修飾活性基團結合、經過修飾的玻璃片上，使不同待檢樣本的PCR產物的一條單鏈固定在玻璃片上，構建得到包含所有待檢樣本的一組DNA晶片或者一張晶片上的一組DNA微陣列；步驟3)檢測根據檢測位點所包含的可能信息，在不同的DNA晶片或者一張晶片的幾個DNA微陣列進行延伸檢測；a)在DNA晶片經過變性、並雜交測序引物後，進行包含螢光標記的核苷酸延伸，並記錄所有樣本該次延伸的結果；b)在DNA晶片經過變性、並雜交測序引物後，先用非標記的核苷酸延伸到需要檢測的鹼基位置，然後進行包含螢光標記的核苷酸延伸，並記錄所有樣本該次延伸的結果；c)根據需要，變換不同的非標記、標記的核苷酸延伸方式，按照步驟b)的方式實施檢測；最後，將所有檢測中不同樣本的信息集合，從而實現多樣本中一個或者多個單鹼基的各種可能變化的檢測。所述螢光單體為不同螢光染料標記不同的dNTP單體或者ddNTP。所述PCR引物5』端修飾的活性基團是在熱條件下穩定的氨基、生物素或丙烯醯胺，所述玻璃片的修飾基團分別為醛基、羧基、親和素或丙烯。一種DNA晶片組合延伸檢測多單樣Kras基因12、13密碼子突變的方法，步驟為
將所有需檢測的樣本處理後提取DNA用作擴增模板；用一對PCR引物分別將所有樣本中待檢測的包含Kras基因12、13密碼子的序列進行 PCR 擴增，其中上遊引物5 』 -CGTCTGCAGTCAACTGGAATT ;下遊引物5 』 -NH2-TTTTTTTTTCCTGACATACTCCCAAGGAAA ；將PCR產物用異丙醇沉澱，並用乙醇洗滌2次後乾燥除去乙醇；用pH = 9碳酸緩衝液溶解所有樣本PCR產物，充分溶解的PCR產物用於點樣製作三張相同的DNA晶片，點樣時記錄樣本在DNA晶片上的位置編碼，同一 DNA晶片上每個樣本DNA晶片上只有一個陣點，或有多個重複；各加入2uM的延伸引物5』 -TTTGAACACCATCAACCTCGA分別與三張晶片雜交；在第一張DNA晶片上加入IuM Cy5_dTTP和IuM Cy3_dGTP的延伸反應液，進行延伸反應；延伸反應完成後，再加入IuM Cy5-dATP的延伸反應液進行延伸反應；在第二張DNA晶片上加入含有2uM dCTP的延伸反應液，延伸反應完成後，洗去未參與延伸反應的dCTP，然後加入含有0. IuM/IuM的dGTP/Cy3-dGTP和0. IuM/IuM的dATP/Cy5_dATP的延伸反應液，進行延伸反應；在第三張DNA晶片上加入含有2uM dCTP和2uM dATP的延伸反應液，延伸反應完成後，洗去未參與延伸反應的dCTP和dATP，然後加入含有0. IuM/IuM的dTTP/Cy5_dTTP和0. IuM/IuM的dGTP/Cy3-dGTP的延伸反應液，進行延伸反應；反應結束後，洗去未參與延伸反應的標記物，然後掃描，並記錄三張DNA晶片上每個位置Cy5和Cy3螢光的信號強度；根據第一、第二和第三張晶片掃描的結果，確定DNA晶片上每個陣點樣本的DNA序列，實現所有樣本Kras基因12、13密碼子序列的檢測陣點在第一、第二張晶片掃描無明顯的螢光信號，第三張晶片掃描具有Cy5信號，則序列為GAT GGC ；陣點在第一晶片掃描無明顯的突光信號,第二張晶片掃描同時具有Cy5和Cy3信號，第三張晶片掃描具有Cy3信號，則序列為GCT GGC ；陣點在第一晶片掃描無明顯的螢光信號，第二張晶片掃描同時具有Cy5信號，第三張晶片掃描具有Cy3信號，且Cy5信號的強度大約是Cy3信號強度的2倍，則序列為GTTGGC ；陣點在第一晶片、第三張晶片掃描具有Cy5信號螢光信號，第二張晶片掃描無明顯螢光信號，則序列為AGT GGC ；陣點在第一、第二張、第三張晶片掃描均具有Cy3信號，則序列為CGT GGC ；陣點在第一、第二晶片掃描均具有Cy5的螢光信號，第三張晶片掃描具有Cy3信號，則序列為TGT GGC ；陣點在第一晶片掃描無明顯的螢光信號，第三張晶片掃描具有Cy5的信號，第三張晶片掃描具有Cy5信號，則序列為GGT GAC ；陣點在第一張晶片掃描無明顯的螢光信號，第二晶片掃描均具有Cy5的螢光信號，第三張晶片掃描具有Cy3的信號，則序列為GGT GGC0有益效果本發明與現有技術相比，具有如下優點I.本發明的最大優點是實現了分析的序列片段中至少一個鹼基變化的同時檢測。由於序列是已知的，在沒有4個核苷酸全部加入到延伸反應體系的情況下，引物會延伸到與沒有加入的核苷酸互補的核苷酸單體前終止。基於這個原理，按照不同序列檢測的具體情況，可以設計不同的延伸方法，將螢光標記過的核苷酸單體延伸到序列需要檢測的鹼基位置，從而獲得待檢測信息。 2.本發明在保持現有基於DNA晶片的檢測方法的準確性、靈敏度的前提下，能夠快速、簡單地實現不同樣本的高通量檢測。每個樣本經PCR擴增後，擴增產物固定於DNA晶片上，並記錄樣本位置具體的信息。。這樣相同的DNA晶片經過相同的延伸引物的幾個多鹼基延伸檢測後，根據每次延伸檢測信息的組合來判斷每個樣本中鹼基變化的具體信息。而現有的基於DNA晶片的檢測方法則很難實現一個鹼基各種可能的變化形式以及多個鹼基各種可能的變化形式(尤其是涉及對多個位置鹼基的這種變化形式)的有效檢測。


圖I 是本發明以擬訂序列 AGCA 突變為(GGCA、CGCA, TGCA, ACCA, AACA, ATCA)的 7種可能為序列的多鹼基延伸DNA晶片檢測基因方法的示意圖。圖1(a)和(b)為不同樣本的PCR產物構成的包含7種可能序列的二張相同的DNA晶片。圖中I為PCR產物的模板，2為晶片載體，3為測序引物(測序引物後面的喊基為延伸反應後合成上去的喊基)，*代表Cy5標記，」代表Cy3標記。圖2是本發明以檢測Kras基因12、13密碼子(GGT GGC)常見的7種突變(GATGGC, GCT GGC, GTT GGC,AGT GGC, CGT GGC, TGT GGC, GGT,GAC)的多鹼基延伸 DNA 晶片檢測基因方法的示意圖。圖2(al)表示第一張晶片加入Cy5-dTTP和Cy3_dCTP的結果示意圖。圖2(a2)表不第一張晶片加入Cy5_dATP的結果不意圖。圖2(bl)表不第二張晶片加先入dCTP反應結束後再加入Cy5-dATP和Cy3_dGTP的結果示意圖。圖2 (b2)表示第三張晶片加先入dCTP和dATP反應結束後再加入Cy5-dTTP和Cy3_dGTP的結果示意圖。圖中I為PCR產物的模板，2為晶片載體，3為測序引物(測序引物後面的鹼基為延伸反應後合成上去的鹼基)，*代表Cy5標記，」代表Cy3標記。圖3是本發明用組合延伸檢測鹼基連續突變的方法檢測Kras基因12、13密碼子(GGT GGC)常見的 7 種突變(GAT GGC, GCT GGC, GTT GGC, AGT GGC、CGT GGC、TGT GGC, GGTGAC)中8個典型樣本在DNA晶片上的排布及其延伸掃描圖。(I)樣本在晶片上的排布(2)第一張晶片Cy3掃描圖(3)第一張晶片Cy5掃描圖(4)第二張晶片Cy3掃描圖(5)第二張晶片Cy5掃描圖(6)第三張晶片Cy3掃描圖(7)第三張晶片Cy5掃描圖其中，第一張晶片c點Cy5和Cy3掃描無明顯螢光信號，第二張晶片Cy5掃描圖的c點的亮度大約是第三張晶片Cy3掃描圖c點亮度的2倍，可以說明，第二張晶片c點的上模板連上了兩個Cy5-dTTP。同時，第一張晶片C點Cy5和Cy3掃描無明顯突光信號,第二張晶片Cy5掃描圖的h點的亮度和第三張晶片Cy3掃描圖h點的亮度差不多。由此可見，第二張晶片的h點上的模板連上了一個Cy5-dTTP。由此，可以區分連上兩個Cy5-dTTP的模板是含有GTT GGC的序列，為3號模板，連上一個GTT GGC的h點是8號模板。其他模板的區分可以按照實施例2所講的方法。
具體實施例方式以下將結合附圖對本發明作進一步說明。實施例I結合圖I說明，將所有待檢測的樣本提取DNA並進行PCR擴增後，其PCR產物I通過5』端修飾基團固定在晶片載體2上(如果PCR引物修飾了氨基，則用表面修飾醛基的玻璃載片固定；如果PCR引物修飾了生物素，則用表面修飾親合素的玻璃載片固定)，構建DNA晶片，記錄不同樣本在DNA晶片上的點樣位置，同一 DNA晶片上可以只有一個微陣列，也可以有多個微陣列。微陣列中每個模板可以只點一個點，也可以點多個點。當PCR產物固定在玻片上後，對其進行變性。變性過後，將測序引物雜交到單鏈的模板上。當測序引物與模板雜交後，進行多鹼基延伸的序列分析在第一張DNA晶片的微陣列上加入含有dTTP/Cy5-dTTP ( = 0. IuM/IuM)和dCTP/Cy3-dCTP ( = 0. IuM/IuM)的延伸反應液，在DNA聚合酶的作用下進行延伸反應，反應條件50°C反應10分鐘。反應結束後，用2XSSC+10% SDS和0. 2XSSC+1% SDS洗液洗去未參與延伸反應的Cy5-dTTP和Cy3-dCTP標記物，再用氮氣吹乾，然後用掃描儀(如北京博奧生物晶片有限責任公司的Luxscan-10K/A等)掃描，並記錄DNA晶片上每個位置Cy5和Cy3突光的信號強度。在第二張DNA晶片的微陣列上加入含有dTTP (2uM)的延伸反應液，在DNA聚合酶的作用下進行延伸反應，反應條件50°C反應10分鐘，延伸反應結束後，用1XTEMP，1%BSA, 0. IMDTT清洗緩衝液洗淨片子、吹乾，然後加入0. 025U/ y L的Apyrase，室溫反應5分鐘降解未參與延伸反應的dTTP，用1XTEMP，1% BSA, 0. IM DTT清洗緩衝液洗滌，然後加入含有 dATP/Cy5-dATP( = 0. IuM/IuM)和 dGTP/Cy3_dGTP( = 0. IuM/IuM)的延伸反應液，反應結束後，用2XSSC+10% SDS和0. 2XSSC+1% SDS洗液洗去未參與延伸反應的Cy5_dATP和Cy3-dGTP標記物，再用氮氣吹乾，然後掃描，並記錄DNA晶片上每個位置Cy5和Cy3螢光的信號強度。根據第一和第二張晶片掃描的結果，確定DNA晶片上每個陣點(樣本)的DNA序列(參見表I)如果陣點在第一張晶片掃描結果同時具有Cy5和Cy3信號，第二張晶片掃描無明顯的突光信號，則屬於編號為I的序列(AGCA)；如果陣點在第一張晶片掃描結果為Cy3，第二張晶片掃描無明顯的螢光信號，則屬於編號為2的序列(GGCA)；如果陣點在第一張晶片掃描無明顯的螢光信號，第二張晶片掃描結果為Cy3，則屬於編號為3的序列(CGCA)；如果陣點在第一張晶片掃描無明顯的螢光信號，第二張晶片掃描結果為Cy5，則屬於編號為4的 序列(TGCA)；如果陣點在第一張晶片掃描結果為Cy5，第二張晶片掃描結果為Cy3，且第二張晶片上Cy3的強度大致為第一張晶片上Cy5的強度的2倍，則屬於編號為5的序列(ACCA)；如果陣點在第一張晶片掃描結果為Cy5,第二張晶片掃描結果為Cy3,且第一張晶片上Cy5的強度大致為第二張晶片上Cy3的強度的2倍，則屬於編號為6的序列(AACA)；如果陣點在第一張晶片掃描結果為Cy5，第二張晶片掃描同時具有Cy5和Cy3信號，則屬於編號為7的序列(ATCA)。表I :擬訂序列AGCA突變為NNCA的組合多鹼基延伸檢測結果
權利要求
1.DNA晶片組合延伸檢測鹼基連續突變的方法，其特徵在於已知一段核酸序列的待檢樣本中的至少ー個單鹼基的各種可能變化的確定是通過ー個雜交到固定的樣本核酸序列上的至少ー個鹼基延伸的組合檢測來確定的，具體步驟為 步驟I)擴增利用包含ー個5』端修飾活性基團的PCR引物，對待檢樣本進行平行擴增； 步驟2)DNA晶片及微陣列的製備將不同待檢樣本的擴增產物經過濃縮後點樣於能與上述PCR引物5』端修飾活性基團結合、經過修飾的玻璃片上，使不同待檢樣本的PCR產物的一條單鏈固定在玻璃片上，構建得到包含所有待檢樣本的ー組DNA晶片或者一張晶片上的ー組DNA微陣列； 步驟3)檢測根據檢測位點所包含的可能信息，在不同的DNA晶片或者一張晶片的幾個DNA微陣列進行延伸檢測；a)在DNA晶片經過變性、並雜交測序引物後，進行包含螢光標記的核苷酸延伸，並記錄所有樣本該次延伸的結果山)在DNA晶片經過變性、並雜交測序引物後，先用非標記的核苷酸延伸到需要檢測的鹼基位置，然後進行包含螢光標記的核苷酸延伸，並記錄所有樣本該次延伸的結果；c)根據需要，變換不同的非標記、標記的核苷酸延伸方式，按照步驟b)的方式實施檢測；最後，將所有檢測中不同樣本的信息集合，從而實現多祥本中一個或者多個單鹼基的各種可能變化的檢測。
2.根據權利要求I所述的DNA晶片組合延伸檢測鹼基連續突變的方法，其特徵在於螢光單體為不同螢光染料標記不同的dNTP單體或者ddNTP。
3.根據權利要求I所述的DNA晶片組合延伸檢測鹼基連續突變的方法，其特徵在於所述PCR引物5』端修飾的活性基團是在熱條件下穩定的氨基、生物素或丙烯醯胺，所述玻璃片的修飾基團分別為醛基、羧基、親和素或丙烯。
4.ー種DNA晶片組合延伸檢測多單樣Kras基因12、13密碼子突變的方法，其特徵在於步驟為 (1)將所有需檢測的樣本處理後提取DNA用作擴增模板； (2)用ー對PCR引物分別將所有樣本中待檢測的包含Kras基因12、13密碼子的序列進行 PCR 擴增，其中上遊引物5』 -CGTCTGCAGTCAACTGGAATT ;下遊引物5』 -NH2-TTTTTTTTTCCTGACATACTCCCAAGGAAA ； (3)將PCR產物用異丙醇沉澱，並用こ醇洗滌2次後乾燥除去こ醇； (4)用pH= 9碳酸緩衝液溶解所有樣本PCR產物，充分溶解的PCR產物用於點樣製作三張相同的DNA晶片，點樣時記錄樣本在DNA晶片上的位置編碼，同一 DNA晶片上每個樣本DNA晶片上只有ー個陣點，或有多個重複； (5)各加入2uM的延伸引物5』-TTTGAACACCATCAACCTCGA分別與三張晶片雜交； (6)在第一張DNA晶片上加入IuMCy5-dTTP和IuM Cy3_dGTP的延伸反應液，進行延伸反應；延伸反應完成後，再加入IuM Cy5-dATP的延伸反應液進行延伸反應；在第二張DNA晶片上加入含有2uM dCTP的延伸反應液，延伸反應完成後，洗去未參與延伸反應的dCTP，然後加入含有O. IuM/IuM的dGTP/Cy3-dGTP和O. IuM/IuM的dATP/Cy5_dATP的延伸反應液，進行延伸反應；在第三張DNA晶片上加入含有2uM dCTP和2uM dATP的延伸反應液，延伸反應完成後，洗去未參與延伸反應的dCTP和dATP，然後加入含有O. IuM/IuM的dTTP/Cy5_dTTP和O. IuM/IuM的dGTP/Cy3-dGTP的延伸反應液，進行延伸反應；(7)反應結束後，洗去未參與延伸反應的標記物，然後掃描，並記錄三張DNA晶片上每個位置Cy5和Cy3螢光的信號強度；根據第一、第二和第三張晶片掃描的結果，確定DNA晶片上每個陣點樣本的DNA序列，實現所有樣本Kras基因12、13密碼子序列的檢測陣點在第一、第二張晶片掃描無明顯的螢光信號，第三張晶片掃描具有Cy5信號，則序列為 GAT GGC ；陣點在第一晶片掃描無明顯的螢光信號，第二張晶片掃描同時具有Cy5和Cy3信號，第三張晶片掃描具有Cy3信號，則序列為GCT GGC ；陣點在第一晶片掃描無明顯的螢光信號，第二張晶片掃描同時具有Cy5信號，第三張晶片掃描具有Cy3信號，且Cy5信號的強度大約是Cy3信號強度的2倍，則序列為GTT GGC ； 陣點在第一晶片、第三張晶片掃描具有Cy5信號螢光信號，第二張晶片掃描無明顯螢光信號，則序列為AGT GGC ；陣點在第一、第二張、第三張晶片掃描均具有Cy3信號，則序列為CGT GGC ；陣點在第一、第二晶片掃描均具有Cy5的螢光信號，第三張晶片掃描具有Cy3信號，則序列為TGT GGC ；陣點在第一晶片掃描無明顯的螢光信號，第三張晶片掃描具有Cy5的信號，第三張晶片掃描具有Cy5信號，則序列為GGT GAC ；陣點在第一張晶片掃描無明顯的螢光信號，第二晶片掃描均具有Cy5的螢光信號，第三張晶片掃描具有Cy3的信號，則序列為GGT GGC0
全文摘要
DNA晶片組合延伸檢測鹼基連續突變的方法，已知一段核酸序列的待檢樣本中的至少一個單鹼基的各種可能變化的確定是通過一個雜交到固定的樣本核酸序列上的至少一個鹼基延伸的組合檢測來確定的。本發明的最大優點是實現了分析的序列片段中至少一個鹼基變化的同時檢測。由於序列是已知的，在沒有4個核苷酸全部加入到延伸反應體系的情況下，引物會延伸到與沒有加入的核苷酸互補的核苷酸單體前終止。基於這個原理，按照不同序列檢測的具體情況，可以設計不同的延伸方法，將螢光標記過的核苷酸單體延伸到序列需要檢測的鹼基位置，從而獲得待檢測信息。
文檔編號C12Q1/68GK102634587SQ201210128598
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者劉必成, 浦丹, 肖鵬峰, 陸祖宏 申請人:東南大學